CN114672558A - 肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法 - Google Patents

肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，包括以下步骤，S1：分别构建仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感的肝癌细胞；S2：利用高通量转录组测序技术分析仑伐替尼耐药引起的基因差异，分析仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感两组肝癌细胞差异的LncRNAs，筛选分析仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌细胞中显著高表达的LncRNAs；S3：使用体外和体内的方法检测步骤S2中筛选出来的新分子NRAV在仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌细胞中的水平；S4：分析NRAV与仑伐替尼耐药性的关系。本发明通过筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子，探索NRAV与仑伐替尼治疗效果的关系，为进一步探索NRAV与肝癌药物仑伐替尼耐药机制及其在肝癌临床诊断及治疗中的应用提供基础。

Description

肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法
技术领域
本发明涉及肝癌药物仑伐替尼技术领域，尤其涉及肝癌药物仑伐替尼耐药 机制的研究方法。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC，简称肝癌)是肝脏最常见的恶性 肿瘤，具有隐匿性、进展迅速、恶性程度高、治疗效果差、化疗耐药率高等特 点。近70％的HCC患者诊断时已处于疾病中晚期，不再适合根治性治疗方案。 基于仑伐替尼的靶向治疗是中晚期HCC患者的首选药物之一，它属于喹啉羧酰 胺类，是一种新型口服多激酶抑制剂，较索拉非尼抑制血管内皮生长因子发挥 抗肿瘤效果具有明显优势。目前TKI的临床应用使得部分不可切除的肝癌患者 出现降期，甚至部分患者达到临床手术指征而获得更多治愈机会，因此被认为 是目前中晚期肝癌的重要治疗手段。然而仑伐替尼化疗耐药是其一大挑战。因此，探索预警仑伐替尼耐药的新分子，可最大程度优化治疗方案，提高治疗效 果。
长链非编码RNA(lncRNAs)是近年来发现的一类主要的非编码RNA， 其长度超过200个碱基，不仅调节人体基本生物学过程，而且在人类疾病特别 是肿瘤性疾病中发挥重要作用。肝癌中lncRNAs可作为促癌或抑癌分子，是判 断肝癌诊断、治疗、预后的潜在标记物。研究发现，体液中可检测到 lncRNAs存在，不同的lncRNA代表癌组织的起源，且在细胞外环境中具有动 态调节性、组织特异性和丰富性，对HCC诊断、治疗及监测预后具有重要价值。 据报道，长链非编码RNA中的NR2F1-AS1及UCA1可促进HCC进展，调节 耐药相关蛋白ABCC1和经典的AKT/mTOR癌症通路介导仑伐替尼化疗耐药的 发生。关于lncRNA介导仑伐替尼耐药的报道较少，并且缺乏探索仑伐替尼耐 药标记物的相关研究。因此，筛选仑伐替尼耐药相关lncRNA，评估lncRNA用 于仑伐替尼化疗耐药的诊断标记物的价值，可推进lncRNA的临床应用。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种肝癌药物仑伐替尼耐药机制的 研究方法，通过筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子，探索NRAV与 仑伐替尼治疗效果的关系，得到NRAV与肝癌药物仑伐替尼耐药机制的关系。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：分别构建仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感的肝癌细胞；
S2：高通量筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子；
S3：分析步骤S2中筛选出来的新分子NRAV基因在仑伐替尼耐药和仑伐替 尼敏感肝癌细胞及组织中的表达水平；
S4：分析NRAV调控肝癌仑伐替尼耐药可能机制。
进一步的，步骤S2的具体操作包括以下步骤，
S201：利用高通量转录组测序技术分析仑伐替尼耐药引起的基因差异，分析 仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感两组肝癌细胞差异的lncRNAs；
S202：筛选仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌细胞中显著高表达的 lncRNAs。
进一步的，步骤S3的具体操作包括以下步骤，
S301：提取肝癌蜡块组织总RNA，检测NRAV水平；
S302：根据临床数据分析NRAV与肝癌预后以及不同化疗方案患者预后的关 系；
S303：利用合成NRAV特异性探针进行组织荧光探针原位杂交技术，检测 NRAV在仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌患者肿瘤组织中的水平。
进一步的，步骤S301的具体操作包括以下步骤，
S3011：将肝癌蜡块样品切成5-10μm厚的片状，并迅速将切片置于1.5ml 无RNA酶的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10s，室温下12,000 rpm离心2min；
S3012：用枪头吸除上清，然后加入1ml无水乙醇并混匀，室温下12,000 rpm离心2min；
S3013：用枪头吸除上清，室温或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完 全；
S3014：加入200μl裂解液以及10μl蛋白酶K并充分混匀，55℃孵育 15min，80℃孵育15min，室温下12,000rpm离心5min，转移上清至新的无 RNA酶离心管中；
S3015：在转移后的上清中加入220μl的缓冲液RB混匀，然后加入660μl的 无水乙醇并充分混匀；
S3016：取700μl步骤S3017中形成的溶液和沉淀，转移至吸附柱中， 12,000rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中，重复此步骤，直到 所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱；
S3017：向吸附柱中加入80μl的DNase I工作液，室温静置15min，然后再 向吸附柱中再加入500μl去蛋白液RW，室温下12,000rpm离心1min，弃掉废 液后将吸附柱放回收集管中；
S3018：向吸附柱中再加入500μl洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离 心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中；重复该步骤多次，将吸附柱置于 室温静置5min后转入新的无RNA酶离心管，悬空滴加30-100μl DEPC水，室 温静置5min，12,000rpm离心2min，离心管底即为RNA；
S3019：采用步骤S202中的方法对离心管底的RNA进行逆转录，以及RT- PCR检测NRAV水平。
进一步的，步骤S303中合成NRAV特异性探针的具体操作包括以下步骤，
S3031：石蜡组织样本依次进行烤片、脱蜡、浸泡、切片、消化、清洗和再浸泡 处理；
S3032：对每块组织切片进行预杂交、杂交和清洗；
S3033：对杂交处理后的切片进行DNA染色；
S3034：避光条件下进行封片。
进一步的，步骤S4的具体操作包括以下步骤，
S401：检测Lenva-S和Lenva-R的肝癌细胞中ROS水平是否存在差异；
S402：分析Lenva-S和Lenva-R肝癌细胞中细胞差异表达的基因，并进行 基因富集分析耐药相关的信号通路；
S403：根据步骤S401中分析出来的耐药基因富集的信号通路，筛选此通路 中与耐药相关的基因，统计TCGA数据库肝癌病人NRAV水平与耐药相关基因 表达量的相关性，确定与NRAV相关性最高的基因SLC；
S404：提取肝癌细胞总RNA进行反转录，然后进行RT-PCR检测 NRAV在肝癌细胞中的表达情况；
S405：提取肝癌细胞总蛋白，检测肝癌细胞中SLC蛋白水平；免疫组织化学 染色分析SLC与肝癌及仑伐替尼耐药的关系。
S406：分析SLC与肝癌患者预后的关系。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子，探索 NRAV与仑伐替尼治疗效果的关系，得到NRAV与肝癌药物仑伐替尼耐药机制 的关系，为NRAV在肝癌临床诊断及治疗中的应用提供基础。
2、本发明通过转录组测序筛选肝癌化疗药物耐药的差异基因，基于仑伐 替尼耐药肝癌细胞进行高通量转录组测序筛选的耐药基因准确性高，证据充足。
3、本发明通过肝癌组织荧光探针检测lncRNA表达，分析肝癌化疗耐药中 长链非编码RNA的表达水平，是检测肝组织lncRNA的有效技术方法。
lncRNA在组织中的鉴定技术是目前值得改进的新技术，FISH荧光探针检测用 于肝癌组织lncRNA的检测是检测lncRNA的新技术。
附图说明
图1为本发明中Lenva-R和Lenva-S肝癌细胞的构建的流程图；
图2为本发明中Lenva-R和Lenva-S肝癌细胞的相对细胞活力对比结果；
图3为本发明中Lenva-R和Lenva-S肝癌细胞的凋亡细胞染色对比结果；
图4为本发明中转录组测序筛选仑伐替尼耐药和敏感差异表达lncRNA；
图5为本发明中NRAV水平及对HCC患者预后影响结果；
图6为本发明中与仑伐替尼耐药相关信号通路及相关功能。
图7为本发明中NRAV相关靶基因SLC在肝癌细胞及组织表达水平。
图8为本发明中SLC水平对肝癌患者预后的影响。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合 附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例：
肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，包括以下步骤，
S1：分别构建Lenva-R(仑伐替尼耐药，耐药指数为3.0)和Lenva-S(仑伐 替尼敏感)的肝癌细胞；如附图1-3所示，其中，图1为Lenva-R和Lenva- S肝癌细胞的构建的流程图，图2为Lenva-R和Lenva-S肝癌细胞的相对细胞 活力对比结果，图3为Lenva-R和Lenva-S肝癌细胞的凋亡细胞染色对比结果。 从图1-3中可以看出，与Lenva-S的HepG2细胞相比，Lenva-R细胞增殖能力 较强、凋亡率较低(P＜0.01)。
进一步的，S2：筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子；
S201：利用高通量转录组测序技术分析仑伐替尼耐药引起的基因差异，分 析Lenva-R和Lenva-S两组肝癌细胞差异的lncRNAs；
目前，前高通量转录组测序技术已广泛用来探索肿瘤发生及发展的原因， 也是筛选肿瘤进展及耐药基因组差异的重要技术手段，也即高通量转录组测序 技术属于现有技术，本申请中也不做赘述，通过高通量转录组测序技术可以得 出Lenva-R和Lenva-S两组肝癌细胞差异的lncRNAs。
S202：RT-PCR分析Lenva-R和Lenva-S肝癌细胞中前50个显著表达的 lncRNAs；
(a)分别提取Lenva-R和Lenva-S肝癌细胞的总RNA；
(b)配置体系1；将2ug提取出来的总RNA与0.5ug的Oligo(dT)混合， 加入DEPC水补齐至15.9μl，混匀，如下表1所示；70℃×5min解链，立即冰 浴；
表1体系1
Figure BDA0003442766880000061
(c)配置体系2；将5μl 5×M-ML V buffer、2.5μl 10mM dNTP(4×)、 0.6μl Rnaseinhibitor与1μl M-ML V混匀，如下表2所示；
表2体系2
Figure BDA0003442766880000062
(d)将体系1中的预混9.1μl/管加入体系2中混匀，金属浴42℃×1h后 95℃×5min解链，得到产物cDNA，测cDNA浓度在4000-5000ug/ml，完成对 总RNA的逆转录；
(e)向产物cDNA中加入ddH2O稀释成500μl，cDNA浓度在1000-2000 ug/ml；
(f)配置RT-PCR体系；将10μl SYBR、0.4μl P1上游引物、0.4μl P2上游 引物和9.2μl步骤(e)中稀释后的cDNA混匀，配制成20μlRT-PCR体系，如 下表3所示，以β-actin为内参，每个样本设置3个复孔，上机进行检测，上机 结束后数据按2-△△Ct公式计算出基因相对表达量，结果如附图4所示。
表3 RT-PCR体系
Figure BDA0003442766880000063
从图4中可以看出，RNA-Seq检测到HepG2细胞的lncRNA总数为 13490个，其中Lenva-S和Lenva-R细胞差异表达lncRNA有994个(上调的有 827个，下调的有167个)，NRAV是仑伐替尼耐药中明显上调的lncRNA之 一。RT-PCR检测Lenva-S和Lenva-R差异明显的lncRNAs也证实了，NRAV是仑伐替尼耐药中上调最明显的lncRNA。
进一步的，S3：利用体内和体外的方法，分析步骤S2中筛选出来的新分子 NRAV在TCGA数据库中肝癌和对照、人肝癌组织和癌旁组织、Lenva-R和 Lenva-S肝癌细胞中的NRAV的表达水平；收集10例接受仑伐替尼静脉化疗肝 癌患者肿瘤组织分析NRAV与肝癌预后及仑伐替尼耐药的影关系。
具体的，TCGA数据库中数据分析不再赘述，重点阐述组织及细胞检测 NARV：
S301：提取肝癌蜡块组织总RNA，检测NRAV水平；
S302：根据临床数据分析NRAV与肝癌预后的关系；
S303：采用组织荧光探针原位杂交技术合成NRAV特异性探针，检测 NRAV在Lenva-S和Lenva-R肝癌患者肿瘤组织中的水平。
步骤S301的具体操作包括以下步骤，
S3011：将肝癌蜡块样品切成5-10μm厚的片状，并迅速将切片置于1.5ml 无RNA酶的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10s，室温下12,000 rpm离心2min；
S3012：用枪头吸除上清，然后加入1ml无水乙醇并混匀，室温下12,000 rpm离心2min；
S3013：用枪头吸除上清，室温或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完 全；
S3014：加入200μl裂解液以及10μl蛋白酶K并充分混匀，55℃孵育 15min，80℃孵育15min，室温下12,000rpm离心5min，转移上清至新的无 RNA酶离心管中；
S3015：在转移后的上清中加入220μl的缓冲液RB混匀，然后加入660μl的 无水乙醇并充分混匀；
S3016：取700μl步骤S3017中形成的溶液和沉淀，转移至吸附柱中， 12,000rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中，重复此步骤，直到 所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱；
S3017：向吸附柱中加入80μl的DNase I工作液，室温静置15min，然后再 向吸附柱中再加入500μl去蛋白液RW1，室温下12,000rpm离心1min，弃掉废 液后将吸附柱放回收集管中；
S3018：向吸附柱中再加入500μl洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离 心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中；重复该步骤多次，将吸附柱置于 室温静置5min后转入新的无RNA酶离心管，悬空滴加30-100μl DEPC水，室 温静置5min，12,000rpm离心2min，离心管底即为RNA；
S3019：采用步骤S202中的方法对离心管底的RNA进行逆转录，以及RT- PCR检测NRAV水平。
进一步的，步骤S302中，从TCGA数据库分析NRAV水平对肝癌患者预 后的影响，从癌症基因组图谱(The cancer genome atlas，TCGA) (https://portal.gdc.cancer.gov/)数据库筛选肝细胞癌患者，统计NRAV水平与 肝癌患者总生存期及无疾病进展生存期的关系。从GEPIA数据库 (http://gepia.cancer-pku.cn/)中筛选肝细胞肝癌(Liverhepatocellular carcinoma, LIHC)患者364例，其中高水平NRAV患者182例，低水平NRAV患者 182例，统计两组LIHC患者OS及DFS的差异，并绘制Kaplan-Meier生存曲 线，分析NRAV对LIHC患者OS及DFS的影响，结果如附图5所示，附图 5中，A为TGGA数据库中肝癌组织和癌旁组织NRAV水平，B为临床肝癌及 癌旁组织样本NRAV转录水平差异，C为仑伐替尼敏感和耐药的肝癌患者肿瘤 组织NRAV水平差异，D为NRAV水平对肝癌患者总生存期及无疾病进展期的影响，E不同分期肝癌患者NRAV水平差异。从附图5中可以看出， GEPIA网站分析364例肝癌患者NRAV与预后关系中，与182例低水平 NRAV肝癌患者相比，182例高水平NRAV肝癌患者OS(P＝1.3e-05)及 DFS较短(P＝0.003)。
进一步的，步骤S303中合成NRAV特异性探针的具体操作包括以下步骤，
S3031：石蜡组织样本处理；
①将石蜡组织切片置于65℃恒温烤片机中烤片2h；
②脱蜡：将烤片后的石蜡组织浸泡于二甲苯中脱蜡15min×2次，随后放入 100％无水乙醇中洗涤二甲苯；
③将脱蜡后的石蜡组织切片，然后100％乙醇×3min，85％乙醇×3min， 70％乙醇×3min，ddH2O×3min，99℃水×15min依次浸泡处理；
④使用2×SSC清洗组织切片2次×5min；
⑤用200ug/ml蛋白酶K于37℃下消化组织蛋白15min；
⑥再次使用2×SSC清洗组织2次×5min；
⑦使用70％乙醇×3min，85％乙醇×3min，100％乙醇×3min依次浸泡切片；
S3032：探针杂交；
①预杂交：在每块组织切片中加入200μl预杂交液，37℃×30min；
②杂交：在37℃避光条件下，把预杂交后的组织放于lncRNA FISH Probe Mix储存液或内参FISH Probe Mix储存液中杂交；
③清洗：在42℃避光条件下，依次使用4×SSC清洗组织3次×5min， 2×SSC清洗组织3次×5min，1×SSC清洗组织3次×5min，PBS室温清洗组织 5min，去除染色的背景；
S3033：DNA染色；
①避光条件下使用1×DAPI对DNA进行染色；
②避光条件下使用1×PBS清洗染色后的组织3次×5min；
S3034：避光条件下进行封片。
进一步的，使用该NRAV特异性探针检测NRAV在7例Lenva-S和3例 Lenva-R肝癌患者肿瘤组织中的水平，结果如附图6所示。从附图6中可以看 出，Lenva-R肝癌组织中NRAV水平明显高于Lenva-R患者(P＜0.0001)。
通过以上三个步骤的研究可以发现，NRAV与仑伐替尼耐药密切相关，提 示肝癌患者较差的临床预后，且可能作为仑伐替尼耐药的重要分子标记物，参 与调控仑伐替尼耐药的发生。
进一步的，步骤S4：分析NRAV与仑伐替尼耐药性的关系。
具体的，S401：分析Lenva-S和Lenva-R肝癌细胞中细胞差异表达的基因， 并进行基因富集分析耐药相关的信号通路；
具体的，通过分析步骤S2中转录组测序(RNA-Seq)数据得出线粒体功能 是仑伐替尼耐药相关基因主要富集的通路。
S402：检测Lenva-S和Lenva-R的肝癌细胞中ROS水平是否存在差异；
具体的，采用流式细胞术检测Lenva-S和Lenva-R的细胞ROS水平；
1)将Lenva-S和Lenva-R的HepG2细胞铺于6孔板，每孔加入仑伐替尼 (10μM)；
2)持续刺激72h，收细胞后胰酶消化，加1ml培基终止消化并吹匀，吸至 EP管中；4℃离心机3000rpm×5min后弃上清。
3)加入1ml稀释好的DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育30min；
4)用无血清DMEM清洗细胞3次，最后用500μl无血清DMEM重悬细胞， 半小时内进行流式分析检测ROS水平。
Lenva-S和Lenva-R的细胞ROS水平检测结果如附图7中C所示，从附图7中C 可以看出，与肝癌Lenva-S细胞相比，Lenva-R细胞ROS水平明显降低(P＜0.01)。
筛选并确定NRAV调控线粒体相关靶基因为SLC家族，分析NRAV与各 基因的相关性，确定与NRAV相关性最高的基因为SLC。从GEPIA数据库分 析SLC水平对364例LIHC患者OS及DFS的影响，并绘制Kaplan-Meier生存 曲线。同上步骤提取Lenva-S和Lenva-R的细胞总RNA及蛋白，分析SLC在 两种细胞中的表达水平，同上利用免疫组织化学染色分析对照、Lenva-S和 Lenva-R患者组织中SLC表达水平。发现Lenva-R的细胞和患者肝癌组织 SLC明显高表达。提示SLC作为NRAV靶基因可能参与仑伐替尼耐药。
S403：分别在Lenva-S和Lenva-R肝癌细胞中进行NRAV的过表达转染， 并提取细胞总RNA；
具体的，构建NRAV过表达重组质粒的具体操作包括以下步骤，
1)设计引物：分别设计pcDNA3.0-NRAV的上下游引物。
2)目的基因扩增(PCR)：目的基因扩增体系如下表6所示，PCR程序如 下表7所示，按照体系配制PCR反应液，置于PCR仪内按照PCR程序设定反 应条件以扩增目的基因。
表6目的基因扩增体系
Figure BDA0003442766880000111
表7 PCR程序
Figure BDA0003442766880000112
3)配制好TAE buffer和琼脂糖凝胶，50μl的PCR反应体系结束后加入 10μl的6×DNA loading buffer，混匀后上样。160V电压条件下电泳12min左右， 将凝胶放于凝胶成像仪观察对应位置是否有清晰条带，若有则用刀片切下，放 入1.5ml EP管内。
4)DNA片段回收：
①加约400μl左右PG溶胶(没过切下的琼脂糖胶)到上述EP，60℃×5- 10min彻底溶解凝胶；
②溶解后液体全部加入DNA吸附柱内，静置至少30min；
③1,2000rpm离心2min后弃去外管中液体，加750μl PW洗液， 1,2000rpm×2min清洗一遍；加250μl PW液，1,2000rpm×2min清洗第二遍；
④将吸附柱放入新的EP管内，晾干5min，加入50-60℃ddH2O，50μl静置 5min后1,2000rpm×2min离心；EP管内即为回收到的PCR产物。
5)酶切目的基因片段和载体：酶切体系如下表8所示，按表8配制反应液， 置于37℃，4-6h或过夜。
表8酶切体系
Figure BDA0003442766880000121
6)载体回收：载体酶切后同未酶切质粒一起进行琼脂糖凝胶电泳，并回收 酶切后的载体(同上述DNA片段回收)。最后以50μl ddH2O溶解。PCR回收 的目的基因产物直接加入150μl PG溶胶，过柱，最后以30μlddH2O回收。
7)酶连：按照下表9的酶连体系进行酶连，置于16℃恒温金属浴，4- 6h或过夜。
表9酶连体系
Figure BDA0003442766880000122
8)转化：
①从-80℃取出感受态细胞(DH5a)，在冰上进行融化。加入全部酶连产物， 冰上静置30min。
②42℃金属浴热冲击1.5min，冰上冷却2min，向离心管中加入500μl无抗 生素液体LB，37℃恒温摇床×200rpm振荡培养1h。
③在超净台上将转化后产物均匀涂至带抗性的LB固体培养基平板上，倒置 平板于37℃恒温培养箱培养12-16h。
9)挑菌后菌液PCR：挑取8个单克隆样菌落至5ml的液体LB试管中， 37℃恒温摇床×200rpm振荡2-3h，按表9中的体系进行菌液PCR。
表9菌液PCR体系
Figure BDA0003442766880000131
表10菌液PCR程序
Figure BDA0003442766880000132
按照以上体系配置预混液，加入阴、阳性对照。反应完成后，在PCR产物 中加入5μl的6×SDS混匀，进行琼脂糖凝胶电泳。选取PCR阳性菌落进行摇菌 扩增。
10)质粒提取：
①将扩增好的菌液倒入EP管，离心1,2000rpm×2min，弃上清。
②每5ml细菌中加入250μl重悬液，吹打均匀。
③每5ml细菌中加入250μl裂解液，立即向每5ml细菌中加入10μl碱性蛋 白酶，翻转混匀，放置5min。
④每5ml菌液中加入350μl中和液，翻转混匀，将EP管倒置10min，1,2000rpm离心15min。
⑤将离心后的上清液打入内柱，静置2min后1,2000rpm×2min离心，回倒， 再次静置，离心。
⑥在内柱中加750μl洗液后1,2000rpm×2min离心，倒掉外管中的液体。
⑦再加入250μl洗液后1,2000rpm×2min离心。弃外管，套上新EP管，静 置5min晾干。
⑧每5ml菌液加50μl加热的60℃去离子水，静置5min。
⑨离心内柱加EP管，1,2000rpm×2min离心，质粒存入EP管。测质粒浓度 后-20℃保存备用。
11)双酶切质粒鉴定：双酶切质粒鉴定体系如下表11所示。
表11双酶切质粒鉴定体系如
Figure BDA0003442766880000141
双酶切质粒37℃温箱4-6h或过夜，进行DNA电泳鉴定是否构建成功，并 送华大基因进行测序，测序成功后，进行细胞转染。
12)细胞过表达转染技术鉴定重组质粒：
①铺293T细胞，细胞密度80％左右。
②待细胞贴壁后进行半量换液，更换新鲜DMEM。
③转染用量：如表12所示。
表12转染用量
Figure BDA0003442766880000142
④根据表12的量，计算出所用Vg，混入氯化钠后静置5min。
⑤将稀释好的质粒加入到稀释后的Vg中，混匀，静置15min，缓慢加入细 胞培养液中，培养4-6h后换液。
⑥再培养24-48h后收细胞总RNA进行如上步骤的逆转录，后进行RT- PCR。
⑦RT-PCR：RT-PCR体系(20μl)如下表13所示。
表13 RT-PCR体系
Figure BDA0003442766880000151
⑧每个样本设置3个复孔,上机结束后以β-actin为内参，按2-△△Ct公式计 算两组NRAV相对表达量。
进一步的，敲低转染MHCC97H细胞NRAV基因的具体操作包括以下步骤，
1)细胞的量为50-60％为最佳。
2)配转染试剂：如表14所示，每份转染试剂RNAiMax 10μl+DMEM补齐 至500μl。
表14转染试剂
Figure BDA0003442766880000152
3)将siRNA+转染试剂混匀后静置20min。
4)分别加至各培养皿中6-8h后换液，48-72h后收细胞。
5)提取细胞总RNA，进行RT-PCR，鉴定NRAV敲低效果。
按照上述NRAV过表达重组质粒构建过程和敲低转染MHCC97H细胞 NRAV基因的具体操作，在HepG2细胞进行NRAV的过表达转染，并提取细 胞总RNA。
S405：将步骤S404和步骤S405中提取的总RNA进行反转录，然后进行RT- PCR检测NRAV在肝癌细胞中的表达情况；
RT-PCR：RT-PCR体系(20μl)如下表15所示。
表15 RT-PCR体系
Figure BDA0003442766880000161
基因：β-actin(内参)，每个样本设置3个复孔。
4)上机结束后以Lenva-S或LO2为对照，按2-△△Ct公式计算出NRAV或 SLC基因的相对表达量。
S407：检测肝癌细胞中SLC蛋白水平；
具体的，使用Western blot和免疫组织化学染色检测肝癌细胞中SLC蛋白水平。
Western blot检测肝癌细胞系SLC蛋白水平的具体操作包括：
1)收集Lenva-S和Lenva-R细胞总蛋白：
①去除各组细胞DMEM培养基，PBS清洗细胞，胰酶消化后收取细胞至 EP管。
②3000rpm×5min离心，弃上清，1ml PBS洗涤细胞，再次 3000rpm×5min离心，弃上清，收细胞置于冰上。
③根据细胞的量加入3倍体积RIPA裂解细胞，冰浴30min后加入与 RIPA等量2×SDS蛋白上样缓冲液，沸水煮15min，1,2000rpm×2min。
2)SDS-PAGE电泳：分别取10～15μl蛋白样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS-PAGE)，电压设定为160V，电泳至条带明显分散开后终止电泳。
3)转膜：将硝酸纤维素膜(NC膜)及滤纸在转膜液中充分浸润，将电泳 后的聚丙烯酰胺凝胶置于NC膜上，并在两侧各夹4层滤纸，自下而上按照滤 纸-NC膜-凝胶-滤纸的顺序小心放置于半干转膜仪，避免各层之间存留气泡， 安装好转膜仪，16V转膜1h。
4)抗体孵育+显影：电转完毕后，将NC膜置于用含5％脱脂奶粉的 1×TBST封闭液中10min-1h；分别孵育抗β-actin抗体(HRP)、抗SLC抗体 (兔源)，室温下1h或4℃过夜，再用1×TBST洗膜3次，10min/次；用ECL方法进行显色，Bio-Rad凝胶成像分析仪显影成像并保存图片。
免疫组织化学染色检测肝癌组织中SLC水平的具体操作包括：
1)烤片：65℃烤片1h。
2)脱蜡及覆水：二甲苯Ⅰ×5min，二甲苯Ⅱ×5min，100％酒精×5min， 90％酒精×5min，80％酒精×5min，75％酒精×5min，蒸馏水×5min。
3)修复：配置修复液2L，放入高压锅待阀门跳起来以后，调成1000w， 计时2-5min，拨动气阀放气后打开锅盖自然降温至室温。
4)封闭：用非特异性染色阻断剂封10min；PBS洗5min×2次；非特异性 染色阻断剂封闭×30min。
5)一抗：抗SLC抗体1:50孵育×4℃过夜，后用PBS洗5min×2次。
6)二抗：生物素标记的单抗鼠/兔IgG室温孵育×15min，PBS洗5min×2次。
7)三抗：链霉卵白素-过氧化物酶×15min，用PBS洗5min×2次。
8)显色：DAB显色1-3min。
9)苏木素染色：1-5min，苏木素新则时间短1min，旧则时间延长至 5min。分化30s后，自来水10-30min返蓝。
10)脱水：75％酒精×5min→85％酒精×5min→90％酒精×5min→100％酒精 ×5min→二甲苯Ⅱ×5min→二甲苯Ⅰ×5min。
11)封片晾干后拍照留存：中性树脂胶封片，待晾干后再普通光学显微镜下 拍照存取图片。
S408：检测仑伐替尼作用下HepG2和MHCC97H细胞存活情况；
具体的，使用CCK-8法检测仑伐替尼作用下HepG2和MHCC97H细胞存活情 况。
1)胰酶消化细胞正在培养的贴壁HepG2和MHCC97H细胞；
2)取100μl细胞到6孔板加培养基至1ml；
3)取10μl加至细胞计数板用细胞计数仪测定细胞浓度c；
4)取96孔板，每孔铺6000个细胞(V＝6000/cμl)，将培基补至100μl， 待细胞贴壁约4-6h后，向两组细胞加入仑伐替尼，浓度呈对数递增(0，2， 4，8，16，32μM)，每组3个复孔。
5)加药后，将96孔板放于37℃细胞培养箱，第3天将各孔的DMEM吸 净，每孔加DMEM90μl+CCK-8 10μl，培养1h后将反应后上清液全部吸至新 的96孔板，排净气泡，Thermo酶标仪选择450nm波长进行上机检测，记录数 值并计算两组存活率差异。
S409：对步骤S407和步骤S408中的检测结果进行统计分析。
应用SPSS 21.0及Graphad Prism 8.0进行数据统计分析。两样本之间比较 采用独立样本t检验，所有的实验数据以均数±标准差表示。Pearson相关性分 析用于分析两者之间相关性，计算对应R值及P值。Kaplan-Meier生存曲线采 用Log Rank法进行统计分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。
SLC在仑伐替尼敏感及耐药肝癌组织的表达水平如附图7所示，附图 7中A为TCGA数据库中肝癌患者和正常对照SLC表达水平差异，B为仑伐替 尼敏感和耐药肝癌细胞SLC蛋白水平及转录水平的差异，C为正常肝组织与仑 伐替尼敏感、耐药肝癌组织中SLC的蛋白表达水平差异。从附图8中可以看出， 与Lenva-S的HepG2细胞相比，Lenva-R细胞SLC转录及翻译水平较高(P＜ 0.01)；与Lenva-S肝癌组织相比，肝组织明显较低，而Lenva-R肝癌组织SLC表达水平较高(P＜0.01)。
SLC对肝癌患者预后的影响如附图8所示。附图8为不同水平的SLC对 患者总生存期(A)及无疾病进展期的影响(B)。由此可见，高水平的 SLC患者总生存期及无疾病进展期较短，提示高水平SLC患者临床预后较差， 可能与治疗过程中仑伐替尼耐药有关。
综上所述，通过对转录组测序数据进行基因富集分析，发现线粒体功能是 导致仑伐替尼耐药的关键。SLC作为该线粒体相关重要基因，受NRAV靶向调 控，在耐药HCC细胞及肝癌组织中高表达。临床上，高水平SLC提示HCC患 者较差的临床预后，同时反应仑伐替尼治疗效果欠佳。因此，NRAV-SLC轴可 能是介导仑伐替尼耐药的重要途径。下一步需进一步探索NRAV如何调控SLC及仑伐替尼在NRAV-SLC途径中的作用。这将有助于阐明仑伐替尼具体耐 药机制，为寻找新的治疗方向提供依据。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明 还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本 发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：分别构建仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感的肝癌细胞；
S2：高通量筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子；
S3：分析步骤S2中筛选出来的新分子NRAV在仑伐替尼耐药和敏感肝癌细胞及组织中的表达水平；
S4：分析NRAV调控肝癌仑伐替尼耐药可能机制。
2.根据权利要求1所述的肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，其特征在于，步骤S2的具体操作包括以下步骤，
S201：利用高通量转录组测序技术分析仑伐替尼耐药引起的基因差异，分析仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感两组肝癌细胞差异的lncRNAs；
S202：筛选仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌细胞中显著高表达的lncRNAs。
3.根据权利要求2所述的肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，其特征在于，步骤S3的具体操作包括以下步骤，
S301：提取肝癌蜡块组织总RNA，检测NRAV水平；
S302：根据临床数据分析NRAV与肝癌预后以及不同化疗方案患者预后的关系；
S303：合成NRAV特异性探针后采用组织荧光探针原位杂交技术检测NRAV在仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌患者肿瘤组织中的水平。
4.根据权利要求3所述的肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，其特征在于，步骤S301的具体操作包括以下步骤，
S3011：将肝癌蜡块样品切成5-10μm厚的片状，并迅速将切片置于1.5ml无RNA酶的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10s，室温下12,000rpm离心2min；
S3012：用枪头吸除上清，然后加入1ml无水乙醇并混匀，室温下12,000rpm离心2min；
S3013：用枪头吸除上清，室温或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全；
S3014：加入200μl裂解液以及10μl蛋白酶K并充分混匀，55℃孵育15min，80℃孵育15min，室温下12,000rpm离心5min，转移上清至新的无RNA酶离心管中；
S3015：在转移后的上清中加入220μl的缓冲液RB混匀，然后加入660μl的无水乙醇并充分混匀；
S3016：取700μl步骤S3017中形成的溶液和沉淀，转移至吸附柱中，12,000rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中，重复此步骤，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱；
S3017：向吸附柱中加入80μl的DNase I工作液，室温静置15min，然后再向吸附柱中再加入500μl去蛋白液RW，室温下12,000rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中；
S3018：向吸附柱中再加入500μl洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中；重复该步骤多次，将吸附柱置于室温静置5min后转入新的无RNA酶离心管，悬空滴加30-100μl DEPC水，室温静置5min，12,000rpm离心2min，离心管底即为RNA；
S3019：采用步骤S202中的方法对离心管底的RNA进行逆转录，以及RT-PCR检测NRAV水平。
5.根据权利要求4所述的肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，其特征在于，步骤S303中合成NRAV特异性探针后进行组织荧光探针原位杂交。具体操作步骤如下：
S3031：石蜡组织样本依次进行烤片、脱蜡、浸泡、切片、消化、清洗和再浸泡处理；
S3032：对每块组织切片进行预杂交、杂交和清洗；
S3033：对杂交处理后的切片进行DNA染色；
S3034：避光条件下进行封片。
6.根据权利要求5所述的肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，其特征在于，步骤S4的具体操作包括以下步骤，
S401：检测Lenva-S和Lenva-R的肝癌细胞中ROS水平是否存在差异；
S402：分析Lenva-S和Lenva-R肝癌细胞中细胞差异表达的基因，并进行基因富集分析耐药相关的信号通路；
S403：根据步骤S401中分析出来的耐药基因富集的信号通路，筛选此通路中与耐药相关的基因，统计TCGA数据库肝癌病人NRAV水平与耐药相关基因表达量的相关性，确定与NRAV相关性最高的基因SLC；
S404：提取肝癌细胞总RNA进行反转录，然后进行RT-PCR检测NRAV在肝癌细胞中的表达情况；
S405：提取肝癌细胞总蛋白，检测肝癌细胞中SLC蛋白水平；免疫组织化学染色分析SLC与肝癌及仑伐替尼耐药的关系。
S406：分析SLC与肝癌患者预后的关系。
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