CN114672497A - 马铃薯StPHB3基因在提高马铃薯块茎品质中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及领域遗传工程技术领域，具体涉及突变马铃薯StPHB3基因在提高马铃薯块茎品质的应用。为了解决问题，本发明提出StPHB3蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑制因子的生物材料在调控马铃薯品质中的应用，利用基因编辑技术，可以抑制马铃薯绿变、降低马铃薯块茎还原糖和淀粉含量、提高马铃薯块茎维生素C(Vc)含量，获得优异的马铃薯种质。

Description

马铃薯StPHB3基因在提高马铃薯块茎品质中的应用
技术领域
本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及突变马铃薯StPHB3基因在提高马铃薯块茎品质的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
马铃薯作世界上第四大粮食作物，其地位仅次于大米、小麦和玉米；营养价值丰富，淀粉含量较高，富含优质蛋白、维生素、矿物质、膳食纤维等人体所必须营养物质，且低热量、低脂肪，其丰富的营养物质能极大地改善人体的营养膳食水平。
采后马铃薯见光易发生绿变，并产生有毒的糖苷生物碱(主要为α-茄碱和α-卡茄碱)，不仅降低商品价值，也对消费者的安全造成隐患。
马铃薯中过量的还原糖含量在油炸过程中与氮的化合物氨基酸发生美拉德反应，致使产品颜色变深、变黑，并易产生有毒的丙烯酰胺。研究表明还原糖含量被认为是影响加工品质的最主要因素，也是决定马铃薯商业价值的重要指标。
近些年来，基因工程技术的突飞猛进，利用基因技术手段定向改良马铃薯的性状，是改良其品质及培育新品种的有效手段。
抑制蛋白(prohibitin,PHB)最先发现于动物细胞中，是在筛选人类细胞增殖调控因子时发现的，它可作为癌症的抑制因子发挥功能。在拟南芥中PHB基因定位于叶绿体及线粒体，且与一氧化氮信号以及根系的生长发育相关。但是PHB 蛋白在马铃薯中的功能研究尚属空白。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提出马铃薯StPHB3基因在提高马铃薯块茎品质中的应用，利用基因编辑技术，可以抑制马铃薯绿变、降低马铃薯块茎还原糖和淀粉含量、提高马铃薯块茎维生素C(Vc)含量，获得优异的马铃薯种质。
具体地，本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一方面，提供StPHB3蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑制因子的生物材料在调控马铃薯品质中的应用。
本发明第二方面，提高StPHB3蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑制因子的生物材料在选育品质较高的马铃薯中的应用。
本发明第三方面，提供一种制备马铃薯突变体的方法，包括抑制马铃薯中StPHB3蛋白的编码基因的表达。
本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
1.本发明首次发现，通过抑制StPHB3蛋白的表达，可以提高马铃薯块茎品质的提高。
2.本发明通过系统研究，首次提出了一种马铃薯块茎品质提高的StPHB3基因突变体，stphb3。本发明提出的马铃薯StPHB3基因突变体，能够在光照后使马铃薯绿变程度显著减缓，叶绿素及龙葵素含量显著降低；还原糖以及淀粉含量降低；Vc含量显著提高。
3.本发明通过系统研究，通过构建CRISPR/CAS9载体，农杆菌转化、侵染马铃薯及测序筛选编辑资料，获得StPHB3基因突变体马铃薯，为培育新品种提供了研究基础。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例中马铃薯纯合突变株系stphb3突变靶点的测序结果；
图2为实施例中野生型与StPHB3基因突变体stphb3在模拟货架期条件下(温度 20℃，湿度80-85％，光照强度150-200lux，16h/d)，6d后的外观表型；
图3为实施例中野生型与StPHB3基因突变体stphb3的叶绿素含量差异；
图4为实施例中野生型与StPHB3基因突变体stphb3的龙葵素含量差异；
图5为实施例中野生型与StPHB3基因突变体stphb3的还原糖含量差异；
图6为实施例中野生型与StPHB3基因突变体stphb3的淀粉含量差异；
图7为实施例中野生型与StPHB3基因突变体stphb3的Vc含量差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
目前，马铃薯存在容易绿变、还原糖和淀粉含量高、维生素C含量低的技术问题，为了解决以上技术问题：本发明公开了一种突变马铃薯StPHB3基因抑制马铃薯绿变、降低马铃薯块茎还原糖和淀粉含量、提高马铃薯块茎维生素C(Vc)含量的应用，属于马铃薯基因工程技术领域。
本发明第一方面，提供StPHB3蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑制因子的生物材料在调控马铃薯品质中的应用。
本发明第二方面，提高StPHB3蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑制因子的生物材料在选育品质较高的马铃薯中的应用。
在一些实施例中，通过抑制StPHB3蛋白的编码基因的表达，以提高马铃薯的品质。
在一些实施例中，所述StPHB3蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：
1)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列；
2)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述StPHB3蛋白的编码基因具有以下任意一种核苷酸序列：
1)SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID No：1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的核苷酸序列；
3)SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
4)SEQ ID No：3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的核苷酸序列；
5)SEQ ID No：4所示的核苷酸序列；
6)SEQ ID No：4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的目的是为了提供一种马铃薯块茎品质提高的StPHB3基因突变体的应用，本发明从“Desiree”马铃薯cDNA文库中克隆StPHB3基因全长cDNA，在马铃薯中进行功能验证。本发明所提供的马铃薯基因名称为StPHB3, 所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
在一些实施例中，与核苷酸序列SEQ ID No：1相比，所述StPHB3蛋白的核苷酸序列发生碱基缺失且非移码纯合突变，该突变会使StPHB3基因编码的氨基酸序列在突变体在36及41位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。
在一些实施例中，本发明为双子叶“Desiree”植物品种。
在一些实施例中，所述应用为如下任一种应用：
1)在降低马铃薯叶绿素中的应用；
2)在降低马铃薯龙葵素中的应用；
3)在降低马铃薯还原糖及淀粉含量中的应用；
4)在增加马铃薯Vc含量在的应用；
5)在提高马铃薯块茎品质中的应用。
本发明第三方面，提供一种制备马铃薯突变体的方法，包括抑制马铃薯中StPHB3蛋白的编码基因的表达。
在一些实施例中，通过CRISPR/Cas9技术在马铃薯中对StPHB3蛋白的编码基因进行编辑，抑制所述编码基因的表达。
在一些实施例中，包括在StPHB3基因外显子上设计靶序列，靶序列的核苷酸序列如SEQID No：5所示，然后将AtU6-26启动子连同包含上述的靶序列的sgRNA序列AtU6-26-sgRNA(如SEQ ID No：6)所示进行基因合成后，插入到载体 PHSN/BUN401-Cas9的BasI酶切位点上，得到StPHB3基因突变载体。
在一些实施例中，首先构建出马铃薯基因CRISPR/Cas9表达载体，设计StPHB3 基因的靶序列，然后将启动子连通含有靶点的sgRNA序列进行基因合成后，插入到敲除载体的酶切位点上，得到StPHB3基因的突变载体。构建的测序正确载体转入宿主细胞中，侵染马铃薯的子叶外植株，在阳性转基因马铃薯后代中筛选 StPHB3基因突变但不包含基因敲除载体序列的马铃薯植株，获得能够提高块茎品质的马铃薯。
所获得的突变体马铃薯具有以下特点：1)stphb3突变体马铃薯块茎绿变程度明显低于野生型，叶绿素含量和龙葵素显著低于野生型。2)stphb3突变体马铃薯块茎还原糖含量和淀粉含量低于野生型。3)stphb3突变体马铃薯块茎Vc含量显著高于野生型。4)所述stphb3突变体基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No： 3及SEQ ID No：4所示。本发明证实，突变StPHB3基因得到的突变体马铃薯块茎品质显著提高，为马铃薯作物的品质改良及培育新品种提供了研究基础，且在生产实践上具有重大意义。
在一些实施例中，本发明提供一种马铃薯块茎品质提高的突变体培育方法，主要有以下步骤：
构建含有马铃薯StPHB3基因敲除载体的宿主细胞工程菌；
将获得的根癌农杆菌转染马铃薯子叶外植体中，筛选出马铃薯StPHB3基因突变的植株。
上述叙述的一种马铃薯块茎品质提高的突变体的培育方法，首先是构建出马铃薯StPHB3基因CRISPR/Cas9表达载体，利用CRISPR-2.0网站设计StPHB3基因的靶序列，然后将AtU6-26启动子连接包含靶点的的sgRNA序列上进行基因合成后，插入到载体PHSN/BUN401-Cas9的BasI酶切位点上，得到StPHB3基因敲除载体。然后将构建载体的正确序列转入宿主细胞中，在利用其侵染马铃薯(品种为“Desiree”)的子叶外植体，鉴定为阳性植株后，后筛选出不包含敲除载体的植株，而后获得品质提高的马铃薯块茎。
上述所叙述的块茎品质提高的马铃薯植株培育方法，将StPHB3基因通过基因编辑技术敲除部分碱基，将启动子连接到包含靶序列的sgRNA序列上进行基因合成后，插入到敲除载体酶切位点上，而获得敲除载体。后侵染相应的马铃薯的子叶外植株，经过培养而得到的植株即为马铃薯StPHB3突变体植株。得到的马铃薯块茎具有品质提高的功能。
优选地，将马铃薯StPHB3基因敲除得到块茎品质提高的马铃薯植株是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术而获得的。所述的马铃薯StPHB3基因敲除载体是 PHSN/BUN401-Cas9-AtU6-26-sgRNA。
实施例1：
本发明提供了一种马铃薯块茎品质提高的StPHB3基因突变体stphb3，所述马铃薯块茎品质提高的StPHB3基因突变体stphb3的核苷酸序列如SEQID No：3及SEQID No：4所示，与核苷酸序列为SEQID No：1所示的StPHB3基因相比，所述马铃薯块茎品质提高的StPHB3基因突变体stphb3均发生碱基缺失且非移码纯合突变。该突变体会使StPHB3基因编码的氨基酸序列在突变体在36及41位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。
马铃薯野生型植株的StPHB3基因的cDNA序列如SEQID No：1所示。
马铃薯块茎品质提高基因StPHB3的氨基酸序列，其序列如SEQ IDNo：2所示。所述马铃薯块茎品质提高的StPHB3基因突变体stphb3的cDNA序列如SEQID No： 3及SEQID No：4所示。
实施例2：
StPHB3基因敲除载体和相应的宿主细胞工程菌的构建
利用CRISPR-2.0网站，在StPHB3基因外显子上设计靶序列，靶序列的核苷酸序列如SEQID No：5(CCGTTCTCTTCGACCGTTTCAAT)所示，然后将AtU6-26启动子连同包含上述的靶序列的sgRNA序列AtU6-26-sgRNA(如SEQ ID No：6)所示进行基因合成后，插入到载体PHSN/BUN401-Cas9的BasI酶切位点上，得到StPHB3 基因突变载体，送测序。
将经过测序正确的StPHB3基因突变载体转染到宿主细胞根癌农杆菌为EHA105中，得到宿主细胞工程菌。
实施例3：
马铃薯StPHB3基因突变材料的构建与检测
利用实施例2中制备的宿主细胞工程菌侵染马铃薯品种为Desiree的子叶外植体，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，利用PCR及测序验证技术验证，筛选出StPHB3基因突变马铃薯植株。
经过测序发现，上述StPHB3基因突变体stphb3马铃薯植株中在靶点处两条不同的染色体上分别缺失了8和38个碱基(如图1所示)。
实施例4：
马铃薯表皮中叶绿素含量的测定
使用紫外分光光度计法。用研磨体分别将马铃薯表皮研磨成粉末状，取马铃薯表皮样品1.0g，加入25mL 95％的乙醇，在0℃黑暗条件下浸提24h，然后过滤至玻璃离心管中，使用同样的乙醇清洗滤渣、滤纸及玻璃棒，滤液进容量瓶中，直至滤渣及滤纸无绿色，用95％的乙醇定容至30mL。以95％乙醇作为空白对照，测定提取液在波长665nm、649nm下的吸光度。
Ca＝13.95A665-6.88A649
Cb＝24.96A649-7.32A665
叶绿素总浓度(mg/L)：C(a+b)＝Ca+Cb；叶绿素a与叶绿素b的总浓度之和为总叶绿素的浓度。
总叶绿素的质量分数(mg/kg)＝C(a+b)×50/M，其中M为样品鲜重。
实施例5：
马铃薯表皮龙葵素含量的测定高效液相色谱法(HPLC)测龙葵素含量。α-茄碱及α-卡茄碱提取：称取约0.2g 样本，加入1mL 5％乙酸溶液，冰浴匀浆，冰水浴超声30min，过夜浸提，8000g 离心10min，取上清液，沉淀加入0.5mL5％乙酸溶液超声30min复提，合并上清，NaOH水溶液调节至11.0左右，三氯甲烷萃取三次，合并有机相，氮吹吹干，1mL 甲醇复溶，针头式过滤器过滤后待测。
HPLC液相条件：Thermo U3000高效液相色谱仪，Thermo C18反相色谱柱 (250mm×4mm，5μm)，流动相的配制：A：乙腈，B：0.02M磷酸二氢钾溶液 (A：B＝25：75)，进样量10μL，流速1mL/min，柱温30℃，紫外波长270nm，待基线稳定后，开始加样，测样品。
实施例6：
Vc含量的测定
取马铃薯样品2.0g，加入10mL 2％的草酸溶液，混匀，然后转移至100mL 容量瓶中，用1％草酸将样品全部洗入容量瓶中，并定容至刻度，然后过滤，取滤液5mL于锥形瓶中，使用标定过的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至呈现淡红色，15s内不褪色为止。记录滴定的体积，计算Vc的含量。
实施例7：
还原糖含量的测定
取马铃薯冻干粉1.0g于试管中，加水20mL于80℃水浴提取30min，期间摇动数次；定容到25mL刻度试管中；5000r/min离心15min，取上清液稀释3 倍后取2mL备用。加入3，5-二硝基水杨酸试剂1.5mL，摇匀，沸水浴5min，迅速以流水冷却；加蒸馏水定容至10mL，于540nm处测定吸光值。计算结果均在标准曲线中查出相应的还原糖含量，按公式进行计算样品中还原糖含量。
实施例8：
淀粉含量的测定
使用科铭生物(目录号DF-2-Y)的试剂盒进行淀粉含量测定，按照试剂盒的分光光度法操作方法进行。称取约0.1g新鲜样本于研钵中研碎，加入1mL试剂一，充分匀浆后转移到EP管中，80℃水浴提取30min，3000g，25℃离心5min，弃上清，留沉淀。后根据试剂盒方法操作进行。
以上所揭露的仅为本发明的优选实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 马铃薯StPHB3基因在提高马铃薯块茎品质中的应用
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 831
<212> cDNA
<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）
<400> 1
atgggtagcc aagctgctgt ttccttcctc accaacatag cccgtgccgc tttcactctc 60
ggcctcggcg gcgcacttgt caattcctcc ctttacaccg tcgacggcgg tcaacgcgcc 120
gttctcttcg accgtttcaa tggtgtcctt gaaaaaaccg ttggtgaagg cactcatttc 180
ttgatcccat ggcttcagaa gcccttcata ttcgatatcc gtaccaggcc tcacgttttc 240
tcctcagtct ccggtacaaa ggatctacaa atggttaatc tcacgctacg tattctttct 300
agaccagaaa tatcacgcct tccctacatt ttcaaaaacc taggtactga atatgacgaa 360
aaagtccttc cttctattgg taatgaggtg ctcaaagctg ttgtggctca atttaacgct 420
gatcagctcc ttacggatcg tccacaggtc tctgcacttg tacgggagag tttgattaaa 480
cgtgccaagg atttcaatat tgtgcttgat gatgtggcga tcacacactt atcttatgga 540
gctgagtttt cgaaagctgt ggagcagaaa caggtagctc agcaggaggc tgagaggtcg 600
aaatttgtgg tgatgaaagc tgagcaagag aggagagcgg caattattcg ggctgaagga 660
gagagcgaat ctgccaagct gatttcggat gctactgcag ctgctggaat gggtttgatt 720
gagttgagga ggattgaagc ttctagagaa gttgctggga ctttggctaa gactcctaat 780
gttgcttact tgccaaagca agggaatatg cttcttggac tcaaccgttg a 831
<210> 2
<211> 276
<212> PRT
<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）
<400> 2
Met Gly Ser Gln Ala Ala Val Ser Phe Leu Thr Asn Ile Ala Arg Ala Ala Phe Thr Leu Gly Leu Gly
1 5 10 15 20
Gly Ala Leu Val Asn Ser Ser Leu Tyr Thr Val Asp Gly Gly Gln Arg Ala Val Leu Phe Asp Arg Phe
25 30 35 40 45
Asn Gly Val Leu Glu Lys Thr Val Gly Glu Gly Thr His Phe Leu Ile Pro Trp Leu Gln Lys Pro Phe
50 55 60 65
Ile Phe Asp Ile Arg Thr Arg Pro His Val Phe Ser Ser Val Ser Gly Thr Lys Asp Leu Gln Met Val
70 75 80 85 90
Asn Leu Thr Leu Arg Ile Leu Ser Arg Pro Glu Ile Ser Arg Leu Pro Tyr Ile Phe Lys Asn Leu Gly
95 100 105 110 115
Thr Glu Tyr Asp Glu Lys Val Leu Pro Ser Ile Gly Asn Glu Val Leu Lys Ala Val Val Ala Gln Phe
120 125 130 135
Asn Ala Asp Gln Leu Leu Thr Asp Arg Pro Gln Val Ser Ala Leu Val Arg Glu Ser Leu Ile Lys Arg
140 145 150 155 160
Ala Lys Asp Phe Asn Ile Val Leu Asp Asp Val Ala Ile Thr His Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Phe Ser
165 170 175 180
Lys Ala Val Glu Gln Lys Gln Val Ala Gln Gln Glu Ala Glu Arg Ser Lys Phe Val Val Met Lys Ala
185 190 195 200 205
Glu Gln Glu Arg Arg Ala Ala Ile Ile Arg Ala Glu Gly Glu Ser Glu Ser Ala Lys Leu Ile Ser Asp Ala
210 215 220 225 230
Thr Ala Ala Ala Gly Met Gly Leu Ile Glu Leu Arg Arg Ile Glu Ala Ser Arg Glu Val Ala Gly Thr
235 240 245 250
Leu Ala Lys Thr Pro Asn Val Ala Tyr Leu Pro Lys Gln Gly Asn Met Leu Leu Gly Leu Asn Arg
255 260 265 270 275
<210> 3
<211> 823
<212> cDNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
atgggtagcc aagctgctgt ttccttcctc accaacatag cccgtgccgc tttcactctc 60
ggcctcggcg gcgcacttgt caattcctcc ctttacaccg tcgacggcgg tcaacgcgcc 120
gttctgtttc aatggtgtcc ttgaaaaaac cgttggtgaa ggcactcatt tcttgatc 180
atggcttcag aagcccttca tattcgatat ccgtaccagg cctcacgttt tctcctcagt 240
ctccggtaca aaggatctac aaatggttaa tctcacgcta cgtattcttt ctagaccaga 300
aatatcacgc cttccctaca ttttcaaaaa cctaggtact gaatatgacg aaaaagtcct 360
tccttctatt ggtaatgagg tgctcaaagc tgttgtggct caatttaacg ctgatcagct 420
ccttacggat cgtccacagg tctctgcact tgtacgggag agtttgatta aacgtgccaa 480
ggatttcaat attgtgcttg atgatgtggc gatcacacac ttatcttatg gagctgagtt 540
ttcgaaagct gtggagcaga aacaggtagc tcagcaggag gctgagaggt cgaaatttgt 600
ggtgatgaaa gctgagcaag agaggagagc ggcaattatt cgggctgaag gagagagcga 660
atctgccaag ctgatttcgg atgctactgc agctgctgga atgggtttga ttgagttgag 720
gaggattgaa gcttctagag aagttgctgg gactttggct aagactccta atgttgctta 780
cttgccaaag caagggaata tgcttcttgg actcaaccgt tga 823
<210> 4
<211> 793
<212> cDNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
atgggtagcc aagctgctgt ttccttcctc accaacatag cccgtgccgc tttcactctc 60
ggcctcggcg gcgcacttgt caattcctcc ctttacaccg tcgacggcgg ttgaaaaaac 120
cgttggtgaa ggcactcatt tcttgatccc atggcttcag aagcccttca tattcgatat 180
ccgtaccagg cctcacgttt tctcctcagt ctccggtaca aaggatctac aaatggttaa 240
tctcacgcta cgtattcttt ctagaccaga aatatcacgc cttccctaca ttttcaaaaa 300
cctaggtact gaatatgacg aaaaagtcct tccttctatt ggtaatgagg tgctcaaagc 360
tgttgtggct caatttaacg ctgatcagct ccttacggat cgtccacagg tctctgcact 420
tgtacgggag agtttgatta aacgtgccaa ggatttcaat attgtgcttg atgatgtggc 480
gatcacacac ttatcttatg gagctgagtt ttcgaaagct gtggagcaga aacaggtagc 540
tcagcaggag gctgagaggt cgaaatttgt ggtgatgaaa gctgagcaag agaggagagc 600
ggcaattatt cgggctgaag gagagagcga atctgccaag ctgatttcgg atgctactgc 660
agctgctgga atgggtttga ttgagttgag gaggattgaa gcttctagag aagttgctgg 720
gactttggct aagactccta atgttgctta cttgccaaag caagggaata tgcttcttgg 780
actcaaccgt tga 793
<210> 5
<211> 23
<212> cDNA
<213> 马铃薯（Solanum tuberosum L.）
<400> 5
ccgttctcttcgaccgtttcaat 23
<210> 6
<211> 1199
<212> cDNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagt 900
taagcttggt accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca 960
gcacagtggc ggccgctcga gtctagaggg cccttcgact acaaagacca tgacggtgat 1020
tataaagatc atgacatcga ctacaaggat gacgatgaca agtgagttta aacccgctga 1080
tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 1140
tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgc 1199

Claims (10)

1.StPHB3蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑制因子的生物材料在调控马铃薯品质中的应用。
2.StPHB3蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑制因子的生物材料在选育品质较高的马铃薯中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过抑制StPHB3蛋白的编码基因的表达，以提高马铃薯的品质。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述StPHB3蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：
1)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列；
2)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述StPHB3蛋白的编码基因具有以下任意一种核苷酸序列：
1)SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID No：1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的核苷酸序列；
3)SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
4)SEQ ID No：3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的核苷酸序列；
5)SEQ ID No：4所示的核苷酸序列；
6)SEQ ID No：4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，与核苷酸序列SEQ ID No：1相比，所述StPHB3蛋白的核苷酸序列发生碱基缺失且非移码纯合突变，该突变会使StPHB3基因编码的氨基酸序列在突变体在36及41位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为如下任一种应用：
1)在降低马铃薯叶绿素中的应用；
2)在降低马铃薯龙葵素中的应用；
3)在降低马铃薯还原糖及淀粉含量中的应用；
4)在增加马铃薯Vc含量在的应用；
5)在提高马铃薯块茎品质中的应用。
8.一种制备马铃薯突变体的方法，其特征在于：包括抑制马铃薯中StPHB3蛋白的编码基因的表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9技术在马铃薯中对StPHB3蛋白的编码基因进行编辑，抑制所述编码基因的表达。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括在StPHB3基因外显子上设计靶序列，靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示，然后将AtU6-26启动子连同包含上述的靶序列的sgRNA序列AtU6-26-sgRNA(如SEQ ID No：6)所示进行基因合成后，插入到载体PHSN/BUN401-Cas9的BasI酶切位点上，得到StPHB3基因突变载体。
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