CN114761039A - 通过干扰细胞受体阻断asfv感染的方法 - Google Patents
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Abstract
在动物中预防和治疗细菌或病毒感染、或癌症的方法,该方法通过在动物中抑制病毒进入蛋白与细胞受体的相互作用并且预防和治疗细菌或病毒感染、或癌症。在个体中用溶原性和裂解性病毒治疗病毒感染的方法,该方法通过施用靶向病毒溶原期外膜上的蛋白的病毒抗原,施用靶向病毒裂解期衣壳上的蛋白的病毒抗原,并且治疗病毒感染。用于在个体中用溶原性和裂解性病毒治疗病毒感染的组合物。在个体中用溶原性和裂解性病毒发现用于治疗病毒感染的抗体的方法。
Description
发明背景
1.技术领域
本发明涉及在动物(非人类)中预防病毒和细菌感染、癌症预防和/或治疗的方法。更具体地,本发明涉及在猪和其他动物中治疗和预防感染及癌症的方法。
2.背景技术
非洲猪瘟病毒(ASFV)是大型双链DNA病毒,主要感染家猪、野猪、疣猪和非洲野猪(bush pig)。它也存在于软蜱中,因此软蜱充当了感染性载体。ASFV主要感染单核细胞和巨噬细胞,尽管在急性感染时可以感染许多其他细胞类型;因此重新定义GMO动物中的病毒/细胞受体将有助于预防急性感染和满足额外治疗的需要。ASFV会导致这些动物高烧、出血性病变、发绀、厌食和死亡。对于这种病毒没有疫苗或治疗,目前防止其传播的唯一方法是扑杀动物。申请人的美国临时专利申请号62/871,949披露了用于消除或中和病毒携带者(例如携带ASFV的软蜱)的基因驱动。在该基因驱动中,等位基因被改变,从而其一直在所有子代(不仅是50%)中作为显性等位基因出现。然而,仍然需要治疗病毒其本身的方法。
迄今为止,尚未确定ASFV的细胞受体,但有证据表明该病毒通过动力蛋白依赖的和网格蛋白介导的微胞饮过程进入单核细胞或巨噬细胞中(Jia等人,非洲猪瘟病毒结构蛋白在病毒感染中的作用,J Vet Res[兽医研究杂志]61,135-143,2017)。尝试建立针对ASFV病毒抗原的强烈抗体应答的结果不佳。
基因编辑允许通过使用核酸酶在生物体的基因组中插入、删除或替换DNA或RNA。目前使用的核酸酶有几种类型,包括大范围核酸酶、锌指核酸酶、基于转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas核酸酶。这些核酸酶可以产生DNA的位点特异性双(或单)链断裂,从而编辑该DNA。靶向受体基因组需要精确切割病毒基因组,并且没有可能对受试者有害的脱靶效应。
基因编辑先前已经被用于靶向病毒。Quake的美国专利申请公开号20160060655披露了使用指导核酸酶系统选择性治疗病毒感染的方法。本发明的方法可用于从宿主生物体中去除病毒或其他外来遗传物质,而不干扰宿主的遗传物质的完整性。核酸酶可用于靶向病毒核酸,例如CRISPR Cas9、锌指或TALEN,从而干扰病毒复制或转录,或甚至从宿主基因组中切除病毒遗传物质。
Zhang等人的美国专利申请公开号2014/0357530披露了在功能基因组学中使用的组合物、方法应用和筛选,其专注于细胞中的基因功能并使用载体系统和与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统及其组件相关的其他方面。Zhang等人披露了DNA短部分的修饰,产生最多200个碱基对,优选最多100个碱基对,或更优选最多50个碱基对的5'突出端。
Doudna等人的美国专利号10,266,850披露了靶向DNA的RNA,其包含靶向序列并且与修饰多肽一起提供靶DNA和/或与靶DNA相关的多肽的位点特异性修饰。还披露了在靶细胞中调节靶核酸的转录的方法,该方法通常涉及使靶核酸与酶失活的Cas9多肽和靶向DNA的RNA接触。
基因编辑也已经被用于创建点突变。Rees等人(Nat Rev Genet.[遗传学自然评论]2018年12月;19(12):770-788)教导了碱基编辑,较新的基因组编辑方法,其使用来自CRISPR系统的组件与其他酶一起将点突变直接安装到细胞DNA或RNA中,而不会使双链DNA断裂。DNA碱基编辑器包含与核碱基脱氨酶融合的催化失效的核酸酶,并且在某些情况下包含DNA糖基化酶抑制剂。RNA碱基编辑器使用靶向RNA的组件实现类似的变化。碱基编辑器直接将一个碱基或碱基对转换为另一个碱基或碱基对,从而能够在非分裂细胞中有效地安装点突变,而不会生成过多的不希望的编辑副产物。
Cas/脱氨酶融合蛋白也已经用于进行点突变。Zheng等人(CommunicationsBiology[通讯生物学]第1卷,文章编号:32(2018))使用切口酶Cas9-胞苷脱氨酶融合蛋白指导原核细胞内的胞嘧啶至胸腺嘧啶的转化,导致了大肠杆菌和布鲁氏菌中的高突变频率。Liu等人的美国专利申请公开号20160304846还披露了用于编辑细胞或受试者的基因组内的单个位点的Cas9和核酸编辑酶或酶结构域(例如脱氨酶结构域)的融合蛋白。
仍然需要通过改变动物中的受体来治疗和预防细菌和病毒感染(例如ASFV)以及癌症。
发明内容
本发明提供了在动物中预防和治疗细菌或病毒感染、或癌症(优选地猪ASFV)的方法,该方法通过在动物中抑制病毒进入蛋白与细胞受体的相互作用(viral entryprotein-to-cellular receptor interaction)并且预防和治疗细菌或病毒感染、或癌症。这可以通过1)小分子非竞争性抑制或竞争性抑制或2)通过基因编辑方法改变细胞受体来完成,从而使病毒进入蛋白不再识别天然/野生型受体。
本发明提供了在个体中用溶原性和裂解性病毒治疗病毒感染的方法,该方法通过施用刺激产生靶向病毒溶原期外膜上的蛋白的抗体的B细胞应答的病毒抗原,施用靶向病毒裂解期衣壳上的蛋白的病毒抗原,并且治疗病毒感染。
本发明还提供了用于在个体中用溶原性和裂解性病毒治疗病毒感染的组合物,该组合物包含:刺激产生靶向病毒溶原期外膜上的蛋白的抗体的B细胞应答的病毒抗原,以及靶向病毒裂解期衣壳上的蛋白的病毒抗原。
本发明提供了在个体中用溶原性和裂解性病毒发现用于治疗病毒感染的抗体的方法,该方法通过将病毒溶原期外膜上的靶蛋白和病毒裂解期衣壳上的靶蛋白的全蛋白或肽用作抗原以使用抗体发现平台发现抗体,测试发现的抗体的亲和力(affinity)、亲合力(avidity)、特异性、选择性、稳定性、精密度和稳健性,并且选择最佳候选抗体作为病毒感染的治疗性治疗。
附图说明
在与以下附图结合考虑时,参照以下详细描述,会容易认识到并更好地理解本发明的其他优点:
图1描绘了溶原性和裂解性ASFV病毒粒子;
图2描绘了α-衣壳抗体,这些抗体不能靶向具有外膜的溶原性病毒粒子,但容易靶向衍生自裂解性复制的不含外膜具有暴露的衣壳的病毒粒子;
图3A描绘了溶原性ASFV中的靶蛋白,并且图3B描绘了裂解性ASFV中的靶蛋白;以及
图4描绘了治疗策略。
具体实施方式
本发明提供了通过抑制病毒进入蛋白质与细胞受体的相互作用来在动物(优选猪的ASFV)中预防和治疗细菌或病毒感染、或癌症的方法。技术上,这可以通过1)小分子非竞争性抑制或竞争性抑制或2)通过基因编辑方法改变细胞受体来实现,从而使病毒进入蛋白不再识别天然/野生型受体。
如本文所使用的“动物”是指任何哺乳动物,优选为猪,并且还可以包括人类。
如本文所使用的“猪(porcine)”或“猪(swine)”可以是家猪、野猪、疣猪和非洲野猪。
术语“载体”包括克隆和表达载体,以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调控区域的载体。以下还进一步描述了载体。
如本文所使用的“gRNA”指的是指导RNA。CRISPR Cas9系统中的gRNA和本文中的其他CRISPR核酸酶用于改变或编辑受体或编码受体的基因。该gRNA可以是与编码序列或非编码序列互补的序列,并且可以针对特定受体或待靶向基因进行定制。该gRNA可以是与蛋白编码序列互补的序列,例如编码一个或多个病毒结构蛋白的序列(例如,在ASFV中CP2475基因编码多肽220,其被切割成蛋白p150、p37、p14和p34)。该gRNA序列可以是正义序列或反义序列。应当理解,当在本文中施用基因编辑器组合物时,这优选地包括一个或多个gRNA。
如本文所使用的“核酸”是指RNA和DNA两者,包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和含有核酸类似物的DNA(或RNA),以上中的任何一种可以编码本发明的多肽,并且以上所有都涵盖在本发明中。多核苷酸可以基本上具有任何三维结构。核酸可以是双链或单链的(即,正义链或反义链)。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)及其部分、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、微小RNA、短发夹RNA(shRNA)、干扰RNA(RNAi)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化型多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物,以及核酸类似物。在本发明的上下文中,核酸可以编码天然存在的Cas9的片段或其生物活性变体和至少两种gRNA,其中这些gRNA与受体或编码受体基因中的序列互补。
“分离的”核酸可以是例如天然存在的DNA分子或其片段,其条件是通常发现在天然存在的基因组中紧密侧接该DNA分子的核酸序列中的至少一个被去除或不存在。因此,分离的核酸包括但不限于作为单独的分子存在、不依赖于其他序列的DNA分子(例如化学合成的核酸,或由聚合酶链式反应(PCR)或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。分离的核酸还指被整合到载体、自主复制性质粒、病毒中或者原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA分子。另外,分离的核酸可以包括工程化的核酸,例如作为杂交体或融合核酸的一部分的DNA分子。存在于例如cDNA文库或基因组文库中的或含有基因组DNA限制性消化的凝胶切片中的许多(例如数十或数百至数百万)其他核酸不是分离的核酸。
分离的核酸分子可以通过标准技术生产。例如,聚合酶链式反应(PCR)技术可用于获得含有本文所述核苷酸序列(包括编码本文所述多肽的核苷酸序列)的分离的核酸。PCR可用于扩增来自DNA以及RNA的特定序列,包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。例如,各种PCR方法描述于例如:PCR Primer:A Laboratory Manual[PCR引物:实验室手册],Dieffenbach和Dveksler编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],1995。通常,来自目的区域的末端或更远端的序列信息被用来设计与待扩增的模板的相反链的序列相同或相似的寡核苷酸引物。各种PCR策略也可用于将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸中。
分离的核酸也可以是化学合成的,作为单个核酸分子(例如,使用亚磷酰胺技术在3’至5’方向使用自动化DNA合成)或作为一系列寡核苷酸。例如,可以合成含有所需序列的一对或多对长寡核苷酸(例如,>50-100个核苷酸),其中每对含有具有互补性的短区段(例如约15个核苷酸),使得寡核苷酸对退火时形成双链体。使用DNA聚合酶来延伸寡核苷酸,产生单个双链核酸分子/寡核苷酸对,然后可以将其连接到载体中。本发明的分离的核酸也可以通过诱变例如编码Cas9的DNA的天然存在部分(根据例如上式)而获得。
在本发明的方法中,可以在动物(尤其是猪)中治疗或预防许多不同的细菌感染、病毒和癌症。最优选地,该病毒是ASFV。细菌感染和它们引起的疾病/病症可以是但不限于:炭疽(炭疽杆菌(Bacillus anthracis)),心内膜炎(酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)),丹毒(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)),出血性败血症(多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、溶血性巴氏杆菌(Pasteurella haemolytica)),类鼻疽(类鼻疽假单孢菌(Pseudomonas pseudomallei)),败血症(Achromobacter anitratium),地方性肺炎(猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)),肺炎(A和D型多杀性巴氏杆菌),博德特氏菌支气管败血症(猪嗜血杆菌(Haemophilus suis)),肉毒中毒(肉毒杆菌(Clostridium botulinum)),痢疾(大肠弧菌(Vibrio coli)),肠炎(鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae-suis)、鸭沙门氏菌(Salmonella anatum)),水肿病(大肠杆菌(Escherichia coli)),溃疡(坏死圆杆菌(Sphaerophorus necrophorus)),流产(猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)),乳腺炎(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、化脓性棒状杆菌(Corynebacterium pyogenes)、坏死圆杆菌),乳腺脓肿(林氏放线杆菌(Actinobacillus lignieresi)),膀胱炎(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)、钩端螺旋体病(波蒙纳钩端螺旋体(Leptospira pomona)、猪型钩螺旋体(Leptospira hyos)、流感伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippothyphosa)、秋令热钩端螺旋体(Leptospira autumnalis)),脓肿(兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、坏死圆杆菌),破伤风(破伤风梭菌(Clostridium tetani)),放线菌病(牛放线菌(Actinomyces bovis)),恶性水肿(败毒梭菌(Clostridium septicum)),木舌病(林氏放线杆菌),伤口(奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、金黄色葡萄球菌、化脓性棒状杆菌、多杀性巴氏杆菌、坏死圆杆菌),关节炎(猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis))或新生儿死亡(大肠杆菌、猪丹毒杆菌(Erysipelothrix insidiosa)、兽疫链球菌、猪布鲁氏菌)。
首先,进行受体筛选。使用发现平台(基于酵母双杂交或生化相互作用测定)来鉴定与病毒附着和进入蛋白/配体(例如,p54(E183L基因)进入蛋白/配体、p30(CP204L基因)进入蛋白/配体、p12(O61R基因)附着蛋白/配体、p10(A78R基因)附着蛋白/配体、p11.5(A137R基因)附着蛋白/配体或p72(B646L基因)进入蛋白/配体)的一种或多种(或其任意组合)相互作用的细胞受体。
有多种酵母双杂交、哺乳动物双杂交和噬菌体展示方法可用于此目的。Luo等人(Biotechniques[生物技术]1997年2月;22(2):350-2)描述了哺乳动物双杂交系统。一种目的蛋白质被表达为与Gal4 DNA结合结构域的融合体,并且另一种蛋白质被表达为与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域的融合体。表达这些融合蛋白的载体与报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)载体一起被共转染到哺乳动物细胞系中。报告基因质粒含有受五个共有Gal4结合位点控制的cat基因。如果两种融合蛋白相互作用,在cat报告基因的表达就将会显著增加。Fields等人(Nature[自然]1989年7月20日;340(6230):245-6)描述了酵母双杂交系统,其中GAL4 DNA结合结构域与蛋白“X”融合,并且GAL4激活区域与蛋白质“Y”融合。如果X和Y可以形成蛋白-蛋白复合物并重组GAL4结构域的邻近性,则会发生由UASG调节的基因的转录。Smith(Science[科学]1985年6月14日;228(4705):1315-7)描述了噬菌体双杂交系统,其中外源DNA片段可以被插入丝状噬菌体基因III中以产生在中间有外源序列的融合蛋白。该融合蛋白被整合到病毒粒子中,该病毒粒子保留了感染性,并展示了处于免疫可接近形式的外源氨基酸。通过对针对外源序列的抗体的亲和力,这些“融合噬菌体”可以比普通噬菌体富集1000多倍。
受体筛选通常可以如下进行。猪(swine/porcine)基因文库在酵母或噬菌体中被表达(噬菌体可用于筛选更多)。然后经表达的蛋白装饰酵母细胞/噬菌体的外部。HPLC柱可由ASFV衣壳或蛋白或其他潜在配体制成。将酵母细胞或噬菌体与选择的固定化ASFV受体配体一起孵育。洗涤、收集这些细胞或噬菌体,并重复以富集。收集样品并使用由每个杂交/噬菌体系统定义的典型生化/遗传方法鉴定受体。
受体和病毒配体的相互作用可以是竞争性抑制或非竞争性抑制。当化学物质、小肽或抗体通过与其竞争结合来抑制另一个的作用时,就会发生竞争性抑制,即其类似于与受体结合的正常底物。当抑制剂降低受体的活性并且无论受体是否已经结合底物仍与受体同样良好地结合时,就会发生非竞争性抑制。
发现受体后,就可以衍生出小分子抑制性治疗。一旦病毒配体和细胞受体之间的相互作用被定义,小分子干扰性筛选(通过双杂交系统或其他的蛋白-蛋白相互作用/干扰)被用来定义可以抑制该相互作用的小分子候选物。可以使用双杂交系统的变体,例如抑制的反式激活因子(RTA)筛选。在这个筛选中,当猪受体肽和病毒受体/配体肽锁定在相互作用中时,小分子文库被加入至仅在选择性培养基上生长的酵母中。通过加入小分子文库,人们可以寻找那些干扰相互作用的小分子。一旦被鉴定出,就可以确定哪个小分子是最稳健、最安全和最有效的。Hirst等人(Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊],2001年7月17日;98(15):8726-31.Epub 2001年7月10日.)描述了抑制的反式激活因子(RTA)系统采用酵母通用抑制因子TUP1的N-端抑制结构域。与GAL4一起共表达时,TUP1-GAL80融合蛋白示出可抑制GAL4-依赖性报告基因的转录。Joshi等人(Biotechniques[生物技术]2007年5月;42(5):635-44)已将该系统用于从小分子化合物文库中筛选蛋白相互作用的抑制剂。用于本发明筛选和测试的文库可以来自海洋、雨林,或者是合成的。也可以使用肽和抗体文库。可以实施进一步的筛选和测试以缩小小分子的数量,并在细胞培养和动物模型中测试安全性和有效性。
基因修饰的细胞受体可用于通过进入蛋白的功能障碍或其他干扰来预防病毒结合。一旦鉴定出细胞受体,特别是受体内对识别病毒蛋白配体至关重要的氨基酸,可以使用基因编辑工具(例如但不限于CRISPR、ZFN、TALEN,下文将进一步描述)用阻断病毒进入的一个或多个非干扰性(功能上可保留的蛋白质)氨基酸序列来改变(通过置换或缺失)一个或多个受体编码基因。进入蛋白在其他方面是结构或功能膜蛋白。在基因水平上,它们的改变可能受到基因编辑的影响,但它们的天然功能可能需要保留,以免干扰或以其他方式杀死靶细胞。
如果受体需要糖基化,可以将猪巨噬细胞细胞提取物加入到酵母/噬菌体表达文库中,以强制在酵母/噬菌体表面表达肽的糖基化。
在上述方法的替代方案中,病毒蛋白可以在如上所述的柱子上分离,然后猪(swine/porcine)分离的巨噬细胞/单核细胞可以流过该柱子,孵育,然后可以通过洗脱富集细胞(保持相互作用完好)。一旦分离的巨噬细胞/单核细胞与分离的病毒受体/配体相互作用,就可以加入识别病毒配体的抗体,然后可以在显微镜下观察突触。可以分离单细胞,然后鉴定细胞受体。
这种基因编辑方法可以在猪胚胎谱系中实施,以产生对ASFV感染有抗性的基因修饰的猪生物体。
本发明中使用的基因编辑器可以包括以下列出的任何基因编辑器。可以使用任何处理的方法,包括由gRNA指导的DNA或RNA的核酸内切酶切割。该核酸酶通过在碱基对水平上切除或改变内源性猪受体序列,并使用以如HITI(非分裂胚胎细胞)方法进行的HDR或在分裂胚胎细胞中进行的传统HDR将它们替换为一种或多种gRNA来起作用。基因编辑可用于产生在所希望受体中生成的点突变或多重突变。Cas/脱氨酶融合蛋白可用于制造点突变。
也可以进行基因替换,其需要切除基因,然后用新基因替换该基因,新基因具有表达阻断病毒进入的突变(仍有功能性)受体的被改变的序列。基因编辑可用于将野生型基因替换为含有允许表达替换受体的突变序列的工程化基因。一旦基因被切除,可以在分裂或非分裂细胞中使用基因替换方法(同源定向重组)将它替换。
锌指核酸酶(ZFN)在特定DNA位置产生双链断裂。ZFN具有两个功能域,一个识别6bp DNA序列的DNA结合结构域和一个核酸酶Fok I的DNA切割结构域。
TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)包括TAL效应DNA结合结构域,该结构域与产生DNA中双链断裂的DNA切割结构域融合。
人WRN是由维尔纳综合征基因编码的RecQ解旋酶。它涉及基因组维护,包括复制、重组、切除修复和DNA损伤应答。这些遗传过程和WRN的表达在许多类型的癌症中同时上调。因此,有人提出,该解旋酶的靶向破坏可用于消除癌细胞。报告已经应用外部指导序列(EGS)方法指导RNA酶P RNA有效切割培养的人细胞系中的WRN mRNA,从而消除了这种独特的3'-5'DNA解旋酶-核酸酶的翻译和活性。
2类VI-A型CRISPR/Cas效应子“C2c2”揭示RNA指导的RNA酶功能。C2c2来自细菌沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii),并提供对RNA噬菌体的干扰。体外生化分析显示C2c2由单个crRNA指导,并且可以被编程以切割携带互补原型间隔子的ssRNA靶标。在细菌中,C2c2可以被编程以敲低特定的mRNA。切割由两个保守的HEPN结构域中的催化残基介导,其中的突变产生催化失活的RNA结合蛋白。C2c2的聚焦RNA的行动补充了CRISPR-Cas9系统,该系统靶向DNA,即细胞身份和功能的基因组蓝图。仅靶向RNA的能力(其有助于执行基因组指令)提供了以高通量方式特异性操纵RNA—并且更广泛地操纵基因功能的能力。这些结果证明了C2c2作为新的RNA靶向工具的能力。
在本发明中还可以使用另一种2类V-B型CRISPR/Cas效应子“C2c1”用于编辑DNA。C2c1含有与Cpf1较远相关的RuvC样内切核酸酶结构域(以下所述)。C2c1可以位点特异性地靶向和切割靶DNA的两条链。根据Yang等人(PAM-Depenednt Target DNARecognition andCleavage by C2c1 CRISPR-Cas Endonuclease[C2c1CRISPR-Cas内切核酸酶的PAM依赖性靶DNA识别和切割],Cell[细胞],2016年12月15日;167(7):1814-1828),晶体结构证实酸土脂环酸芽孢杆菌C2c1(AacC2c1)与sgRNA结合作为二元复合物并且靶向DNA作为三元复合物,从而捕获AacC2c1的催化能力构象,其中靶和非靶DNA链两者独立地定位在单个RuvC催化口袋内。Yang等人证实C2c1介导的切割导致靶DNA的错开的七-核苷酸断裂,crRNA在二元复合物中采用预先排序的五-核苷酸A型种子序列,其中释放插入的色氨酸,促进20-bp指导RNA:三元复合物形成上的靶DNA异源双链的拉链式配对,并且PAM相互作用的裂缝在三元复合物形成上采用“锁定”构象。
C2c3是V-C型基因编辑器效应子,与C2c1有较远关系,并含有RuvC样核酸酶结构域。C2c3也类似于以下描述的CasY.1-CasY.6组。
如本文所使用的“CRISPR Cas9”是指成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶Cas9。在细菌中,CRISPR/Cas基因座编码针对移动遗传元件(病毒、转座元件和接合质粒)的RNA指导的适应性免疫系统。已经鉴定了三种类型(I-III)的CRISPR系统。CRISPR簇含有间隔子,即与先前的移动元件互补的序列。CRISPR簇被转录并加工成成熟的CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)RNA(crRNA)。CRISPR相关内切核酸酶Cas9属于II型CRISPR/Cas系统,并具有强的切割靶DNA的内切核酸酶活性。Cas9由成熟的crRNA(其含有约20个碱基对(bp)的独特靶序列(称为间隔子))和反式激活的小RNA(tracrRNA)(其可用作前crRNA的核糖核酸酶III辅助的加工的指导)指导。crRNA:tracrRNA双链体通过crRNA上的间隔子和靶DNA上的互补序列(称为原型间隔子)之间的互补碱基配对,指导Cas9靶向DNA。Cas9识别三核苷酸(NGG)原型间隔子相邻基序(PAM)以指定切割位点(来自PAM的第3核苷酸)。crRNA和tracrRNA可以单独表达或经由合成的茎环(AGAAAU)工程化到人工融合小指导RNA(sgRNA)中以模拟天然crRNA/tracrRNA双链体。这种sgRNA,如shRNA,可被合成或体外转录用于直接RNA转染或者从U6或H1促进的RNA表达载体表达,尽管人工sgRNA的切割效率低于具有单独表达的crRNA和tracrRNA的系统的切割效率。
CRISPR/Cpf1是一种类似于CRISPR/Cas9系统的DNA编辑技术,由博德研究所(Broad Institute)和麻省理工学院(MIT)的Feng Zhang小组于2015年表征。Cpf1是II类CRISPR/Cas系统的RNA指导型内切核酸酶。这种获得性免疫机制见于普雷沃菌属(Prevotella)和弗朗西丝氏菌属(Francisella)细菌中。它可以防止病毒对基因的损伤。Cpf1基因与CRISPR基因座相关联,编码使用指导RNA来发现和切割病毒DNA的内切核酸酶。Cpf1是一种比Cas9更小更简单的内切核酸酶,克服了CRISPR/Cas9系统的一些局限性。CRISPR/Cpf1可以具有多种应用,包括遗传性疾病和退行性病症的治疗。
还可以使用CRISPR/TevCas9系统。在某些情况下,已经表明一旦CRISPR/Cas9在一个点中切割DNA,生物体细胞中的DNA修复系统将修复切割位点。TevCas9酶被开发用于在靶标的两个位点处切割DNA,因此细胞的DNA修复系统难以修复切割(Wolfs等人,Biasinggenome-editing events toward precise length deletions with an RNA-guidedTevCas9 dual nuclease[用RNA指导的TevCas9双核酸酶使基因组编辑事件偏向精确长度的缺失],PNAS[美国国家科学院院刊],doi:10.1073)。TevCas9核酸酶是I-Tevi核酸酶结构域与Cas9的融合体。
Cas9核酸酶可以具有与野生型酿脓链球菌(Streptococcuspyrogenes)序列相同的核苷酸序列。在一些实施例中,CRISPR相关内切核酸酶可以是来自其他物种的序列,例如其他链球菌属(Streptococcus)物种,例如嗜热链球菌;铜绿假单胞菌(Psuedomonaaeruginosa),大肠杆菌(Escherichia coli),或其他经测序的细菌基因组和古细菌,或其他原核微生物。可替代地,可以修饰野生型酿脓链球菌Cas9序列。可以对核酸序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中有效表达,即“人源化”。人源化Cas9核酸酶序列可以是例如由Genbank登录号KM099231.1GI:669193757;KM099232.1GI:669193761;或KM099233.1GI:669193765中列出的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列。可替代地,Cas9核酸酶序列可以是例如含有在可商购载体例如来自Addgene公司(剑桥,马萨诸塞州)的PX330或PX260内的序列。在一些实施例中,Cas9内切核酸酶可以具有氨基酸序列,所述的氨基酸序列是Genbank登录号KM099231.1GI:669193757;KM099232.1GI:669193761;或KM099233.1GI:669193765的任何Cas9内切核酸酶序列的变体或片段,或是PX330或PX260(Addgene公司,剑桥,马萨诸塞州)的Cas9氨基酸序列。可以修饰Cas9核苷酸序列以编码Cas9的生物活性变体,并且这些变体可以具有或可以含有例如由于含有一个或多个突变(例如,添加、缺失或取代突变、或这些突变的组合)而不同于野生型Cas9的氨基酸序列。这些取代突变中的一个或多个可以是取代(例如,保守的氨基酸取代)。例如,Cas9多肽的生物活性变体可以具有与野生型Cas9多肽具有至少或约50%序列同一性(例如,至少或约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性)的氨基酸序列。保守性氨基酸取代典型地包括在下组内的取代:甘氨酸和丙氨酸;缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸;天冬氨酸和谷氨酸;天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸;赖氨酸、组氨酸和精氨酸;以及苯丙氨酸和酪氨酸。Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的氨基酸残基以及非标准氨基酸(例如具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包括是标准残基的修饰版本的氨基酸残基(例如吡咯赖氨酸可以用来代替赖氨酸,以及硒代半胱氨酸可以用来代替半胱氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是那些在自然界中未被发现,但符合氨基酸的基本化学式并可以掺入肽中的氨基酸残基。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。对于其他实例,可以查阅教科书或浏览万维网(该网站目前由加利福尼亚理工学院维护并显示已经成功掺入功能性蛋白质中的非天然氨基酸的结构)。Cas-9还可以是下表1中示出的任何一种。
表1
尽管RNA指导的内切核酸酶Cas9已经成为一种通用的基因组编辑平台,但有些报道称,常用的来自酿脓链球菌(SpCas9)的Cas9的大小限制了其用于基础研究和使用高度通用的腺相关病毒(AAV)递送媒介物的治疗应用的效用。因此,已经使用了六个较小的Cas9直系同源物,并且报道已显示来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)可以编辑基因组,其效率类似于SpCas9,但是比它短了多于1千碱基。SaCas9为1053bp,而SpCas9为1358bp。
Cas9核酸酶序列或本文所述的任何基因编辑器效应序列可以是突变序列。例如,Cas9核酸酶可以在保守的HNH和RuvC结构域中突变,这些结构域参与链特异性切割。例如,RuvC催化结构域中的天冬氨酸-丙氨酸(D10A)突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)使DNA产生缺口而不是切割DNA,以产生单链断裂,并且随后通过HDR进行的优先修复可以潜在地减少不希望的来自脱靶双链断裂的插入缺失突变的频率。通常地,基因编辑器效应序列的突变可以最小化或阻止脱靶。
基因编辑器效应子也可以是CasX或CasY。CasX在5'端有TTC PAM(类似于Cpf1)。TTC PAM在富含GC的病毒基因组中可能存在局限性,但在缺乏GC的病毒基因组中则没有那么多。CasX的大小(986bp),比其他V型蛋白小,在递送质粒中提供了四个gRNA和一个siRNA的潜力。CasX可以衍生自δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)或浮霉菌(Planctomycetes)。
基因编辑器效应子也可以是古细菌Cas9。古细菌Cas9的大小为950aa ARMAN 1和967aa ARMAN 4。古细菌Cas9可以衍生自ARMAN-1(Candidatus Micrarchaeum acidiphilumARMAN-1)或ARMAN-4(Candidatus Parvarchaeum acidiphilum ARMAN-4)。ARMAN 1和ARMAN4的序列如下。
在本发明中,当这些组合物中的任一个包含在表达载体内时,CRISPR内切核酸酶可以由与gRNA序列相同的核酸或载体编码。可替代地或另外地,CRISPR内切核酸酶可以在来自gRNA序列的物理分离的核酸中或在单独的载体中编码。
还提供了含有例如本文所述的那些核酸的载体。“载体”是复制子,例如质粒、噬菌体或粘粒,向其中可插入另一个DNA片段以引起插入片段的复制。通常,载体在与适当控制元件缔合时能够复制。合适的载体骨架包括例如本领域常规使用的那些,例如质粒、病毒、人造染色体、BAC、YAC或PAC。术语“载体”包括克隆和表达载体,以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调控区域的载体。许多载体和表达系统可从诺瓦根公司(Novagen)(麦迪逊,威斯康辛州)、克隆科技公司(Clontech)(帕洛阿尔托,加利福尼亚州)、斯图特基因公司(Stratagene)(拉荷亚,加利福尼亚州)和英杰公司(Invitrogen)/生命技术公司(LifeTechnologies)(卡尔斯巴德,加利福尼亚州)等公司商购。
本文提供的载体还可以包括例如复制起点、支架附着区(SAR)和/或标志。标志基因可赋予宿主细胞可选择的表型。例如,标志可赋予杀生物剂抗性,例如对抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)的抗性。如上所指出,表达载体可以包括标签序列,该标签序列被设计成促进表达的多肽的操作或检测(例如纯化或定位)。标签序列,例如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血凝素或FlagTM标签(柯达公司,纽黑文,康涅狄格州)序列典型地表达为与编码的多肽的融合体。这样的标签可以插入多肽内的任何位置,包括羧基或氨基末端处。
另外的表达载体也可以包括例如染色体的、非染色体的和合成的DNA序列的区段。合适的载体包括SV40的衍生物和已知细菌质粒,例如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物,质粒例如RP4;噬菌体DNA,例如噬菌体1的众多衍生物,例如NM989,以及其他噬菌体DNA,例如M13和丝状单链噬菌体DNA;酵母质粒例如2μ质粒或其衍生物;在真核细胞中有用的载体,例如在昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体;衍生自质粒和噬菌体DNA组合的载体,例如已修饰为采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒。
还可以使用酵母表达系统。根据本发明可以使用例如,非融合pYES2载体(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1和HindIII克隆位点;Invitrogen)或融合体pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI和HindIII克隆位点,用ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N端肽;英杰公司),仅提及两种。根据本发明也可以制备酵母双杂交表达系统。
该载体还可以包括调控区域。术语“调控区域”是指影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核苷酸序列。调控区域包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、核定位信号和内含子。
如本文所使用的,术语“有效地连接”是指将调控区域和待转录的序列定位在核酸中以影响这种序列的转录或翻译。例如,为了使编码序列处于启动子的控制之下,多肽的翻译阅读框的翻译起始位点通常位于启动子下游一个至约五十个核苷酸之间。然而,启动子可位于翻译起始位点上游约5,000个核苷酸处或转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子典型地包含至少一个核心(基础)启动子。启动子还可以包括至少一个控制元件,例如增强子序列、上游元件或上游激活区域(UAR)。待包括的启动子的选择取决于几个因素,包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平以及细胞或组织优先表达。本领域技术人员通过适当选择和定位相对于编码序列的启动子和其他调控区域来调控编码序列的表达是常规问题。
载体包括例如病毒载体(例如腺病毒(“Ad”)、腺相关病毒(AAV)、以及水泡性口炎病毒(VSV)和逆转录病毒)、脂质体和其他含脂质的复合物,以及其他能够介导多核苷酸到宿主细胞的递送的大分子复合物。载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或者以其他方式对靶细胞提供有益特性的其他组分或功能性。如以下所述以及更详细所示,这样的其他组分包括,例如,影响与细胞结合或靶向的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分);影响细胞吸收载体核酸的组分;影响吸收后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂);和影响多核苷酸表达的组分。此类组分还可能包括标志,例如可以用来检测或选择细胞的可检测和/或选择性标志,这些细胞已经摄取并且正在表达由该载体递送的核酸。此类组分可以作为载体(例如使用某些具有或介导结合以及摄取的组分或功能性的病毒载体)的自然特征而提供,或者载体可以被改性为提供此种功能性。其他载体包括那些由Chen等人,BioTechniques[生物技术],34:167-171(2003)描述的那些载体。各种各样的此类载体在本领域中是已知的,并且通常是可得的。
“重组病毒载体”是指包含一种或多种异源基因产物或序列的病毒载体。由于许多病毒载体表现出与包装相关的尺寸限制,所以这些异源基因产物或序列典型地通过替代该病毒基因组的一个或多个部分而引入。此类病毒可能变成复制缺陷型的,从而要求在病毒的复制和包封期间以反式提供一种或多种删除功能(通过使用,例如携带复制和/或包封所必要的基因产物的辅助病毒或包装细胞系)。已经对其中在病毒颗粒外面上携带有待递送的多核苷酸的改性病毒载体进行了描述(参见,例如Curiel,D T等人,PNAS[美国国家科学院院刊]88:8850-8854,1991)。
适合的核酸递送系统包括重组病毒载体,典型地是来自腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、依赖辅助病毒的腺病毒、逆转录病毒、或日本脂质体(HVJ)复合物的血凝病毒中至少一种的序列。在这样的情况中,该病毒载体包含有效地连接到该多核苷酸上的强真核启动子,例如巨细胞病毒(CMV)启动子。重组病毒载体可以在其中包含一个或多个多核苷酸,优选约一个多核苷酸。在一些实施例中,在本发明的方法中所使用的病毒载体具有从约108至约5x 1010pfu的pfu(斑形成单位)。在其中多核苷酸与一种非病毒载体一起施用的实施例中,使用从约0.1纳克至约4000微克经常是有用的,例如约1纳克至约100微克。
另外的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒以及基于HIV的病毒。一种基于HIV的病毒载体包括至少两种载体,其中gag和pol基因来自HIV基因组并且env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体包括痘病毒载体,例如正痘病毒或禽痘病毒载体;疱疹病毒载体,例如单纯疱疹病毒I(HSV)载体[Geller,A.I.等人,J.Neurochem[神经化学杂志],64:487(1995);Lim,F.等人,DNA Cloning:MammalianSystems[DNA克隆:哺乳动物系统],D.Glover编辑(Oxford Univ.Press,Oxford England[牛津大学出版社,英格兰牛津])(1995);Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.[美国国家科学院院刊]:90 7603(1993);Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]:87:1149(1990)];腺病毒载体[LeGal LaSalle等人,Science[科学],259:988(1993);Davidson等人,Nat.Genet.[自然基因学]3:219(1993);Yang,等人,J.Virol.[病毒学杂志]69:2004(1995)];以及腺相关病毒载体[Kaplitt,M.G.等人,Nat.Genet.[自然遗传学]8:148(1994)]。
痘病毒载体可将基因导入到细胞质内。禽痘病毒载体只产生核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒(HSV)载体可以是一些发明实施例的指示。腺病毒载体导致了比腺相关病毒更短期的表达(例如,小于约一个月),在一些实施例中可以显示远远更长的表达。所选择的具体载体将取决于靶细胞以及正在治疗的病况。适当的启动子的选择可以很容易地完成。适合的启动子的实例是763-碱基对巨细胞病毒(CMV)启动子。可用于基因表达的其他合适的启动子包括但不限于劳斯氏肉瘤病毒(RSV)(Davis等人,HumGene Ther[人类基因治疗]4:151(1993))、SV40早期启动子区域、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(MMT)基因的调控序列、原核表达载体(如β-内酰胺酶启动子)、tac启动子、来自酵母或其他真菌的启动子元件(如Gal 4启动子)、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子;以及表现组织特异性且已用于转基因动物中的动物转录控制区:在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区,在胰岛β细胞中有活性的胰岛素基因控制区,在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区,在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区,在肝中有活性的白蛋白基因控制区,在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区,在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区,在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区,在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区,在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区,和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。某些蛋白可以使用其天然启动子表达。还可以包括其他的增强表达的元件,例如导致高水平表达的增强子或系统,例如tat基因和tar元件。这种盒然后可以插入到载体中,例如质粒载体,如pUC19、pUC118、pBR322或其他已知的质粒载体,该盒包括例如大肠杆菌复制起点。参见,Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],(1989)。这种质粒载体还可以包括一种选择性标志,例如用于氨苄青霉素耐药性的β-内酰胺酶基因,条件是标志多肽不会不利地影响正在治疗的有机体的新陈代谢。该盒还可以与合成递送系统(例如在WO95/22618中披露的系统)中的核酸结合部分进行结合。
如果需要,本发明的多核苷酸还可以与微量递送媒介物例如阳离子脂质体和腺病毒载体一起使用。对于脂质体制备、内容物的靶向和递送程序的综述,参见Mannino和Gould-Fogerite,BioTechniques[生物技术公司],6:682(1988)。还参见Felgner和Holm,Bethesda Res.Lab.Focus[贝塞斯达研究实验室焦点杂志],11(2):21(1989)以及Maurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus[贝塞斯达研究实验室焦点杂志],11(2):25(1989)。
复制缺陷型重组腺病毒载体可以根据已知技术生产。参见,Quantin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:2581-2584(1992);Stratford-Perricadet等人,J.Clin.Invest.[临床研究杂志],90:626-630(1992);以及Rosenfeld等人,Cell[细胞]68:143-155(1992)。
另一种递送方法是使用产生单链DNA的载体,这些载体可以在细胞内生产生表达产物。参见,例如Chen等人,BioTechniques[生物技术],34:167-171(2003),将其通过引用以其全文并入本文。或者,也可以使用RNA和/或蛋白质治疗性递送。
如上所述,本发明的组合物能以本领域普通技术人员已知的各种方式制备。无论其原始来源或获得其的方式如何,本发明的组合物都可以根据它们的用途来配制。例如,可将上述核酸和载体配制在组合物中以施用于组织培养中的细胞或施用患者或受试者。可以配制本发明的任何药物组合物用于制备药物,并且在治疗的上下文中特定用途如下所示。当用作药物时,任何核酸和载体能以药物组合物的形式施用。这些组合物可以按制药领域中熟知的方式制备,并且可以通过多种途径施用,取决于希望局部治疗还是全身性治疗并且取决于有待治疗的部位。施用可以是局部的(包括眼的和至粘膜,包括鼻内、阴道和直肠递送)、肺部的(例如,通过吸入或吹入粉末或气溶胶,包括通过喷雾器;气管内、鼻内、表皮和经皮肤)、眼部的、口腔的或肠胃外的。用于眼部递送的方法可以包括局部施用(滴眼剂),结膜下、眼周或玻璃体内注射或者通过用手术方法放置在结膜囊中的气囊式导管或眼科插入件引入。肠胃外施用包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注;或颅内的,例如鞘内的或心室内的施用。肠胃外施用可以处于单次推注剂量的形式,或者可以例如通过连续灌注泵。用于局部施用的药物组合物和配制品可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉剂等。常规的药物载体、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或希望的。
本发明还包括药物组合物,其含有与一种或多种药学上可接受的载体组合的作为活性成分的本文所述的核酸和载体。我们使用术语“药学上可接受的”(或者“药理学上可接受的”)指当施用于适当的动物或人类时,不产生不利的、过敏的或者其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所使用的,“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、黏合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等,其可以用作用于药学上可接受的物质的介质。在制备本发明的组合物中,典型地将活性成分与赋形剂混合,用赋形剂稀释或封装在这样一种载体之内,该载体呈例如胶囊、片剂、药袋(sachet)、纸或其他容器的形式。当赋形剂用作稀释剂时,其可以是固体、半固体、或液体材料(例如,生理盐水),其用作活性成分的媒介物、载体或介质。因此,这些组合物可以呈片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、洗剂、乳膏、软膏、凝胶剂、软和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌可注射溶液以及无菌包装粉剂的形式。如本领域已知的,稀释剂的类型可以根据预期的施用途径而变化。所得组合物可包括另外的试剂,例如防腐剂。在一些实施例中,载体可以是或可以包括基于脂质或基于聚合物的胶体。在一些实施例中,载体材料可以是配制成脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒或嵌段共聚物胶束的胶体。如指出的,载体材料可以形成胶囊,并且该材料可以是基于聚合物的胶体。
本发明的核酸序列可以被递送至受试者的合适的细胞。这可以通过例如使用聚合的、生物可降解的微粒或微胶囊递送媒介物来实现,其尺寸被设计成通过吞噬细胞如巨噬细胞优化吞噬作用。例如,可以使用直径约1-10μm的PLGA(聚-乳酸-共-乙交酯)微粒。将多核苷酸包封在这些微粒中,这些微粒被巨噬细胞吸收并在细胞内逐渐生物降解,由此释放多核苷酸。一旦释放,DNA在细胞内表达。第二种类型的微粒意图不被细胞直接吸收,而是主要起核酸的缓释储库的作用,其仅在通过生物降解从微粒释放时才被细胞吸收。因此这些聚合物颗粒应该足够大以排除吞噬作用(即大于5μm并且优选地大于20μm)。实现核酸吸收的另一种方式是使用通过标准方法制备的脂质体。核酸可以单独掺入这些递送媒介物中或与组织特异性抗体共同掺入,例如靶向病毒感染常见的潜伏感染宿主(例如脑巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和肠相关淋巴细胞)的细胞类型的抗体。可替代地,可以通过静电或共价力制备由质粒或附接至聚-L-赖氨酸的其他载体构成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合可结合靶细胞受体的配体。将“裸DNA”(即不含递送媒介物)递送到肌内、皮内或皮下位点是实现体内表达的另一种方式。在相关多核苷酸(例如表达载体)中,对包含CRISPR相关内切核酸酶编码序列的分离的核酸序列和指导RNA进行编码的核酸序列有效地连接启动子或增强子-启动子组合。上面描述了启动子和增强子。
在一些实施例中,本发明的组合物可以被配制成纳米颗粒,例如纳米颗粒由与DNA复合的高分子量直链聚乙烯亚胺(LPEI)的核心构成,并被聚乙二醇修饰的(聚乙二醇化的)低分子量LPEI的壳包围。
核酸和载体也可以应用于装置(例如导管)的表面或包含在泵、贴片或其他药物递送装置内。本发明的核酸和载体可以是在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)的存在下单独或以混合物的形式施用。根据施用方式和途径选择赋形剂或载体。用于药物配制品的合适的药物载体以及药物必需品描述于本领域公知的参考文献雷明顿的药学科学(E.W.Martin),以及USP/NF(美国药典和国家处方集)中。
本发明的方法可以根据药物的制备来表达。因此,本发明包括本文所述的试剂和组合物在制备药物中的用途。本文所述的化合物可用于治疗性组合物和方案或用于制造用于治疗如本文所述的疾病或病症的药物。
本文所述的任何组合物可以向宿主身体的任何部位施用以用于随后递送至靶细胞。组合物可递送至但不限于哺乳动物的脑、脑脊髓液、关节、鼻粘膜、血液、肺、肠、肌肉组织、皮肤或腹膜腔。就递送途径而言,可以通过以下方式施用组合物:静脉内、颅内、腹膜内、肌内、皮下、肌内、直肠内、阴道内、鞘内、气管内、皮内或经皮注射;通过口服或鼻腔施用;或通过随时间逐渐灌注。在另外的实例中,组合物的气溶胶制剂可通过吸入给予宿主。
所需剂量将取决于施用途径,配制品的性质,动物疾病的性质,动物的体型、体重、表面积、年龄和性别,正在施用的其他药物以及主治医生的判断。鉴于细胞靶标的多样性和各种施用途径的不同效率,预期所需剂量有广泛变化。正如本领域完全领会的,可使用标准经验性路径来调整这些剂量水平的变化以进行优化。施用可以是单次或多次(例如2倍或3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍或更多倍)。将化合物包封在合适的递送媒介物(例如聚合物微粒或可植入装置)中以增加递送效率。可以给予剂量以提供完全的病毒载量消除。还可以给予剂量以减少动物体内的病毒载量,以允许对剩余的病毒载量进行免疫破坏。
用本文提供的任何组合物的治疗的持续时间可以是从短至一天至长至宿主寿命(例如多年)的任何时间长度。例如,化合物可以每周施用一次(例如,持续4周至几个月或几年);每月一次(例如,持续三到十二个月或多年);或者每年一次,为期5年、十年或更长时间。还应注意的是治疗的频率可以变化。例如,本发明化合物可以每天、每周、每月或每年施用一次(或两次、三次等)。
有效量的本文提供的任何组合物可以施用于需要治疗的个体。如本文所使用的,术语“有效的”是指诱导希望的应答而不诱导患者显著毒性的任何量。这种量可以通过在施用已知量的特定的组合物后评估患者的应答来确定。此外,毒性水平(如果有的话)可以通过在施用已知量的特定组合物之前和之后评估个体的临床症状来确定。应当指出,可以根据希望的结果以及个体的应答和毒性水平来调整施用于患者的特定组合物的有效量。对每个特定个体的显著毒性可能不同,且取决于多种因素,包括但不限于个体的疾病状态、年龄和对副作用的耐受性。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法来确定是否诱发了特定应答。能够评估特定疾病状态程度的临床方法可以用于确定是否诱发了应答。用于评估应答的具体方法将取决于个体病症的性质、个体的年龄和性别、所施用的其他药物以及主治医师的判断。可以监测个体中的病毒载量,例如与测量每毫升血液中的病毒RNA的血液测试一样。此类测试的实例包括定量分支DNA(bDNA)、逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)和定性转录介导的扩增。
本发明还提供了治疗ASFV的具体方法。据推测,ASFV既具有裂解性又具有溶原性。在该病毒的早期阶段,它很可能被锁定在溶原性复制周期中,在这里它从单核细胞/巨噬细胞细胞膜出芽,从而产生被含有病毒和宿主细胞蛋白的外膜脂质双层包围的ASFV颗粒。随着病毒在猪体内传播,推测某些东西将溶原周期转变为裂解周期(机制不明确)。在裂解周期中,受感染的细胞破裂,将ASFV(没有外膜,仅衣壳)送入受感染的猪体内,如图1所示。已经表明两种类型的ASFV病毒粒子都具有传染性。
抗体和基于抗原的疫苗没有起效,这可能是因为它们的开发策略没有考虑到两种类型的复制周期——溶原周期和裂解周期。例如,靶向衣壳蛋白的抗体(作为治疗剂直接注射的抗体,或在体内由对病毒肽的免疫应答刺激的抗体)可能不会中和ASFV病毒粒子,因为衣壳受到外膜的保护(即无法接近)。随着病毒复制周期转变为裂解周期,抗体确实可能与其各自的衣壳表位相互作用,但在这个阶段,体内病毒滴度可能太高而无法具有有效且持久的中和应答。这与病毒的快速扩张(与病毒相关的24至72小时100%死亡率相关)相结合,导致身体因病毒而不堪重负。由于抗原几乎总是以衣壳为基础,因此抗原刺激作为预防措施在过去没有起作用。因此,产生IgG的B细胞应答不能识别被外膜包围的早期ASFV(如图2所示)。
因此,本发明提供了在个体中用溶原性和裂解性病毒治疗病毒感染的方法,该方法通过施用靶向病毒溶原期外膜上的蛋白的病毒抗原,施用靶向病毒裂解期衣壳上的蛋白的病毒抗原,并且治疗病毒感染。
为了克服这些挑战,新的双重策略是必要的。
1.猪需要用衍生自ASFV外膜上存在的病毒蛋白的病毒抗原刺激,以中和在感染早期发芽(溶原性)的病毒粒子。
2.猪还需要用衍生自衣壳上存在的病毒蛋白的病毒抗原治疗,以中和在感染晚期没有外膜(裂解性)的病毒粒子。
最近,鉴定出了负责细胞外病毒与红细胞对接(使病毒在循环血液中快速分布的可能的机制)的病毒外膜。这种蛋白质称为pE402R,其与人CD2同源。此外,pE402R也被证明通过抑制淋巴细胞增殖而负责免疫抑制活性。因此,出于疫苗或治疗目的,通过靶向pE402R蛋白,将极大地抑制细胞外病毒在整个生物体中的传播以及阻止淋巴细胞抑制(如图3A所示)。
构成衣壳的病毒结构的其他关键蛋白包括pE102R、p72和p49。这三种蛋白质可以作为疫苗和/或治疗方法的靶标,以中和缺乏外膜的细胞外病毒粒子(作为裂解周期的结果)(如图3B所示)。
因此,可以用衍生自pE402R和/或pE102R、p72、p49的全蛋白或肽(表面暴露)或肽的混合物对猪进行治疗。该治疗在猪体内产生B细胞应答(即时的和记忆的),作为抗ASFV的预防性措施。pE402R蛋白(并且不是全蛋白)的肽段可用于产生免疫刺激应答。该肽不包括任何与人CD2同源的氨基酸序列,以防止抗体脱靶。图4示出了该策略。
本发明还提供了用于在个体中用溶原性和裂解性病毒治疗病毒感染的组合物,该组合物包含靶向病毒溶原期外膜上的蛋白的病毒抗原和靶向病毒裂解期衣壳上的蛋白的病毒抗原。
治疗可以包括使用以下中的至少一种的抗原刺激方法:
1.两次分开的注射,每次各自用pE402R肽注射,然后用全蛋白pE102R、p72或p49注射。
2.两次分开注射衍生自pE402R或pE102R、p72、p49中的每一个的肽片段。该一种或多种肽可以衍生自暴露在外膜或衣壳的外表面上的表位。
3.两次分开注射衍生自pE402R或pE102R、p72、p49中的每一个的一种或多种肽片段池。该肽池将衍生自暴露在外膜或衣壳外表面上的表位。
4.一次注射,含有各自用pE402R肽注射,然后用全蛋白pE102R、p72或p49注射的注射。
5.一次注射,含有衍生自pE402R和pE102R、p72和p49中的每一个的肽片段。该肽可以衍生自暴露在外膜或衣壳的外表面上的表位。
6.一次注射,含有衍生自pE402R或pE102R、p72、p49中的每一个的肽片段池。该肽池可以衍生自暴露在外膜或衣壳外表面上的表位。
这些策略中的每一种都不限于pE402R、pE102R、p72或p49,因为额外的外膜和衣壳蛋白可以用于相同的目的/结果。
pE402R和/或pE102R、p72、p49全蛋白或其一种或多种肽的任何组合可用作抗原以使用任何类型的抗体发现平台来发现抗体。仅举几例,其中一些平台包括B细胞中基因编辑驱动的抗体过表达系统、噬菌体文库、酵母表达系统、纳米孔GFP标记系统。一旦发现抗体,就可以测试它们的亲和力、亲合力、特异性、选择性、稳定性、精确度、稳健性,并且最佳候选物(来源于平台筛选)可以在猪被感染后用作治疗性治疗以中和病毒pE402R和/或pE102R、p72、p49(或其他外膜和/或衣壳蛋白)。
治疗性治疗可以包括以下中的至少一种:两次分开的注射,每次各自注射针对pE402R和/或pE102R、p72、p49的抗体(或几种中和抗体);或一次注射,含有针对pE402R和/或pE102R、p72、p49的抗体池。如果病毒跨越物种,这种策略也可用于治疗人类。
因此,本发明提供了在个体中用溶原性和裂解性病毒发现用于治疗病毒感染的抗体的方法,该方法通过将病毒溶原期外膜上的靶蛋白和病毒裂解期衣壳上的靶蛋白的全蛋白或肽段用作抗原以使用抗体发现平台发现抗体,测试被发现的抗体的亲和力、亲合力、特异性、选择性、稳定性、精密度和稳健性,并且选择最佳候选抗体作为病毒感染的治疗性治疗。本发明还提供了通过该方法发现的抗体。
在整个申请中,将包括美国专利在内的各种出版物均通过作者和年份以及专利号进行引用。下面列出了这些出版物的完整引文。这些出版物和专利的披露内容以其全文通过引用特此并入本申请中,以便更全面地描述本发明所属领域的现状。
已经以示例性的方式描述了本发明,并且应理解,已经使用的术语意在具有说明性词语的性质,而非限制性的。
显而易见地,能够根据以上教导进行本发明的很多修改和变化。因此,应当理解,在所附权利要求的范围内可以用不同于具体描述的方式来实践本发明。
Claims (26)
1.一种在动物中预防和治疗细菌或病毒感染、或癌症的方法,该方法包括以下步骤:
抑制动物中的病毒进入蛋白与细胞受体的相互作用,以及
预防和治疗动物中的细菌或病毒感染、或癌症。
2.如权利要求1所述的方法,其中该抑制步骤被进一步定义为选自由以下组成的组的步骤:进行小分子非竞争性抑制或进行竞争性抑制,并且通过基因编辑方法进行细胞受体改变。
3.如权利要求1所述的方法,其中该病毒感染是非洲猪瘟病毒(ASFV)。
4.如权利要求1所述的方法,其中该细菌感染选自由以下组成的组:炭疽杆菌、酿脓链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、类鼻疽假单孢菌、Achromobacter anitratium、猪肺炎支原体、A和D型多杀性巴氏杆菌、猪嗜血杆菌、肉毒杆菌、大肠弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸭沙门氏菌、大肠杆菌、坏死圆杆菌、猪布鲁氏杆菌、流产布鲁氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、化脓棒杆菌、林氏放线杆菌、波蒙纳钩端螺旋体、猪型钩螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、秋令热钩端螺旋体、兽疫链球菌、似马链球菌、破伤风梭菌、牛放线菌、败毒梭菌、林氏放线杆菌、奇异变形杆菌、化脓性棒状杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪鼻支原体和猪丹毒杆菌。
5.如权利要求1所述的方法,该方法进一步包括,在所述抑制步骤之前,进行受体筛选并鉴定与病毒附着及进入蛋白相互作用的细胞受体的步骤。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述进行竞争性抑制并且通过基因编辑方法进行细胞受体改变进一步包括通过使进入蛋白功能障碍或将其破坏来阻止病毒结合的步骤。
7.如权利要求6所述的方法,其中这些基因编辑方法使用选自由以下组成的组的核酸酶:锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶、人WRN、C2c2、C2c1、C2c3、CRISPR Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/TevCas9、CasX、CasY和古细菌Cas9。
8.一种在个体中用溶原性和裂解性病毒治疗病毒感染的方法,该方法包括以下步骤:
施用靶向该病毒溶原期外膜上的蛋白的病毒抗原;
施用靶向该病毒裂解期衣壳上的蛋白的病毒抗原;以及
治疗该病毒感染。
9.如权利要求8所述的方法,其中该病毒感染是ASFV。
10.如权利要求9所述的方法,其中该个体是猪。
11.如权利要求9所述的方法,其中所述施用靶向该病毒溶原期外膜上的蛋白的病毒抗原的步骤被进一步定义为靶向pE402R。
12.如权利要求10所述的方法,其中所述施用靶向该病毒裂解期衣壳上的蛋白的病毒抗原的步骤被进一步定义为靶向选自由以下组成的组的蛋白:pE102R、p72、p49及其组合。
13.如权利要求8所述的方法,其中每个所述施用步骤包括施用选自由以下组成的组的组合物:衍生自靶蛋白的全蛋白、肽、肽片段及肽的混合物。
14.如权利要求8所述的方法,其中所述施用步骤通过单次注射或分开的注射进行。
15.如权利要求8所述的方法,其中所述治疗步骤进一步包括在个体中诱导B细胞应答并产生免疫刺激应答的步骤。
16.一种在个体中用溶原性和裂解性病毒治疗病毒感染的组合物,该组合物包含靶向所述病毒溶原期外膜上的蛋白的病毒抗原和靶向所述病毒裂解期衣壳上的蛋白的病毒抗原。
17.如权利要求16所述的组合物,其中所述病毒感染是ASFV。
18.如权利要求17所述的组合物,其中所述个体是猪。
19.如权利要求17所述的组合物,其中所述病毒溶原期外膜上的所述蛋白被进一步定义为pE402R。
20.如权利要求19所述的组合物,其中所述病毒裂解期衣壳上的蛋白被进一步定义为选自由以下组成的组的蛋白:pE102R、p72、p49及其组合。
21.如权利要求16所述的组合物,其中所述组合物包括选自由以下组成的组的病毒抗原:衍生自所述靶蛋白的全蛋白、肽、肽片段及肽的混合物。
22.如权利要求16所述的组合物,其中所述组合物与药学上可接受的赋形剂一起配制在单次注射剂中。
23.如权利要求16所述的组合物,其中所述组合物与药学上可接受的赋形剂一起配制,在第一注射剂中该组合物包含靶向溶原期外膜上的蛋白的所述病毒抗原,并且在第二注射剂中该组合物包含靶向裂解期衣壳上的蛋白的所述病毒抗原。
24.一种在个体中用溶原性和裂解性病毒发现用于治疗病毒感染的抗体的方法,该方法包括以下步骤:
将该病毒溶原期外膜上的靶蛋白和该病毒裂解期衣壳上的靶蛋白的全蛋白或肽用作抗原,以使用抗体发现平台发现抗体;
测试被发现的抗体的亲和力、亲合力、特异性、选择性、稳定性、精密度和稳健性;以及
选择最佳候选抗体作为病毒感染的治疗性治疗。
25.如权利要求24所述的方法,其中该病毒溶原期外膜上的靶蛋白为pE402R,并且其中该病毒裂解期衣壳上的靶蛋白选自由以下组成的组:pE102R、p72、p49及其组合。
26.由如权利要求24所述的方法发现的抗体。
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Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN115927460B (zh) * | 2022-08-11 | 2023-08-29 | 绍兴君斐生物科技有限公司 | 抗非洲猪瘟病毒转基因的重组载体和猪成纤维细胞系及其构建方法和应用 |
CN116554311B (zh) * | 2023-05-04 | 2023-11-21 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 抗CD2v-N的特异性抗体及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006077427A2 (en) * | 2005-01-21 | 2006-07-27 | Mnl Pharma Limited | Antiviral drug combinations |
JP2007145777A (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-14 | Glycomedics Inc | インフルエンザウイルス感染阻害方法 |
WO2015148670A1 (en) * | 2014-03-25 | 2015-10-01 | Editas Medicine Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids |
RU2016115461A (ru) * | 2016-04-20 | 2017-10-25 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Рекомбинационная кассета, содержащая гены EP153R и EP364R штамма Congo (КК-262) вируса африканской чумы свиней и рекомбинантный штамм ΔСongoCD2v вируса африканской чумы свиней |
CN109069560A (zh) * | 2016-06-01 | 2018-12-21 | 切除生物治疗公司 | 用于裂解性病毒和溶原性病毒的组合物和治疗方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8603736B2 (en) * | 2004-06-07 | 2013-12-10 | Monogram Biosciences, Inc. | Compositions and methods for determining resistance to inhibitors of virus entry using recombinant virus assays |
US20060293267A1 (en) * | 2005-04-13 | 2006-12-28 | University Of Massachusetts | Dual functional oligonucleotides for use as anti-viral agents |
US20080131449A1 (en) * | 2006-06-22 | 2008-06-05 | Matthias Rath | Polypeptides from African Swine Fever virus as vaccines for preventive and therapeutic use |
EP2126105A4 (en) * | 2007-02-20 | 2010-11-03 | Anaptysbio Inc | SOMATIC HYPERPERMUTATION SYSTEMS |
WO2010029313A1 (en) * | 2008-09-11 | 2010-03-18 | Summit Corporation Plc. | Antiinfective compounds |
US20110293521A1 (en) * | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Anti-viral compositions and methods for administration |
JP6143853B2 (ja) * | 2012-06-12 | 2017-06-07 | オルタナティブ ジーン エクスプレッション エセ.エレ. | 宿主細胞における組換えタンパク質の発現のためのバキュロウイルスdnaエレメント |
KR20160144383A (ko) * | 2014-04-17 | 2016-12-16 | 인터벳 인터내셔널 비.브이. | 돼지 파르보바이러스 |
CN111315407B (zh) * | 2018-09-11 | 2023-05-02 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用 |
MX2022003068A (es) * | 2019-09-16 | 2022-06-14 | Dalu Chen | Metodos para bloquear la infeccion por asfv mediante la interrupcion de receptores celulares. |
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2022
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006077427A2 (en) * | 2005-01-21 | 2006-07-27 | Mnl Pharma Limited | Antiviral drug combinations |
JP2007145777A (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-14 | Glycomedics Inc | インフルエンザウイルス感染阻害方法 |
WO2015148670A1 (en) * | 2014-03-25 | 2015-10-01 | Editas Medicine Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids |
RU2016115461A (ru) * | 2016-04-20 | 2017-10-25 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Рекомбинационная кассета, содержащая гены EP153R и EP364R штамма Congo (КК-262) вируса африканской чумы свиней и рекомбинантный штамм ΔСongoCD2v вируса африканской чумы свиней |
CN109069560A (zh) * | 2016-06-01 | 2018-12-21 | 切除生物治疗公司 | 用于裂解性病毒和溶原性病毒的组合物和治疗方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MARÍA L. SALAS等: "African swine fever virus morphogenesis", 《VIRUS RESEARCH》, vol. 173, no. 1, 30 April 2013 (2013-04-30), pages 29 - 41, XP028525461, DOI: 10.1016/j.virusres.2012.09.016 * |
侯绍华等: "非洲猪瘟病毒p72蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析", 《 中国预防兽医学报》, vol. 34, no. 1, 15 May 2012 (2012-05-15), pages 33 - 36 * |
李根;刘军花;赫丽杰;尹秀山;: "CRISPR-Cas9应用于病毒性传染病防控的研究进展", 生物化学与生物物理进展, no. 10, 25 October 2018 (2018-10-25), pages 1006 - 1025 * |
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