CN114686439B - 靶向黏附分子的异质型cic细胞模型及其制备方法 - Google Patents
靶向黏附分子的异质型cic细胞模型及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114686439B CN114686439B CN202111575479.8A CN202111575479A CN114686439B CN 114686439 B CN114686439 B CN 114686439B CN 202111575479 A CN202111575479 A CN 202111575479A CN 114686439 B CN114686439 B CN 114686439B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- beta
- cells
- heterogeneous
- catenin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种靶向N‑cadherin或β‑catenin的异质型CIC细胞模型及其制备方法,本发明是通过调控外部靶细胞中N‑cadherin或β‑catenin基因的表达来制备得到所述异质型CIC细胞模型。本发明的发明人首次发现,提高N‑cadherin或β‑catenin基因在肝癌细胞内表达可以促进其内化免疫细胞CCRF的能力,促进异质型CIC结构的形成;反之,降低N‑cadherin或β‑catenin基因在肝癌细胞内表达可以抑制异质型CIC结构的形成;即靶向N‑cadherin和β‑catenin基因可调控异质型CIC形成。本发明所提供的这种通过干预N‑cadherin和β‑catenin基因表达调控异质性CIC结构形成的方法,通过该方法有望促进异质型CIC介导的免疫杀伤,实现杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种靶向黏附分子(N-cadherin或β-catenin基因)的异质型CIC(heterotypic cell-in-cell)细胞模型及其制备方法。
背景技术
Cell-in-cell(简称:CIC)结构是指一个或多个活细胞存在于另一个细胞内部形成的细胞叠套结构,外部细胞(靶细胞)的细胞核被内部细胞(效应细胞)挤压为新月形,整体形态特征似鸟眼。根据参与形成的细胞种类,分为同质型CIC,即来源相同的肿瘤或上皮细胞之间形成的CIC结构;异质型CIC,即来源不同的细胞之间形成的CIC结构,常见于免疫细胞进入肿瘤细胞内部形成的CIC结构。
异质型CIC结构广泛地形成于多种肿瘤细胞,如黑色素瘤、胃癌、唾液腺导管癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤细胞均可内化免疫细胞。各种正常组织细胞也可作为靶细胞,如人柱状上皮细胞、肝细胞等。多种免疫细胞可参与形成异质型CIC结构,如中性粒细胞、NK细胞、T淋巴细胞、LAK细胞、B细胞等。异质型CIC结构中靶细胞与效应细胞复杂的关系与其多样化的生物学功能息息相关。
异质型CIC结构具有非常重要的生物学意义,如胸腺孵育功能:淋巴细胞进入胸腺孵育细胞后发育为成熟T细胞后逸出;免疫逃逸作用:NK细胞进入肿瘤细胞内部后回吞自身分泌的颗粒酶B而死亡,肿瘤细胞实现免疫逃逸;免疫调控:肝细胞内化CD4+T细胞并选择性的杀死调节性T细胞而调控免疫细胞的相对数量实现免疫系统稳态调控。
异质型CIC结构的形成涉及靶细胞和效应细胞这两类细胞间的相互作用,目前的研究揭示了一些与异质型CIC形成相关的基因,但都只适用于特定的两种细胞间的异质型CIC形成。如人表皮癌细胞A431内化自然杀伤细胞NK92需要A431细胞表达埃兹蛋白Ezrin和E钙粘蛋白E-cadherin。抗体抑制人膀胱癌细胞MKN-45的粘附分子ICAM-1、CD62L、sLewisA、以及主要组织相容性复合物(MHC class I)和CD8均可抑制MKN-45细胞与HOZOT细胞(一种调节性T细胞)的异质型CIC形成。胸腺哺育细胞(thymic nurse cells,TNC)选择性地内化αβTCRloCD4+CD8+双阳性的胸腺细胞(thymocytes),并且内部胸腺细胞的存活需要MHC、Bcl-2、IL-1β。包括上述报道在内的关于异质型CIC研究都只描述了上皮来源的细胞与免疫细胞形成异质型CIC结构对于某些基因的依赖性,只有相关性研究而缺乏一定的机制探究以及靶向特定基因对异质型CIC的调控。
目前的研究尚缺乏靶向特定基因可控地调控异质型CIC形成的模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向N-cadherin或β-catenin的异质型CIC细胞模型及其制备方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
第一方面,本发明要求保护一种靶向N-cadherin或β-catenin的异质型Cell-in-cell(简称:CIC)细胞模型的制备方法,是通过调控作为靶细胞的肿瘤细胞中N-cadherin或β-catenin基因的表达来制备得到异质型CIC细胞模型。
其中,所述靶细胞为肝癌细胞PLC/PRF/5。所述效应细胞为免疫细胞CCRF-CEM。
进一步地,所述异质型CIC细胞模型包括:抑制异质型CIC细胞模型、以及诱导异质型CIC细胞模型。
所述制备方法可分为如下方法A或方法B:
方法A:制备抑制异质型CIC细胞模型的方法,可包括如下步骤:抑制所述靶细胞中N-cadherin或β-catenin基因的表达。
方法B:所述方法为制备诱导异质型CIC细胞模型的方法,可包括如下步骤:使所述靶细胞中过量表达N-cadherin或β-catenin基因。
更进一步地,在所述方法A中,所述靶细胞可为N-cadherin或β-catenin基因有效表达的细胞(如通过Western blot检测出N-cadherin和β-catenin蛋白的表达量比对照野生型细胞的多)。
在所述方法B中,所述靶细胞可为N-cadherin或β-catenin基因表达缺失或功能突变的细胞(如通过Western blot检测到N-cadherin和β-catenin蛋白的表达比对照野生型细胞的少)。
更进一步地,在所述方法A中,所述“抑制靶细胞中N-cadherin或β-catenin基因的表达”可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现,如通过小干扰RNA(siRNA)降低N-cadherin或β-catenin基因在所述靶细胞中的表达;或通过CRISPR-Cas9技术敲除N-cadherin或β-catenin基因在所述靶细胞中的表达;或通过N-cadherin或β-catenin蛋白的封闭性抗体抑制N-cadherin或β-catenin蛋白的活性和功能。
在本发明的具体实施中,在所述方法A中,抑制靶细胞中N-cadherin或β-catenin基因的表达是通过siRNA实现的。其中,合成siRNA序列靶向的N-cadherin基因序列为CAACAGGGAGCAAGGGGAGCTT;合成siRNA序列靶向的β-catenin基因序列为ACCACCAGAGAAGGAgCGGGTT。
在所述方法B中,在靶细胞中过量表达N-cadherin或β-catenin基因是通过向靶细胞中导入N-cadherin或β-catenin基因的重组载体实现的。其中,重组表达载体为逆转录病毒载体pQCXIP-mCherry-N1和pEGFP-C1为骨架,插入序列分别为基因N-cadherin和β-catenin的蛋白质编码区(Sequence coding for aminoacids in protein,CDS),分别构建N-cadherin和β-catenin过表达载体。基因N-cadherin被插入到病毒载体pQCXIP-mCherry-N1的酶切位点XhoI和BamHI之间,得到N-cadherin基因的重组表达载体。基因β-catenin被插入到病毒载体pEGFP-C1的酶切位点AgeI和XhoI之间,得到β-catenin基因的重组表达载体。通过293FT细胞包装生产逆转录病毒颗粒,将表达N-cadherin和β-catenin基因的逆转录病毒颗粒分别感染靶细胞并筛选阳性细胞,即可实现靶细胞中分别过量表达N-cadherin和β-catenin基因。
在本发明某一具体实施例中,所述N-cadherin基因在染色体的位置为18q12.1,包含19个外显子,其核苷酸序列如GeneBank:NC_000018.10的第27932878-28177130位所示。所述β-catenin基因在染色体的位置为3p22.1,包含19个外显子,其核苷酸序列如GeneBank:NC_000003.12的第41199422-41240445位所示。
在本发明中,所述cell-in-cell(简称CIC)的种类为异质型cell-in-cell,即免疫细胞进入肿瘤细胞内部形成的cell-in-cell结构。
第二方面,本发明还要求保护由前文所述制备方法得到的异质型CIC细胞模型。
本发明检测异质型CIC细胞模型可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。如通过将肿瘤细胞与免疫细胞的共培养体系进行消化、甩片、显微拍照后统计CIC形成率;或通过活细胞工作站显微镜进行长时程地拍摄肿瘤细胞与免疫细胞的共培养体系,观察统计CIC形成率;或将不同颜色荧光蛋白标记的肿瘤细胞与免疫细胞的共培养体系进行消化、流式检测双阳性细胞的比例来定量CIC形成率。
在本发明的具体实施中,制备异质型CIC细胞模型是通过肿瘤细胞与免疫细胞的共培养实现的。其中,肿瘤细胞为肝癌细胞PLC/PRF/5,免疫细胞为CCRF-CEM;共培养条件为肿瘤细胞与免疫细胞的比例为1∶5;肿瘤细胞贴壁生长,上方加入悬浮生长的免疫细胞;使用免疫细胞的培养基;37℃培养箱中共培养8小时。定量方法为甩片、显微拍照后统计CIC形成率。
第三方面,本发明要求保护所述异质型CIC细胞模型在如下任一中的应用:
(1)通过所述CIC细胞模型评价待测物对肿瘤免疫杀伤、免疫逃逸及其生长的影响;
(2)利用所述CIC细胞模型评价待测物的生物安全性;
(3)利用所述CIC细胞模型建立肿瘤治疗方法;如用于通过异质型CIC建立新的疾病(如肿瘤)治疗手段,包括利用CIC结构进行肿瘤杀伤、利用CIC结构运输药物、基因、蛋白等;
(4)通过或借助所述CIC细胞模型建立动物模型。
上述待测物可以为:化合物、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等。
本发明的有益效果:
1、本发明提供一种靶向N-cadherin或β-catenin的异质型CIC细胞模型及其制备方法。
本发明的发明人首次发现,提高N-cadherin或β-catenin基因在肝癌细胞内表达可以促进其内化免疫细胞CCRF的能力,促进异质型CIC结构的形成;反之,降低N-cadherin或β-catenin基因在肝癌细胞内表达可以抑制异质型CIC结构的形成;即靶向N-cadherin和β-catenin基因可调控异质型CIC形成。
2、实验证明,使用siRNA技术靶向基因N-cadherin或β-catenin的特定序列,可敲低肝癌细胞PLC/PRF/5的内源性N-cadherin或β-catenin表达,进而降低PLC/PRF/5细胞内化免疫细胞的能力,获得抑制异质型CIC细胞模型。另一方面,通过逆转录病毒表达载体转染在肝癌细胞PLC/PRF/5中过量表达N-cadherin或β-catenin蛋白可获得诱导异质型CIC细胞模型。
3、本发明所提供的这种通过干预N-cadherin和β-catenin基因表达调控异质性CIC结构形成的方法,通过该方法有望促进异质型CIC介导的免疫杀伤,实现杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的目的。
附图说明
图1为代表性的异质型CIC、同质型细胞聚团、异质型细胞间粘附的显微照片。A,B:改变N-cadherin表达量(A)和β-catenin表达量(B)时肝癌细胞PLC/PRF/5的单克隆系F6ft与免疫细胞CCRF-CEM形成的异质型CIC结构(heterotypic CIC)、肝癌细胞间的细胞聚团(homotypic cluster)、异质型细胞间粘附(heterotypic adhesion)的照片。定义:免疫细胞完全位于肿瘤细胞内部为异质型CIC结构;6个及以上的细胞聚集在一起形成的团块为细胞聚团;免疫细胞粘附到肿瘤细胞上为异质型粘附(吸走培养上清时免疫细胞不会被吸掉)。A图比例尺分别为20μm、50μm、50μm;B图比例尺分别为30μm、50μm、50μm。
图2为改变N-cadherin和β-catenin表达量对异质型CIC和细胞粘附的影响。A:在肝癌细胞PLC/PRF/5的单克隆系shCD44-F6ft中分别敲低N-cadherin或β-catenin基因表达,均可抑制异质型CIC形成(heterotypic CIC)、肿瘤细胞间的粘附(homotypiccluster)、肿瘤细胞与免疫细胞间的粘附(heterotypic adhesion);在肝癌细胞PLC/PRF/5的单克隆系F6ft中分别过表达N-cadherin或β-catenin基因,均可促进异质型CIC形成、肿瘤细胞间的粘附、肿瘤细胞与免疫细胞间的粘附。每个实验组统计3个以上20倍物镜视野的细胞。**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。B,C:Western blot检测肝癌细胞PLC/PRF/5的单克隆系F6ft中分别改变N-cadherin(B)和β-catenin(C)基因的表达。
图3为蛋白N-cadherin和β-catenin存在分子间互作。A:免疫荧光染色结果显示在肝癌细胞PLC/PRF/5的单克隆A4S(高CIC形成率)和F6ft(低CIC形成率)中N-cadherin和β-catenin都共定位于细胞膜和细胞间连接处。B:蛋白N-cadherin和β-catenin在划线处荧光强度的分布。C,D:免疫共沉淀实验结果展示用N-cadherin抗体免疫沉淀N-cadherin蛋白时与其结合的β-catenin蛋白也沉淀下来(C);用β-catenin抗体免疫沉淀β-catenin蛋白时与其结合的N-cadherin蛋白也沉淀下来(D)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
PLC/PRF/5细胞:ATCC细胞库,#CRL-8024。
CCRF-CEM细胞:ATCC细胞库,#CCL-119
HEK 293FT细胞:北纳生物细胞库,#BNCC339263。
ShCD44-F6ft细胞:肝癌细胞PLC/PRF/5的低异质型CIC形成率的细胞F6ft进行了CD44基因的敲低。筛选单克隆系为有限稀释法;敲低CD44基因为慢病毒敲低载体介导的基因表达量敲低。由本实验室构建并保存,公众可从申请人处获得,仅可用于重复本发明实验使用。
CCRF-CEM-EGFP,CCRF-CEM-mCherry:由CCRF-CEM细胞感染pQCXIP-EGFP-N1和pQCXIP-mCherry-N1逆转录病毒得到,感染方法为构建稳定表达细胞系的常规方法。由本实验室构建并保存,公众可从申请人处获得,仅可用于重复本发明实验使用。
anti-N-cadherin mouse monoclonal:BD Bioscience,#610921。
anti-β-catenin mouse monoclonal:BD Biosciences,#610154。
Alexa Flour 488 goat anti-mouse IgG:Life technologies,#A11029。
Alexa Flour 568 goat anti-mouse IgG:Life technologies,#A11031。
siRNA:购于中国苏州吉玛公司。
pEGFP-C1质粒:优宝生物,#VT1118。
pVPack-VSV-G质粒:优宝生物,#VT8154。
gag/pol质粒:Addgene,#14887。
逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-N1:记载于“Wang M,Ning X,Chen A,Huang H,NiC,Zhou C,et al.Impaired formation of homotypic cell-in-cell structures inhuman tumor cells lacking alpha-catenin expression.Scientific reports.2015;5:12223”一文,公众可从申请人处获得,仅可用于重复本发明实验使用。逆转录病毒载体pQCXIP-mCherry-N1由本实验室通过pQCXIP-EGFP-N1质粒改造得到,即将荧光蛋白EGFP替换为mCherry。
实施例1、抑制异质型CIC细胞模型的建立
本实施例中的靶细胞是PLC/PRF/5肝癌细胞的单克隆系F6ft敲低CD44基因的细胞株shCD44-F6ft(高CIC形成率),Western blot可检测出N-cadherin和β-catenin基因编码蛋白在此细胞株的表达(图2B,C),具体参见本实施例步骤一2中Western blot。
一、敲低N-cadherin和β-catenin基因的表达
1.利用siRNA敲低N-cadherin和β-catenin基因
1)设计siRNA:设计分别靶向N-cadherin和β-catenin基因的两条siRNA序列,并由苏州吉玛公司合成。
2)转染siRNA:利用转染试剂盒RNAiMAX Reagent(Invitrogen,#13778)进行siRNA转染,反应体系和条件是依据试剂盒的说明书操作。具体如下:准备1×105/孔肝癌细胞单克隆shCD44-F6ft贴壁生长于12孔板;取siRNA溶液2.5μL与RNAiMAX 2.5μL混合于100μL Opti-MEM培养基(Invitrogen,#31985070)并加入到12孔板细胞上方;静置10分钟后再加入Opti-MEM培养基400μL;培养6小时后换为DMEM完全培养基继续培养48小时。
2.Western blot检测N-cadherin和β-catenin基因敲低效率
1)提取蛋白质:取上述siRNA处理的shCD44-F6ft细胞生长至汇合度约80-90%,加入500μL预冷的细胞裂解液RIPA(含蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂),使裂解液充分覆盖细胞,刮刀刮取细胞并收集至1.5mL离心管。4℃、12000rpm、10min离心,取上清。取1μL上清用于BCA法蛋白定量(ThermoFisher,#23225)。剩余上清中加入5×Loading Buffer(即SDS上样缓冲液),100℃加热10min变性。
2)免疫印迹实验:配制10%SDS-PAGE凝胶。加样,每个加样孔内加入蛋白20μg。电泳通电,电压60V、20min使蛋白进入浓缩胶,当染料进入分离胶后,电压改为100V、90min。取蛋白胶转膜至0.2μm孔径的PVDF膜,转膜条件:100V、1h。取出PVDF膜置于5%(质量百分比)脱脂奶粉中室温放置1h进行封闭。接着孵育待检测分子的一抗,放置于4℃摇床过夜,如抗N-cadherin和β-catenin分子的抗体1∶1000分别溶解于脱脂奶粉。置于1×TBST溶液中洗涤3×10min。孵育相应种属的HRP耦连二抗(1∶3000)室温1h。置于1×TBST溶液中洗涤3×10min。
3)显影:PVDF膜平铺于保鲜膜上方,滴加化学发光液(ThermoFisher,#34095)适量至完全覆盖膜,避光孵育1-2min。PVDF膜平铺于压片暗盒,暗室中将X光片放入压片暗盒内PVDF膜上方适当时间,取X光片依次放入显影液-水-定影液;室温晾干,标上Marker,样品名称。或者在化学发光之后使用显影仪器进行曝光显影、拍照记录。
Western blot结果表明:与对照siNC相比,分别靶向N-cadherin和β-catenin基因的siRNA处理后肝癌细胞单克隆shCD44-F6ft的N-cadherin和β-catenin基因基因表达量显著降低(图2B,C)。
二、异质型CIC形成实验(Heterotypic CIC)
1.肿瘤细胞贴壁培养
第一天,12孔板内每孔铺1.0×105肝癌细胞PLC/PRF/5,过夜培养至贴壁。
2.加入免疫细胞共培养
第二天,细胞计数,按效应细胞(免疫细胞)∶靶细胞(肿瘤细胞)=5∶1计算,每个孔需要CCRF-CEM细胞(带绿色荧光蛋白EGFP标记,或者利用cell tracker进行染色)5.0×105,细胞离心(1000rpm,3min)沉淀后备用。将漂洗过的CCRF-CEM细胞用1mL/孔的完全培养基重悬,加入长有PLC/PRF/5细胞的12孔板(弃原培养上清),细胞混匀,共培养8h。
3.细胞甩片
弃培养上清,用PBS润洗2次,加入胰酶消化并重悬细胞。准备好甩片装置后每个甩片孔加入200μL细胞重悬液进行甩片(500rpm、4min),细胞被离心至粘附载玻片上。
4.制片
将载玻片放置于4%多聚甲醛溶液(PFA,质量体积比)中固定细胞,室温放置10min。用PBS润洗3×10min,加入5%BSA配制的Alexa Fluor 594 phalloidin(终浓度5μg/mL,Invitrogen,#A12381)溶液孵育室温1h;加入20μL封片剂(含DAPI,中衫金桥)将细胞覆盖,用盖玻片小心覆盖。放入避光湿盒中,室温放置24h等待干燥。
5.异质型CIC统计
宽场荧光显微镜(尼康)拍照,使用405nm、488nm、568nm、DIC通道拍摄20倍镜。每张载玻片随机选取六个视野,每个视野至少统计200个细胞,DAPI标记细胞核。定义绿色的免疫细胞完全被红色肿瘤细胞包裹的结构为异质型CIC结构;定义异质型CIC形成率=100%×视野内异质型CIC结构中的免疫细胞数目/视野内肿瘤细胞总数目。
异质型CIC结构如图1A,B所示(Heter CIC);统计结果表明,通过siRNA敲低N-cadherin和β-catenin基因在肝癌细胞的表达,均可显著地抑制肝癌细胞内化免疫细胞、抑制异质型CIC结构形成(图2A)。
三、细胞间粘附实验
1.同质型细胞聚团实验(Homotypic cluster);
1)铺软琼脂:微波炉水浴加热融化2.5%软琼脂,完全融化为液态后在超净台用PBS稀释至0.5%并混匀;于六孔板加入0.5%软琼脂1.5mL/孔,自然冷却凝固。注意操作迅速,在凝结成块前加入六孔板。
2)铺细胞:将细胞消化并计数,于六孔板凝胶上方每孔中加入3×105肝癌细胞和2mL培养液,培养8小时。
3)甩片:结束培养后先在显微镜下拍照记录悬浮状态的cluster。准备甩片用具,加样槽、吸水纸板、粘附载玻片、甩片机等;将细胞悬浮培养液转移至离心管,可适当降低离心速度例如600rpm进行离心,之后吸走部分上清,留下约0.6mL,轻柔吹打重悬;将重悬液200uL加入甩片机加样槽,注意吹打均匀,样品槽下方提前夹粘附载玻片,400rpm、5min离心。
4)观察:第一次甩片后显微镜观察细胞密度和形态,视情况增减下次加入甩片孔的细胞重悬液数量和甩片机离心速度,合适密度应当便于分辨每个cluster又不至于太稀疏,若密度不合适则重复上述步骤。
5)固定:取出载玻片,轻柔滴加4%多聚甲醛溶液(PFA)覆盖细胞,室温放置10min固定。
6)封片:PBS润洗载玻片上的细胞,卫生纸擦去细胞周围液体,于细胞上方滴加封片剂(含DAPI)10uL,倾斜压上盖玻片,避免气泡。
7)拍照统计:使用尼康宽场荧光显微镜405nm、488nm、DIC拍摄20倍镜,每个实验组随机拍摄大于6个视野。定义大于等于6个细胞的细胞聚集在一起成团块定义为细胞团cluster,参与形成细胞团的细胞数目除以总细胞数目即为细胞成团比例。
2.异质性粘附实验(Heterotypic adhesion)
1)铺细胞:培养PLC/PRF/5、CCRF-CEM细胞待生长状态良好,汇合度至80%;第一天晚上将PLC/PRF/5原培养液吸走,消化、离心、重悬细胞并计数;12孔板加入圆形盖玻片,将细胞铺入12孔板内盖玻片上方,数量为10万/孔,注意铺匀,过夜待其贴壁。
2)细胞共培养:第二天取悬浮培养的CCRF-CEM细胞,依次离心、重悬、计数;吸走PLC/PRF/5细胞上方培养液,加入CCRF-CEM细胞50万/孔,共培养8小时。
3)结束培养:吸走原培养上清及悬浮的CCRF-CEM细胞,PBS润洗三次。
4)细胞固定:取出12孔板内的盖玻片小心滴加200uL 4%PFA,室温静置10min。(若使用TCA固定液,要在冰上操作)。
5)封片:PBS润洗3次,擦干净细胞周围液体,粘附载玻片上方滴加封片剂10uL,轻轻覆盖上述生长有细胞的盖玻片避免气泡,放入湿盒,盒内勿加水,室温干燥过夜。
6)拍照统计:使用尼康宽场荧光显微镜405nm、488nm、568nm、DIC拍摄20倍镜,每个实验组随机拍摄大于6个视野。定义异质型粘附率(Heterotypicadhesion)=粘附于肿瘤细胞上方的免疫细胞数量/肿瘤细胞总数。
同质型细胞聚团(Homo cluster)和异质型细胞间粘附(Heter adhesion)如图1A,B所示;统计结果表明,通过siRNA敲低N-cadherin和β-catenin基因在肝癌细胞的表达,均可显著地抑制肝癌细胞间的粘附、抑制肝癌细胞与免疫细胞间的粘附(图2A)。
实施例2、诱导异质型CIC细胞模型的建立
本实施例中的靶细胞是PLC/PRF/5肝癌细胞的单克隆系F6ft,Westernblot可检测出N-cadherin和β-catenin基因编码蛋白的表达较低(图2B,C),具体参见本实施例步骤一2中Western blot。
一、F6ft-Ncadherin和F6ft-βcatenin过表达细胞系的建立
1.构建过表达N-cadherin的质粒
1)PCR扩增N-cadherin片段:以cDNA为模板PCR扩增带有Xho I、EcoR I酶切位点的N-cadherin基因编码序列片段CDS,并使用胶DNA片段回收试剂盒(天根,#DP208-02)进行纯化。
2)酶切:将pQCXIP-mCherry-N1骨架质粒和PCR扩增的N-cadherin片段与限制性内切酶Xho I、EcoR I(New England Biolabs公司)及反应buffer混合,37℃放置1小时进行双酶切;再次进行胶回收纯化DNA片段。
3)DNA连接:将上述双酶切的骨架质粒与N-cadherin插入片段及T4 DNA连接酶混合,室温放置30分钟。
4)转化:上述连接好的过量表达质粒mCherry-N-cadherin利用水浴热激、冰浴冷却的方法转化到大肠杆菌感受态Trans10,氨苄青霉素筛选;
5)测序:挑选单克隆测序,选择测序正确质粒进行保存。
2.构建过表达β-catenin的质粒
1)PCR扩增β-catenin片段:以cDNA为模板PCR扩增带有AgeI、Xho I酶切位点的β-catenin基因编码序列片段CDS,并进行回收纯化。
2)酶切:将pEGFP-C1骨架质粒和PCR扩增的β-catenin片段与限制性内切酶AgeI、Xho I内切酶及反应buffer混合,双酶切之后进行胶回收纯化。
3)DNA连接:将上述双酶切的骨架质粒与β-catenin插入片段及T4 DNA连接酶混合,室温放置30分钟。
4)转化:将上述连接好的过量表达质粒EGFP-β-catenin转化到大肠杆菌感受态Trans10,卡那霉素筛选;
5)测序:挑选单克隆测序,选择测序正确质粒进行保存。
3.包装过表达N-cadherin和β-catenin的病毒
1)铺细胞:按1×106个每孔种植HEK 293FT细胞于鼠尾I型胶原溶液(BD,#34236)包被过的六孔板,贴壁生长12h之后转染。
2)包被:按照产品说明书使用脂质体转染试剂2000 Reagent(Invitrogen,#11668),具体如下:(a)配DNA混合液:200ng pVPack-VSV-G质粒、250ng gag/pol质粒和400ng mCherry-N-cadherin或EGFP-β-catenin逆转录病毒质粒,加Opti-MEM减血清培养基100 μL。(b)配脂质体混合液:5μLLipofectamine 2000,100μL Opti-MEM培养基。(c)将DNA混合液和脂质体混合液混合后,将HEK 293FT细胞的原培养基替换成包含质粒脂质体复合物的Opti-MEM培养基。(d)37℃孵育6h后,弃Opti-MEM培养基,加入含血清的DMEM完全培养基。
3)收集病毒:培养24h后收集病毒上清,暂存于4℃,与培养48h时收集的病毒上清混合,使用前2500rpm离心5min,将悬浮的细胞和碎片离心弃去。
4.过表达N-cadherin和β-catenin的病毒液感染单克隆F6ft
1)病毒感染:病毒侵染前一天,种植待感染细胞F6ft至6孔板内使其贴壁生长至汇合度30%。次日,弃去原培养基,将0.5mL完全培养基、1mL病毒上清和1.5μL Polybrene(终浓度5μg/mL)混匀后加入细胞中,使病毒侵染。第三天上午更换DMEM完全培养基,使细胞恢复生长状态。
2)筛选稳定转染的细胞系。第四天,感染mCherry-N-cadherin病毒液的细胞更换含嘌呤霉素puromycin(终浓度1μg/mL)的培养基;感染EGFP-β-catenin病毒液的细胞更换含遗传霉素G418(500ug/mL)的培养基,筛选细胞。
5.Western blot检测N-cadherin和β-catenin过表达效率
方法同实施例1中步骤一2。Western blot结果表明:与对照空载相比,转染过表达质粒后肝癌细胞单克隆F6ft的N-cadherin和β-catenin基因表达量都显著升高(图2B,C)。
二、异质型CIC形成实验
1.肝癌细胞F6ft贴壁培养
2.加入CCRF-CEM细胞共培养
3.细胞甩片
4.制片
5.异质型CIC统计
方法同实施例1中步骤二1-5。肝癌细胞单克隆F6ft细胞分别过量表达N-cadherin和β-catenin基因均可显著促进异质型CIC结构形成(图1B,图2A)。
三、细胞间粘附实验
1.同质型细胞聚团实验(Homotypic cluster);
(1)铺软琼脂
(2)铺细胞
(3)甩片
(4)观察
(5)固定
(6)封片
(7)拍照统计
2.异质性粘附实验(Heterotypic adhesion)
(1)铺细胞
(2)细胞共培养
(3)结束培养
(4)细胞固定
(5)封片
(7)拍照统计
方法同实施例1中步骤三1-2。过量表达N-cadherin和β-catenin基因的F6ft细胞形成的同质型细胞聚团(Homo cluster)和异质型细胞间粘附(Heter adhesion)如图1A,B所示;统计结果表明,在肝癌细胞PLC/PRF/5分别过表达N-cadherin和β-catenin基因,均可显著地促进肝癌细胞间的粘附、促进肝癌细胞与免疫细胞间的粘附(图2A)。
四、免疫荧光染色实验(IF)
1、铺细胞爬片
(1)培养PLC/PRF/5细胞待生长状态良好,汇合度至80%。
(2)第一天晚上取PLC/PRF/5细胞加胰酶消化、离心、重悬均匀后取10uL加入血球计数板并计数。
(3)于12孔板内放置圆形盖玻片,将细胞铺入12孔板内盖玻片上方,数量为10万/孔,注意铺匀,过夜待其贴壁。
2.染色
(1)细胞固定:取出生长于盖玻片上的细胞上小心地滴加200uL 4%PFA,室温放置10min。
(2)破膜:玻片用PBS润洗,置于含0.2%Triton-100的PBST溶液中浸泡2min。
(3)封闭:玻片用PBS润洗,滴加5%牛血清白蛋白溶液100uL(BSA),于避光湿盒内常温静置1小时。
(4)孵育一抗:使用5%BSA配制一抗溶液,按照说明书确定稀释比例(如抗N-cadherin和β-catenin抗体为1:200稀释),冰上操作;细胞上滴加一抗溶液100uL,置于湿盒,湿盒内加水少许防止蒸发干,4℃过夜。
(5)漂洗:玻片用PBS润洗,10min×3次。
(6)孵育二抗:按照一抗的种属来源选择相应的荧光基团耦连二抗,使用5%BSA配制二抗溶液,冰上操作,稀释比例一般1∶500,同时加入核染料Hoechst-22358(ThermoFisher,#H1398)。细胞上滴加二抗溶液100uL,放入湿盒内常温静置1小时。
(7)漂洗:玻片用PBS润洗,10min×3次。
(8)封片:擦干净细胞周围液体,粘附载玻片上方滴加封片剂20uL,轻轻盖上上述生长有细胞的盖玻片,避免气泡,放入湿盒,盒内勿加水,室温干燥24小时。
3.显微拍照
使用尼康激光共聚焦显微镜的100倍物镜拍摄多个视野,荧光通道按照所使用二抗耦连荧光基团的激发光波长进行选择,一般拍摄405nm、488nm、568nm、647nm共四个波长的激发光。分析目的分子(N-cadherin和β-catenin)的亚细胞定位及其荧光强度分布规律。
免疫荧光染色结果显示肝癌细胞PLC/PRF/5的2个单克隆系包括高CIC形成率的A4S细胞和低CIC形成率的F6ft细胞,在这2个细胞中中N-cadherin和β-catenin共定位于细胞膜和细胞间连接处,在细胞连接处具有高强度的荧光信号值(图3A,B)。
五、免疫共沉淀实验(CO-IP)
1.免疫沉淀
1)配制CO-IP裂解液:配方为20mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、0.1%NP40和5mmol/L的EDTA。当需要配制1L的裂解液时称取2.4228g的Tris、5.844g的NaCl和1.4612g的EDTA,加入1mLNP40,最后加蒸馏水定容至1L并调节pH为8.0。
2)在10em皿中培养PLC/PRF/5细胞汇合度约80-90%,弃培养基,PBS洗涤4mL×1次。
3)弃除PBS,加入500μL预冷的IP Buffer,裂解液充分覆盖细胞,置于冰上10min,刮刀将其刮下来后,收集至1.5mL离心管,冰浴20min。
4)细胞裂解液4℃、12000rpm、10min离心,吸取上清(留下其中100μL作为Input)。
5)分别取4μg N-cadherin、β-catenin抗体与加入细胞裂解上清中,用IP Buffer补至500μL,4℃旋转孵育过夜。
6)于上述溶液加入20μL免疫沉淀试剂盒Protein A+G磁珠(碧云天,#P2179M),4℃旋转孵育3小时。
7)上述溶液4℃、3000rpm、3min离心后弃上清(蛋白被吸附于磁珠),加入IPBuffer洗涤ProteinA+G磁珠500μL×4次。
8)加入40μL 2×Loading Buffer(即SDS上样缓冲液),100℃加热10 min使蛋白变性。
2.免疫印迹实验
1)配制10%SDS-PAGE凝胶(10孔),安装蛋白电泳装置。
2)蛋白电泳:取上述变性蛋白样品加至凝胶孔内;电泳条件为电压60V、20min使蛋白样品进入浓缩胶;当染料进入分离胶后,电压条件改为100V、90min。
3)转膜:取出含蛋白样品的SDS-PAGE凝胶,与0.2um孔径的PVDF膜(浸泡过无水甲醇)安装到转膜装置中,转膜条件为100V、1小时、冰浴。
4)封闭:取出PVDF膜置于5%脱脂奶粉溶液(质量体积比)中,摇床上常温平缓摇动,封闭1小时。
5)孵育一抗:将上述膜置于特定抗体的一抗溶液中(如抗N-cadherin和β-catenin抗体1:1000稀释于5%脱脂奶粉溶液),4℃摇床过夜。加入1×TBST(1∶1000Tween-20稀释于TBS溶液)溶液洗涤3×10min。
6)孵育二抗:将上述膜置于相应种属的HRP二抗溶液(1∶3000)中,室温1小时。加入1×TBST洗涤3×10min。
3.显影:
1)将PVDF膜平铺于保鲜膜,滴加化学发光液(ThermoFisher,#34095)避光孵育1-2min;
2)膜平铺于压片暗盒,不能有气泡;暗室中取出X光片放入压片暗盒,时间适宜,依次浸泡于显影液-水-定影液;室温晾干,标上Marker、样品名称。
3)或者在化学发光之后使用显影仪器进行曝光显影、拍照记录。
免疫共沉淀实验结果显示肝癌细胞PLC/PRF/5中用N-cadherin(或β-catenin)抗体免疫沉淀N-cadherin(或β-catenin)蛋白时与其结合的β-catenin(或N-cadherin)蛋白也沉淀下来,即肝癌细胞PLC/PRF/5中N-cadherin蛋白和β-catenin蛋白存在分子间相互作用(图3C,D)。
需要说明的是,在本文中,诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个......”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种异质型cell-in-cell细胞模型的制备方法,其特征在于,通过调控外部靶细胞中N-cadherin或β-catenin基因的表达来制备得到所述异质型cell-in-cell细胞模型,以肿瘤细胞作为靶细胞,以免疫细胞作为效应细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述靶细胞为肝癌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法分为如下方法A或方法B:
方法A:抑制所述靶细胞中N-cadherin或β-catenin基因的表达,从而制得抑制异质型cell-in-cell细胞模型;
方法B:使所述靶细胞中过量表达N-cadherin或β-catenin基因,从而制得诱导异质型cell-in-cell细胞模型。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,在所述方法A中,所述靶细胞为N-cadherin或β-catenin基因有效表达的细胞;
在所述方法B中,所述靶细胞为N-cadherin或β-catenin基因表达缺失或功能突变的细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,
在所述方法A中,所述靶细胞为N-cadherin或β-catenin基因高表达的细胞系或单克隆细胞;
在所述方法B中,所述靶细胞为N-cadherin或β-catenin基因低表达的细胞系或单克隆细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,在所述方法A中,抑制所述靶细胞中N-cadherin或β-catenin基因的表达,采用敲除/敲低实现;
在所述方法B中,在靶细胞中过量表达N-cadherin或β-catenin基因,是通过使所述靶细胞中过量表达N-cadherin或β-catenin基因的编码序列(CDS序列)实现的。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,在所述方法A中,靶向N-cadherin或β-catenin基因制备抑制异质型cell-in-cell细胞模型是通过抑制细胞间粘附实现的;
所述抑制细胞间粘附是通过抑制存在相互作用的分子N-cadherin和β-catenin基因的表达实现的;
在所述方法B中,靶向N-cadherin或β-catenin基因制备诱导异质型cell-in-cell细胞模型是通过促进细胞间粘附实现的;
所述促进细胞间粘附是通过促进存在相互作用的分子N-cadherin和β-catenin基因的表达实现的。
8.一种由权利要求1-7任一项所述制备方法得到的异质型cell-in-cell细胞模型。
9.如权利要求8所述的异质型cell-in-cell细胞模型在如下任一中的应用:
1)通过所述异质型cell-in-cell细胞模型评价待测物对肿瘤疾病进程的影响;
2)将待测物靶向所述异质型cell-in-cell细胞模型从而评价所述待测物的生物安全性;
3)利用所述异质型cell-in-cell细胞模型制备肿瘤治疗药物;
4)通过或借助所述异质型cell-in-cell细胞模型建立新的动物模型。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111575479.8A CN114686439B (zh) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | 靶向黏附分子的异质型cic细胞模型及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111575479.8A CN114686439B (zh) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | 靶向黏附分子的异质型cic细胞模型及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114686439A CN114686439A (zh) | 2022-07-01 |
CN114686439B true CN114686439B (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=82136451
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111575479.8A Active CN114686439B (zh) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | 靶向黏附分子的异质型cic细胞模型及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114686439B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114672460B (zh) * | 2021-12-21 | 2023-06-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种靶向cd44的异质型cic细胞模型的制备方法及应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108588028A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-09-28 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种靶向cdkn2a的cic细胞模型及其制备方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3045302A1 (en) * | 2016-11-29 | 2018-06-07 | Health Research, Inc. | Methods and compositions for cancer therapy |
CN110732025A (zh) * | 2018-07-19 | 2020-01-31 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种cell-in-cell结构的动物模型及其制备方法 |
CN114672460B (zh) * | 2021-12-21 | 2023-06-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种靶向cd44的异质型cic细胞模型的制备方法及应用 |
-
2021
- 2021-12-21 CN CN202111575479.8A patent/CN114686439B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108588028A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-09-28 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种靶向cdkn2a的cic细胞模型及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
原钙黏蛋白7b与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在MCF10A细胞中的表达定位;陈昂;袁龙;张峥嵘;梁剑青;闫敏;李世崇;王启伟;孙强;刘真真;管静芝;陈昭烈;;生物技术通讯(第03期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114686439A (zh) | 2022-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rani et al. | Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling | |
US20070292348A1 (en) | Low-density lipoprotein receptor 6 (lrp6) as a mammary stem cell marker and related methods | |
JP2009529888A (ja) | 超薄多孔質メンブレンを有する細胞培養装置およびその使用 | |
CN114686439B (zh) | 靶向黏附分子的异质型cic细胞模型及其制备方法 | |
CN106980018B (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
BRPI1007376A2 (pt) | novos ligantes de ligação a receptores e seu uso na detecção de células de interesse biológico | |
US20230323352A1 (en) | Exosome secreted from gene-modified cells with long non-coding ribonucleic acids and application thereof | |
Coquand et al. | A cell fate decision map reveals abundant direct neurogenesis in the human developing neocortex | |
Duan et al. | A faster immunofluorescence assay for tracking infection progress of human cytomegalovirus | |
CN111154807B (zh) | 一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法 | |
Englund et al. | Laminin matrix adhesion regulates basal mammary epithelial cell identity | |
CN114672460B (zh) | 一种靶向cd44的异质型cic细胞模型的制备方法及应用 | |
WO2005021744A1 (ja) | デジタル細胞 | |
Ueno et al. | Development of T-lymphocytes in mouse fetal thymus organ culture | |
Bravo-Cordero et al. | Live cell imaging of RhoGTPase biosensors in tumor cells | |
CN109232742B (zh) | 一种嵌合抗原受体及其应用 | |
JP7302919B2 (ja) | スクリーニング方法 | |
CN114752626A (zh) | 一种可逆性永生化ⅱ型肺泡上皮细胞及其构建与应用 | |
Coxon et al. | Isolation and purification of rabbit osteoclasts | |
CN110904229B (zh) | Ilt4在肿瘤诊治中的应用 | |
CN105483087B (zh) | 一种人支气管上皮细胞株hbe-tt | |
CN109946451B (zh) | 一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒 | |
Greiner et al. | Genetic modification of primary human myeloid cells to study cell migration, activation, and organelle dynamics | |
Traver et al. | T cell receptor activation of NF-κB in effector T cells: Visualizing signaling events within and beyond the cytoplasmic domain of the immunological synapse | |
Tettey-Matey et al. | Generation of Connexin-Expressing Stable Cell Pools |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |