CN114712499B - 一种负载no的超分子聚肽纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载NO的超分子聚肽纳米药物及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。所述负载NO的超分子聚肽纳米药物由吡啶‑聚（L‑半胱氨酸）‑S‑亚硝基、柱[5]芳烃、阿霉素和吲哚菁绿制得。本发明通过水溶性柱[5]芳烃与吡啶盐的主客体作用，制备了负载NO的超分子聚肽纳米药物，用于同时输送化疗药物阿霉素与光热转换剂吲哚菁绿。在近红外光照射下，吲哚菁绿吸收光能转换成热能，同时热能使纳米药物释放出NO，逆转肿瘤的多药耐药性，协同促进阿霉素的化疗效果，形成光热治疗‑NO气体治疗‑化疗的三重协同治疗。

Description

一种负载NO的超分子聚肽纳米药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种负载NO的超分子聚肽纳米药物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症严重危及人类生存和社会的发展，是全世界公认的公共卫生问题。如何有效地治疗癌症成为全球性的一个难题。目前，临床化疗仍是治疗癌症的主要手段之一。但是，化疗往往存在着杀死正常细胞、破坏免疫系统和增加二次癌症发病率的风险，而且多药耐药性的产生也严重影响了化疗的效果。一氧化氮(NO)作为一种人体内源性气体，在高浓度时不仅能抑制肿瘤生长，还可以诱导肿瘤细胞凋亡，甚至能直接对肿瘤细胞造成杀伤，同时能抑制转运糖蛋白P-gp(多药耐药性(MDR)的主要原因之一)的表达水平同其他治疗方案相联合具备巨大的潜力，能够获得更加良好的协同抗肿瘤效应，这对耐药肿瘤的治疗极为有益。

光热疗法作为治疗癌症的高效新型技术，虽然具有高选择性和微创性，也会受到间歇性照射、局部组织过热损伤、疤痕化、肿瘤消融不完全和复发等临床应用难题。因此，利用个体化治疗的优势进行联合治疗，开发具有光热疗-化疗一体化协同作用的纳米药物体系，为解决上述问题提供了一种提高疗效、减少副作用的综合治疗策略，具有实现肿瘤高效治疗的临床应用前景。因此，将刺激响应性、前药和纳米药物相结合，设计制备刺激响应性的纳米前药体系，对癌症治疗领域具有重要的研究意义以及实用价值。

传统的两亲性聚肽是通过共价键链接亲疏水链段，其合成过程复杂且分子量也难以精确调控，从而影响其组装体的形貌和尺寸，而这又对纳米药物的抗肿瘤效果有着十分重要的影响。为了充分发挥刺激响应性聚肽纳米药物输送体系的潜力，急需一种高效简洁的方法来制备多功能两亲性聚肽。因此，通过在聚肽中引入大环化合物，如环糊精、杯芳烃、葫芦脲、柱芳烃等，利用主客体识别作用进一步构建两亲性超分子聚肽，不仅简化了合成步骤，缩短了制备过程和成本，还使得组装体的尺寸和形貌更易于预测和调控，有利于实现纳米药物在肿瘤部位的富集和肿瘤细胞内药物的可控释放。

Chang-Ming Dong等人在Zwitterionic polypeptide nanomedicine with dualNIR/reduction-responsivity for synergistic cancer photothermal-chemotherapy(Polym.Chem.,2019,10,4825-4836)这一研究中报道了关于两性离子聚肽纳米药物的制备及其性能研究。但是，上述体系中两性离子聚肽纳米药物存在结构单一，无法解决肿瘤多药耐药性等问题，不能实现对多药耐药性细胞的光热疗法-化疗一体化治疗，难于在临床中转化和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种负载NO的超分子聚肽纳米药物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，以解决原有技术中纳米药物结构单一、无法解决肿瘤多药耐药性等问题，从而实现光热治疗-NO气体治疗-化疗的三重协同治疗。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种负载NO的超分子聚肽纳米药物，由吡啶-聚(L-半胱氨酸)-S-亚硝基、水溶性柱[5]芳烃、阿霉素和吲哚菁绿制得；

所述吡啶-聚(L-半胱氨酸)-S-亚硝基的结构式如下式所示：

所述水溶性柱[5]芳烃的结构式如下式所示：

上述超分子聚肽纳米药物的制备方法，具体为：将吡啶-聚(L-半胱氨酸)-S-亚硝基、阿霉素、吲哚菁绿溶于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌后滴加水溶性柱[5]芳烃的去离子水溶液，搅拌后经透析得到负载NO的超分子聚肽纳米药物。

在本发明的一个具体实施例中，所述方法中，吡啶-聚(L-半胱氨酸)-S-亚硝基的浓度为7.0mg/mL。

在本发明的一个具体实施例中，所述方法中，阿霉素的浓度为3.0mg/mL。

在本发明的一个具体实施例中，所述方法中，吲哚菁绿的浓度为3.0mg/mL。

在本发明的一个具体实施例中，所述方法中，水溶性柱[5]芳烃的浓度为0.19mg/mL。

在本发明的一个具体实施例中，所述方法中，N,N-二甲基甲酰胺溶剂与水的体积比为1:30。

在本发明的一个具体实施例中，所述方法的搅拌条件依次为：室温搅拌3h、48h。

在本发明的一个具体实施例中，所述方法的透析条件是：用分子量3500的透析袋，去离子水500mL×1次/8h，透析24h。

本发明还提供所述负载NO的超分子聚肽纳米药物在制备肿瘤治疗产品中的应用，具体而言，所述的负载NO的超分子聚肽纳米药物可用于抗肿瘤光热治疗、NO气体治疗和化疗的联合治疗。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的负载NO的超分子聚肽纳米药物可用于杀死人乳腺癌细胞的耐药细胞肿瘤(MCF-7/ADR)，并且在一次给药和一次光照后，所述的负载NO的超分子聚肽纳米药物能够明显抑制MCF-7/ADR肿瘤的生长，表明具有逆转多药耐药性的光热治疗-NO气体治疗-化疗一体化的技术具有优异的抗肿瘤作用。

所述负载NO的超分子聚肽纳米药物中，其成分阿霉素系化疗，吲哚菁绿系光热治疗，吡啶-聚(L-半胱氨酸)-S-亚硝基系NO气体治疗，光热治疗、NO气体治疗和化疗三者协同治疗。

本发明通过水溶性柱[5]芳烃与吡啶盐的主客体作用，制备了负载NO的超分子聚肽纳米药物，用于同时输送化疗药物阿霉素与光热转换剂吲哚菁绿。在近红外光照射下，吲哚菁绿吸收光能转换成热能，同时热能使纳米药物释放出NO，逆转肿瘤的多药耐药性，协同促进阿霉素的化疗效果，形成光热治疗-NO气体治疗-化疗的三重协同治疗。

本发明负载NO的超分子聚肽纳米药物用于具有逆转多药耐药性功能的光热疗-NO气体治疗-化疗一体化治疗体系提供了一种简单而有效的途径。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)高效合成了一种用于负载NO的超分子聚肽纳米药物。

(2)该负载NO的超分子聚肽纳米药物，在近红外光照条件下(光强1W/cm²、波长808nm、光照时间5min)，吲哚菁绿组分能够吸收近红外光转换成热能，杀死肿瘤细胞，实现光热治疗。

(3)该负载NO的超分子聚肽纳米药物，S-亚硝基组分能够在热能的作用下释放出NO气体，逆转肿瘤细胞的多药耐药性，提高肿瘤细胞对药物的摄取。

(4)该负载NO的超分子聚肽纳米药物，在进入肿瘤细胞的酸性环境中，柱[5]芳烃和吡啶盐发生解组装，响应性释放出抗癌药物阿霉素，杀死肿瘤细胞，实现化疗。

(5)该具有逆转多药耐药性功能的光热疗-NO气体治疗-化疗一体化治疗技术操作简单，能够实现多药耐药肿瘤细胞的有效治疗，具有重要的临床应用前景。

(6)本发明为制备负载NO的超分子聚肽纳米药物提供了一种简单而有效的途径，为获得具有逆转多药耐药性功能的光热疗-NO气体治疗-化疗一体化治疗的超分子聚肽纳米药物提供了很好的实验平台。

附图说明

图1为实施例1中负载NO的超分子聚肽纳米药物的动态光散射图谱。

图2为实施例1中负载NO的超分子聚肽纳米药物的透射电镜图。

图3为实施例2中细胞活性测试的结果。

图4为实施例3中肿瘤体积的结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

1、吡啶-聚(L-半胱氨酸)-S-亚硝基的制备

步骤一：参考已有文献得到1-(4-氨基丁基)吡啶六氟磷酸盐和S-邻硝基苄基-L-半胱氨酸。在手套箱中，取1-(4-氨基丁基)吡啶六氟磷酸盐7.5mg，溶1mL无水的N，N-二甲基甲酰胺中，再加入S-邻硝基苄基-L-半胱氨酸200mg，室温反应48h后，将反应液沉降在8mL无水乙醚中，再离心，反复3次，真空干燥24h得到白色固体178.5mg。产率83.5～87.2％。

步骤二：取步骤一得到的白色固体50mg溶解在100mL无水的N，N-二甲基甲酰胺/无水乙腈(体积比为4:1)的混合溶剂中，配制成0.5mg/mL浓度的溶液，置于UV LED灯(波长365nm，功率150W)下光照12h，使聚合物中的邻硝基苄基(NB)发生光解，完全从聚合物骨架上脱落。光照结束后，将溶液浓缩至3mL左右，再沉降于25mL的无水乙醚中并离心，反复3次后，真空干燥得到黄色固体42mg。产率83.5～88.4％。

步骤三：取步骤二得到的黄色固体120.0mg溶解在2mL N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入80μL亚硝酸叔丁酯，于室温避光搅拌反应24h。反应结束后，将反应液沉降于无水乙醚中并离心，反复3次后，避光快速真空干燥得到黄色固体99.6mg。产率82～86.6％。

2、负载NO的超分子聚肽纳米药物的制备

取3.5mg吡啶-聚(L-半胱氨酸)-S-亚硝基、1.5mg阿霉素、1.5mg吲哚菁绿溶解于0.5mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌2h后，取2.78mg柱[5]芳烃溶于15mL去离子水将其滴加至N，N-二甲基甲酰胺溶液中，再搅拌48h。结束后，将溶液置于分子量3500的透析袋中，用500mL去离子水透析2天，中间每8小时换一次去离子水，透析结束后，冷冻干燥后得到负载NO的超分子聚肽纳米药物，收率为78.5％～83.8％。

本实施例制得的负载NO的超分子聚肽纳米药物的动态光散射图谱如图1所示，其数均粒径为175.9±2.1nm，PDI为0.12±0.03；其透射电镜图如图2所示，成球形粒子结构。

实施例2

负载NO的超分子聚肽纳米药物对多药耐药性人乳腺癌细胞的影响

将实施例1中制备得到的负载NO的超分子聚肽纳米药物(WPC/DOX-ICG)、未包裹吲哚菁绿的负载NO的超分子聚肽纳米药物(WPC/DOX)、未包裹阿霉素的负载NO的超分子聚肽纳米药物(WPC/ICG)和阿霉素(DOX)分别用细胞培养液配制成阿霉素浓度分别为0.2、0.5、1、2、5、10μg/mL，对应吲哚菁绿的浓度分别为0.14、0.34、0.68、1.36、3.38、6.72μg/mL，然后分别跟MCF-7/ADR细胞(多药耐药性人乳腺癌细胞)培养48h。此外，对于负载NO的超分子聚肽纳米药物和未包裹阿霉素的负载NO的超分子聚肽纳米药物(WPC/ICG)需要各另设一组，培养4h后，再用近红外激光对其进行光照5min(808nm，1W/cm²)，继续培养48h。采用MTT方法进行细胞活性测试，结果如图3所示。图3中，下横坐标DOX指代的是阿霉素的浓度，下横坐标ICG指代的是吲哚菁绿的浓度。图中，WPC/DOX-ICG、WPC/DOX和DOX是指负载NO的超分子聚肽纳米药物、未包裹吲哚菁绿的负载NO的超分子聚肽纳米药物和阿霉素分别单独使用的实验组，WPC/DOX-ICG+NIR和WPC/ICG+NIR是指负载NO的超分子聚肽纳米药物和未包裹阿霉素的负载NO的超分子聚肽纳米药物分别跟癌细胞培养4h后，再用近红外激光对其进行光照的实验组。

如图3所示，针对于多药耐药性人乳腺癌细胞(MCF-7/ADR细胞)，阿霉素基本没有效果，但负载NO的超分子聚肽纳米药物在光照作用下显示了很强的杀死癌细胞的能力，并且比其他实验组，表现出更强的抗癌能力。说明该负载NO的超分子聚肽纳米药物在光照作用下能够明显逆转癌细胞的多药耐药性，对多药耐药肿瘤细胞表现出很好的抗肿瘤效果。

实施例3

负载NO的超分子聚肽纳米药物对HeLa肿瘤生长的影响实验

将接种了HeLa荷瘤的小鼠分别分为5组：生理盐水、阿霉素(5mg/kg)、未包裹吲哚菁绿的负载NO的超分子聚肽纳米药物(2mg/mL)、未包裹阿霉素的负载NO的超分子聚肽纳米药物(2mg/mL)+NIR、负载NO的超分子聚肽纳米药物(2mg/mL)、负载NO的超分子聚肽纳米药物(2mg/mL)+NIR。第0天注射一次，且注射12h后对未包裹阿霉素的负载NO的超分子聚肽纳米药物+NIR和负载NO的超分子聚肽纳米药物+NIR进行光照5min(808nm,1W/cm²)，同时每隔1天对肿瘤体积进行测量，结果如图4所示。

图4中，横坐标表示小鼠接受实验的天数，纵坐标表示小鼠肿瘤体积。图中，PBS是指注射生理盐水对照组，DOX是指注射阿霉素实验组，WPC/DOX是指注射未包裹吲哚菁绿的负载NO的超分子聚肽纳米药物的实验组,WPC/ICG+NIR是指注射未包裹阿霉素的负载NO的超分子聚肽纳米药物12h后，再用近红外激光对其进行光照的实验组，WPC/DOX-ICG是指注射负载NO的超分子聚肽纳米药物的实验组，WPC/DOX-ICG+NIR是指注射负载NO的超分子聚肽纳米药物12h后，再用近红外激光对其进行光照的实验组。

如图4所示，对于MCF-7/ADR肿瘤，游离的阿霉素对于该耐药肿瘤没有抑制的作用，而对于WPC/DOX-ICG+NIR组，所有小鼠肿瘤明显得到抑制。

Claims (2)

1.一种负载NO的超分子聚肽纳米药物，其特征在于，由吡啶-聚(_L-半胱氨酸)-S-亚硝基、水溶性柱[5]芳烃、阿霉素和吲哚菁绿制得，其制备方法为：将吡啶-聚(_L-半胱氨酸)-S-亚硝基、阿霉素、吲哚菁绿溶于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌后滴加水溶性柱[5]芳烃的去离子水溶液，搅拌后经透析得到负载NO的超分子聚肽纳米药物；

所述吡啶-聚(_L-半胱氨酸)-S-亚硝基的结构式如下式所示：

所述水溶性柱[5]芳烃的结构式如下式所示：

2.权利要求1所述的超分子聚肽纳米药物在制备肿瘤治疗产品中的应用。