CN110732025A - 一种cell-in-cell结构的动物模型及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种cell‑in‑cell结构的动物模型及其制备方法。本发明保护有丝分裂抑制剂在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为制备具有CIC结构的动物模型。本发明还保护有丝分裂抑制剂在制备具有CIC结构的动物模型中的应用。本发明还保护一种制备动物模型的方法，包括如下步骤：给予动物有丝分裂抑制剂，获得具有CIC结构的动物模型。本发明还保护以上任一所述方法制备的动物模型的应用：进行CIC结构的研究；筛选具有治疗肿瘤功能的物质；对待测物进行毒理学分析以评价待测物的生物安全性。本发明是首例报道在动物体内成功诱导CIC结构的制备方法，为进一步探究CIC的生理学和病理学意义提供有利的实验基础。

Description

一种cell-in-cell结构的动物模型及其制备方法
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，涉及一种cell-in-cell结构的动物模型及其制备方法。
背景技术
细胞死亡是一个重要的生命过程，在生物体的整个生长和发育过程都具有关键作用。细胞死亡主要包括细胞坏死和细胞程序性死亡。细胞坏死是指一种被动性的细胞死亡，其特征表现是细胞肿胀、细胞膜破损、内溶物释放，并引起机体内明显的局部炎症反应。与细胞坏死不同，程序性细胞死亡受特定基因调控，是生物体为维持机体内环境稳态和组织正常机能的重要调节机理。细胞凋亡属于程序性细胞死亡的主要一类，由一系列含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase介导，通过质膜起泡形成凋亡小体瓦解细胞，该过程能保持细胞膜的完整性，避免了细胞内溶物释放引起机体内的炎症反应。此外，基于机制的不同，程序性细胞死亡还包括细胞自噬、类凋亡、胀亡、有丝分裂灾难、细胞焦亡以及程序性细胞坏死。一直以来，细胞死亡的机制研究是生命科学领域的热门方向。
近年来，cell-in-cell(CIC)介导的一种区别于传统细胞死亡方式(如细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬)的新型细胞死亡方式被提出来。CIC既不同于细胞凋亡和细胞坏死的典型细胞死亡方式，它是两个或以上活细胞间的相互作用，也与常规细胞吞噬作用有着不同的特征和机制，CIC形成过程通常是一个活细胞主动“进入”宿主细胞的过程，并且被选择的宿主细胞一般是肿瘤细胞。CIC结构除了内部细胞是活细胞的不同特征以外，内部细胞在宿主细胞胞内的命运也不同，“钻入”的内部细胞被由宿主细胞膜形成的类空泡样结构包裹，在宿主细胞内或死亡或长时间停留，甚至可在宿主细胞内进行细胞分裂或者从宿主细胞内逃逸至细胞外继续生存。根据CIC结构的特点可以将其分为同质CIC结构和异质CIC结构两类，前者最常见于肿瘤细胞间的“互钻”；后者可发生于各类不同细胞间，但最常见的是免疫细胞“钻入”肿瘤或其他组织细胞。CIC结构形成后，最常见的细胞命运是入侵的内部细胞在其宿主细胞中死亡。2007年，国外学者Overholtzer博士等利用现代化的动态显微技术观察乳腺上皮细胞发生CIC的过程，发现入侵的内部细胞在其宿主细胞中的主要命运是胞内死亡，且不依赖于经典的凋亡信号通路的激活，因此，他将这种CIC的死亡过程定义为一种新的非凋亡的细胞死亡方式，命名为Entosis。而后，国内学者王小宁团队解析了杀伤细胞钻入肿瘤细胞的异质CIC的胞内死亡机制，并将其命名为Emperitosis。过去十年，关于CIC介导的细胞死亡机制、形成规律、信号通路及其生物学功能逐渐明晰，然而报道的结果仅停留在体外细胞实验水平，缺乏可靠的动物模型支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种cell-in-cell结构的动物模型及其制备方法。
CIC结构，全称为cell-in-cell结构，又称为细胞叠套结构。
本发明保护有丝分裂抑制剂在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为制备具有CIC结构的动物模型。所述动物为小鼠。所述小鼠为C57BL/6小鼠。所述小鼠为雌性C57BL/6小鼠。
本发明还保护有丝分裂抑制剂在制备具有CIC结构的动物模型中的应用。所述动物为小鼠。所述小鼠为C57BL/6小鼠。所述小鼠为雌性C57BL/6小鼠。
本发明还保护一种制备动物模型的方法，包括如下步骤：给予动物有丝分裂抑制剂，获得具有CIC结构的动物模型。
本发明还保护一种制备小鼠模型的方法，包括如下步骤：给予小鼠有丝分裂抑制剂，获得具有CIC结构的小鼠模型。所述小鼠为C57BL/6小鼠。所述小鼠为雌性C57BL/6小鼠。
本发明和还保护一种制备小鼠模型的方法，包括如下步骤：通过腹腔注射的方式分两次给予小鼠有丝分裂抑制剂溶液，获得具有CIC结构的小鼠模型。所述小鼠为C57BL/6小鼠。所述小鼠为雌性C57BL/6小鼠。所述有丝分裂抑制剂溶液为秋水仙素溶液。所述秋水仙素溶液为2mM的秋水仙素溶液。所述方法中，两次给予的时间间隔为60小时，每次给予量为0.1mL。所述方法中，将第一次注射的时刻作为0时刻，整个周期为72小时。整个周期，自由饮水。24小时时刻至72小时时刻过程持续禁食，24小时时刻以前正常饲喂。
本发明还保护以上任一所述方法制备的动物模型的应用，为如下(a)、(b)或(c)：
(a)进行CIC结构的研究；
(b)筛选具有治疗肿瘤功能的物质；
(c)对待测物进行毒理学分析以评价待测物的生物安全性。
本发明还保护以上任一所述方法制备的小鼠模型的应用，为如下(a)、(b)或(c)：
(a)进行CIC结构的研究；
(b)筛选具有治疗肿瘤功能的物质；
(c)对待测物进行毒理学分析以评价待测物的生物安全性。
以上任一所述有丝分裂抑制剂为将细胞阻滞于分裂中期的有丝分裂抑制剂。
以上任一所述有丝分裂抑制剂为秋水仙素、诺考达唑(Nocodazole)、长春新碱(Vinblastin)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)或多西杉醇(Docetaxel)等。
秋水仙碱，能抑制细胞有丝分裂，破坏纺锤体，使细胞阻滞在分裂中期。
所述研究具体为分子学研究、细胞学研究、生理学研究、病理学研究或机制研究。
所述物质具体为化合物、提取物、小分子物质、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等。
所述待测物为化合物、提取物、小分子物质、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等。
本发明的目的是为了解决CIC介导的细胞死亡机制研究中缺乏可靠的CIC动物模型的瓶颈问题，提供一种诱导体内CIC结构的动物模型的制备方法。本发明是首例报道在动物体内成功诱导CIC结构的制备方法，为进一步探究CIC的生理学和病理学意义提供有利的实验基础。
附图说明
图1为实施例中步骤二的2的(3)的结果。
图2为实施例中步骤二的2的(4)的结果。
图3为实施例中步骤二的2的(5)的结果。
图4为实施例中步骤二的2的(6)的结果。
图5为实施例中步骤二的3的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
雌性C57BL/6小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。
如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.0的PBS缓冲液。
Phospho-histone H3为有丝分裂早期的标志性蛋白。
封闭液：5％BSA溶液。BSA：Amresco#0332。
实施例1、体内具有CIC结构的动物模型的建立
一、分组处理
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠共9只，体重20～22g，活动能力相近。随机分为3组(每组3只)：
第一组(对照组)：试验初始时刻(0时刻)，每只小鼠腹腔注射0.1mL无菌无热源的PBS缓冲液；60小时时刻，每只小鼠腹腔注射0.1mL无菌无热源的PBS缓冲液；
第二组(秋水仙素1mM组)：试验初始时刻(0时刻)，每只小鼠腹腔注射0.1mL 1mM秋水仙素溶液；60小时时刻，每只小鼠腹腔注射0.1mL 1mM秋水仙素溶液；
第三组(秋水仙素2mM组)：试验初始时刻(0时刻)，每只小鼠腹腔注射0.1mL 2mM秋水仙素溶液；60小时时刻，每只小鼠腹腔注射0.1mL 2mM秋水仙素溶液；
秋水仙素溶液是用无菌无热源的PBS缓冲液配制的；
整个试验为72小时。整个试验期间，自由饮水。24小时时刻至72小时时刻过程持续禁食，24小时时刻以前正常饲喂。整个试验期间，动物室以自然节律采光，温度18～23℃，湿度40～60％，清洁、安静。
二、组织切片的制备和免疫组织化学染色
1、组织切片的制备
试验完成后，处死小鼠，从胃幽门后2cm处开始截取1.5cm长的小肠组织，用PBS缓冲液冲洗后在10％中性福尔马林溶液中4℃浸泡12小时，然后依次用75％乙醇溶液、95％乙醇溶液和100％乙醇浸泡以进行梯度脱水，然后进行二甲苯透明，然后进行石蜡包埋，然后切片(厚度5μm)，37℃烤片12h，常温保存。
2、免疫组织化学染色
(1)取组织切片，65℃烤片2h，然后用二甲苯脱蜡3次(每次10min)，然后依次用100％乙醇(5min)、95％乙醇溶液(5min)和75％乙醇溶液(2min)浸泡以复水。
(2)完成步骤(1)后，用灭菌水洗涤，然后浸泡于抗原修复液中，微波修复15min，室温自然冷却，然后用灭菌水洗涤，然后在TBST溶液中浸泡2min。
抗原修复液即柠檬酸盐修复液pH6.0，北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9064。
微波修复：使用美的微波炉(M1-211A)，输出功率700W，待体系沸腾后设置20％power，微波修复15min。
(3)完成步骤(2)后，用封闭液封闭1小时；然后弃除封闭液，滴加一抗工作液(anti-E-cadherin,BD,#610182)，4℃孵育12小时；然后用TBST溶液洗两次，每次3min；然后滴加二抗工作液(Alexa flour 568Anti-Mouse IgG，Life technologies,A11036)，室温孵育1h；然后用TBST溶液洗两次，每次3min；然后滴加含DAPI的封片剂，避光自然干燥。使用Perkin Elemer高速转盘激光共聚焦显微镜摄片，在60x油镜下选择固态激光器激光波长561nm和405nm并辅以步长0.5nm的Z轴扫描，在肠隐窝位置进行全片拍摄记录。
第一组小鼠几乎未检出CIC结构。第二组小鼠和第三组小鼠均检出了CIC结构。第三组小鼠的CIC结构数量高于第二组小鼠。第一组和第三组的示例性照片见图1。图1中：红色荧光标记钙粘蛋白E-cadherin，蓝色荧光标记细胞核DAPI，箭头指示典型的cell-in-cell结构；左图标尺为30μm，右图标尺为3μm。
(4)完成步骤(2)后，用封闭液封闭1小时；然后弃除封闭液，滴加一抗工作液，4℃孵育12小时；然后用TBST溶液洗两次，每次3min；然后滴加二抗工作液，室温孵育1h；然后用TBST溶液洗两次，每次3min；然后滴加含DAPI的封片剂，避光自然干燥。使用尼康宽场显微镜摄片，选择多通道(10xDIC、mCherry通道、FITC通道和DAPI通道)在靠近肠隐窝位置随机选取10个视野进行摄片记录。
一抗anti-E-cadherin(BD,#610182)对应的二抗为Alexa flour 568Anti-MouseIgG(Life technologies,A11036)。一抗anti-Phospho-histone H3(CST,#9764s)对应的二抗为Alexa flour 488Anti-Rabbit IgG(Life technologies,A11034)。
第一组小鼠几乎未检出CIC结构且pH3阳性的细胞数较第二组和第三组少。第二组小鼠和第三组小鼠均检出了CIC结构，CIC结构多见于肠隐窝位置，并且存在大量pH3阳性的细胞，表明秋水仙素处理组的小肠组织处于分裂期的细胞明显增多。第三组小鼠的CIC结构数量高于第二组小鼠，细胞pH3阳性率最高。第一组和第三组的示例性照片见图2。图2中：红色荧光标记钙粘蛋白E-cadherin，绿色荧光标记pH3，蓝色荧光标记细胞核DAPI；标尺为100μm。
(5)根据步骤(3)的结果进行Cell-in-cell结构判定。
Cell-in-cell结构判定：以E-cadherin指示细胞膜、DAPI指示细胞核，利用Z轴扫描获得的三维成像进行判断，内部细胞完全被外部细胞包裹的结构记为1个cell-in-cell结构。Cell-in-cell形成率分析：以隐窝为单位，计数每个隐窝中cell-in-cell结构的个数。第一组的平均每5个隐窝中Cell-in-cell结构的个数为0.125个，第二组的平均每5个隐窝中Cell-in-cell结构的个数为3.5个，第三组的平均每5个隐窝中Cell-in-cell结构的个数为8.875个。结果见图3。
(6)根据步骤(4)的结果统计cell-in-cell结构的pH3阳性率。
pH3阳性÷(pH3阳性+pH3阴性)×100％。
第三组获得的组织切片中，随机对130个cell-in-cell结构的pH3阳性率进行统计，pH3阳性率为63％。结果见图4。
三、扫描电镜观察
试验完成后，处死小鼠，从胃幽门后2cm处开始截取1.5cm长的小肠组织，进行扫描电镜观察。
第三组cell-in-cell代表性的照片见图5。图5为秋水仙素处理组小肠组织中cell-in-cell结构的扫描电镜图。外部细胞：蓝色轮廓；内部细胞：红色轮廓。
采用其他有丝分裂抑制剂(诺考达唑、长春新碱、细胞松弛素B、多西杉醇等)按照实施例1中的第三组的方法进行处理，小鼠均可检出CIC结构，但Cell-in-cell形成率显著低于秋水仙素处理。

Claims (10)

1.有丝分裂抑制剂在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为制备具有CIC结构的动物模型。
2.有丝分裂抑制剂在制备具有CIC结构的动物模型中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述有丝分裂抑制剂为秋水仙素。
4.一种制备动物模型的方法，包括如下步骤：给予动物有丝分裂抑制剂，获得具有CIC结构的动物模型。
5.一种制备小鼠模型的方法，包括如下步骤：给予小鼠有丝分裂抑制剂，获得具有CIC结构的小鼠模型。
6.一种制备小鼠模型的方法，包括如下步骤：通过腹腔注射的方式分两次给予小鼠有丝分裂抑制剂溶液，获得具有CIC结构的小鼠模型。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述有丝分裂抑制剂溶液为秋水仙素溶液。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述秋水仙素溶液为2mM的秋水仙素溶液。
9.如权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，两次给予的时间间隔为60小时，每次给予量为0.1mL。
10.权利要求4所述方法制备的动物模型或权要求至9中任一所述方法制备的小鼠模型的应用，为如下(a)、(b)或(c)：
(a)进行CIC结构的研究；
(b)筛选具有治疗肿瘤功能的物质；
(c)对待测物进行毒理学分析以评价待测物的生物安全性。
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