CN114761568A

CN114761568A - 密码子优化的新一代可调节的促进融合的溶瘤单纯疱疹病毒1型病毒及使用方法

Info

Publication number: CN114761568A
Application number: CN202080080575.2A
Authority: CN
Inventors: 姚丰
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-07-15
Also published as: JP2023502099A; WO2021101796A1; US20220409684A1; EP4061951A4; EP4061951A1

Abstract

对常规疗法具有抗性的恶性肿瘤代表了重大的治疗性挑战。本发明的实施方案提供了密码子优化的新一代可调节的促进融合的溶瘤单纯疱疹病毒‑1，其在选择性杀伤靶细胞(如肿瘤细胞)方面更有效。在本文呈现的各种实施方案中，本文所述的溶瘤病毒适于治疗实体瘤以及其它癌症。

Description

密码子优化的新一代可调节的促进融合的溶瘤单纯疱疹病毒 1型病毒及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年11月18日提交的美国临时申请第62/936,776号的权益，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文中。

发明领域

本发明涉及使用密码子优化的可调节的促进融合的溶瘤单纯疱疹病毒1(HSV-1)病毒治疗癌症的组合物和方法。

背景

溶瘤病毒疗法需要利用病毒在人细胞中繁殖和裂解人细胞的能力，并且这种病毒复制依赖性裂解优先针对癌细胞。癌症生物学的进展以及对宿主因子和病毒编码的基因产物在控制感染细胞中的病毒产生中的作用的详细理解，已经促进了一些病毒作为抗癌的潜在治疗剂的使用(Aghi和Martuza,2005；Parato等人,2005)。单纯疱疹病毒(HSV)具有作为溶瘤剂的几种独特性质(Aghi和Martuza,2005)。它可以感染广泛的细胞类型，导致新病毒的复制和细胞死亡。HSV具有短的复制周期(9至18h)并且编码许多非必需基因，当被缺失时，这些基因极大地限制了病毒在非分裂正常细胞中复制的能力。由于其庞大的基因组，可以将多个治疗基因包装到溶瘤重组体的基因组中。

HSV-1的复制条件性毒株作为溶瘤剂的用途被首先报道用于治疗恶性胶质瘤(Martuza等人,1991)。从那时起，人们进行了各种努力以试图扩大它们的治疗功效和提高病毒在肿瘤细胞中的复制特异性。然而，不足为奇的是，损害正常细胞中病毒复制的基因缺失也导致靶向肿瘤细胞的病毒溶瘤活性显著降低(Advani等人,1998；Chung等人,1999)。目前，还没有能够仅杀伤肿瘤细胞而保留正常细胞完整的溶瘤病毒。因此，现有溶瘤病毒的治疗剂量受到显著限制(Aghi和Martuza,2005)。可以严格控制和药理学调整溶瘤病毒复制的溶瘤病毒的可用性将提供极大增加的安全性和治疗功效。此类可调节的溶瘤病毒将在肿瘤被消除后在邻近和远处组织中使不需要的复制以及在靶区域中不期望的子代病毒超载量最小化。该调节特征还允许在检测到不良效应时迅速关闭病毒的溶瘤活性(Aghi和Martuza,2005；Shen和Nemunaitis,2005)。本文所述的工作呈现了溶瘤HSV的新一代可调节的促进融合的变体，其在杀伤癌细胞方面明显比其它溶瘤HSV病毒更有效。

发明概述

在本发明中，我们首先描述了在HSV-1重组病毒的背景下使用HSV-2立即早期启动子来驱动来自报告基因的高效基因表达。其次，我们构建了哺乳动物细胞表达质粒，其在经修饰的HSV-2 ICP4启动子的控制下，编码经开发的密码子优化的显性失活TGF-β突变体mmTGF-β2-7M。再次，我们建立了穿梭载体，其允许通过同源重组将目的基因有效插入HSV-1UL26基因和UL27基因的基因间区域。第四，我们构建了四环素可调节的促进融合的HSV-1溶瘤病毒，其在含有tetO的HSV-2 ICP4启动子控制下编码mmTGF-β2-7M。为了促进mmTGF-β2-7M的分泌，将密码子优化的mmTGF-β2-7M与HSV-1gD基因的信号肽融合。

因此，本文所述的一个方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体、糖蛋白B(gB)变体、UL24变体和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL26基因和UL27基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0，并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

本文所述的一个方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL21基因和UL22基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

本文所述的一个方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL21基因、UL22基因、UL26基因和UL27基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述(f)的基因序列是LacZ基因序列。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述(f)的基因序列是显性失活TGF-β突变序列。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述显性失活TGF-β突变序列是mmTGF-β2-7M片段序列。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述(f)的启动子是经修饰的HSV立即早期启动子、HCMV立即早期启动子或人类延伸α启动子。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述变异基因是编码选自以下的氨基酸取代的gK变异基因：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸40的Ala至Thr的氨基酸取代；对应于SEQ IDNO:2的氨基酸40的Ala至“x”的氨基酸取代，其中“x”是任意氨基酸；对应于SEQ ID NO:2的氨基酸99的Asp至Asn的氨基酸取代；对应于SEQ ID NO:2的氨基酸304的Leu至Pro的氨基酸取代；以及对应于SEQ ID NO:2的氨基酸310的Arg至Leu的氨基酸取代。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述四环素操纵子序列包含两个Op2阻遏物结合位点。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述VP5启动子是HSV-1或HSV-2的VP5启动子。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述立即早期启动子是HSV-1或HSV-2立即早期启动子。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述HSV立即早期启动子选自：ICP0启动子、ICP4启动子和ICP27启动子。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述重组DNA是HSV-1基因组的一部分。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述重组DNA是HSV-2基因组的一部分。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述溶瘤HSV还包含药学上可接受的载体。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述溶瘤HSV还编码能够提高所述溶瘤HSV诱导抗肿瘤特异性免疫的功效的至少一种多肽。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述至少一种多肽编码选自以下的产物：白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)、白细胞介素15(IL15)、抗PD-1抗体或抗体试剂、抗PD-L1抗体或抗体试剂、抗OX40抗体或抗体试剂、CTLA-4抗体或抗体试剂、TIM-3抗体或抗体试剂、TIGIT抗体或抗体试剂、可溶性白细胞介素10受体(IL10R)、可溶性IL10R与IgG-Fc结构域之间的融合多肽、可溶性TGFβII型受体(TGFBRII)、可溶性TGFBRII与IgG-Fc结构域之间的融合多肽、抗IL10R抗体或抗体试剂、抗IL10抗体或抗体试剂、抗TGFBRII抗体或抗体试剂以及抗TGFBRII抗体或抗体试剂。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述溶瘤HSV还编码促进融合的活性。

本文所述的另一方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL26基因和UL27基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

本文所述的另一方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL21基因和UL22基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

本文所述的另一方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL21基因、UL22基因、UL26基因和UL27基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

本文所述的另一方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA不编码功能性ICP0基因或ICP34.5基因；并且编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA不编码功能性ICP0基因和ICP34.5基因；并且编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

本文所述的另一方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA不编码功能性ICP0；并且编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

本文所述的另一方面提供了编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列的溶瘤病毒。

本文所述的另一方面提供了编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列的重组病毒。

本文所述的另一方面提供了包含本文所述的任一病毒的组合物。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

本文所述的另一个方面提供了表达本文所述的病毒或组合物中任一种的细胞。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物动物。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述细胞是癌细胞或免疫细胞。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述免疫细胞是B细胞或T细胞。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述细胞表达高水平的mmTGF-β2-7M。

本文所述的另一方面提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的对象施用本文所述的病毒或组合物中的任一种。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述癌症是实体瘤。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述肿瘤是良性的或恶性的。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述对象被诊断为或已经被诊断为患有选自以下的癌症：癌、黑色素瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述对象被诊断为或已经被诊断为患有选自以下的癌症：非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌和胰腺癌。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述癌症是转移性的。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述方法还包括施用调节含有tet操纵子的启动子的试剂。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述试剂是强力霉素或四环素。在本文任一方面的一个实施方案中，所述试剂是局部或全身性施用的。在本文任一方面的一个实施方案中，所述全身性施用是口服施用。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述病毒或组合物被直接施用于所述肿瘤。

本文所述的另一方面提供了含有治疗性抗体和mmTGF-β2-7M的序列的杂合核酸序列，其中mmTGF-β2-7M与所述治疗性抗体的Fc结构域融合。

在本文任一方面的一个实施方案中，其中所述治疗性抗体序列是免疫治疗性抗体的序列。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述治疗性抗体序列是选自以下的序列：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗抗CTLA4抗体和抗TDM-1抗体以及抗TIGIT抗体。

本文所述的另一方面提供了由本文所述的任一杂合核酸编码的多肽。

本文所述的另一方面提供了表达本文所述的杂合核酸或多肽中的任一种的载体。

本文所述的另一方面提供了嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含以下中的至少一种：(a)包含显性失活TGF-β突变序列的细胞外结构域；(b)跨膜结构域；(c)共刺激结构域；和(d)细胞内信号传导结构域。

本文所述的另一方面提供了编码本文所述的任一CAR多肽的核酸。

本文所述的另一方面提供了哺乳动物细胞，其包含：(a)本文所述的任一CAR多肽；或本文所述的任一核酸。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述细胞是T细胞。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述细胞是人细胞。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述细胞还包含至少第二CAR多肽。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述至少第二CAR多肽包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含免疫治疗性抗体的序列。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述细胞获自患有或被诊断为患有癌症的个体。

本文所述的另一方面提供了治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括施用本文所述的任一细胞。

本文所述的另一方面提供了治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括：(a)使T细胞工程化以在所述T细胞表面上包含本文所述的任一CAR多肽或本文所述的任一核酸；和(b)将工程化的T细胞施用于所述对象。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述工程化的T细胞还包含至少第二CAR多肽。

在本文任一方面的一个实施方案中，所述方法还包括施用至少一种另外的抗癌治疗剂。

定义

本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入，如同完全阐述一样。

除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因此可以改变。常见术语的定义可以见于Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology 3^rd ed.,J.Wiley&Sons New York,NY(2001)；March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 5^th ed.,J.Wiley&Sons New York,NY(2001)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)；Davis等人,Basic Methods in MolecularBiology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)；Jon Lorsch(编辑)Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Elsevier,(2013)；Frederick M.Ausubel(编辑),Current Protocols in Molecular Biology(CPMB),John Wiley and Sons,(2014)；John E.Coligan(编辑),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John Wileyand Sons,Inc.,(2005)；以及Ethan M Shevach,Warren Strobe,(编辑)CurrentProtocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David HMargulies,John Wiley and Sons,Inc.,(2003)；其各自为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指导。

如本文所用，“癌症”可以指细胞的过度增殖，其独特性状——失去正常细胞控制—导致不受调节的生长、缺乏分化、局部组织侵袭和转移，并且可以是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或实体瘤。白血病的非限制性实例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一个实施方案中，癌症是ALL或CLL。淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)。在一个实施方案中，癌症是DLBCL或滤泡性淋巴瘤。实体瘤的非限制性实例包括肾上腺皮质肿瘤、肺泡软组织肉瘤、癌、软骨肉瘤、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮瘤、尤文肉瘤、生殖细胞肿瘤(实体瘤)、骨和软组织的巨细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、肾瘤、成神经细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和Wilms肿瘤。实体瘤可以在骨、肌肉或器官中发现，并且可以是肉瘤或癌。预期本文所述技术的任一方面可以被用于治疗所有类型的癌症，其包括本申请中未列出的癌症。如本文所用，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长，例如恶性类型或良性类型。

如本文所用，“对象”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括例如黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括例如小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括，例如，牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物物种(例如，家猫)、犬科动物物种(例如，狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方案中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。术语“个体”、“患者”和“对象”在本文中可互换使用。

优选地，对象是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除了人类之外的哺乳动物可以有利地被用作代表疾病(例如癌症)的动物模型的对象。对象可以是雄性/男性或雌性/女性。

对象可以是这样的对象，其先前已经被诊断为或被鉴定为罹患或患有需要治疗的病况(例如癌症)或者与这种病况相关的一种或多种并发症，并且任选地，已经经历了针对该病况或者与该病况相关的一种或多种并发症的治疗。可选地，对象也可以是先前未被诊断为患有这种病况或相关并发症的对象。例如，对象可以是表现出该病况的一种或多种风险因素或者与该病况相关的一种或多种并发症的对象或者不表现出风险因素的对象。

如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止与疾病或病症(例如癌症)相关的病况的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病况、疾病或病症的至少一种不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。可选地，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且还包括与在没有治疗的情况下预期的相比症状的停止或至少减慢的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减少疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或舒缓疾病进展、改善或缓和疾病状态、缓解(不论是部分的或全部的)和/或降低死亡率，无论是可检测的还是不可检测的。疾病的术语“治疗”还包括提供对疾病的症状或副作用的缓解(包括姑息治疗)。

在本文描述的各种实施方案中，还预期涵盖所述的任意特定多肽的变体(天然存在的或其他方面)、等位基因、同源物、保守性修饰的变体和/或保守性取代变体。关于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到，改变编码序列中单个氨基酸或一小部分氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单独取代、缺失或添加是“保守性修饰的变体”，其中改变产生用化学上相似的氨基酸取代氨基酸并保留所期望的多肽活性。此类保守性修饰的变体是除了与本公开内容一致的多态性变体、种间同源物和等位基因之外并且不排除与本公开内容一致的多态性变体、种间同源物和等位基因。

给定的氨基酸可以被具有类似生化特性的残基替代，例如，用一种脂肪族残基取代另一种脂肪族残基(如，用Ile、Val、Leu或Ala取代另一种)，或者用一种极性残基取代另一种极性残基(如，在Lys与Arg之间；在Glu与Asp之间；或在Gln与Asn之间)。其它此类保守性取代(例如具有类似疏水性特性的整个区域的取代)是众所周知的。包含保守性氨基酸取代的多肽可以在本文所述的任一种测定中进行测试，以确认保留了天然或参考多肽的所期望的活性，例如利肝(ligan)介导的受体活性和特异性。

氨基酸可根据其侧链性质的相似性进行分组(A.L.Lehninger,in Biochemistry,第二版,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可选地，可以根据共有的侧链性质将天然存在的残基分成以下组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。非保守性取代将需要将这些类别之一的成员更换为另一类别。具体保守性取代包括，例如Ala取代为Gly或取代为Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或取代为His；Asp取代为Glu；Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或取代为Pro；His取代为Asn或取代为Gln；Ile取代为Leu或取代为Val；Leu取代为Ile或取代为Val；Lys取代为Arg、取代为Gln或取代为Glu；Met取代为Leu、取代为Tyr或取代为Ile；Phe取代为Met、取代为Leu或取代为Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr取代为Trp；和/或Phe取代为Val、取代为Ile或取代为Leu。

在一些实施方案中，本文所述的多肽(或编码此类多肽的核酸)可以是本文所述的氨基酸序列之一的功能性片段。如本文所用，“功能性片段”是根据本领域已知或本文以下所述的测定保留野生型参考多肽活性的至少50％的肽的片段或区段。功能性片段可以包含本文所公开的序列的保守性取代。

在一些实施方案中，本文所述的多肽可以是如本文所述的多肽或分子的变体。在一些实施方案中，变体是保守性修饰的变体。例如，可以通过天然核苷酸序列的突变获得保守性取代变体。本文中提及的“变体”是与天然或参考多肽基本同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或取代而具有与天然或参考多肽不同的氨基酸序列。编码变体多肽的DNA序列涵盖当与天然或参考DNA序列相比时，包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，但编码保留非变体多肽活性的变体蛋白质或其片段的序列。本领域已知多种基于PCR的位点特异性诱变方法，并且可以由普通技术人员应用。

变异氨基酸或DNA序列可以是与天然或参考序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多相同的。例如，可以通过使用在万维网上通常用于此目的的免费使用的计算机程序(例如，具有默认设置的BLASTp或BLASTn)来比较两个序列，以确定天然序列与突变序列之间的同源性程度(同一性百分比)。

天然氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种来完成。例如，通过合成含有侧接有允许连接到天然序列的片段的限制位点的突变序列的寡核苷酸，可以在特定基因座处引入突变。在连接后，所得重构序列编码具有所期望的氨基酸插入、取代或缺失的类似物。可选地，寡核苷酸定向的位点特异性诱变程序可以被用于提供具有根据所需的取代、缺失或插入而改变的特定密码子的改变的核苷酸序列。用于进行此类改变的技术是充分确定的，并且包括例如由以下公开的那些：Walder等人(Gene 42:133,1986)；Bauer等人(Gene 37:73,1985)；Craik(BioTechniques,January 1985,12-19)；Smith等人(Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981)；以及美国专利第4,518,584号和第4,737,462号，它们通过引用整体并入本文。不参与维持多肽的适当构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，通常被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，半胱氨酸键可以被添加到多肽中以改善其稳定性或促进寡聚化。

如本文所用，术语“DNA”被定义为脱氧核糖核酸。术语“多核苷酸”在本文中可以与“核酸”互换使用以表示核苷的聚合物。通常，多核苷酸由天然存在于通过磷酸二酯键连接的DNA或RNA(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)中的核苷组成。然而，该术语涵盖包含含有化学或生物修饰的碱基、修饰的主链等的核苷或核苷类似物的分子，无论是否存在于天然存在的核酸中，并且此类分子对于某些应用可以是优选的。在本申请涉及多核苷酸的情况下，应理解，提供了DNA、RNA以及在每种情况下的单链和双链形式(以及每个单链分子的互补物)。本文中使用的“多核苷酸序列”可以是指多核苷酸材料本身和/或序列信息(即用作碱基缩写的连续字母)，其生化地表征特定核酸。除非另有说明，否则本文所呈现的多核苷酸序列以5’至3’方向呈现。

本文使用的术语“可操作地连接”是指各种核酸分子元件相对于彼此的排列，使得元件在功能上连接并且能够彼此相互作用。此类元件可以包括但不限于启动子、增强子、多聚腺苷酸化序列、一个或多个内含子和/或外显子以及待表达的目的基因的编码序列。当可操作地连接时，核酸序列元件可共同起作用以调节彼此的活性，并且最终可影响目的基因的表达水平，包括由上述序列编码的那些中的任一个。

本文使用的术语“载体”是指载体核酸分子，核酸序列可以插入载体核酸分子中以引入细胞中，在那它可以被复制。核酸序列可以是“外源的”，这意味着它对于引入载体的细胞是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源，但在宿主细胞核酸中通常没有发现该序列的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员将充分具备通过标准重组技术构建载体的能力(参见，例如，Maniatis等人,1988和Ausubel等人,1994，两者通过引用并入本文)。另外，本文所述且在附图中示出的技术对于有效的载体构建也具有指导意义。

术语“溶瘤HSV-1载体”是指对应于HSV-1基因组的至少一部分的基因工程化的HSV-1病毒，其能够感染靶细胞、复制以及被包装成HSV-1病毒粒子。基因工程化的病毒包括使病毒溶瘤的核酸的缺失和/或突变和/或插入，使得基因工程化的病毒通过溶瘤活性在肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞。所述病毒可以是减毒的或非减毒的。所述病毒可以递送或可以不递送与HSV病毒基因组不同的转基因。在一个实施方案中，溶瘤HSV-1载体不表达转基因以产生对病毒而言是外来的蛋白质。

如本文所用，“UL21”是指被膜蛋白UL21(例如，来自人类α疱疹病毒1)。UL21的序列对于多种物种是已知的，例如HSV-1 UL21(NCBI基因ID：2703372)多肽(例如，NCBI Ref SeqYP_009137095.1)。UL21可以指HSV-1 UL21，包括其天然存在的变体、分子和其等位基因，并且可以指同源物(如HSV-2)。

如本文所用，“UL22”是指包膜糖蛋白H(例如，来自人两累α疱疹病毒1)。UL22的序列对于多种物种是已知的，例如HSV-1 UL22(NCBI基因ID:24271466)多肽(例如，NCBI RefSeq YP_009137096.1)。UL22可以指HSV-1 UL22，包括其天然存在的变体、分子和其等位基因，并且可以指同源物(如HSV-2)。

如本文所用，“UL26”是指衣壳成熟蛋白酶(例如，来自人类α疱疹病毒1)。UL26的序列对于许多物种是已知的，例如HSV-1 UL26(NCBI基因ID:2703453)多肽(例如，NCBI RefSeq YP_009137100.1)。UL26可以指HSV-1 UL26，包括其天然存在的变体、分子和等位基因，并且可以指同源物(如HSV-2)。

如本文所用，“UL27”是指包膜糖蛋白B(例如，来自人类α疱疹病毒1)。UL27的序列对于许多物种是已知的，例如HSV-1 UL27(NCBI基因ID：24271469)多肽(例如，NCBI RefSeq YP_009137102.1))。UL27可以指HSV-1 UL27，包括其天然存在的变体、分子和等位基因，并且可以指同源物(如HSV-2)。

本文使用的术语“启动子”是指直接或间接调节与其可操作连接的相应核酸编码序列的转录的核酸序列。启动子可以单独发挥功能以调节转录，或者在一些情况下，启动子可以与一个或多个其它调节序列(如增强子或沉默子)共同起作用，以调节目的基因的转录。启动子包含DNA调节序列，其中所述调节序列来源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’-方向)编码序列的转录的基因。启动子通常包含发挥定位RNA合成的起始位点的功能的序列。这方面最有名的实例是TATA盒，但在缺乏TATA盒的一些启动子(诸如例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点本身的离散元件有助于固定起始位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能性元件。为了使编码序列“在”启动子的“控制下”，可以定位所选启动子“下游”(即3’端)的转录阅读框的转录起始位点的5’端。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码RNA的表达。

启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒转或移动时保持启动子功能。根据所使用的启动子，各个元件可以协同地或独立地发挥功能以激活转录。本文所述的启动子可以与或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列，如本文中所列出的针对基因或其部分或功能性等同物的那些顺式作用调节序列。

启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。此类启动子可以被称为“内源的”。类似地，增强子可以是位于核酸序列下游或上游的与该序列天然相关联的增强子。可选地，可以通过在重组或异源启动子的控制下定位编码核酸区段来获得某些优势，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关联的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列相关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，以及从任何其它病毒、或者原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及不是“天然存在的”启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，在重组DNA构建中最常用的启动子包括HCMV立即早期启动子、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。

编码特定蛋白的“基因”或“序列”是这样的核酸分子，当置于一个或多个适当的调节序列的控制下时，所述核酸分子在体外或体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽。目的基因可以包括但不限于来自真核mRNA的cDNA、来自真核DNA的基因组DNA序列，以及甚至是合成的DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3’端。通常，提供多聚腺苷酸化信号以终止插入重组病毒的基因的转录。

本文使用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文可以互换使用。肽是相对短的多肽，长度通常为约2至60个氨基酸。本文使用的多肽通常含有蛋白质中最常见的氨基酸，诸如20种L-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其它氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一种或多种氨基酸可以例如通过添加化学实体(如碳水化合物基团、磷酸基团、脂肪酸基团、用于缀合的连接子、官能化等)来修饰。具有与其共价或非共价结合的非多肽部分的多肽仍然被认为是“多肽”。示例性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化、使用重组DNA技术产生或通过化学手段(如常规固相肽合成)等合成。本文使用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可指多肽材料本身和/或序列信息(即，用作氨基酸名称缩写的连续字母或三个字母代码)，其生化地表征多肽。除非另有指示，否则本文所呈现的多肽序列以N-末端至C-末端方向呈现。

术语“转基因”是指编码在插入有核酸序列的细胞中待表达的多肽或多肽的一部分的特定核酸序列。术语“转基因”意在包括(1)在细胞中天然不存在的核酸序列(即异源核酸序列)；(2)核酸序列，其为在其已插入的细胞中天然存在的核酸序列的突变形式；(3)核酸序列，其用于添加在其已插入的细胞中天然存在的相同(即同源)或类似核酸序列的另外拷贝；或者(4)沉默的天然存在的或同源的核酸序列，其表达在其已经插入的细胞中被诱导。“突变形式”或“经修饰的核酸”或“进修饰的核苷酸”序列意指含有与野生型或天然存在的序列不同的一个或多个核苷酸的序列，即突变核酸序列包含一个或多个核苷酸取代、缺失和/或插入。在一些情况下，目的基因还可包括编码前导肽的序列或信号序列，使得转基因产物可以从细胞分泌。

如本文所用，术语“抗体试剂”是指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列并特异性结合给定抗原的多肽。抗体试剂可以包含抗体或包含抗体的抗原结合结构域的多肽。在任何方面的一些实施方案中，抗体试剂可以包含单克隆抗体或包含单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一个实例中，抗体包含两条重(H)链可变区和两条轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv、CDR和结构域抗体(dAb)片段(参见例如de Wildt等人,Eur J.Immunol.1996；26(3):629-39；将其通过引用整体并入本文))以及完全抗体。抗体可以具有IgA、IgG、IgE、IgD或IgM的结构特征(以及其亚型和组合)。抗体可以来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类动物(人和非人灵长类动物)以及灵长类化的(primatized)抗体。抗体还包括微抗体(midibodies)、纳米抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。

本文使用的术语“溶瘤活性”是指施加在肿瘤细胞上的体外和/或体内的细胞毒性效应，而在相同条件下对正常细胞没有任何明显或显著的有害效应。在体外条件下的细胞毒性效应通过现有技术中已知的多种手段检测，例如通过用针对死亡细胞的选择性染色剂进行染色、通过抑制DNA合成或通过细胞凋亡。通过本领域已知的方法在体内条件下进行细胞毒性效应的检测。

如本文所用，分子的“生物活性”部分是指能够执行与较大分子类似功能的较大分子的一部分。仅作为非限制性实例，启动子的生物活性部分是保留影响基因表达的能力(即使只是稍微地)的启动子的任何部分。类似地，蛋白质的生物活性部分是保留执行全长蛋白质的一个或多个生物功能(例如与另一分子结合、磷酸化等)的能力(即使只是稍微地)的蛋白质的任何部分。

如本文所用，术语“施用”是指通过一种方法或途径将如本文所公开的治疗性组合物或药物组合物放置在对象中，所述方法或途径导致在所期望部位至少部分递送药剂。包含如本文所公开的试剂的药物组合物可以通过任何适当的途径施用，这导致在对象中的有效治疗。

术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计显著性，并且通常意指两个标准偏差(2SD)或更大的差异。

除了在操作实例中之外，或在另有指出的情况下，本文使用的表示成分或反应条件的量的所有数值应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以意指±1％。

如本文所用，术语“包含”意指除了所呈现的限定元素之外还可以存在其他元素。使用“包含”表示包括而不是限制。术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应的组分，其不包括在实施方案的描述中未叙述的任何元素。如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些元素。该术语允许不会实质上影响该技术的那个实施方案的基本和新颖或功能特性的另外元素的存在。

除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则措辞“或”旨在包括“和”。虽然可以在本公开内容的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”来源于拉丁文“例如(exempli gratia)”，并且在本文中被用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(forexample)”是同义的。

在一些实施方案中，用于描述和要求保护本申请的某些实施方案的表示成分的量、诸如分子量的性质、反应条件等的数值将被理解为在一些情况下被术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，在书面说明和所附权利要求书中阐述的数值参数是可以根据通过具体实施方案寻求获得的所期望性质而变化的近似值。在一些实施方案中，数值参数应根据所报告的有效位数的数量并通过应用普通舍入技术来解释。尽管阐述应用的一些实施方案的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中阐述的数值是尽可能精确地报告的。

考虑到前述的初步描述和定义，下文提供另外的背景，以提供本文所述的本发明载体、组合物和方法的产生和发展的背景。

附图简述

在参考附图中示出了示例性实施方案。旨在将本文所公开的实施方案和附图视为说明性而非限制性的。

图1显示了QREOF-lacZ基因组的示意图。UL和US分别代表HSV-1基因组的独特的长区域和独特的短区域，它们的侧接有它们相应的反向重复区(空心框)。在HSV-1基因组的图上显示了ICP0编码序列被侧接有ICP0序列的兔β-珠蛋白基因(斜条纹框)的编码tetR(黑框)和内含子II的DNA序列取代。ICP5TO表示在携带tetO的HSV-1Icp5启动子的控制下编码ICP5的HSV-1 UL19基因。插入UL26基因和UL27基因的基因间区域的扩增的DNA片段，其在经修饰的HSV-2 ICP0启动子(交叉阴影线框)的控制下编码lacZ基因。

图2显示了以7.5×10e5个细胞/60mm皿接种的H1299细胞。在存在或不存在强力霉素的情况下，在细胞接种后48h，以0.05PFU/皿的MOI用QREOF-lacZ感染细胞。感染的细胞在感染后48h用X-Gal染色并拍照。

图3显示了以1.5×10e6个细胞/皿接种的U2OS细胞。接种后20h，通过lipofectamine 2000用5μg/皿的pICP6-eGFP或5μg/皿的pQUL2627-TGF-DN转染细胞的双份皿。转染后70h制备细胞提取物。在SDS-PAGE上分离转染细胞提取物和从转染细胞收集的培养基中的蛋白质，然后用兔抗TGF-β1抗体(Abcam,ab179695)进行免疫印迹。

图4显示了通过mmTGF-β2-7M阻断TGF-β1信号传导对U2OS细胞增殖的影响。以1.5×10e6个细胞/皿接种U2OS细胞。在接种后20h，通过lipofectamine2000用5μg/皿的pICP6-EGFP或5μg/皿的pQUL2627-TGFDN转染细胞的一式三份皿。转染后76h收集细胞。通过台盼蓝排除法对活细胞计数并绘制为每个皿的活细胞数，表示为平均值±SEM。

图5显示了mmTGF-β2-7M在QREOF-DNT感染的U2OS细胞中的表达。U2OS细胞一式三份地被模拟感染，或者在强力霉素存在下，以3PFU/个细胞的MOI，用QREOF-DNT或QREOF-lacZ感染。在感染后18h制备感染的细胞提取物。在SDS-PAGE上分离模拟感染和感染的细胞提取物中的蛋白质，然后用抗HSV-1 ICP27(Santa Cruz)或兔抗TGF-β1抗体的单克隆抗体进行免疫印迹。

图6显示了QREO5F基因组的示意图。

发明的描述

溶瘤病毒是经基因修饰的病毒，其在宿主癌细胞中优先复制，导致新病毒的产生并最终导致细胞死亡。单纯疱疹病毒(HSV)具有作为溶瘤剂的几种独特性质。它可以感染广泛的细胞类型并且具有短的复制周期(9至18h)。HSV-1的复制条件性毒株作为溶瘤剂的用途被首先报道用于治疗恶性胶质瘤。从那时起，人们进行了各种努力以试图扩大其治疗功效和提高病毒在肿瘤细胞中的复制特异性。然而，不足为奇的是，损害正常细胞中病毒复制的基因缺失也导致靶向肿瘤细胞的病毒溶瘤活性显著降低。目前，还没有能够仅杀伤肿瘤细胞而保留正常细胞完整的溶瘤病毒。因此，现有溶瘤病毒的治疗剂量受到显著限制。可以严格控制和药理学调整溶瘤病毒复制的溶瘤病毒的可用性将提供极大增加的安全性和治疗功效。此类可调节的溶瘤病毒将在肿瘤被消除后在邻近和远处组织中使不受控复制的风险以及在靶区域中不期望的子代病毒超载量最小化。该调节特征还允许在检测到不良效应时迅速关闭病毒的溶瘤活性。

溶瘤HSV

HSV在上皮细胞和成纤维细胞中复制，并在感染个体的感觉神经节内的神经元细胞体中建立终身潜伏感染。在生产性感染期间，HSV基因基于其表达的时间顺序分为三个主要类别：立即早期(IE)、早期(E)和晚期(L)(Roizman,2001)。与本发明直接相关的HSV-1病毒蛋白是立即早期调节蛋白ICP0和病毒主要衣壳蛋白ICP5或VP5。虽然对于生产性感染并不是必需的，但ICP0对于在正常细胞中以低感染复数进行有效的病毒基因表达和复制以及从潜伏性感染有效再激活是必需的(Cai和Schaffer,1989；Leib等人,1989；Yao和Schaffer,1995)。需要ICP0来刺激病毒mRNA在静止细胞中的翻译(Walsh和Mohr,2004)，并且在对抗宿主对HSV感染的先天抗病毒应答中起基本作用。简而言之，它防止IFN诱导的病毒转录的核阻断，下调TLR2/TLR9诱导的对病毒感染的炎性细胞因子应答，阻抑TNF-α介导的NF-κB信号通路的激活以及干扰对病毒感染的DNA损伤应答(Lanfranca等人,2014)。考虑到肿瘤细胞在多种细胞通路中受到损害，诸如DNA修复、干扰素信号传导和翻译调节(Barber,2015；Critchley-Thorne等人,2009；Kastan和Bartek,2004；Li和Chen,2018；Mohr,2005；Zitvogel等人,2015)，ICP0缺失突变体在癌细胞中比在正常细胞中，特别是静止细胞和终末分化细胞中更有效地复制也就不足为奇了。Yao和Schaffer(Yao和Schaffer,1995)首次说明了ICP0突变体的溶瘤潜力，他们显示了在人骨肉瘤细胞(U2OS)中ICP0无效突变体的噬菌斑形成效率比在非致瘤性非洲绿猴肾细胞(Vero)中高100倍至200倍。最近已经表明，在U2OS细胞中干扰素基因刺激因子(STING)信号通路的缺陷导致其被证明能够有效地支持ICP0无效突变体的生长(Deschamps和Kalamvoki,2017)。

使用由Yao Feng博士发明的T-RExTM基因开关技术(Thermo Fisher/Invitrogen,Carlsbad,CA)和自切割核酶，产生了第一可调节溶瘤病毒KTR27(美国专利第8236,941号，将其通过引用整体并入本文)，其中HSV-1 ICP0基因被编码四环素阻遏物(tetR)的DNA序列替代，而必需的HSV-1 ICP27基因由携带tetO的ICP27启动子和ICP27编码序列的5’非翻译区中的自切割核酶控制。最近对KTR27衍生的促进融合的病毒(命名为KTR27-F)的DNA序列分析表明，除了ICP0基因的两个拷贝缺失外，HSV-1 ICP34.5基因的两个拷贝也从所述KTR27-F病毒中缺失。此外，用ICP34.5基因特异性引物对KTR27病毒DNA进行的PCR分析表明，与KTR27-F类似，KTR27不编码ICP0基因和ICP34.5基因。ICP34.5基因位于HSV-1基因组的反向重复区域中的ICP0基因的5’端，所述HSV-1基因组的反向重复区域侧接有HSV-1基因组的独特长序列。各种HSV-1溶瘤病毒基于ICP34.5基因的缺失(Aghi和Martuza,2005；Kaur等人,2012；Lawler等人,2017)，包括最近FDA批准的用于治疗晚期黑色素瘤的talimogenelaherparepvec(T-VEC)(Rehman等人,2016)。

基于KTR27的tet依赖性病毒复制和肿瘤选择性特征以及在构建KTR27以实现更高程度的tet依赖性病毒复制中使用的自切割核酶由于ICP27的小于最佳表达而显著限制病毒在癌细胞中复制的观点，最近开发了一种新的基于ICP0无效突变体的tetR表达的溶瘤病毒QREO5，其在含有tetO的VP5启动子的控制下编码晚期HSV-1主要衣壳蛋白VP5。因为VP5是晚期病毒基因产物(其表达依赖于病毒IE基因的表达)，所以假设携带tetO的VP5启动子的晚期动力学将允许在携带tetO的ICP27启动子的控制下通过从IE ICP0启动子表达的tetR对VP5表达进行比ICP27更严格的控制。实际上，在感染的H1299细胞和Vero细胞中，QREO5表现出明显优于KTR27的tet依赖性病毒复制。此外，因为QREO5基因组不含自切割核酶并且编码野生型ICP34.5基因，所以它在Vero细胞和H1299细胞中比KTR27分别更有效地复制100倍和450倍。

HSV-1是能够感染几乎所有脊椎动物细胞的人嗜神经病毒。自然感染之后是裂解、复制周期或建立潜伏期(通常在周围神经节中)，其中DNA无限期地维持在游离状态。HSV-1含有长度约152千碱基的双链线性DNA基因组，其已经由McGeoch完全测序(McGeoch等人,J.Gen.Virol.69:1531(1988)；McGeoch等人,Nucleic Acids Res 14:1727(1986)；McGeoch等人,J.Mol.Biol.181:1(1985)；Perry和McGeoch,J.Gen.Virol.69:2831(1988)；SzparaML等人,J Virol.2010,84:5303；Macdonald SJ等人,J Virol.2012,86:6371)。DNA复制和病毒粒子组装发生在感染细胞的细胞核中。在感染后期，多联体病毒DNA被切割成基因组长度的分子，其被包装成病毒粒子。在CNS中，单纯疱疹病毒跨神经元传播，随后轴突内转运(逆行或顺行)到发生复制的细胞核。

因此，本文所述的一方面提供了是包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体、糖蛋白B(gB)变体、UL24变体和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL26基因和UL27基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0，并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

本文所述的一方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL21基因和UL22基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

本文所述的一方面提供了包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：(a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；(b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；(c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；(d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；(e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及(f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL21基因、UL22基因、UL26基因和UL27基因的基因间区域，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

本文所述的溶瘤病毒的区别特征是病毒基因组表达编码功能性ICP34.5的基因序列。感染的细胞蛋白34.5(ICP34.5)是由病毒(如单纯疱疹病毒)中的γ34.5基因表达的蛋白质(例如基因产物)。ICP34.5是HSV神经毒性因子之一(C Chou J,Kern ER,Whitley RJ和Roizman B,Science,1990)。ICP34.5的功能之一是阻断对病毒感染的细胞应激应答，即阻断双链RNA依赖性蛋白激酶PKR介导的抗病毒应答(Agarwalla,P.K.,等人，Method inMol.Bio.,2012)。

本文所述的溶瘤病毒是ICP0无效病毒。感染细胞多肽0(ICP0)是由HSV-1α0基因编码的蛋白质。在病毒基因表达的立即早期阶段期间产生ICP0。ICP0被合成并转运到感染的宿主细胞的细胞核中，在那里它促进来自病毒基因的转录、破坏细胞核和细胞质细胞结构(如微管网络)，并改变宿主基因的表达。本领域技术人员可以分别使用基于PCR的测定来检测基因在病毒基因组中的存在或基因产物的表达，或者使用功能性测定来评估它们的功能，来确定ICP0基因产物是否已经被缺失或者病毒是否不表达该基因产物的功能形式。

在一个实施方案中，编码这些基因产物的基因含有抑制基因产物的适当表达的突变(例如失活突变)。例如，基因可以编码基因产物中抑制基因产物的适当折叠、表达、功能等的突变。如本文所用，术语“失活突变”旨在广泛地意指对基因的突变或改变，其中该基因的表达显著降低，或者其中该基因产物变得无功能，或者其功能能力显著降低。术语“基因”涵盖编码基因产物的区域以及该基因的调节区域(如启动子或增强子)，除非另有说明。

实现此类改变的方法包括：(a)破坏基因产物表达的任何方法，或者(b)使表达的基因无功能的任何方法。许多破坏基因表达的方法是已知的，包括通过插入、缺失和/或碱基改变来改变基因的编码区域或其启动子序列。(参见,Roizman,B和Jenkins,F.J.,Science 229:1208-1214(1985))。

本发明的DNA的基本特征是存在病毒复制所需的基因，其与具有TATA元件的启动子可操作地连接。Tet操纵子序列位于启动子的TATA元件的最后一个核苷酸的3’端与基因的5’端的6至24个核苷酸之间。通过使用含有通过2-20(优选1-3或10-13个)核苷酸的序列连接的两个op2阻遏物结合位点(每个这样的位点具有核苷酸序列：TCCCTATCAGTGATAGAGA(SEQ ID NO:8))的操纵子的形式，增强了tet阻遏物与操纵子序列结合的强度。当阻遏物与该操纵子结合时，将发生很少或不发生相关基因的转录。如果具有这些特征的DNA存在于也表达四环素阻遏物的细胞中，则该基因的转录将被与操纵子结合的阻遏物阻断，并且将不会发生病毒复制。然而，如果例如引入四环素，它将结合阻遏物，使阻遏物与操纵子分离，病毒复制将继续进行。

在生产性感染期间，基于表达的时间顺序，HSV基因表达分为三个主要类别：立即早期(α)、早期(β)和晚期(γ)，晚期基因进一步被分为两组，γ1和γ2。立即早期基因的表达不需要从头病毒蛋白合成，并且当病毒DNA进入细胞核时由病毒粒子相关蛋白VP16和细胞转录因子激活。立即早期基因的蛋白质产物被指定为感染细胞多肽ICPO、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，并且这些基因的启动子优选用于指导tet阻遏物(tetR)的表达。病毒复制所需的基因表达受含有tetO启动子的控制，这些必需基因可以是立即早期、早期或晚期基因，例如ICP4、ICP27、ICP8、UL9、gD和VP5。在一个实施方案中，tetR具有SEQIDNO:9的序列。

ICP0在增强HSV从潜伏期的再激活中起主要作用，并且在低的感染复数下赋予病毒显著的生长优势。ICP4是HSV-1的主要转录调节蛋白，其激活病毒早期和晚期基因的表达。ICP27对于生产性病毒感染是必需的，并且对于有效的病毒DNA复制以及病毒β基因和γ1基因以及病毒γ2基因的子集的最佳表达是必需的。HSV感染期间ICP47的功能似乎是下调I类主要组织相容性复合体(MHC)在感染细胞表面的表达。

重组DNA还可以包括编码四环素阻遏物的至少一种(优选至少两种)的序列，这些序列的表达在立即早期启动子(优选ICP0或ICP4)的控制下。HSV ICP0、ICP4和ICP27启动子及其内源性调节的基因的序列在本领域是众所周知的(Perry等人,J.Gen.Virol.67:2365-2380(1986)；McGeoch等人,J.Gen.Virol.72:3057-3075(1991)；McGeoch等人,Nucl.AcidRes.14:1727-1745(1986))以及先前已经描述了用于制备含有这些元件的病毒载体的程序(参见美国公布的申请2005-0266564)。

这些启动子不仅在促进基因表达方面非常活跃，而且它们由VP16特异性诱导，VP16是当HSV-1感染细胞时释放的反式激活子。因此，当最需要阻遏物来关闭病毒复制时，来自ICP0启动子的转录特别高。一旦产生了适当的DNA构建体，就可以使用本领域众所周知的方法将其掺入HSV-1病毒中。在US 2005-0266564中描述了一种适当的程序，但也可以采用本领域已知的其它方法。

可用于本发明发明人驱动(f)中基因表达的其它启动子包括但不限于经修饰的HSV立即早期启动子(例如，HSV ICPO、ICP4、ICP27、ICP22和ICP47启动子/调节序列)、HCMV立即早期启动子(例如，pWRG7128(Roy等人，Vaccine 19,764-778,2001)以及在WO95/20660中提及PbCl2/CMV和pJW4303，；它们通过引用整体并入本文)，或人类延长因子-1α(EF-1α)启动子。这些启动子是本领域已知的，并且本领域技术人员能够鉴定所用的这些启动子的序列。在一个实施方案中，(f)的启动子是具有含tet操纵子的HSV-2立即早期启动子。

在各种实施方案中，所述变异基因包含至少一个氨基酸变化，其偏离该基因的野生型序列。在一个实施方案中，本文所述的溶瘤HSV可以在至少一个变异基因中包含两个或更多个氨基酸取代。可以在同一基因中发现至少两个氨基酸取代，例如，gK变异基因含有至少两个氨基酸取代。可选地，可以在至少两个不同的基因中发现至少两个氨基酸取代，例如，gK变异基因和UL24变异基因各自含有至少一个氨基酸取代。

SEQIDNO:2是编码gK的氨基酸序列(菌株KOS)。

MLAVRSLQHLSTVVLITAYGLVLVWYTVFGASPLHRCIYAVRPT

GTNNDTALVWMKMNQTLLFLGAPTHPPNGGWRNHAHICYANLIAGRVVPFQVPPDATN

RRIMNVHEAVNCLETLWYTRVRLVVVGWFLYLAFVALHQRRCMFGVVSPAHKMVAPAT

YLLNYAGRIVSSVFLQYPYTKITRLLCELSVQRQNLVQLFETDPVTFLYHRPAIGVIV

GCELMLRFVAVGLIVGTAFISRGACAITYPLFLTITTWCFVSTIGLTELYCILRRGPA

PKNADKAAAPGRSKGLSGVCGRCCSIILSGIAMRLCYIAVVAGVVLVALHYEQEIQRR

LFDV(SEQ ID NO:2)

本文所述的溶瘤病毒的另一区别特征是病毒基因组序列例如在VP5的5’非翻译区不包含核酶序列。核酶是能够以与蛋白酶类似的方式催化生化反应的RNA分子。核酶进一步描述于例如Yen等人,Nature431:471-476,2004中，其内容通过引用整体并入本文。

在各个方面的一个实施方案中，溶瘤病毒表达本领域熟知的LacZ基因。

在各个方面的一个实施方案中，溶瘤病毒表达显性失活TGFβ。如本文所用，术语“显性失活”是指突变或修饰的蛋白质，其基本上防止具有野生型功能的相应蛋白质执行野生型功能。例如，显性失活TGFβ将能够抑制表达显性失活的细胞中TGFβ的野生型功能。

在一个实施方案中，显性失活TGFβ能够将野生型TGFβ的功能(例如，启动TGFβ信号传导的能力)或表达水平(例如，mRNA或蛋白水平)抑制至少10％。在一个实施方案中，与适当的对照相比，显性失活TGFβ能够抑制野生型功能(例如，启动TGFβ信号传导的能力)或表达水平(例如，mRNA或蛋白水平)至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。本文所用的适当对照是指未与显性失活TGFβ接触的细胞中TGFβ的功能或表达水平。本领域技术人员可以分别通过例如评估细胞中TGFβ信号传导的水平来评估TGFβ的功能，或通过例如蛋白质印迹或基于PCR的测定来分别评估蛋白质和mRNA水平来评估TGFβ的表达水平。

在一个实施方案中，显性失活TGFβ包含具有与野生型TGFβ至少90％同一性的序列，由或基本上由具有与野生型TGFβ至少90％同一性的序列组成，并且能够抑制TGFβ的野生型功能。在另一个实施方案中，显性失活TGFβ包含具有与野生型TGFβ至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的序列，由或基本上由具有与野生型TGFβ至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的序列组成，并且能够抑制TGFβ的野生型功能。

在一个实施方案中，显性失活TGFβ是mmTGF-b2-7M片段，具其有SEQ ID NO:10的核苷酸序列。

ATGGCCCTGGACGCCGCCTACTGCTTCCGCAACGTGCAGGACAACTGCTGCCTGCGCCCCCTGTACATCGACTTCCGCAAGGACCTGGGCTGGAAGTGGATCCACGAGCCCAAGGGCTACAACGCCAACTTCTGCGCCGGCGCCTGCCCCTACCGCGCCAGCAAGAGCCCCAGCTGCGTGAGCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCGTGTACTACGTGGGCCGCAAGCCCAAGGTGGAGCAGCTGAGCAACATGATCGTGAAGAGCTGCAAGTGCAGCTAA(SEQ ID NO:10)。

在一个实施方案中，显性失活TGFβ是mmTGF-b2-7M片段，其具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

ALDAAYCFRN VQDNCCLRPL YIDFRKDLGW KWIHEPKGYN ANFCAGACPYRASKSPSCVSQDLEPLTIVY YVGRKPKVEQ LSNMIVKSCK CS(SEQ ID NO:11).

在一个实施方案中，显性失活TGFβ包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的序列，由或基本上由具有与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多同一性的序列组成。

在一个实施方案中，本文所述的溶瘤HSV还包含编码产物(例如，蛋白质、基因、基因产物、或者抗体或抗体试剂)的至少一种多肽，所述产物可以增加溶瘤HSV的功效以诱导抗肿瘤特异性免疫。示例性产物包括但不限于白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)、白细胞介素15(IL15)、抗PD-1抗体或抗体试剂、抗PD-L1抗体或抗体试剂、抗OX40抗体或抗体试剂、CTLA-4抗体或抗体试剂、TIM-3抗体或抗体试剂、TIGIT抗体或抗体试剂，可溶性白细胞介素10受体(IL10R)、可溶性IL10R与IgG-Fc结构域之间的融合多肽、可溶性TGF-βII型受体(TGFBRII)、可溶性TGFBRII与IgG-Fc结构域之间的融合多肽、抗IL10R抗体或抗体试剂、抗IL10抗体或抗体试剂、抗TGF-β1抗体或抗体试剂以及抗TGFBRII抗体或抗体试剂。在一个实施方案中，如下文所述的，产物是IL-2、IL-12或IL-15的片段，其包含与IL-2、IL-12或IL-15相同的功能。本领域技术人员可以确定是否使用本领域的标准技术来诱导抗肿瘤特异性免疫，所述技术被进一步描述在，例如，Clay,TM等人,Clinical Cancer Research(2001)；Malyguine,A等人,J Transl Med(2004)；或Macchia I等人,BioMed ResearchInternational(2013)中，其各自通过引用整体并入本文。

白细胞介素-2(IL-2)是一种白细胞介素，是免疫系统中的一种类型的细胞因子信号分子。IL-2调节负责免疫的白血细胞(例如白细胞和淋巴细胞)的活性。IL-2是机体对微生物感染的自然应答的一部分，用于区分外来的“非自我”和“自我”。它通过结合由淋巴细胞表达的IL-2受体来介导其作用。许多物种的IL-2(也被称为TCGF和淋巴因子)的序列是已知的，例如人IL-2(NCBI基因ID：3558)多肽(例如，NCBI Ref Seq NP_000577.2)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_000586.3)。IL-2可以指人IL-2，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。IL-2是指例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的哺乳动物IL-2。SEQ ID NO:5的核酸序列包括编码IL-2的核酸序列。

SEQ ID NO:5是编码IL-2的核苷酸序列。

白细胞介素-12(IL-12)是树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和人B淋巴母细胞样细胞(NC-37)应答抗原刺激而自然产生的白细胞介素。IL-12参与初始T细胞分化为Th1细胞。它被称为T细胞刺激因子，其可以刺激T细胞的生长和功能。它刺激T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，并减少IL-4介导的IFN-γ抑制。许多物种的IL-12a的序列(也被称为P35、CLMF、NFSK和KSF1)是已知的，例如人IL-12a(NCBI基因ID：3592)多肽(例如，NCBI Ref Seq NP_000873.2)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_000882.3)。IL-12可以指人IL-12，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。IL-12是指例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的哺乳动物IL-12。SEQ ID NO:6的核酸序列包括编码IL-12a的核酸序列。

SEQ ID NO:6是编码IL-12a的核苷酸序列。

白细胞介素-15(IL-15)是在被病毒感染后由单核吞噬细胞(和一些其它细胞)分泌的白细胞介素。该细胞因子诱导以下细胞的细胞增殖：自然杀伤细胞；先天免疫系统的细胞，其主要作用是杀伤病毒感染的细胞。许多物种的IL-15的序列是已知的，例如人IL-15(NCBI基因ID：3600)多肽(例如NCBI Ref Seq NP_000585.4)和mRNA(例如NCBI Ref SeqNM_000576.1)。IL-15可以指人IL-15，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。IL-15是指例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的哺乳动物IL-15。SEQ ID NO:7的核酸序列包括编码IL-15的核酸序列。

SEQ ID NO:7是编码IL-15的核苷酸序列。

可溶性或野生型白细胞介素10受体(IL10R)已显示介导白细胞介素10的免疫抑制信号，导致抑制促炎细胞因子的合成。据报道，该受体通过胰岛素受体底物-2/PI 3-激酶/AKT途径促进髓样祖细胞的存活。IL10R的激活导致JAK1和TYK2激酶的酪氨酸磷酸化。已经发现了该基因的两种转录变体，一种编码蛋白质和另一种不编码蛋白质。许多物种的IL10R的序列是已知的，例如人IL10R(NCBI基因ID:3587)多肽(例如NCBI Ref Seq NP_001549.2)和mRNA(例如NCBI Ref Seq NM_001558.3)。IL10R可以指人IL10R，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。IL10R是指例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的哺乳动物IL10R。SEQIDNO:3的核酸序列包括编码IL10R的核酸序列。

SEQ ID NO:3是编码IL10R的核苷酸序列。

可溶性或野生型形式的转化生长因子β受体II(TGFBRII)是由该基因编码的蛋白质，当与TGF-β结合时与II型TGF-β受体形成异聚复合物，将TGF-β信号从细胞表面转导到细胞质。许多物种的TGFBRII的序列是已知的，例如人TGF-BRII(NCBI基因ID:7048)多肽(例如NCBI Ref Seq NP_001020018.1)和mRNA(例如NCBI Ref Seq NM_001024847.2)。TGFBRII可以指人TGFBRII，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。TGFBRII是指例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪等的哺乳动物TGFBRII。SEQ ID NO:4的核酸序列包括编码TGFBRII的核酸序列。

SEQ ID NO:4是编码TGFBRII的核苷酸序列。

结合PD-1或其配体PD-1的抗体或抗体试剂被描述于例如美国专利第7,488,802号；第7,943,743号；第8,008,449号；第8,168,757号；第8,217,149号，以及PCT公布专利申请第WO03042402号、第WO2008156712号、第WO2010089411号、第WO2010036959号、第WO2011066342号、第WO2011159877号、第WO2011082400号和第WO2011161699号中；它们通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，PD-1抗体包括纳武单抗(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538)，全人IgG4抗体，其结合PD-1并通过PD-1的配体PD-Ll和PD-L2阻断PD-1的激活；lambrolizumab(MK-3475或SCH 900475)，针对PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，一种结合PD-1的人源化抗体；AMP-224，B7-DC的融合蛋白；抗体Fc部分；BMS-936559(MDX-1105-01)，用于PD-L1(B7-H1)阻断。本文还特别考虑了破坏或阻断PD-1与PD-L1之间相互作用的试剂(如高亲和性PD-1拮抗剂)。

PD-1抗体的非限制性实例包括：派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)；纳武单抗(Bristol Meyers Squibb)；匹地利珠单抗(pidilizumab)(Medivation)；以及AUNP12(Aurigene)。PD-L1抗体的非限制性实例可以包括阿特珠单抗(atezolizumab)(Genentech)；MPDL3280A(Roche)；MEDI4736(AstraZeneca)；MSB0010718C(EMD Serono)；阿维单抗(avelumab)(Merck)；以及德瓦鲁单抗(durvalumab)(Medimmune)。

结合OX40(也称为CD134)的抗体被描述于例如美国专利第US9006399号、第US9738723号、第US9975957号、第US9969810号、第US9828432号；PCT公布的专利申请：第WO2015153513号、第WO2014148895号、第WO2017021791号、第WO2018002339号；以及美国申请：第US20180273632号；第US20180237534号；第US20180230227号；第US20120269825号中；它们通过引用整体并入本文。

结合CTLA-4的抗体被描述于例如美国专利第US9714290号、第US6984720号、第US7605238号、第US6682736号、第US7452535号；PCT公布的专利申请：第WO2009100140号；以及美国申请：第US20090117132A号、第US20030086930号、第US20050226875号、第US20090238820号中；它们通过引用整体并入本文。CTLA-4抗体的非限制性实例包括：伊匹木单抗(Bristol-Myers Squibb)。

结合TIM3的抗体被描述于例如美国专利第US8552156号、第US9605070号、第US9163087号、第US8329660号；PCT公布的专利申请：第WO2018036561号、第WO2017031242号、第WO2017178493号；以及美国申请：第US20170306016号、第US20150110792号、第US20180057591号、第US20160200815号中；它们通过引用整体并入本文。

结合TIGIT(也被称为CD134)的抗体描述于例如美国专利：递US 10017572号、第US9713641号；PCT公布的专利申请：第WO2017030823号；以及美国申请：第US20160355589号、第US20160176963号、第US20150322119号中；它们通过引用整体并入本文。

结合白细胞介素10受体(IL10R)(例如，可溶性或野生型)的抗体描述于例如美国专利第7553932号；以及美国申请：第US20040009939号、第US20030138413号、第US20070166307号、第US20090087440号和第US201000028450号中，它们通过引用整体并入本文。

结合TGFBRII(例如，可溶性或野生型)的抗体描述于例如美国专利第6497729号；以及美国申请：第US2012114640号、第US20120021519号中，它们通过引用整体并入本文。

另一方面提供了溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其包含不编码功能性ICP0或ICP34.5并编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列的重组DNA。

包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA不编码功能性ICP0和ICP34.5基因；并且编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

另一方面提供了包含重组DNA的溶瘤HSV，所述重组DNA不编码功能性ICP0，并且编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

另一方面提供了溶瘤HSV，其编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

又一方面提供了重组病毒，其编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

在一个实施方案中，本文所述的任一溶瘤HSV还编码促进融合的活性。

本文所述的本发明的一个方面提供了包含本文所述的溶瘤HSV中的任一种的组合物。在一个实施方案中，所述组合物是药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体(例如制药工业中常用的载体)组合的活性剂。

在一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域众所周知的，并且包括水性溶液(如生理缓冲盐水)或其它溶剂或媒介物，诸如二醇类、甘油、植物油(例如橄榄油)或可注射有机酯。药学上可接受的载体可以被用于将本发明的组合物施用至体外细胞或体内对象。药学上可接受的载体可以含有生理学上可接受的化合物，其起作用例如以稳定组合物或增加试剂的吸收。生理学上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。其它生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，它们特别可用于防止微生物的生长或作用。多种防腐剂是众所周知的，并且包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员将知道，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如溶瘤HSV的施用途径。

杂合核酸

本文所提供的另一方面是含有治疗性抗体和显性失活TGFβ的序列的杂合核酸序列，其中显性失活TGFβ与治疗性抗体的Fc结构域融合。

本文所提供的另一方面是含有治疗性抗体和mmTGF-β2-7M片段的序列的杂合核酸序列，其中mmTGF-β2-7M与治疗性抗体的Fc结构域融合。

在一个实施方案中，治疗性抗体序列是免疫治疗性抗体的序列。例如，治疗性抗体序列是可以选自以下的序列：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗抗CTLA4抗体以及抗TDM-1抗体和抗TIGIT抗体。上文描述了此类治疗性抗体。

本文还提供了由本文所述的杂合核酸中的任一种编码的多肽。

本文还提供了表达本文所述的杂合核酸中的任一种的载体。

嵌合抗原受体

本文所述的技术提供了用于治疗癌症的改进的CAR。下面讨论CAR和各种改进。

本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指经工程化的T细胞受体，其将配体或抗原特异性移植到T细胞上(例如天然T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合)。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。

CAR将特异性结合在T细胞应答所靶向的细胞的表面表达的靶标(例如多肽)的嵌合胞外靶标结合结构域置于构建体上，所述构建体包括T细胞受体分子的跨膜结构域和胞内结构域。在一个实施方案中，嵌合胞外靶标结合结构域包含特异性结合在T细胞应答所靶向的细胞上表达的抗原的抗体的抗原结合结构域。CAR的细胞内信号传导结构域的特性可以如本领域已知的和如本文所公开的那样变化，但是当嵌合靶标/抗原结合结构域结合靶向的细胞表面上的靶标/抗原时，嵌合靶标/抗原结合结构域使受体对信号传导激活敏感。

关于细胞内信号传导结构域，所谓的“第一代”CAR包括在抗原结合时仅提供CD3ζ信号的那些CAR。所谓的“第二代”CAR包括同时提供共刺激(例如，CD28或CD137)和激活(CD3ζ)结构域的那些CAR，并且所谓的“第三代”CAR包括提供多个共刺激(例如，CD28和CD137)结构域和激活结构域(例如CD3ζ)的那些CAR。在各种实施方案中，CAR被选择为对靶标/抗原()具有高亲和力或亲合力，例如，抗体衍生的靶标或抗原结合结构域通常将对靶抗原具有比天然存在的T细胞受体更高的亲和力和/或亲合力。这种特性与高特异性相结合，可以选择抗体来提供CAR T细胞的高特异性T细胞靶向。

如本文所用，“CAR T细胞”或“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。当在T细胞中表达时，CAR具有利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性方式将T细胞特异性和反应性重定向到选择的靶标的能力。非MHC限制性抗原识别使表达CAR的T细胞具有识别不依赖于抗原加工的抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。

如本文所用，术语“细胞外靶标结合结构域”是指在细胞外部发现的多肽，其足以促进与靶标的结合。细胞外靶结合结构域将特异性结合其结合配偶体(即靶标)。作为非限制性实例，细胞外靶标结合结构域可以包括编码显性失活肽、抗体的抗原结合结构域或配体的序列，其识别并结合同源结合配偶体(例如TGFβ)蛋白。

在一个实施方案中，CAR是双特异性CAR。例如，CAR在其细胞外结构域中包含显性失活TGFβ序列(例如,mmTGF-β2-7M片段)；以及治疗性抗体(例如抗PD1抗体、抗CTLA4抗体或抗TIM3抗体)的序列。

跨膜结构域

本文所述的每个CAR必然包括将细胞外靶标结合结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域。

如本文所用，“跨膜结构域”(TM结构域)是指CAR的通常疏水的区域，其穿过细胞的质膜。TM结构域可以是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白或其它跨膜蛋白)、人工疏水序列或其组合的跨膜区或其片段。虽然本文提供了并在实施例中使用了具体的实施例，但是其它跨膜结构域对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且可以与本技术的替代实施方案结合使用。选定的跨膜区或其片段优选不干扰CAR的预期功能。如关于蛋白质或多肽的跨膜结构域所使用的，“其片段”是指足以将蛋白质锚定或附着到细胞表面的跨膜结构域的一部分。

在一个实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域或其片段包含选自以下的跨膜结构域的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。

在一个示例性实施方案中，CAR的跨膜结构域或其片段衍生自CD8的跨膜结构域或包含CD8的跨膜结构域。CD8是优先在细胞毒性T淋巴细胞的细胞表面上发现的抗原。CD8介导免疫系统内的细胞-细胞相互作用，并作为T细胞共受体。CD8由α(CD8α)和β(CD8β)链组成。许多物种的CD8α序列是已知的，例如人CD8α(NCBI Gene ID:925)多肽(例如，NCBI RefSeq NP_001139345.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_000002.12)。CD8可以指人CD8，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任一方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，CD8可以指例如狗、猫、牛、马、猪等的CD8。针对此类物种，本领域技术人员容易鉴定出人CD8的同源物和/或直系同源物，例如使用NCBI直系同源物搜索功能，或在给定物种的可用序列数据中搜索与参比CD8序列相似的序列。

共刺激结构域

本文所述的CAR可包含共刺激分子的细胞内结构域或共刺激结构域。如本文所用，术语“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子，其在与抗原结合时提供T淋巴细胞的有效激活和功能所需的第二信号。此类共刺激分子的说明性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2CSLP76、TRIM和ZAP70。

在一个示例性实施方案中，细胞内结构域是4-1BB的细胞内结构域。4-1BBL是属于TNF超家族的2型跨膜糖蛋白。4-1BBL在激活的T淋巴细胞上表达。许多物种的4-1BBL序列是已知的，例如人4-1BBL(也被称为TNFSF9)(NCBI基因ID:8744)多肽(例如，NCBI Ref SeqNP_003802.1)和mRNA(例如，NCBI Ref Seq NM_003811.3)。4-1BBL可以指人4-1BBL，包括其天然存在的变体、分子和等位基因。在任一方面的一些实施方案中，例如在兽医应用中，4-1BBL可指例如狗、猫、牛、马、猪等的4-1BBL。针对此类物种，本领域技术人员容易鉴定出人4-1BBL的同源物和/或直系同源物，例如使用NCBI直系同源物搜索函数或在给定物种的可用序列数据中搜索类似于参考4-1BBL序列的序列。

细胞内信号传导结构域

如本文所述的CAR可包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指参与将有效CAR结合至靶抗原的信息转导至免疫效应细胞的内部以引起效应细胞功能(例如，激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括细胞毒性因子释放至CAR结合的靶细胞，或在抗原结合至细胞外CAR结构域之后引起的其它细胞应答)的CAR多肽的部分。

CD3是T细胞共受体，当与适当的共刺激(例如，共刺激分子的结合)同时进行时，其促进T淋巴细胞激活。CD3复合体由4条不同的链组成；哺乳动物的CD3由一条CD3γ链、一条CD3δ链和两条CD3ε链组成。这些链与被称为T细胞受体(TCR)和CD3ζ的分子缔合以在T淋巴细胞中产生激活信号。完整的TCR复合体包括TCR、CD3ζ和完整的CD3复合体。

在任一方面的一些实施方案中，本文所述的CAR多肽包含细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含来自CD3ζ的基于免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM。在任一方面的一些实施方案中，ITAM包含CD3ζ的ITAM的三个基序(ITAM3)。

ITAM被称为初级信号结构域，其以刺激方式或抑制方式调节TCR复合体的初级激活。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。本技术中特别使用的含有ITAM的细胞内信号传导结构域的非限制性实例包括衍生自以下的那些细胞内信号传导结构域：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、

、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

在一个实施方案中，CAR还包含连接子结构域。如本文所用的“连接子结构域”是指长度为约2至100个氨基酸的寡肽或多肽区域，其将如本文所述的CAR的结构域/区域中的任一种连接在一起。在一些实施方案中，连接子可包括柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)或由柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)组成，使得相邻的蛋白质结构域可相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域不会在空间上相互干扰时，可以使用更长的连接子。连接子可以是可切割的或不可切割的。可裂解连接子的实例包括2A连接子(例如T2A)、2A样连接子或其功能等同物及它们的组合。在一个实施方案中，连接子区是衍生自Thosea asigna病毒的T2A。可用于本技术的连接子的非限制性实例包括P2A和F2A。

CAR和CAR T细胞的更详细的描述可以发现于Maus等人，Blood 2014 123:2624-35；Reardon等人，Neuro-Oncology 2014 16:1441-1458；Hoyos等人，Haematologica 201297:1622；Byrd等人，J Clin Oncol 2014 32:3039-47；Maher等人，Cancer Res 2009 69:4559-4562；和Tamada等人，Clin Cancer Res 2012 18:6436-6445；它们各自通过引用整体并入本文。

本文所提供的另一方面是编码本文所述的CAR多肽中的任一种的核酸。

细胞

本文提供了包含本文所述的溶瘤病毒或重组病毒中的任一种的细胞或其群体。

本文提供了包含杂合核酸、编码杂合核酸的多肽、或表达杂合核酸或编码杂合核酸的多肽的载体中任一种的细胞或其群体。

本文还提供了包含本文所述的任一CAR多肽或编码CAR多肽的任一核酸的细胞或其群体。

在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，细胞是人细胞。在一个实施方案中，细胞是非人哺乳动物细胞。

在一个实施方案中，细胞是T细胞。在一个实施方案中，所述细胞是CAR T细胞。

在一个实施方案中，细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞是造血来源的并且包括淋巴细胞，诸如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；髓样细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞；NK细胞；NKT细胞；淋巴细胞，诸如B细胞和T细胞；以及髓样细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。

在一个实施方案中，细胞获自患有或被诊断患有癌症的个体。

在一个实施方案中，细胞是CAR T细胞。

在一个实施方案中，细胞是双特异性CAR T细胞，意思是包含多于一种CAR多肽。例如，CAR T细胞包含具有细胞外结构域(其包含显性失活TGFβ序列(例如mmTGF-β2-7M片段))的CAR多肽和包含细胞外结构域(其包含治疗性抗体(例如，抗PD1抗体、抗CTLA4抗体或抗TIM3抗体)的序列)的第二CAR多肽。

在某些实施方案中，细胞具有高水平的显性失活TGFβ，例如mmTGF-β2-7M。显性失活TGFβ的表达水平可以由本领域技术人员确定，例如，通过蛋白质印迹或基于PCR的测定来分别评估显性失活TGFβ的蛋白质或mRNA水平。

治疗方法

本文所述的溶瘤病毒、杂合核酸和CAR T细胞或其组合物可被施用于患有癌症的对象。在某些实施方案中，在适当的情况下，调节溶瘤病毒的tet操纵子的试剂还与本文所述的溶瘤病毒或其组合物一起施用。示例性的试剂包括但不限于强力霉素或四环素。

一个方面提供了治疗癌症的方法，所述方法包括使T细胞工程化以在T细胞表面上包含本文所述的CAR多肽或编码CAR多肽的核酸中的任一种；以及将工程化的T细胞施用于对象。

在一个实施方案中，癌症是实体瘤。实体瘤可以是恶性的或良性的。在一个实施方案中，对象被诊断患有或已经被诊断患有癌、黑色素瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。示例性癌症包括但决不限于：非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌和胰腺癌。在一个实施方案中，癌症是转移性的。这些类型的癌症是本领域已知的，并且可以由熟练的临床医生使用本领域已知的标准技术来诊断，例如血液分析、血细胞计数分析、组织活检、非侵入性成像和/或家族史的回顾。

在肿瘤容易接近的情况下，例如皮肤、口腔的肿瘤或由于手术而可接近的肿瘤，可以局部应用病毒。在其它情况下，可以通过注射或输注施用。在感染之前或感染时，使用的调节tet操纵子和tetR相互作用的试剂(例如强力霉素或四环素)也可以以这种方式施用，或者可以全身性施用(例如口服施用)。

虽然在前面的描述中提供了某些施用途径，但根据本发明，可以修改载体的任何合适的施用途径，因此上文所述的施用途径不旨在是限制性的。施用途径可以包括但不限于静脉内、区域动脉输注、口服、颊、鼻内、吸入、局部应用至粘膜或注射，包括瘤内、皮内、鞘内、脑池内、病灶内或任何其它类型的注射。施用可以连续或间歇地进行，并且将随对象和待治疗的病况而变化。本领域技术人员将容易理解，本文所述的各种施用途径将允许本发明的载体或组合物在肿瘤或靶癌细胞上、中或附近递送。本领域技术人员也将容易理解，本文所述的各种施用途径将允许本文所述的载体和组合物被递送至待治疗的肿瘤或个体细胞附近的区域。“在附近”可以包括对象中的任何组织或体液，所述组织或体液与肿瘤或个体癌细胞足够接近，使得施用至对象的载体或组合物的至少一部分到达其预期靶标并发挥其治疗作用。

在施用前，可以将溶瘤病毒悬浮在任何药学上可接受的溶液中，包括无菌等渗盐水、水、磷酸盐缓冲盐水、1,2-丙二醇、与水混合的聚乙二醇、林格氏溶液等。待施用的病毒的确切数量对于本发明来说不是关键的，但应该是“有效量”，即足以引起足够广泛的细胞裂解以对释放的肿瘤抗原产生免疫应答的量。由于病毒在感染后在细胞中复制，因此最初施用的数量将随着时间迅速增加。因此，通过改变允许病毒复制的时间(即细胞暴露于四环素的时间)，最初施用病毒的广泛不同的量可以产生相同的结果。通常，预期最初施用的病毒的数量(PFU)将为1x10⁶至lx10¹⁰。

四环素或强力霉素将在感染时或感染前1-72h局部或全身性施用以诱导病毒复制。待施用的四环素或强力霉素的量将取决于递送途径。在体外，1μg/ml的四环素足以允许病毒在感染的细胞中复制。因此，当局部递送时，可以施用含有0.1μg/ml至100μg/ml的任何溶液。然而，如果期望，可以使用高得多剂量的四环素或强力霉素(例如，1-5mg/ml)。单次局部给予的总量将取决于接受治疗的一个或多个肿瘤的大小，但通常，预期一次使用0.5至200ml四环素或强力霉素溶液。当全身性给予时，将给予更高剂量的四环素或强力霉素，但预期所需的总量将显著小于通常用于治疗细菌感染的量(例如，在强力霉素的情况下，在成人中，通常为1-2克/天，分为2-4个等剂量；在儿童中，每天2.2-4.4mg/千克体重，可分为至少2个剂量)。预期在大多数情况下，5-100mg/天应该是有效的。四环素和强力霉素的剂量在本领域中是众所周知的，并且最好可以由熟练的临床医生针对给定患者确定。

在一些实施方案中，如本文所述的包含CAR T细胞的药物组合物可以是肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的施用通常绕过患者对污染物的天然防御，所以除CAR T细胞本身之外的组分优选是无菌的或能够在施用于患者之前进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备溶解或悬浮在药学上可接受的注射用媒介物中的干燥产品、准备注射的悬浮液和乳液。可以在施用前将这些中的任一种添加到CAR T细胞制剂中。

可用于提供本领域所公开的CAR T细胞的肠胃外剂型的合适载体为本领域技术人员所熟知。实例包括但不限于：盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物，其包括但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸化林格氏注射液；水混溶性媒介物，诸如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性媒介物，诸如但不限于玉米油、棉花籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

在一些实施方案中，本文所述的CAR T细胞作为单一疗法施用，即，不同时向对象施用对病况的另一治疗。

包含本文所述的T细胞的药物组合物通常可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重，在一些情况下为10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量施用，包括在那些范围内的所有整数值。如果需要，T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)。

在某些方面，可能需要对对象施用CAR T细胞，然后再抽血(或进行单采术)，如本文所述激活T细胞，并用这些激活和扩增的T细胞再输注患者。该过程可以每几周进行多次。在某些方面，T细胞可以从10cc至400cc的抽血中激活。在某些方面，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血激活。

施用模式可包括例如静脉内(i.v.)注射或输注。本文所述的组合物可经动脉、瘤内、结内或髓内施用于患者。在一些实施方案中，T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在一个实施方案中，将本文所述的组合物施用至体腔或体液(例如，腹水、胸膜液、腹膜液或脑脊髓液)中。

如本文所用，术语“治疗有效量”旨在意指发挥溶瘤活性，引起肿瘤细胞增殖的衰减或抑制，导致肿瘤消退的载体的量。有效量将根据待治疗的病理或病况、患者及其状态以及本领域技术人员众所周知的其它因素而变化。本领域技术人员容易确定有效量。在一些实施方案中，治疗范围是一次引入10³至10¹²个噬菌斑形成单位。在一些实施方案中，在上述治疗范围内的治疗剂量通过瘤内、鞘内、对流增强的、静脉内或动脉内途径以每天到每月的间隔施用。

组合疗法

本文所述的溶瘤病毒和CAR T细胞可与其它已知的试剂和疗法组合使用。在一个实施方案中，向对象进一步施用抗癌疗法。本文所用的“组合”施用意指在对象罹患病症的过程中向对象递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在对象已被诊断患有病症之后并且在病症已被治愈或消除之前或由于其它原因治疗已停止之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，一种治疗的递送仍然在第二治疗的递送开始时发生，从而在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其它实施方案中，一次治疗的递送在另一次治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于联合施用，治疗更有效。例如，与在没有第一治疗的情况下施用第二治疗相比，第二治疗更有效，例如，在第二治疗较少的情况下观察到等效效果，或者第二治疗将症状减轻到更大的程度，或者在第一治疗的情况下观察到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的降低大于在不存在另一种的情况下递送的一种治疗所观察到的。两种治疗的效果可以是相加的、完全相加的或大于相加的。递送可以是这样的：当递送第二治疗剂时，递送的第一治疗的效果仍然是可检测的。本文所述的溶瘤病毒或CAR T细胞以及至少一种另外的治疗剂可以同时，在相同或分开的组合物中或依次施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的溶瘤病毒或CAR T细胞，可以其次施用另外的试剂，或者可以颠倒施用顺序。溶瘤病毒或CAR T细胞和/或其它治疗剂、程序或形式可以在活动性病症期间或缓解或较少活动性疾病期间施用。溶瘤病毒或CAR T细胞可在另一治疗之前，与治疗同时、治疗后或在病症缓解期间施用。

当组合施用时，溶瘤病毒或CAR T细胞和另外的试剂(例如，第二或第三试剂)或全部，可以以与单独使用(例如，作为单一疗法)的每种试剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施方案中，溶瘤病毒或CAR T细胞、另外的试剂(例如，第二或第三试剂)或全部的施用量或剂量比单独使用的每种试剂的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其它实施方案中，产生所期望的效果(例如，癌症的治疗)的溶瘤病毒或CAR T细胞、另外的试剂(例如，第二或第三试剂)或全部的量或剂量低于(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)实现相同治疗效果各自所需的每种试剂的量或剂量。在其它实施方案中，本文所述的溶瘤病毒或CAR T细胞可以与以下组合用于治疗方案中：手术、化疗、放射、mTOR途径抑制剂、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506)、抗体或其它免疫消除剂(例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子或肽疫苗(如描述于Izumoto等人，2008J Neurosurg 108:963-971)。

在一个实施方案中，本文所述的溶瘤病毒或CAR T细胞可与检查点抑制剂组合使用。示例性的检查点抑制剂包括抗PD-1抑制剂(纳武单抗，MK-3475，帕博利珠单抗(Pembrolizumas)，匹地利珠单抗，AMP-224，AMP-514)、抗CTLA4抑制剂(伊匹木单抗和曲美木单抗(Tremelimumab))、抗PDL1抑制剂(阿特珠单抗、阿维单抗(Avelomab)、MSB0010718C、MEDI4736和MPDL3280A)以及抗TIM3抑制剂。

在一个实施方案中，本文所述的溶瘤病毒或CAR T细胞可与化疗剂组合使用。示例性的化疗剂包括蒽环霉素(例如，阿霉素(例如，脂质体阿霉素))、长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪(decarbazine)、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢物(包括例如,叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克那霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂(如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺))。被认为用于组合疗法的一般化疗剂包括阿那曲唑

比卡鲁胺

硫酸博来霉素

白消安注射剂

卡培他滨

N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂

卡莫司汀

苯丁酸氮芥

顺铂

克拉屈滨

环磷酰胺(

或

)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside，

)、阿糖胞苷脂质体注射剂

达卡巴嗪(DTIC-

)、更生霉素(放线菌素D，

)、盐酸道诺霉素

柠檬酸道诺霉素脂质体注射剂

地塞米松、多西他赛

盐酸阿霉素

依托泊苷

磷酸氟达拉滨

5-氟尿嘧啶

氟他胺

替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(二氟脱氧胞苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲

伊达比星

异环磷酰胺

伊立替康

L-天冬酰胺酶

亚叶酸钙、美法仑

6-巯基嘌呤

甲氨蝶呤

米托蒽醌

麦罗塔、紫杉醇

phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、具有卡莫司汀植入物

的聚苯丙生20、枸橼酸他莫昔芬

替尼泊苷

6-硫鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明

注射用盐酸拓扑替康

长春花碱

长春新碱

和长春瑞滨

示例性的烷基化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶氮芥(

(Aminouracil

)、

尿嘧啶氮芥

尿嘧啶氮芥

(Uracil nitrogen

)、

氮芥(chlormethine)

环磷酰胺(

Revimmune^TM)、异环磷酰胺

美法仑

苯丁酸氮芥

哌泊溴烷

三乙撑蜜胺

三亚乙基硫代磷胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺

噻替派

白消安

卡莫司汀

洛莫司汀

链脲菌素

和达卡巴嗪(DTIC-

)。另外的示例性烷基化剂包括但不限于奥沙利铂

替莫唑胺(

和

)；更生霉素(也被称为放线菌素D，

)；美法仑(也被称为L-PAM、L-霉法兰和苯丙氨酸芥、

)；六甲密胺(也被称为六甲基三聚氰胺(HMM)、

)；卡莫司汀

苯达莫司汀

白消安(

和

)；卡铂

罗氮芥(也被称为CCNU、

)；顺铂(也被称为CDDP、

和

-AQ)；苯丁酸氮芥

环磷酰胺(

或

)；达卡巴嗪(也被称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、DTIC-

)；甲密胺(也被称为六甲基三聚氰胺(HMM)、

)；异环磷酰胺

泼尼莫司汀(Prednumustine)；甲基苄肼

双氯乙基甲胺(Mechlorethamine、也被称为氮芥、氮芥和盐酸双氯乙基甲胺、

)；链脲菌素

噻替派(也被称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、

)；环磷酰胺

和苯达莫司汀HCl

示例性的mTOR抑制剂包括，例如西罗莫司脂化物；地磷莫司(形式上被称为去铁莫司，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2][(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]六三氮杂-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也被称为AP23573和MK8669，并且描述于PCT公开第WO03/064383号中)；依维莫司(

或RADOOl)；雷帕霉素(AY22989、

)；西马莫德(simapimod，CAS 164301-51-3)；emsirolimus(5-{2，4-双[(35)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2，3-(i]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[iraw5,4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-JJ嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬酰胺基-L-丝氨酸-(SEQID NO:29)、内盐(SF1126,CAS 936487-67-1)和XL765。示例性免疫调节剂包括例如afutuzumab(可得自

)；乙二醇化非格司亭

来那度胺(CC-5013、

)；沙利度胺

actimid(CC4047)；和IRX-2(人细胞因子的混合物，包括白介素1、白介素2和干扰素γ,CAS 951209-71-5，可得自IRX Therapeutics)。示例性蒽环类包括例如阿霉素(

和

)；博来霉素

道诺霉素(道诺霉素盐酸盐、道诺霉素和红比霉素盐酸盐、

)；道诺霉素脂质体(柠檬酸道诺霉素脂质体，

)；米托蒽醌(DHAD、

)；表柔比星(Ellence^TM)；伊达比星(

Idamycin

)；丝裂霉素C

格尔德霉素；除莠霉素；雷维霉素(ravidomycin)；和脱乙酰雷维霉素。示例性的长春花生物碱包括，例如，酒石酸长春瑞滨

长春新碱

和长春地辛

长春碱(也被称为硫酸长春花碱(vinblastine sulfate/vincaleukoblastine)和VLB、Alkaban-

和

)；和长春瑞滨

示例性蛋白体抑制剂包括硼替佐米

卡非佐米(PX-171-007、(S)-4-甲基-N-((5)-1-((5)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((5)-2-(吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；Marizomib(NPT0052)；枸橼酸伊沙佐米(MLN-9708)；地兰佐米(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(11S’)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。

本领域技术人员可以容易地鉴定使用的化学治疗剂(例如，参见医师癌症化疗药物手册2014(Physicians’Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014)，Edward Chu,Vincent T.DeVita Jr.,Jones&Bartlett Learning；癌症治疗原则(Principles ofCancer Therapy),哈里森的内科学原理中的第85章(Chapter 85in Harrison'sPrinciples of Internal Medicine)，第18版；癌细胞的治疗靶向：分子靶向药物和癌症药理学的时代(Therapeutic Targeting of Cancer Cells:Era of Molecularly TargetedAgents and Cancer Pharmacology)，Abeloff的临床肿瘤学中的Chs.28-29(Chs.28-29inAbeloff’s Clinical Oncology)，2013Elsevier；和Fischer D S(编辑):癌症化疗手册(The Cancer Chemotherapy Handbook),第4版，St.Louis,Mosby-Year Book,2003)。

在一个实施方案中，将本文所述的溶瘤病毒或CAR T细胞与降低靶向GITR和/或调节GITR功能的分子、降低Treg细胞群的分子、mTOR抑制剂、GITR激动剂、激酶抑制剂、非受体酪氨酸激酶抑制剂、CDK4抑制剂和/或BTK抑制剂组合施用于对象。

功效

溶瘤病毒或CAR T细胞在例如治疗本文所述的病况或诱导如本文所述的应答(例如，癌细胞减少，肿瘤大小缩小)中的功效可以由熟练的临床医师确定。然而，如本文所用的术语治疗被认为是“有效治疗”，如果本文所述的病况的一种或多种病征或症状以有益的方式改变，则其它临床上接受的症状得到改善，或甚至改进，或例如在根据本文所述的方法治疗后诱导期望的应答至少10％。功效可例如通过测量根据本文所述的方法或任何其它合适的可测量参数治疗的病况的标志物、指标、症状和/或发病率来评估。根据本文所述的方法的治疗可以降低病况的标志物或症状的水平，例如降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。

功效还可以通过个体不能恶化来测量，如通过住院治疗或需要医学干预(即，疾病的进展停止)所评估的。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或本文所述的。

治疗包括在个体或动物(一些非限制性实例包括人或动物)中对疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如预防症状(例如疼痛或炎症)的恶化；或(2)减轻疾病的严重性，例如引起症状的消退。用于治疗疾病的有效量是指当向有需要的对象施用时足以使得如本文所定义的该术语用于该疾病的有效治疗的量。试剂的功效可通过评估病款或所期望应答的物理指标来确定。本领域技术人员通过测量此类参数中的任一个或参数的任意组合来监测施用和/或治疗的效力是完全在本领域技术人员的能力范围内的。给定方法的功效可以在本文所述的病况(例如ALL的治疗)的动物模型中评估。当使用实验动物模型时，当观察到标记物的统计学显著变化时，证明了治疗的功效。

所有专利和其它出版物；包括参考文献、公布的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请；为了描述和公开例如在此类出版物中所述的可能与本文描述的技术结合使用的方法，在整个本申请中引用的内容通过引用明确地并入本文。在本申请的申请日之前，这些出版物仅用于它们的公开。在这一点上，不应将任何东西解释为承认发明人不具有借助于现有技术或出于任何其它原因而先于此类公开的权利。关于这些文件的内容的日期或表示的所有声明都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何认可。

本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。虽然本文出于说明目的描述了本公开的具体实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内，各种等同的修改是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是替换实施方案可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文所提供的本公开的教导可适用于其它程序或方法。本文所述的各种实施方案可经组合以提供其它实施方案。如果需要，可以修改本公开的方面，以采用上述参考文献和申请的组成、功能和概念来提供本公开的其它实施方案。此外，由于生物功能等同的考虑，可以在蛋白质结构上进行一些改变，而不会在种类或量上影响生物或化学作用。根据详细描述，可以对本公开进行这些和其它改变。所有这些修改都旨在包括在所附权利要求的范围内。

在其它实施方案中，任何前述实施方案的特定元件可组合或替代元件。此外，虽然已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优势，但是其他实施方案也可以呈现这些优势，并且不是所有实施方案都必须呈现落入本公开的范围内的这些优势。

本文所述的技术通过以下实施例进一步说明，这些实施例决不应被解释为进一步限制。

在以下编号的段落中可以进一步描述本文提供的本发明。

1.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：

a)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；

b)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；

c)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；

d)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；

e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL26基因和UL27基因的基因间区域，

其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP0并且不含有位于VP5的所述5’非翻译区中的核酶序列。

2.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：

e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL21基因和UL22基因的基因间区域，

3.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：

e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

f)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL26基因、UL27基因、UL21基因和UL21基因的基因间区域，

4.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中(f)的基因序列是LacZ基因序列。

5.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中(f)的基因序列是显性失活的TGF-β突变序列。

6.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述显性失活TGF-β突变序列是mmTGF-β2-7M片段序列。

7.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中(f)的启动子是经修饰的HSV立即早期启动子、HCMV立即早期启动子或人类延长α启动子。

8.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述变异基因是编码选自以下的氨基酸取代的gK变异基因：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸40的Ala至Thr的氨基酸取代；对应于SEQID NO:2的氨基酸40的Ala至“x”的氨基酸取代，其中“x”是任意氨基酸；对应于SEQ ID NO:2的氨基酸99的Asp至Asn的氨基酸取代；对应于SEQ ID NO:2的氨基酸304的Leu至Pro的氨基酸取代；以及对应于SEQ ID NO:2的氨基酸310的Arg至Leu的氨基酸取代。

9.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述四环素操纵子序列包含两个Op2阻遏物结合位点。

10.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述VP5启动子是HSV-1或HSV-2的VP5启动子。

11.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述立即早期启动子是HSV-1或HSV-2的立即早期启动子。

12.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述HSV立即早期启动子选自：ICP0启动子、ICP4启动子和ICP27启动子。

13.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述重组DNA是HSV-1基因组的一部分。

14.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述重组DNA是HSV-2基因组的一部分。

15.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其还包含药学上可接受的载体。

16.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其还编码能够提高所述溶瘤HSV诱导抗肿瘤特异性免疫的功效的至少一种多肽。

17.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述至少一种多肽编码选自以下的产物：白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)、白细胞介素15(IL15)、抗PD-1抗体或抗体试剂、抗PD-L1抗体或抗体试剂、抗OX40抗体或抗体试剂、CTLA-4抗体或抗体试剂、TIM-3抗体或抗体试剂、TIGIT抗体或抗体试剂、可溶性白细胞介素10受体(IL10R)、可溶性IL10R与IgG-Fc结构域之间的融合多肽、可溶性TGFβII型受体(TGFBRII)、可溶性TGFBRII与IgG-Fc结构域之间的融合多肽、抗IL10R抗体或抗体试剂、抗IL10抗体或抗体试剂、抗TGFBRII抗体或抗体试剂以及抗TGFBRII抗体或抗体试剂。

18.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV还编码促进融合的活性。

19.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：

e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

f)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL26基因和UL27基因的基因间区域，

20.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：

e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

f)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL21基因和UL22基因的基因间区域，

21.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA包含：

e)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

f)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL21基因、UL22基因、UL26基因和UL27基因的基因间区域，

22.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述显性失活TGF-β突变序列是mmTGF-β2-7M片段序列。

23.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中(f)的HSV-2立即早期启动子选自ICP0、ICP4和ICP27。

24.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中(f)的HSV-2立即早期启动子含有tet操纵子。

25.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述HSV是可调节的四环素或强力霉素。

26.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA不编码功能性ICP0基因或ICP34.5基因；并且编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

27.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA不编码功能性ICP0；并且编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

28.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述HSV还编码促进融合的活性。

29.如任何前述段落所述的溶瘤HSV，其中所述HSV是可调节的四环素或强力霉素。

30.溶瘤病毒，其编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

31.重组病毒，其编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

32.组合物，其包含任何前述段落所述的病毒。

33.如任何前述段落所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。

34.细胞，其表达任何前述段落所述的病毒或权利要求32-33所述的组合物中的任一种。

35.如任何前述段落的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

36.如任何前述段落所述的细胞，其中所述细胞是癌细胞或免疫细胞。

37.如任何前述段落的细胞，其中所述免疫细胞是B细胞或T细胞。

38.如任何前述段落所述的细胞，其中所述细胞表达高水平的mmTGF-β2-7M。

39.用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的对象施用任何前述段落所述的病毒或任何前述段落所述的组合物。

40.如任何前述段落所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。

41.如任何前述段落所述的方法，其中所述肿瘤是良性的或恶性的。

42.如任何前述段落所述的方法，其中所述对象被诊断为或已经被诊断为患有选自以下的癌症：癌、黑色素瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。

43.如任何前述段落所述的方法，其中所述对象被诊断为或已经被诊断为患有选自以下的癌症：非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌和胰腺癌。

44.如任何前述段落所述的方法，其中所述癌症是转移性的。

45.如任何前述段落所述的方法，其还包括施用调节所述含有tet操纵子的启动子的试剂。

46.如任何前述段落所述的方法，其中所述试剂是强力霉素或四环素。

47.如任何前述段落所述的方法，其中所述试剂是局部或全身性施用的。

48.如任何前述段落所述的方法，其中所述全身性施用是口服施用。

49.如任何前述段落所述的方法，其中所述病毒或组合物被直接施用于所述肿瘤。

50.含有治疗性抗体和mmTGF-β2-7M的序列的杂合核酸序列，其中mmTGF-β2-7M与所述治疗性抗体的Fc结构域融合。

51.如任何前述段落所述的杂合核酸序列，其中所述治疗性抗体序列是免疫治疗性抗体的序列。

52.如任何前述段落所述的杂合核酸序列，其中所述治疗性抗体序列是选自以下的序列：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗抗CTLA4抗体和抗TDM-1抗体以及抗TIGIT抗体。

53.多肽，其由任何前述段落所述的杂合核酸编码。

54.载体，其表达任何前述段落所述的杂合核酸或任何前述段落所述的多肽中的任一种。

55.嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含以下中的至少一种：

a.包含显性失活TGF-β突变序列的细胞外结构域；

b.跨膜结构域；

c.共刺激结构域；和

d.细胞内信号传导结构域。

56.如任何前述段落所述的CAR多肽，其中所述显性失活TGF-β突变序列是mmTGF-β2-7M片段序列。

57.核酸，其编码任何前述段落所述的CAR多肽。

58.哺乳动物细胞，其包含：

a.任何前述段落所述的CAR多肽；或

b.任何前述段落的编码核酸。

59.如任何前述段落所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。

60.如任何前述段落所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。

61.如任何前述段落所述的细胞，其还包含至少第二CAR多肽。

62.如任何前述段落所述的细胞，其中所述至少第二CAR多肽包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含结合检查点抑制剂的序列。

63.如任何前述段落所述的细胞，其中所述检查点抑制剂选自：PD-L1、PD-1、TIGIT、TIM3和CTLA4。

64.如任何前述段落所述的细胞，其中所述细胞获自患有或被诊断患有癌症的个体。

65.治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用任何前述段落任一项所述的细胞。

66.治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括：

a.使T细胞工程化以在所述T细胞表面上包含任何前述段落所述的CAR多肽或任何前述段落所述的编码核酸；和

b.将工程化的T细胞施用于所述对象。

67.如任何前述段落所述的方法，其中所述工程化的T细胞还包含至少第二CAR多肽。

68.如任何前述段落所述的方法，其还包括施用至少一种另外的抗癌治疗剂。

69.包含重组DNA的溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)，其中所述重组DNA不编码功能性ICP0基因和ICP34.5基因；并且编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

实施例1

引言

免疫检查点阻断(ICB)代表用于治疗各种癌症的令人兴奋的新范例。然而，对ICB的应答率通常为10-35％(Bellmunt等人，2017；Powles等人，2018；Zou等人，2016)，使得更大比例的患者对ICB治疗无应答。免疫抑制肿瘤微环境是显著限制ICB在癌症免疫疗法中的有效性的主要障碍之一。TGF-β在促进和维持肿瘤微环境的免疫抑制状态中起关键作用(Bollard等人，2002；Gorelik and Flavell,2002；Loffek,2018；Massague,2008；Wrzesinski等人，2007；Zhang等人，2016)。已经在多种人类癌症类型中检测到TGF-β的过度表达，并且其与不良的预后相关(Calon等人，2015；Dong和Blobe,2006；Haque和Morris,2017；Lin和Zhao,2015；Mariathasan等人，2018；Massague,2008；Wikstrom等人，1998；Wrzesinski等人2007)。

研究已经揭示TGF-β抑制Th1应答和CD8+T细胞活性，同时促进CD4⁺CD25⁺T-reg细胞功能(Chen等人，2005；Fantini等人，2004；Loffek,2018；Mariathasan等人，2018；Tauriello等人，2018；Verrecchia和Redini,2018)。另外，TGF-β抑制树突细胞成熟和抗原呈递，以及NK细胞、M1巨噬细胞和N1嗜中性粒细胞的抗肿瘤活性(Fridlender等人，2009；Gong等人，2012；Krneta等人，2017；Loffek,2018；Luo等人，2006；Verrecchia和Redini,2018；Zhang等人，2016；Zheng等人，2017)。Mariathasan等人最近已经表明，TGF-β通过防止T细胞浸润来减弱对PD-L1免疫阻断的肿瘤应答，而阻断肿瘤微环境中的TGF-β信号传导导致抗肿瘤T细胞应答和肿瘤消退的强增强(Mariathasan等人，2018)。因此，抑制肿瘤微环境中的TGF-β信号传导已在癌症免疫疗法中获得显著兴趣(Bendle等人，2013；Biswas等人，2007；de Gramont等人，2017；Haque和Morris,2017；Hutzen等人，2017；Knudson等人，2018；Loffek,2018；Muraoka等人，2002；Strauss等人，2018)(Ahn Myung-ju、Barlesi F等人，2019-J Clinical Oncology-Abstract；Strauss J等人和Gulley J,2019-Cancer Res)。

多年来，已经开发了能够阻断TGF-β信号传导的各种分子，包括小分子、肽和可溶性形式的TGF-βII型受体(TβRII)和抗TGF-β1抗体(Biswas等人，2007；Bottinger等人，1997；de Gramont等人，2017；Gil-Guerrero等人，2008；Haque和Morris,2017；Muraoka等人，2002；Qin等人，2016；Rowland-Goldsmith等人，2001；Tian等人，2015；Tojo等人，2005)。最近，Kim等人开发了一种新的完全非功能性单体形式的显性失活TGF-β多肽mmTGF-β2-7M，其对TGF-βII型受体(TβRII)表现出高亲和力，而不能与TGF-βI型受体(TβRI)结合(Kim等人，2017)。此外，从大肠杆菌(E.Coli)产生和纯化的mmTGF-β2-7M在TGF-β报告细胞系中高度有效地阻断TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3信号传导(Kim等人，2017)。迄今为止，没有报道描述mmTGF-β2-7M在哺乳动物细胞中的表达。因此，仍然需要确定从哺乳动物细胞表达的mmTGF-β2-7M是否可以充当能够阻断TGF-β的信号传导的有效显性失活突变体。

QREO5-F是本发明的发明人最近开发的第二代促进融合的四环素可调节的溶瘤HSV-1重组病毒。用QREO5-F感染多种人癌细胞类型导致35,000-至5×10⁷倍的四环素依赖性子代病毒产生，而在感染的生长以及生长停滞的正常人成纤维细胞中观察到很少的病毒复制和病毒相关的细胞毒性。QREO5-F在免疫活性小鼠中对预先建立的Hep1-6肝癌和CT26.WT结肠癌肿瘤高度有效。重要的是，QREO5-F病毒疗法可以诱导有效的肿瘤特异性免疫，该免疫可以在用相同类型的肿瘤细胞再次攻击无肿瘤小鼠后防止肿瘤生长。鉴于TGF-β信号传导在肿瘤生物学中的关键作用及其潜在的免疫抑制活性，具体考虑了QREO5-F在癌症免疫治疗中的治疗功效可以在局部肿瘤微环境中重新表达mmTGF-β2-7M时进一步增强。

QREOF-lacZ(一种QREO5-F衍生的重组体)的构建和表征，其在HSV-1 UL26基因和UL27基因的基因间区域的HSV-2 ICP0立即早期启动子的控制下编码lacZ基因的。

质粒pQUL2627-TO和pQUL2627-lacZ的描述

pQUL2627-TO含有合成的DNA片段，其由以下组成：1)HSV-1 DNA序列，其由HSV-1UL26聚A信号上游963bp至的UL26聚A信号下游30bp组成；2)DNA序列，其含有经修饰的HSV-2ICP0启动子，其中HSV-2TATA元件被改变为HCMV TATATAA，随后是如Yao等人所述的两个串联的tet操纵子(Yao等人，1998)、MCS和SV40聚A信号序列；和3)HSV-1 DNA序列，其由HSV-1UL27聚A信号下游59bp至UL27聚A信号上游935bp组成。pQUL2627-v是没有tet操纵子序列的pQUL2627-TO衍生的质粒。pQUL2627-lacZ是pQUL2627-v衍生的质粒，其在经修饰的HSV-2ICP0启动子的控制下编码lacZ基因。

QREOF-lacZ的构建和表征

QREOF-lacZ是QREO5-F衍生的重组病毒，其中在经修饰的HSV-2 ICP0启动子控制下的lacZ基因插入UL26基因和UL27基因的基因间区域(图1)。通过Lipofectamine 2000介导的转染，用Sap I/Xmn I线性化的pQUL2627-lacZ和感染性QREO5-F病毒DNA共转染U2OS细胞产生QREOF-lacZ(Akhrameyeva等人，2011)。然后在5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)存在下，选择表达lacZ的病毒并在U2OS细胞上噬斑纯化。

QREOF-lacZ是第三轮噬斑纯化的QREO5-F衍生的重组病毒，其在U2OS细胞和表达ICP0的Vero细胞系Q0-19细胞中显示均匀的蓝色促进融合的噬斑。图2所示的结果表明，在QREOF-lacZ感染的细胞中，lacZ基因的表达和QREOF-lacZ的复制都可以被严格调节。

QREO-DNT(一种QREOF-lacZ衍生的重组物)的构建和表征，其在HSV-1 UL26基因和UL27基因的基因间区域处的经修饰的HSV-2 ICP4立即早期启动子的控制下编码显性失活TGF-β突变体mmTGF-β2-7M。

质粒pQUL2627-TGFDN的描述和通过瞬时转染测定的mmTGF-β2-7M的体外表达

在含有tetO的HSV-2 ICP4/TO启动子的控制下，通过用合成的DNA片段替换pQUL2627-lacZ中含有HSV-2 ICP0/lacZ基因的DNA片段来构建pQUL2627-TGF-DN，所述合成的DNA片段由具有HSV-1gD信号肽的密码子优化的mmTGF-β2-7M组成。mmTGF-β2-7M由92个氨基酸组成。为了评估mmTGF-β2-7M的表达，用pQUL26.27-TGF-DN或pICP6-eGFP模拟转染或转染U2OS细胞，所述pQUL26.27-TGF-DN或pICP6-eGFP是在HSV-1 ICP6启动子控制下编码eGFP的表达eGFP的质粒。图3中所示的蛋白质印迹分析显示，尽管在pICP6-EGFP和pQUL26.27-TGF-DN转染的细胞提取物中都存在MW接近50kDa的蛋白质，其代表全长TGF-β1前体(390个氨基酸)，但是仅pQUL26.27-TGF-DN转染的细胞产生MW在11-12kDa之间的蛋白质，其被TGF-β1特异性抗体强烈识别。在eGFP转染的细胞提取物中没有检测到TGF-β1的成熟形式。然而，在从pICP6-eGFP和pQUL26.27-TGF-DN转染的细胞收集的细胞外培养基中均可检测到成熟的TGF-β1。

当在相差光和荧光显微镜下检查上述转染的细胞时，观察到在转染后40h，在pICP6-eGFP转染的皿中约35-40％的细胞是eGFP阳性的。尽管eGFP转染的细胞在转染后28h至70h形态上与模拟转染的细胞相似，但用pQUL2627-TGF-DN转染的U2OS细胞在转染后48h和70h表现出平直、显著扩大和显著应激。此外，似乎用pQUL2627-TGF-DN转染的皿比pICP6-EGFP转染的皿含有显著更少的细胞。这些观察结果进一步通过图4所示的独立实验证实，该实验表明，用pICP6-eGFP转染的皿中每个皿的细胞数比用pQUL2627-TGF-DN转染的皿中的细胞数高约1.6倍，表明从转染细胞表达的mmTGF-β2-7M可有效阻断U2OS细胞中的TGF-β信号传导，与先前的研究一致，TGF-β信号传导对于骨肉瘤细胞(包括U2OS细胞)的增殖、迁移和侵袭是必需的(Li等人，2014；Matsuyama等人，2003；Verrecchia和Redini，2018)。

QREO-DNT的构建和表征

QREO-DNT是QREOF-lacZ衍生的重组病毒，其中在经修饰的HSV-2 ICP0启动子控制下的lacZ基因被编码在HSV-2 ICP4/TO启动子序列控制下的密码子优化的密码子优化的mmTGF-β2-7M的DNA片段替代。

通过Lipofectamine 2000用Nde I/BBS I-线性化的pQUL2627-TGF-DN和感染性QREOF-lacZ病毒DNA共转染U2OS细胞产生QREO-DNT。选择表达mmTGF-β2-7M的病毒并在X-Gal存在下在U2OS细胞上噬斑纯化。简而言之，通过标准噬菌斑测定筛选转染的子代病毒的QREOF-lacZ的LacZ基因与含HSV2 ICP4TO/mmTGF-β2-7M的DNA序列的重组替换。感染后72h用X-Gal染色噬斑。分离反映用mmTGF-β2-7M DNA编码序列替换LacZ基因的白色噬斑。通过用特异性针对HSV2 ICP4TO启动子序列和UL27侧翼序列的引物进行PCR分析，证实了在UL26基因和UL27基因间区域用编码mmTGF-β2-7M的DNA序列替换lacZ基因。QREO-DNT是第二轮噬斑纯化的编码mmTGF-β2-7M的重组病毒，其在U2OS细胞和表达ICP0的Vero细胞系Q0-19细胞中显示均匀的白色促进融合的噬斑。

在强力霉素存在下，在U2OS细胞中，以3PFU/个细胞的MOI评估QREO-DNT有效表达显性失活形式的TGF-β(TGF-DN)的能力。图5中所示的蛋白质印迹分析显示，虽然在QREOF-lacZ-和QREO-DNT感染的细胞中检测到类似水平的ICP27，但仅QREO-DNT表达MW约11-12kDa的蛋白质，其与抗TGF-β1特异性抗体强烈反应。正如所预期的，TGF-β1的全长前体形式在模拟感染和感染的细胞提取物中都是可检测的。值得注意的是，在模拟感染的细胞提取物中检测到MW略高于mmTGF-β2-7M的非常浅的蛋白质条带，其可能代表TGF-β1的成熟形式(112个氨基酸)。总的来说，图5所示的结果表明QREO-DNT能够表达高水平的显性失活形式的TGF-β1,mmTGF-β2-7M。

参考文献

Akhrameyeva,N.V.,Zhang,P.,Sugiyama,N.,Behar,S.M.,and Yao,F.(2011).Development of a glycoprotein D-expressing dominant-negative andreplication-defective herpes simplex virus 2(HSV-2)recombinant viral vaccineagainst HSV-2infection in mice.J Virol 85,5036-5047.

Bellmunt,J.,de Wit,R.,Vaughn,D.J.,Fradet,Y.,Lee,J.L.,Fong,L.,Vogelzang,N.J.,Climent,M.A.,Petrylak,D.P.,Choueiri,T.K.,et al.(2017).Pembrolizumab as Second-Line Therapy for Advanced Urothelial Carcinoma.NEngl J Med 376,1015-1026.Bendle,G.M.,Linnemann,C.,Bies,L.,Song,J.Y.,andSchumacher,T.N.(2013).Blockade of TGF-beta signaling greatly enhances theefficacy of TCR gene therapy of cancer.J Immunol 191,3232-3239.

Biswas,S.,Guix,M.,Rinehart,C.,Dugger,T.C.,Chytil,A.,Moses,H.L.,Freeman,M.L.,and Arteaga,C.L.(2007).Inhibition of TGF-beta with neutralizingantibodies prevents radiation-induced acceleration of metastatic cancerprogression.J Clin Invest 117,1305-1313.

Bollard,C.M.,Rossig,C.,Calonge,M.J.,Huls,M.H.,Wagner,H.J.,Massague,J.,Brenner,M.K.,Heslop,H.E.,and Rooney,C.M.(2002).Adapting a transforminggrowth factor beta-related tumor protection strategy to enhance antitumorimmunity.Blood 99,3179-3187.

Bottinger,E.P.,Jakubczak,J.L.,Roberts,I.S.,Mumy,M.,Hemmati,P.,Bagnall,K.,Merlino,G.,and Wakefield,L.M.(1997).Expression of a dominant-negative mutant TGF-beta type II receptor in transgenic mice revealsessential roles for TGF-beta in regulation of growth and differentiation inthe exocrine pancreas.EMBO J 16,2621-2633.

Calon,A.,Lonardo,E.,Berenguer-Llergo,A.,Espinet,E.,Hernando-Momblona,X.,Iglesias,M.,Sevillano,M.,Palomo-Ponce,S.,Tauriello,D.V.,Byrom,D.,et al.(2015).Stromal gene expression defines poor-prognosis subtypes in colorectalcancer.Nat Genet 47,320-329.

Chen,M.L.,Pittet,M.J.,Gorelik,L.,Flavell,R.A.,Weissleder,R.,vonBoehmer,H.,and Khazaie,K.(2005).Regulatory T cells suppress tumor-specificCD8 T cell cytotoxicity through TGF-beta signals in vivo.Proc Natl Acad Sci US A 102,419-424.

de Gramont,A.,Faivre,S.,and Raymond,E.(2017).Novel TGF-betainhibitors ready for prime time in onco-immunology.Oncoimmunology 6,e1257453.

Dong,M.,and Blobe,G.C.(2006).Role of transforming growth factor-betain hematologic malignancies.Blood 107,4589-4596.

Fantini,M.C.,Becker,C.,Monteleone,G.,Pallone,F.,Galle,P.R.,andNeurath,M.F.(2004).Cutting edge:TGF-beta induces a regulatory phenotype inCD4+CD25-T cells through Foxp3 induction and down-regulation of Smad7.JImmunol 172,5149-5153.Fridlender,Z.G.,Sun,J.,Kim,S.,Kapoor,V.,Cheng,G.,Ling,L.,Worthen,G.S.,and Albelda,S.M.(2009).Polarization of tumor-associatedneutrophil phenotype by TGF-beta:"N1"versus"N2"TAN.Cancer Cell 16,183-194.

Gil-Guerrero,L.,Dotor,J.,Huibregtse,I.L.,Casares,N.,Lopez-Vazquez,A.B.,Rudilla,F.,Riezu-Boj,J.I.,Lopez-Sagaseta,J.,Hermida,J.,Van Deventer,S.,et al.(2008).In vitro and in vivo down-regulation of regulatory T cellactivity with a peptide inhibitor of TGF-beta1.J Immunol 181,126-135.

Gong,D.,Shi,W.,Yi,S.J.,Chen,H.,Groffen,J.,and Heisterkamp,N.(2012).TGFbeta signaling plays a critical role in promoting alternative macrophageactivation.BMC Immunol 13,31.

Gorelik,L.,and Flavell,R.A.(2002).Transforming growth factor-beta inT-cell biology.Nat Rev Immunol 2,46-53.

Haque,S.,and Morris,J.C.(2017).Transforming growth factor-beta:Atherapeutic target for cancer.Hum Vaccin Immunother 13,1741-1750.

Hutzen,B.,Chen,C.Y.,Wang,P.Y.,Sprague,L.,Swain,H.M.,Love,J.,Conner,J.,Boon,L.,and Cripe,T.P.(2017).TGF-beta Inhibition Improves Oncolytic HerpesViroimmunotherapy in Murine Models of Rhabdomyosarcoma.Mol Ther Oncolytics 7,17-26.

Kim,S.K.,Barron,L.,Hinck,C.S.,Petrunak,E.M.,Cano,K.E.,Thangirala,A.,Iskra,B.,Brothers,M.,Vonberg,M.,Leal,B.,et al.(2017).An engineeredtransforming growth factor beta(TGF-beta)monomer that functions as a dominantnegative to block TGF-beta signaling.J Biol Chem 292,7173-7188.

Knudson,K.M.,Hicks,K.C.,Luo,X.,Chen,J.Q.,Schlom,J.,and Gameiro,S.R.(2018).M7824,a novel bifunctional anti-PD-L1/TGFbeta Trap fusion protein,promotes anti-tumor efficacy as monotherapy and in combination withvaccine.Oncoimmunology 7,e1426519.

Krneta,T.,Gillgrass,A.,Poznanski,S.,Chew,M.,Lee,A.J.,Kolb,M.,andAshkar,A.A.(2017).M2-polarized and tumor-associated macrophages alter NK cellphenotype and function in a contact-dependent manner.J Leukoc Biol 101,285-295.

Li,F.,Li,S.,and Cheng,T.(2014).TGF-beta1 promotes osteosarcoma cellmigration and invasion through the miR-143-versican pathway.Cell PhysiolBiochem 34,2169-2179.Lin,R.L.,and Zhao,L.J.(2015).Mechanistic basis andclinical relevance of the role of transforming growth factor-beta incancer.Cancer Biol Med 12,385-393.

Loffek,S.(2018).Transforming of the Tumor Microenvironment:Implications for TGF-beta Inhibition in the Context of Immune-CheckpointTherapy.J Oncol 2018,9732939.Luo,Y.,Zhou,H.,Krueger,J.,Kaplan,C.,Lee,S.H.,Dolman,C.,Markowitz,D.,Wu,W.,Liu,C.,Reisfeld,R.A.,et al.(2006).Targetingtumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cancer.J ClinInvest 116,2132-2141.

Mariathasan,S.,Turley,S.J.,Nickles,D.,Castiglioni,A.,Yuen,K.,Wang,Y.,Kadel,E.E.,III,Koeppen,H.,Astarita,J.L.,Cubas,R.,et al.(2018).TGFbetaattenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion ofT cells.Nature 554,544-548.Massague,J.(2008).TGFbeta in Cancer.Cell 134,215-230.

Matsuyama,S.,Iwadate,M.,Kondo,M.,Saitoh,M.,Hanyu,A.,Shimizu,K.,Aburatani,H.,Mishima,H.K.,Imamura,T.,Miyazono,K.,et al.(2003).SB-431542 andGleevec inhibit transforming growth factor-beta-induced proliferation ofhuman osteosarcoma cells.Cancer Res 63,7791-7798.

Muraoka,R.S.,Dumont,N.,Ritter,C.A.,Dugger,T.C.,Brantley,D.M.,Chen,J.,Easterly,E.,Roebuck,L.R.,Ryan,S.,Gotwals,P.J.,et al.(2002).Blockade of TGF-beta inhibits mammary tumor cell viability,migration,and metastases.J ClinInvest 109,1551-1559.Powles,T.,Duran,I.,van der Heijden,M.S.,Loriot,Y.,Vogelzang,N.J.,De Giorgi,U.,Oudard,S.,Retz,M.M.,Castellano,D.,Bamias,A.,etal.(2018).Atezolizumab versus chemotherapy in patients with platinum-treatedlocally advanced or metastatic urothelial carcinoma(IMvigor211):amulticentre,open-label,phase 3 randomised controlled trial.Lancet 391,748-757.

Qin,T.,Barron,L.,Xia,L.,Huang,H.,Villarreal,M.M.,Zwaagstra,J.,Collins,C.,Yang,J.,Zwieb,C.,Kodali,R.,et al.(2016).A novel highly potenttrivalent TGF-beta receptor trap inhibits early-stage tumorigenesis and tumorcell invasion in murine Pten-deficient prostate glands.Oncotarget 7,86087-86102.

Rowland-Goldsmith,M.A.,Maruyama,H.,Kusama,T.,Ralli,S.,and Korc,M.(2001).Soluble type II transforming growth factor-beta(TGF-beta)receptorinhibits TGF-beta signaling in COLO-357 pancreatic cancer cells in vitro andattenuates tumor formation.Clin Cancer Res 7,2931-2940.

Strauss,J.,Heery,C.R.,Schlom,J.,Madan,R.A.,Cao,L.,Kang,Z.,Lamping,E.,Marte,J.L.,Donahue,R.N.,Grenga,I.,et al.(2018).Phase I Trial of M7824(MSB0011359C),a Bifunctional Fusion Protein Targeting PD-L1 and TGFbeta,inAdvanced Solid Tumors.Clin Cancer Res 24,1287-1295.

Tauriello,D.V.F.,Palomo-Ponce,S.,Stork,D.,Berenguer-Llergo,A.,Badia-Ramentol,J.,Iglesias,M.,Sevillano,M.,Ibiza,S.,Canellas,A.,Hernando-Momblona,X.,et al.(2018).TGFbeta drives immune evasion in genetically reconstitutedcolon cancer metastasis.Nature 554,538-543.

Tian,H.,Liu,J.,Chen,J.,Gatza,M.L.,and Blobe,G.C.(2015).Fibulin-3 is anovel TGF-beta pathway inhibitor in the breast cancermicroenvironment.Oncogene 34,5635-5647.Tojo,M.,Hamashima,Y.,Hanyu,A.,Kajimoto,T.,Saitoh,M.,Miyazono,K.,Node,M.,and Imamura,T.(2005).The ALK-5inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymaltransition by transforming growth factor-beta.Cancer Sci 96,791-800.

Verrecchia,F.,and Redini,F.(2018).Transforming Growth Factor-betaSignaling Plays a Pivotal Role in the Interplay Between Osteosarcoma Cellsand Their Microenvironment.Front Oncol 8,133.

Wikstrom,P.,Stattin,P.,Franck-Lissbrant,I.,Damber,J.E.,and Bergh,A.(1998).Transforming growth factor beta1 is associated with angiogenesis,metastasis,and poor clinical outcome in prostate cancer.Prostate 37,19-29.

Wrzesinski,S.H.,Wan,Y.Y.,and Flavell,R.A.(2007).Transforming growthfactor-beta and the immune response:implications for anticancer therapy.ClinCancer Res 13,5262-5270.

Yao,F.,Svensjo,T.,Winkler,T.,Lu,M.,Eriksson,C.,and Eriksson,E.(1998).Tetracycline repressor,tetR,rather than the tetR-mammalian celltranscription factor fusion derivatives,regulates inducible gene expressionin mammalian cells.Hum Gene Ther 9,1939-1950.

Zhang,F.,Wang,H.,Wang,X.,Jiang,G.,Liu,H.,Zhang,G.,Wang,H.,Fang,R.,Bu,X.,Cai,S.,et al.(2016).TGF-beta induces M2-like macrophage polarization viaSNAIL-mediated suppression of a pro-inflammatory phenotype.Oncotarget 7,52294-52306.Zheng,X.,Turkowski,K.,Mora,J.,Brune,B.,Seeger,W.,Weigert,A.,andSavai,R.(2017).Redirecting tumor-associated macrophages to become tumoricidaleffectors as a novel strategy for cancer therapy.Oncotarget 8,48436-48452.

Zou,W.,Wolchok,J.D.,and Chen,L.(2016).PD-L1(B7-H1)and PD-1pathwayblockade for cancer therapy:Mechanisms,response biomarkers,andcombinations.Sci Transl Med 8,328rv324.

实施例2

DNA序列和氨基酸序列

在经修饰的携带tetO的HSV-2 ICP0启动子的控制下将目标基因靶向至HSV-1UL26/UL27基因座的转录盒：

由UL26聚A信号上游963bp至UL26聚A信号下游30bp组成的DNA序列：

由UL27聚A信号下游59bp至UL27聚A信号上游935bp组成的DNA序列：

携带TetO的经修饰的HSV-2 ICP0启动子加上设计的mcs，随后是sv40聚A信号序列：

SV40聚A信号序列：

CAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTG(SEQ ID NO:16)

在HSV-2 ICP4/TO启动子序列的控制下，用HSV-1gD信号肽密码子优化的mmTGF-β2-7M:

ggcgcgccgggccggcgggggccaacgggagcgcggggccggcatctcattaccacgaacccggaagggcaggggagcgagcccgcccgcgacgagggtctcattagcatcgcgggcggaagcggaagccgcccgcgccgggcgctaatgagatgccgcgcgggcggagcggcggcggcgcgaccaacgggccgccgccacggacgcggacgcgcgggcgtcggggcggggccgcgcataatgcggttccacctgggggcggaaccccggcgagccggggcgcggcggcgtcgatcgctcctcctccgcgtcctcctcctttccccccgccccgcgcgccccgaggacTATATGAGCCGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGAGCTCGCGTGTGCATCGCGTATCACCCAAGCTTgccaccATGGGCGGCGCCGCCGCCCGCCTGGGCGCCGTGATCCTGTTCGTGGTGATCGTGGGCCTGCACGGCGTGCGCGGCGCCCTGGACGCCGCCTACTGCTTCCGCAACGTGCAGGACAACTGCTGCCTGCGCCCCCTGTACATCGACTTCCGCAAGGACCTGGGCTGGAAGTGGATCCACGAGCCCAAGGGCTACAACGCCAACTTCTGCGCCGGCGCCTGCCCCTACCGCGCCAGCAAGAGCCCCAGCTGCGTGAGCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCGTGTACTACGTGGGCCGCAAGCCCAAGGTGGAGCAGCTGAGCAACATGATCGTGAAGAGCTGCAAGTGCAGCTAAgaattc(SEQ I D NO:17)

HSV-2 ICP4/TO启动子序列：

ggcgcgccgggccggcgggggccaacgggagcgcggggccggcatctcattaccacgaacccggaagggcaggggagcgagcccgcccgcgacgagggtctcattagcatcgcgggcggaagcggaagccgcccgcgccgggcgctaatgagatgccgcgcgggcggagcggcggcggcgcgaccaacgggccgccgccacggacgcggacgcgcgggcgtcggggcggggccgcgcataatgcggttccacctgggggcggaaccccggcgagccggggcgcggcggcgtcgatcgctcctcctccgcgtcctcctcctttccccccgccccgcgcgccccgaggacTATATGAGCCGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGAGCTCGCGTGTGCATCGCGTATCACCCAAGCTT(SEQ IDNO:18)

因为HSV ICP4启动子受到ICP4的自动抑制，所以HSV-2 ICP4启动子中的ICP4结合位点从所述的含TETO的HSV-2 ICP4/TO启动子中缺失。

密码子优化的mmTGF-β2-7M，在N-末端具有HSV-1gD信号肽：

gccaccATGGGCGGCGCCGCCGCCCGCCTGGGCGCCGTGATCCTGTTCGTGGTGATCGTGGGCCTGCACGGCGTGCGCGGCGCCCTGGACGCCGCCTACTGCTTCCGCAACGTGCAGGACAACTGCTGCCTGCGCCCCCTGTACATCGACTTCCGCAAGGACCTGGGCTGGAAGTGGATCCACGAGCCCAAGGGCTACAACGCC

AACTTCTGCGCCGGCGCCTGCCCC

TACCGCGCCAGCAAGAGCCCCAGCTGCGTGAGCCAGGACCTGGAGCCCCT

GACCATCGTGTACTACGTGGGCCGCAAGCCCAAGGTGGAGCAGCTGAGCA

ACATGATCGTGAAGAGCTGCAAGTGCAGCTAAgaattc(SEQ I D NO:19)

密码子优化的gD信号肽序列：

ATGGGCGGCGCCGCCGCCCGCCTGGGCGCCGTGATCCTGTTCGTGGTGATCGTGGGCCTGCACGGCGTGCGCGGC(SEQ ID NO:20)

阿特珠单抗(USAN/INN)；阿特珠单抗(遗传重组)(JAN)；Tecentriq(TN)

重链(448个氨基酸)：

轻链(214个氨基酸):

由具有GGGGGGS连接子的mmTGF-β2-7M组成的与重链的C-末端融合的阿特珠单抗重链：

融合蛋白可以是无连接子或具有2-4拷贝的连接子。连接子也可以是GGGGS(SEQID NO:27)或GGGGGS(SEQ ID NO:28)或通常用于融合2种不同功能蛋白的其它连接子。

KEGG DRUG:(例如，派姆单抗；派姆单抗(USAN)；派姆单抗(遗传重组)(JAN)；健痊得(Keytruda)(TN)

重链(447个氨基酸)

轻链(218个氨基酸)

派姆单抗重链，其由与重链的C-末端融合的具有GGGGGGS连接子的mmTGF-β2-7M组成：

融合蛋白可以是无连接子或具有2-4拷贝的连接子。连接子也可以是GGGGS(SEQID NO:27)或GGGGGS(SEQ ID NO:28)。

Claims

g)含有5’非翻译区和HSV-1或HSV-2的基因，即VP5基因，其与包含TATA元件的VP5启动子可操作地连接；

h)定位在所述TATA元件3’端的6至24个核苷酸之间的四环素操纵子序列，其中所述VP5基因位于所述四环素操纵子序列的3’端；

i)编码与HSV立即早期启动子可操作地连接的四环素阻遏物的基因序列，其中所述基因序列位于ICP0基因座处；

j)与野生型相比增加合胞体形成的变异基因，其中所述HSV-1或HSV-2变异基因选自：糖蛋白K(gK)变体；糖蛋白B(gB)变体；UL24变体；和UL20基因变体；

k)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

l)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL26基因和UL27基因的基因间区域，

k)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

l)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL21基因和UL22基因的基因间区域，

k)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

l)与经修饰的HSV启动子可操作地连接的基因序列，其中所述基因位于UL26基因、UL27基因、UL21基因和UL21基因的基因间区域，

4.如权利要求1-3中任一项所述的溶瘤HSV，其中(f)的基因序列是LacZ基因序列。

5.如权利要求1-3中任一项所述的溶瘤HSV，其中(f)的基因序列是显性失活的TGF-β突变序列。

6.如权利要求5所述的溶瘤HSV，其中所述显性失活TGF-β突变序列是mmTGF-β2-7M片段序列。

7.如权利要求1-3中任一项所述的溶瘤HSV，其中(f)的启动子是经修饰的HSV立即早期启动子、HCMV立即早期启动子或人类延长α启动子。

8.如权利要求1-3中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述变异基因是编码选自以下的氨基酸取代的gK变异基因：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸40的Ala至Thr的氨基酸取代；对应于SEQ ID NO:2的氨基酸40的Ala至“x”的氨基酸取代，其中“x”是任意氨基酸；对应于SEQ IDNO:2的氨基酸99的Asp至Asn的氨基酸取代；对应于SEQ ID NO:2的氨基酸304的Leu至Pro的氨基酸取代；以及对应于SEQ ID NO:2的氨基酸310的Arg至Leu的氨基酸取代。

9.如权利要求1-8中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述四环素操纵子序列包含两个Op2阻遏物结合位点。

10.如权利要求1-9中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述VP5启动子是HSV-1或HSV-2的VP5启动子。

11.如权利要求1-10中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述立即早期启动子是HSV-1或HSV-2的立即早期启动子。

12.如权利要求1-11中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述HSV立即早期启动子选自：ICP0启动子、ICP4启动子和ICP27启动子。

13.如权利要求1-12中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述重组DNA是HSV-1基因组的一部分。

14.如权利要求1-12中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述重组DNA是HSV-2基因组的一部分。

15.如权利要求1-13中任一项所述的溶瘤HSV，其还包含药学上可接受的载体。

16.如权利要求1-15中任一项所述的溶瘤HSV，其还编码能够提高所述溶瘤HSV诱导抗肿瘤特异性免疫的功效的至少一种多肽。

17.如权利要求16所述的溶瘤HSV，其中所述至少一种多肽编码选自以下的产物：白细胞介素2(IL2)、白细胞介素12(IL12)、白细胞介素15(IL15)、抗PD-1抗体或抗体试剂、抗PD-L1抗体或抗体试剂、抗OX40抗体或抗体试剂、CTLA-4抗体或抗体试剂、TIM-3抗体或抗体试剂、TIGIT抗体或抗体试剂、可溶性白细胞介素10受体(IL10R)、可溶性IL10R与IgG-Fc结构域之间的融合多肽、可溶性TGFβII型受体(TGFBRII)、可溶性TGFBRII与IgG-Fc结构域之间的融合多肽、抗IL10R抗体或抗体试剂、抗IL10抗体或抗体试剂、抗TGFBRII抗体或抗体试剂以及抗TGFBRII抗体或抗体试剂。

18.如权利要求1-17中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV还编码促进融合的活性。

k)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

l)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL26基因和UL27基因的基因间区域，

k)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

l)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL21基因和UL22基因的基因间区域，

k)编码功能性ICP34.5蛋白的基因序列；以及

l)与经修饰的HSV-2立即早期启动子可操作地连接的显性失活TGF-β突变序列，其中所述基因位于UL21基因、UL22基因、UL26基因和UL27基因的基因间区域，

22.如权利要求19-21中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述显性失活TGF-β突变序列是mmTGF-β2-7M片段序列。

23.如权利要求19-21中任一项所述的溶瘤HSV，其中(f)的HSV-2立即早期启动子选自ICP0、ICP4和ICP27。

24.如权利要求19-21中任一项所述的溶瘤HSV，其中(f)的HSV-2立即早期启动子含有tet操纵子。

25.如权利要求19-21中任一项所述的溶瘤HSV，其中所述HSV是可调节的四环素或强力霉素。

28.如权利要求26或27所述的溶瘤HSV，其中所述HSV还编码促进融合的活性。

29.如权利要求26或27所述的溶瘤HSV，其中所述HSV是可调节的四环素或强力霉素。

30.溶瘤病毒，其编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

31.重组病毒，其编码功能性mmTGF-β2-7M片段序列。

32.组合物，其包含权利要求1-31中任一项所述的病毒。

33.如权利要求32所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。

34.细胞，其表达权利要求1-31中任一项所述的病毒或权利要求32-33所述的组合物中的任一种。

35.如权利要求34所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

36.如权利要求34-35所述的细胞，其中所述细胞是癌细胞或免疫细胞。

37.如权利要求36所述的细胞，其中所述免疫细胞是B细胞或T细胞。

38.如权利要求34-37中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达高水平的mmTGF-β2-7M。

39.用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的对象施用权利要求1-31中任一项所述的病毒或权利要求32-33中任一项所述的组合物。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述肿瘤是良性的或恶性的。

42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述对象被诊断为或已经被诊断为患有选自以下的癌症：癌、黑色素瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。

43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述对象被诊断为或已经被诊断为患有选自以下的癌症：非小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、头颈癌、肾癌和胰腺癌。

44.如权利要求39-43中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性的。

45.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其还包括施用调节所述含有tet操纵子的启动子的试剂。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述试剂是强力霉素或四环素。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述试剂是局部或全身性施用的。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述全身性施用是口服施用。

49.如权利要求39-48中任一项所述的方法，其中所述病毒或组合物被直接施用于所述肿瘤。

51.如权利要求50所述的杂合核酸序列，其中所述治疗性抗体序列是免疫治疗性抗体的序列。

52.如权利要求50或51所述的杂合核酸序列，其中所述治疗性抗体序列是选自以下的序列：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗抗CTLA4抗体和抗TDM-1抗体以及抗TIGIT抗体。

53.多肽，其由权利要求50-52中任一项所述的杂合核酸编码。

54.载体，其表达权利要求50-52中任一项所述的杂合核酸或权利要求53所述的多肽中的任一种。

55.嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含以下中的至少一种：

a.包含显性失活TGF-β突变序列的细胞外结构域；

b.跨膜结构域；

c.共刺激结构域；和

d.细胞内信号传导结构域。

56.如权利要求55所述的CAR多肽，其中所述显性失活TGF-β突变序列是mmTGF-β2-7M片段序列。

57.核酸，其编码权利要求55或56所述的CAR多肽。

58.哺乳动物细胞，其包含：

a.权利要求55或56所述的CAR多肽；或

b.权利要求57的编码核酸。

59.如权利要求58所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。

60.如权利要求58或59所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。

61.如权利要求58-60中任一项所述的细胞，其还包含至少第二CAR多肽。

62.如权利要求61所述的细胞，其中所述至少第二CAR多肽包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含结合检查点抑制剂的序列。

63.如权利要求62所述的细胞，其中所述检查点抑制剂选自：PD-L1、PD-1、TIGIT、TIM3和CTLA4。

64.如权利要求58-63中任一项所述的细胞，其中所述细胞获自患有或被诊断患有癌症的个体。

65.治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求58-64中任一项所述的细胞。

66.治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括：

a.使T细胞工程化以在所述T细胞表面上包含权利要求55或56所述的CAR多肽或权利要求57所述的编码核酸；和

b.将工程化的T细胞施用于所述对象。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述工程化的T细胞还包含至少第二CAR多肽。

68.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括施用至少一种另外的抗癌治疗剂。