CN114672436A

CN114672436A - 一株嗜酸乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114672436A
Application number: CN202210358397.6A
Authority: CN
Inventors: 涂增; 刘仟千
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2022-04-07
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2042-04-07
Also published as: CN114672436B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株嗜酸乳杆菌及其应用，嗜酸乳杆菌保藏编号为CCTCCM20211622。嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的药物或药物组合物中的应用。嗜酸乳杆菌通过改善结肠粘膜损伤、减少结肠中促炎因子的含量、缓解结肠缩短现象、提高肠道菌群多样性、抑制有害菌的生长起作用。本发明嗜酸乳杆菌C4对胃肠液具有较好的耐受能力，改善结肠粘膜损伤和结肠缩短现象，并对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等有害菌的生长有抑制作用。可用于制备具有预防UC的乳制品、豆制品与果蔬制品，具有非常广泛的应用前景。

Description

一株嗜酸乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株嗜酸乳杆菌及其应用。

背景技术

目前，炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种肠道慢性非特异炎症性疾病，其临床表现为腹泻和血便，其特征是病程有进行性和不可预知性。溃疡性结肠炎是结肠黏膜的一种特发性的慢性炎症性疾病，始于直肠，通常以连续的方式向近端延伸穿过部分或整个结肠。临床表现多以腹泻、腹痛、黏液浓血便等症状为主，其中血性腹泻是该疾病的典型症状。

肠道菌群的改变与炎症性肠病的发生发展密切相关，一方面，肠道菌群的紊乱可能导致肠粘膜环境改变和粘膜炎症的发生。

益生菌是用来改善微生物平衡的非致病微生物，特别是在胃肠道。它们由布氏酵母菌或乳酸菌组成，作为膳食补充剂和食品受到监管。许多益生菌来自健康人体肠道中的共生微生物区系；其中几个与IBD有关。大量文献证实了益生菌的抗炎作用，而益生菌又反映了宿主与其微生物群之间存在的免疫耐受性。益生菌通过产生细菌素来抑制潜在致病菌的生长，并创造一个酸性更强的环境，这种环境对致炎细菌有害，但促进有益物种的生长，从而有益地调节微生物区系的组成。以达到增加益生菌多样性，减少真菌多样性，还可以促进具有抗炎和抗癌特性的脂肪酸的产生。近年来，益生菌在溃疡性结肠炎中的作用的几项研究表明，益生菌可以缓解疾病的严重程度。这种效果在益生菌中不是普遍性的，具有菌株特异性。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷：目前还未有相关的能够起到很好预防、调节或治疗作用的益生菌。

解决以上问题及缺陷的难度为：益生菌种类繁多，在不同的乳杆菌菌株之间存在着巨大的基因组多样性。对多种益生菌的体外测定和动物模型数据表明，不同的潜在益生菌菌株的药效不同。不同的益生菌因菌株和疾病特异性不同，对不同的疾病有不同的作用。要从众多来源中分离鉴定挑选出一株对UC有良好缓解和治疗作用的菌株，需要经过繁杂的培养筛选工作才可能找到特异性治疗UC的菌株并且需要通过反复多样的实验来验证该菌株的效力。

解决以上问题及缺陷的意义为：益生菌作为定植于肠道并对肠道环境发挥调节作用的肠道菌群，与肠道疾病有着密切的联系。目前较为广泛的治疗UC的方法包括氨基水杨酸、激素和免疫抑制剂，这三种药物对UC的治疗作用较局限且副作用较多，更多的新疗法有待提出。有研究发现双歧杆菌能够协同美沙拉嗪治疗改善UC患者的临床症状，其效果要优于美沙拉嗪单独治疗，说明益生菌对UC的治疗具有潜在的研究价值。因此迫切需要开发一种有效的益生菌来预防和治疗UC。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株嗜酸乳杆菌及其应用。

本发明是这样实现的，一株嗜酸乳杆菌，所述株嗜酸乳杆菌保藏编号为CCTCC M20211622。

本发明的另一目的在于提供一种所述嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的药物或药物组合物中的应用。

进一步，所述应用包括：所述嗜酸乳杆菌通过改善结肠粘膜损伤、减少结肠中促炎因子的含量、缓解结肠缩短现象、提高肠道菌群多样性、抑制有害菌的生长起作用。

进一步，所述缓解结肠缩短现象即回升溃疡性结肠炎引起的结肠缩短。

进一步，所述药物或药物组合物中嗜酸乳杆菌的含量为不低于1.0×10⁶cfu/mL或1.0×10⁶cfu/g。

本发明的另一目的在于提供一种所述嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的保健品或食品中的应用。

进一步，所述食品为发酵食品。

进一步，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品；所述发酵食品通过嗜酸乳杆菌发酵制备得到。

进一步，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品；所述乳制品包括酸奶、奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜、香蕉、木瓜制品。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述嗜酸乳杆菌的益生菌制剂，所述益生菌用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明嗜酸乳杆菌C4对胃肠液具有较好的耐受能力，改善结肠粘膜损伤和结肠缩短现象效果显著，对UC有良好的的治疗和预防效果。可用于制备具有预防UC的乳制品、豆制品与果蔬制品，具有非常广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例提供的嗜酸乳杆菌C4的菌落形态图。

图2是本发明实施例提供的是嗜酸乳杆菌C4的革兰染色图。

图3是本发明实施例提供的是嗜酸乳杆菌C4对UC小鼠结肠长度的影响示意图。

图4是本发明实施例提供的嗜酸乳杆菌C4对UC小鼠体重变化的影响图。

图5是本发明实施例提供的嗜酸乳杆菌C4对UC小鼠DAI评分的影响图。

图6是本发明实施例提供的嗜酸乳杆菌C4对UC小鼠肠道组织损伤的影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株嗜酸乳杆菌及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明提供的嗜酸乳杆菌CQMU-C4，提议的分类学命名为lactobacillusacidophilus CQMU-C4，于2021年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 20211622，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

该培养物已于2021年12月13日由本保藏中心收到，井登记入册。根据您(们)的请求，由该8日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样晶的请求后再延续保存五年。该培养物的存活性本保藏中心于2021年12月20日检测完毕,结果为存活。

所述株嗜酸乳杆菌保藏编号为CCTCC M 20211622。

本发明提供的嗜酸乳杆菌在药物或药物组合物中含量为不低于1.0×10⁶cfu/mL或1.0×10⁶cfu/g。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：

嗜酸乳杆菌C4具有下述生物学特性：

(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。

(2)菌落特征：厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。

(3)染色特征：革兰染色阳性，呈蓝紫色，菌体长杆状，参见附图2。

(4)生长特性：在37℃恒温有氧或厌氧的条件下，在MRS培养基中培养约16小时达到对数末期。

(5)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力。

(6)对嗜酸乳杆菌C4的生化鉴定结果如表1。

表1嗜酸乳杆菌C4生化鉴定结果

本菌株嗜酸乳杆菌C4的获得方法为：

(1)取1g来自4岁孩童的新鲜粪便溶于1ml的生理盐水中，稀释1000倍后；

(2)采用四区划线法将稀释液接种至含碳酸钙的MRS培养基中37℃培养36-48h；

(3)选有钙溶圈现象并且符合乳酸菌目基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；

(4)将上述单菌落培养于液体MRS培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。

CaCO₃-MRS培养基：MRS培养基+0.3％CaCO₃。

实施例1：嗜酸乳杆菌C4对模拟胃肠液具有良好的耐受性

将冷冻保存的嗜酸乳杆菌C4接种于MRS固体培养基中，在温度37℃厌氧培养36-48h，再经MRS固体培养基传代培养2～3次后，取单个菌落接种于液体MRS培养基中培养24-36h，之后分别取1mL嗜酸乳杆菌C4的培养液，与9.0mL pH＝2.5的MRS和MRS培养基混合，并在37℃下厌氧培养3h后取出，稀释1*10⁵后涂布100ul于MRS固体培养基上，厌氧培养48h后取出，平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率(见表2)。

表2嗜酸乳杆菌C4抗酸能力测定

MRS平板菌落计数	PH＝2的MRS平板菌落计数	存活率(100％)
			1.4*10<sup>8</sup>CFU/ml	3.5*10<sup>7</sup>CFU/ml	25％

分别取1mL嗜酸乳杆菌C4的培养液，与9.0mL含0.3％牛胆盐的MRS和MRS培养基混合，并在37℃下厌氧培养3h后取出，稀释1*10⁵后涂布100ul于MRS固体培养基上，厌氧培养48h后取出，平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率(见表3)。

存活率＝牛胆盐或pH＝2MRS处理后平板活菌计数/MRS平板活菌计数*100％

表3嗜酸乳杆菌C4扛胆盐能力测定

实验结果如表2和表3所示。结果表明，嗜酸乳杆菌C4有较好的抗酸和扛胆盐能力。

实施例2：嗜酸乳杆菌C4对UC小鼠结肠缩短的影响

24只C57雄性小鼠(5周，14-16g)随机分为4组，每组6只，分别为：对照组、模型组、美沙拉嗪(5-ASA)组(75mg/kg/day)和嗜酸乳杆菌C4组。在实验期间，除NC组外，其他实验组给予2.5％DSS连续8天饮水诱导小鼠UC模型，造模同时，对各治疗组进行相应药物和细菌灌胃，每天1次，连续8天。灌胃菌悬液的剂量为1.0×10⁹CFU/mL，重悬于PBS溶液中。具体实验动物分组及处理方法见下：

对照组：不作任何干预

DSS组：2.5％DSS水+200ulPBS

C4组：2.5％DSS水+200ulC4菌悬液(1*10⁹CFU/mL)

美沙拉嗪组：2.5％DSS水+200ul美沙拉嗪(5-ASA)(75mg/kg/day)

造模期间(DSS处理)，每天定时称量小鼠体重；此外，每日观察小鼠的粪便性状、便血性状和体重变化情况，计算得出小鼠的疾病活动指数(Disease activity index，DAI)，具体评分项目的得分如表4。在第9天解剖小鼠，取其结肠并测量结肠长度(图3)，并计算小鼠的体重变化率(图4)和DAI评分(图5)。

表4疾病活动指数(Disease activity index，DAI)

实验结果如图3所示。DSS组小鼠结肠长度明显缩短，而C4和5-ASA组的结肠缩短现象有回升，尤其是C4组长度最长。说明嗜酸乳杆菌C4对溃疡性结肠炎的结肠损伤有缓解作用，如图3。DSS组小鼠体重下降明显，从第一天到第九天C4和5-ASA组的体重下降现象有缓解，尤其是C4组体重反而出现增长；且DSS组的DAI评分显著升高，而C4和5-ASA组较DSS组都有下降，其中C4组下降最显著。说明嗜酸乳杆菌C4对溃疡性结肠炎有缓解修复作用，如图4，图5。

实施例3：嗜酸乳杆菌C4对UC小鼠肠道组织损伤的影响

将小鼠颈椎脱白处死后，取适量长度小鼠结肠组织，用PBS冲洗肠道内容物，然后将其浸泡于4％多聚甲醛过夜固定；

将固定后的组织依次浸入85％乙醇，90min，95％乙醇，40min，2次，无水乙，15min，3次，二甲苯，10min，2次。；

将脱水后的组织放入54-56℃的液体石蜡中，30min，2次。；

将组织块放入82℃硬蜡+蜂蜡包埋，然后用切片机切成4um厚的蜡片，最后70℃，45min把蜡片烤干。

HE染色步骤：(1)脱蜡入水：将依次放入2次二甲苯中，每次10分钟，然后依次放入无水乙醇1、无水乙醇2、95％乙醇、90％乙醇以及80％乙醇的梯度酒精中进行脱蜡，每个梯度脱蜡时间为2min，然后流水冲洗2min。

(2)Harris苏木素染色5min，水洗1min。(3)1％盐酸酒精分化数秒。(4)切片流水冲洗15min返蓝。(5)伊红染色1min，流水冲洗2min。(6)染色完成的切片经过80％酒精、90％酒精、95％酒精1、95％酒精2、无水乙醇1、无水乙醇2梯度酒精脱水，每个梯度酒精脱水时间为2min。(7)依次经过二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3透明，每次透明时间2min。(8)中性树胶封固，待树胶凝固后，进行显微镜观察。

通过对结肠组织进行HE染色可以看出(图6)，DSS组结肠炎细胞浸润严重，已侵至黏膜下层，杯状细胞缺失、隐窝肿胀变形破坏，结肠黏膜完整性被破坏，结肠出现明显的炎症。而control、C4和5-ASA组小鼠结肠黏膜上皮细胞完整，固有层腺体形态正常，隐窝正常，黏膜下层无水肿。说明嗜酸乳杆菌C4对溃疡性结肠炎引起的结肠炎者有缓解作用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 一株嗜酸乳杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1529

<212> DNA

<213> 乳杆菌CQMU-C4(Lactobacilles acidophilus CQMU-C4)

<400> 1

ctgagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60

cgagctgaac caacagattc acttcggtga tgacgttggg aacgcgagcg gcggatgggt 120

gagtaacacg tggggaacct gccccatagt ctgggatacc acttggaaac aggtgctaat 180

accggataag aaagcagatc gcatgatcag cttataaaag gcggcgtaag ctgtcgctat 240

gggatggccc cgcggtgcat tagctagttg gtagggtaac ggcctaccaa ggcaatgatg 300

catagccgag ttgagagact gatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta 360

cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgaaag tctaatggag caacgccgcg 420

tgagtgaaga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgttg gtgaagaagg atagaggtag 480

taactggcct ttatttgacg gtaatcaacc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag 540

ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag 600

gcggaagaat aagtctgatg tgaaagccct cggcttaacc gaggaactgc atcggaaact 660

gtttttcttg agtgcagaag aggagagtgg aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga 720

tatatggaag aacaccagtg gcgaaggtgg ctctctggtc tgcaactgac gctgaggctc 780

gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgagt 840

gctaagtgtt gggaggtttc cgcctctcag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc 900

tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt 960

ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatctagtg 1020

caatccgtag agatacggag ttcccttcgg ggacactaag acaggtggtg catggctgtc 1080

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcatta 1140

gttgccagca ttaagttggg cactctaatg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1200

gggatgacgt caagtcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac 1260

agtacaacga ggagcaagcc tgcgaaggca agcgaatctc ttaaagctgt tctcagttcg 1320

gactgcagtc tgcaactcga ctgcacgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac 1380

gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtctgc 1440

aatgcccaaa gccggtggcc taaccttcgg gaaggagccg tctaaggcag ggcagatgac 1500

tggggtgaag tcgtaacaag gtaaccgta 1529

Claims

1.一株嗜酸乳杆菌，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌保藏编号为CCTCC M20211622。

2.一种如权利要求1所述嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的药物或药物组合物中的应用。

3.如权利要求2所述嗜酸乳杆菌制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的药物或药物组合物中的应用，其特征在于，所述应用包括：所述嗜酸乳杆菌通过改善结肠粘膜损伤、减少结肠中促炎因子的含量、缓解结肠缩短现象、提高肠道菌群多样性、抑制有害菌的生长起作用。

4.如权利要求3所述，嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的药物或药物组合物中的应用，其特征在于，所述缓解结肠缩短现象即回升溃疡性结肠炎引起的结肠缩短。

5.如权利要求2所述，嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的药物或药物组合物中的应用，其特征在于，所述药物或药物组合物中嗜酸乳杆菌的含量为不低于1.0×10⁶cfu/mL或1.0×10⁶cfu/g。

6.一种如权利要求1所述嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的保健品或食品的应用。

7.如权利要求6所述嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的保健品或食品的应用，其特征在于，所述食品为发酵食品。

8.如权利要求7所述嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的保健品或食品的应用，其特征在于，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品；所述发酵食品通过嗜酸乳杆菌发酵制备得到。

9.如权利要求7所述嗜酸乳杆菌在制备用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状的保健品或食品的应用，其特征在于，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品；所述乳制品包括酸奶、奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜、香蕉、木瓜制品。

10.一种包含如权利要求1所述嗜酸乳杆菌的益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌用于缓解、改善溃疡性结肠炎症状。