CN114651719B - 一种利用钙信号抑制剂提高颠茄发根中托品烷类生物碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用钙信号抑制剂提高颠茄发根中托品烷类生物碱含量的方法，通过使用Ca²⁺特异性的螯合剂降低细胞外Ca²⁺浓度，或使用细胞膜Ca²⁺通道抑制剂，或使用胞内Ca²⁺受体钙调蛋白抑制剂，抑制颠茄发根中Ca²⁺/CaM信号途径，从而诱导托品烷类生物碱合成途径相关基因PMT，TRI，CYP80F1，H6H和ArAT4的表达，促进托品烷类生物碱莨菪碱或山莨菪碱或东莨菪碱的合成与积累。

Description

一种利用钙信号抑制剂提高颠茄发根中托品烷类生物碱含量 的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种利用钙信号抑制剂提高颠茄发根中托品烷类生物碱含量的方法。

背景技术

托品烷生物碱(tropane alkaloids,TAs)作为抗胆碱药物在临床上应用非常广泛，包括镇痛、麻醉、抗晕动、止咳、平喘、治疗帕金森症，也可用于改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农业中毒等。由于目前市场上以阿托品和东莨菪碱为主的托品烷生物碱供应主要依赖于从药源植物中提取，研究植物体中TAs生物合成的分子生物学和开展代谢工程研究以提高TAs含量是目前培育高含量优质药源植物的一个最有效的方法，也是次生代谢工程领域的一个研究热点。

颠茄是一种在国内大量种植的TAs商业药源植物，收录于《中国药典》，因此，在颠茄中开展TAs合成生物学和代谢工程研究具有重要的实际意义。基于对烟草、曼陀罗和天仙子等TAs相关模式植物研究成果的借鉴和颠茄转录组数据库的筛选，颠茄中TAs生物合成途径的已知步骤酶基因都得到了克隆，包括ODC、ADC、PMT、MPO、TRI、TRII、CYP80F1、H6H和ArAT4，同时，国内外都对颠茄的再生体系和快速繁殖方法进行了成熟的研究，基于转基因发根和植株系统的次生代谢工程也有大量的尝试，单基因转化(PMT、TRI、H6H和RacGTPase)和双基因转化(内外源的PMT和H6H)都取得了不错的效果，相关高莨菪碱和东莨菪碱含量的转基因株系都已有报道。然而，目前对TAs生物合成的分子生物学和代谢工程的研究也就仅止于此，不仅一些关键的未知反应步骤还不清楚，TAs的合成调控机制也一无所知，相关的调控因子完全没有报道，极大的限制了对其生物合成机制的认识和进一步代谢工程的应用。

为了解决上述研究的瓶颈问题，美国密歇根州立大学从2011年开始对颠茄各组织部位和不同发育阶段的材料进行了转录组测序和代谢组分析，相应的数据分析和完善工作持续更新至今且完全公开。虽然基于转录组测序的数字表达谱能为TAs代谢调控研究提供有价值的线索，但是如果缺乏对TAs合成途径基因诱导表达或含量诱导合成的数据，也很难为深入研究TAs合成调控机制提供切入口。遗憾的是，根据已有的文献报道发现，常见的激素和刺激子如生长素(auxin)、茉莉酸甲酯(methyl jamonate，MeJA)、SA、Glutathione、chitin、chitosan和yeast extract等，均不能使颠茄发根、根培养和植株中TAs总含量提高，有些甚至降低。为了在外源诱导子刺激(或信号转导)水平上对诱导颠茄TAs含量提高取得突破，本发明以颠茄发根为材料，尝试了用钙信号试剂进行处理，对处理的发根检测TAs含量，对于含量提高的处理发根进而检测其合成途径基因表达量，研究其含量的提高是否因为在转录水平上调控其生物合成能力所致，为后续基于该诱导表达情况筛选TAs生物合成的调控因子提供基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用钙信号抑制剂提高颠茄发根中托品烷类生物碱含量的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种利用钙信号抑制剂提高颠茄发根中托品烷类生物碱含量的方法

利用钙信号抑制剂抑制颠茄发根中Ca²⁺/CaM信号途径，从而诱导托品烷类生物碱合成途径相关基因PMT，TRI，CYP80F1，H6H和ArAT4的表达，促进托品烷类生物碱莨菪碱或山莨菪碱或东莨菪碱的合成与积累。

本发明优选的，所述钙信号抑制剂为Ca²⁺特异性的螯合剂，用于降低细胞外Ca²⁺浓度。

本发明进一步优选的，所述Ca²⁺特异性的螯合剂为乙二醇二乙醚二胺四乙酸。

本发明进一步优选的，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度小于10mM。

本发明优选的，所述钙信号抑制剂为细胞膜Ca²⁺通道抑制剂。

本发明进一步优选的，所述细胞膜Ca²⁺通道抑制剂为维拉帕米。

本发明进一步优选的，维拉帕米的浓度为0.8-1.2mM。

本发明优选的，所述钙信号抑制剂为胞内Ca²⁺受体钙调蛋白抑制剂。

本发明进一步优选的，所述胞内Ca²⁺受体钙调蛋白抑制剂为三氟拉嗪。

本发明的有益效果在于：

Ca²⁺信号是植物界普遍存在的一种起调控作用的信号机制，广泛介导了各种外源刺激和内源发育信号对植物生理反应的调控。用信号试剂饲喂法分别在胞外Ca²⁺浓度、细胞膜Ca²⁺通道和胞内Ca²⁺受体三个层面上研究Ca²⁺信号对颠茄发根中TAs生物合成的调控。在MS培养基(CaCl₂本底浓度为3mM)的基础上提高Ca²⁺浓度(5mM,10mM,20mM,30mM)，发根中TAs含量均显著降低，且与培养基中Ca²⁺浓度呈现显著的负相关。高浓度的Ca²⁺(>10mM)同时还抑制了根毛的发育。

降低MS中的Ca²⁺浓度(1.5mM、0.75mM)不影响TAs的含量，但是完全去除Ca²⁺后莨菪碱含量提高了1倍。用Ca²⁺特异性的螯合剂EGTA处理颠茄发根，5mM的剂量分别使莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量提高了1.7倍、1.9倍和0.8倍，同时发根干重减少了23％。

用细胞膜Ca²⁺通道抑制剂verapamil处理发根10天，两种浓度(0.8mM和1.2mM)均提高了TAs的含量，1.2mM处理组含量提高极显著，分别使莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量提高了1.3倍、1.4倍和1.2倍。培养基中TAs分泌提高的程度要高于发根，0.8mM和1.2mM处理的培养基中莨菪碱含量分别是对照的3.2倍和3.6倍，而东莨菪碱含量是对照的6.6倍和9.9倍。6个TAs合成途径基因除MPO表达无变化外，其余5个基因(PMT，TRI，CYP80F1，H6H和ArAT4)表达均受verapamil极显著的诱导。

用胞内Ca²⁺受体钙调蛋白(Calmodulin,CaM)特异的抑制剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)处理发根10天，20μΜ和40μΜ的TFP使发根中莨菪碱含量分别提高了0.7倍和1.5倍，培养基中莨菪碱分泌提高了40％和70％。山莨菪碱和东莨菪碱只在40μΜ处理的发根中分别极显著的提高了1.1倍和1.2倍，但是发根干重降低了12％。东莨菪碱分泌也只在40μΜTFP处理组提高了70％。5个合成途径基因(PMT，TRI，CYP80F1，H6H和ArAT4)在40μΜTFP处理第10天表达量极显著上调，MPO基因在处理的第5天，表达量极显著提高了1.3倍。以上结果表明：颠茄发根中抑制Ca²⁺/CaM信号能够诱导TAs合成途径基因的表达和TAs的合成与积累。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为提高培养基中Ca²⁺浓度抑制了颠茄发根根毛发育(A)，同时也抑制了发根生长和TAs的合成(Hyoscyamine：莨菪碱；Anisodamine：山莨菪碱；Scopolamine：东莨菪碱)；

图2为去除培养基中Ca²⁺离子改变了颠茄发根形态、生长和TAs积累(A)，降低培养基中Ca²⁺离子浓度对TAs含量的影响(B)，添加特异性的Ca²⁺离子螯合剂EGTA对TAs含量的影响(C)；

图3为细胞膜钙通道抑制剂Verapamil处理颠茄发根不影响发根形态和生长(A)，但是提高了发根中TAs含量(B)和向培养基中分泌(C)；

图4为TFP处理颠茄发根改变了发根形态、抑制了生长(A)，但是提高了发根中TAs含量(B)和向培养基中分泌(C)；

图5为钙调蛋白抑制剂TFP抑制了发根的形态(A)及生长速率(B)；

图6为Verapamil处理对颠茄发根中TAs合成途径基因表达的影响；

图7为TFP处理对颠茄发根中TAs合成途径相关基因表达的影响；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明采用的颠茄(Atropa belladonna L.)发根材料由卸甲改造的发根农杆菌C58C1浸染颠茄叶片后诱导获得，MS固体平板上25℃暗培养保存于西南大学重庆市甘薯工程技术研究中心。

试剂：氯化钙(CaCl₂)、乙醇(Ethanol)、氨水(Ammonium solution，25-28％的NH₃w％含量)和HPLC级甲酸(Formic acid)购自成都市科龙化工试剂厂；乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N9,N9-tetraacetic acid，EGTA)购自Amresco公司；三氟拉嗪(Trifluoperazine，TFP)、乙酸铵(Ammonium acetate)、莨菪碱(Hyoscyamine)、山莨菪碱(Anisodamine)和东莨菪碱(Scopolamine)购自Sigma公司；HPLC级甲醇(Methanol)和乙腈(Acetonitrile)购自Sigma公司或Homeywell公司；盐酸维拉帕米(±Verapamil Hydrochloride)、无水氯化镧(LaCl₃)和无水氯化镉(CdCl₂)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；植物凝胶(Gellan Gum)购自Wako公司；分析纯氯仿(Chloroform)购自北碚钛鑫化工；植物培养基MS粉购自北京西美杰科技有限公司；其它如无水乙醇、蔗糖、琼脂糖、琼脂粉和MS培养基等所需生化试剂和有机试剂均为分析纯，购至重庆川东化工或成都科龙化工或从日本进口。

试剂盒：植物总RNA提取试剂盒RNAsimple Total RNA Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒iScript^TM cDNA Synthesis Kit购自Bio-Rad公司；Q-PCR染料iTaq^TM Universal

Green Supermix购自Bio-Rad公司。

耗材：0.2μm直径50mm有机系和水系溶剂微孔过滤膜，0.22μm和0.45μm尼龙66膜(Nylon)一次性滤器购自津腾公司；砂芯过滤过滤装置购自上海申迪玻璃仪器有限公司；无酶的DNase/RNase free EP管和枪头购自AXYGEN公司或KIRGEN公司；Q-PCR的八连管和盖子8strip tubes and 8strip caps购自AXYGEN公司或KIRGEN公司；HPLC色谱柱PhenomenexGemini 5μC18 110A(250×4.6mm，5micron)购自Phenomenex公司。

引物：引物合成及测序由成都擎科梓熙生物技术有限公司、上海英骏生物技术有限公司和华大基因完成，本章引物序列见表1。

表1.颠茄各基因qPCR引物

试剂配制

Ca²⁺：2.5mmol/mL，水溶，称取277.5mg氯化钙固体溶于1mL去离子水中中,

EGTA：0.1mmol/mL，2.5％稀释的氨水溶，吸取250uL氨水溶于9.75mL无菌水中，再称取38.04mg EGTA固体溶于其中，0.22μm尼龙膜过滤灭菌，-20℃保存备用；

LaCl₃：0.04mmol/mL，水溶，稀盐酸促溶，称取79.104mg LaCl₃固体悬溶于10mL无菌水中，溶液呈乳白色浑浊状，逐滴滴加稀HCl并不停摇晃混匀，直至溶液澄清，0.22μm尼龙膜过滤灭菌，-20℃保存备用；

CdCl₂：0.08mmol/mL，水溶，称取73.328mg CdCl₂固体溶于5mL无菌水中，0.22μm尼龙膜过滤灭菌，-20℃保存备用；

Verapamil：0.04mmol/mL，水溶，称取196.424mg盐酸维拉帕米固体溶于10mL无菌水中，0.22μm尼龙膜过滤灭菌，-20℃保存备用；

TFP：20μm/mL，水溶，称取48.04mg三氟拉嗪固体溶于5mL无菌水，0.22μm尼龙膜过滤灭菌，-20℃保存备用；

200mM NH₄Cl溶液：称取1.0678g NH₄Cl固体，溶于100mL蒸馏水，用氨水调pH至9.8；

氯仿饱和氨水：500mL氯仿中加入约100mL氨水，塞紧盖子，剧烈上下摇晃混匀，静置分层，去除上层水相，留下层有机相备用；

生物碱存储缓冲液：17％v/v乙腈，溶于50mM KH₂PO₄溶液，用H₃PO₄调pH至3.0。具体方法：称取0.68g KH₂PO₄固体溶于100mL ddH₂O，用H₃PO₄调pH至3.0，取该溶液83mL与17mL乙腈混匀，4℃保存备用。

乙酸铵缓冲液(HPLC流动相水相)：20mM NH₄OAc，称取1.54g NH₄OAc固体溶于1LddH₂O，加入1mL甲酸，用氨水调pH至4.0。

颠茄发根培养基

MS液体培养基：MS(或称取Phytotech MS粉4.4g/L)+30g/L蔗糖，调pH 5.80-5.85，121℃高压蒸汽灭菌20min；

MS固体培养基：MS+30g/L蔗糖，调pH 5.80-5.85，加入5g/L植物凝胶，121℃高压蒸汽灭菌20min；

颠茄发根各种处理培养基

钙处理培养基：MS配置过程中控制CaCl₂的浓度，正常MS培养基中CaCl₂的浓度为3mM,在此基础上再分别补加5mM、10mM、20mM和30mM的CaCl₂，或分别降低到1.5mM、0.75mM和0mM的CaCl₂，30g/L蔗糖，调pH 5.80-5.85，配固体培养基则加入5g/L植物凝胶，121℃高压蒸汽灭菌20min；

TFP处理培养基：MS+30g/L蔗糖,调pH 5.80-5.85,加入5g/L植物凝胶，121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基冷却至60℃左右时，加入不同浓度的TFP溶液，倒150cm直径平板。

实施例1

一、颠茄发根钙处理

颠茄发根用液体培养基放大培养以备处理前所需，在MS固体培养基上进行两次继代活化，第一次继代7-10天后，剪取新长出的嫩白色且多分支的发根进行第二次继代，约5-7天后，发根根尖生理状态和长势基本一致，剪取3根3-4cm长的根尖接种于50mL MS液体培养基中，110rpm,25℃摇床暗培养用于后续处理。

钙处理：发根接种于含不同CaCl₂浓度的钙处理培养基，培养25天后收获，培养基提生物碱，发根40℃烘干磨成粉，备提生物碱；

各种钙信号抑制试剂处理：培养15天的发根去除旧培养基，加入新鲜50mL MS+不同浓度抑制剂(EGTA、Verapamil、LaCl₃、CdCl₂和TFP)培养基，对照加入50mL新鲜MS培养基+等体积的溶剂ddH₂O，继续培养10天后收获，培养基提生物碱，发根40℃烘干磨成粉，备提生物碱；

二、平板上颠茄发根生长实验

钙离子对平板上颠茄发根生长的影响：发根经过两次继代活化，剪取3-4cm长的根尖接种于添加不同浓度CaCl₂的MS固体培养基平板中，25℃暗培养4天，观察表型。

TFP对平板上颠茄发根生长的抑制实验：同上，发根经过两次继代活化，剪取3-4cm长的根尖接种于含不同浓度TFP的MS固体培养基平板中，25℃暗培养4天，统计根长。三、托品烷生物碱的提取及检测

A.发根中生物碱的提取

1)发根材料于电热鼓风干燥箱中40℃干燥24h或更长至恒重；

2)研磨成粉，称取200mg干粉加入20mL甲醇，超声波清洗仪中超声30min，功率100％，控制水温，可分两段15min，中间换一次冷水；

3)过滤，用10mL甲醇冲洗滤渣，一并回收；40℃挥干甲醇，残留物溶于10mL 200mM的NH₄Cl(pH＝9.8)；

4)过柱(20×1cm)，填充物为4.5g用氯仿饱和氨水侵泡过夜的硅藻土Extrelut-

(Merck)；

5)用30mL氯仿饱和氨水洗柱；

6)洗脱液在40℃用暖风吹干，残留物溶于2mL生物碱存储缓冲液；

7)0.45μm尼龙滤膜过滤，-20℃保存待用。

C.托品烷生物碱的HPLC检测

色谱仪：日本岛津Shimadzu高效液相色谱仪(系统控制器：CBM-20Alite，泵：LC-20AD，柱温箱：CTO-20A，检测器：SPD-M20A，自动进样器：SIL-20A)

色谱柱：Phenomenex Gemini 5μC18 110A液相色谱柱(250×4.6mm，5micron)

流动相：乙腈:乙酸铵缓冲液(20mM乙酸胺，0.1％甲酸，pH＝4.0)＝11:89

流速：1mL/min

检测波长：226nm

柱温：40℃

进样量：20μL

D.三种托品烷生物碱标准曲线

分别称取莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱标准品(Sigma)配制成500μg·mL^-1、250μg·mL^-1、100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1和10μg·mL^-1浓度的梯度标准溶液，按照上述检测条件测定并绘制三种生物碱的标准曲线，算出各自的线性回归方程用于样品的定量计算。

四、RNA的提取和检测

A.植物材料总RNA的提取

用天根公司的RNAsimple Total RNA Kit试剂盒(目录号：DP419)，按操作说明进行，视材料的多少采用两种方法进行样品处理：

1)样品处理：

a：大份的材料在研钵(实验前在180℃烘箱烘2h或用无水乙醇灼烧10min后冷却备用)中液氮研磨成细粉(注意：提取RNA前勺子及研钵等都要预冷处理),将50-100mg粉末迅速转移至加有1mL裂解液RZ的1.5mL离心管中，振荡混匀；

b：取小份的新鲜材料于1.5mL DNase/RNase free离心管中，加入3颗3mm直径的小钢珠和1mL裂解液RZ。若是保存在-80℃冰箱或液氮中的材料，则在材料未融化前加入3颗3mm直径的小钢珠和1mL裂解液RZ，组织研磨仪中60HZ，120s打碎。

2)室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

3)4℃，12000rpm离心5min，将上清移入新的无Rnase的离心管中；

4)加入200ul氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min；

5)4℃，12000rpm离心10min，样品分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作；

6)缓缓加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃，12000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液；

7)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液；

8)向吸附柱CR3中加入600μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液；

9)重复操作步骤8；

10)将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去除残余液体；

11)将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加30-100ul Rnase-free ddH₂O，室

温放置2min，4℃，12000rpm离心2min。

12)变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；分光光度计法检测RNA的纯度，取10μLRNA加到990μL RNase-free water(稀释100倍)中，用HITACHI3010分光光度计测OD₂₆₀和OD₂₈₀，并计算它们的比值，来分析RNA的纯度。按下面公式计算RNA的浓度：

总RNA(μg)＝OD₂₆₀×40μg/mL×100(稀释倍数)×总RNA溶液体积(μL)/1000；

13)-80℃保存检测合格的RNA。

B.RNA的反转录

按照Bio-Rad公司的iScript^TM cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行反转录：

在PCR仪上进行下列条件的反转录反应：

25℃5min

42℃30min

85℃5min

反转录获得的cDNA-20℃保存，该cDNA作为模板既可用于目的片段的扩增，也可用于荧光定量分析。

C.荧光定量PCR

荧光定量PCR引物利用Beacon designer软件设计，本章引物序列见附录中表1。

将上述反转录获得的cDNA用超纯水稀释5倍，按照Bio-Rad公司iTaq^TM Universal

Green Supermix试剂盒操作说明进行荧光定量PCR，反应体系如下：

*注：除TRI-L和TRII，上下游引物量为1μL/20μL外，其余基因体系均如上。

各组分加完后轻弹管壁赶去管内液体中气泡，离心混匀后，放入荧光定量PCR仪中进行荧光定量检测。

反应程序：95℃，30sec；40个扩增循环(95℃10sec，×℃20sec，72℃30sec，各基因退火温度见附录表1，在每次循环的72℃延伸结束后采集荧光)，然后进行融解曲线分析：60℃到95℃逐渐升温，每间隔0.5℃采集一次荧光，每次保温10sec，连续记录荧光信号的变化。

各样本和内参基因分别设3个重复及1个阴性对照，基因表达量以PGK和ACTIN双内参基因的表达量为校准进行相对定量，采用Pfaffl Method算法计算基因在各个样本中的相对表达量。

五、结果与分析

A.外源钙浓度对颠茄发根TAs合成的影响

外源刺激子诱导的次生代谢产物生物合成是通过信号转导途径来介导的，Ca²⁺作为真核生物中广泛存在的第二信使，以其为核心的Ca²⁺信号介导了多种次生代谢产物的合成。先前已有大量的研究表明，在各种TAs资源植物的培养系统中添加Ca²⁺到合适的浓度，都能显著提高植物培养材料中的TAs含量(表2)。

表2.提高培养基中Ca²⁺浓度促进了TAs资源植物中TAs的合成

本发明尝试在颠茄发根培养基中添加不同浓度的CaCl₂(5mM,10mM,20mM,30mM)，培养25天后检测生物碱含量，结果如图1，B所示，发根中TAs含量与培养基中Ca²⁺浓度呈现显著的负相关，当培养基中Ca²⁺浓度达到10mM时，三种TA(Hyoscyamine：莨菪碱；Anisodamine：山莨菪碱；Scopolamine：东莨菪碱)含量显著低于对照，当Ca²⁺浓度高于20mM时，则极显著低于对照。在MS+20mM CaCl₂处理组发根中，莨菪碱含量(1.03mg·g^-1DW)是对照(1.69mg·g^{- 1}DW)的60％，山莨菪碱和东莨菪碱含量相比对照分别下降了46％和47％(图1，B)。如图1，A所示，发根生长随着Ca²⁺浓度提高也受到了抑制，在20mM CaCl₂处理组发根干重比对照降低了40％，在30mM CaCl₂处理组则降低了67％。高浓度的Ca²⁺(>10mM)同时还抑制了根毛的发育(图1，A)。

考虑到培养基中Ca²⁺浓度与TAs含量负相关，我们接下来梯度降低了MS培养基中的Ca²⁺浓度(MS培养基中CaCl₂本底浓度为3mM)，三个CaCl₂浓度组分别为：1.5mM、0.75mM和0mM，发根培养25天后检测生物碱含量。含量检测结果是符合预期的，当培养基中CaCl₂浓度为0时，发根中莨菪碱含量(3.66mg·g^-1DW)比对照(1.81mg·g^-1DW)提高了1倍，山莨菪碱和东莨菪碱含量没有变化，同时，发根干重也提高了50％(图2，B)。培养基中去除CaCl₂使发根形态发生了改变，发根呈浅褐色、易碎、生长加厚且根毛消失(图2，A)。1.5mM和0.75mM两个CaCl₂浓度处理对发根生长、形态和生物碱含量影响不大。为了验证去除CaCl₂含量能提高TAs含量，我们用Ca²⁺特异性的螯合试剂EGTA来去除MS培养基中的Ca²⁺离子，5mM EGTA处理的颠茄发根中，莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量分别比对照提高了1.7倍、1.9倍和0.8倍，但是发根干重减少了23％；高浓度的EGTA(10mM)对发根生长有毒害作用，发根生长完全停止并且部分坏死，TAs合成能力和含量和对照不差异(图2，C)。

B.细胞膜钙通道抑制剂verapamil对颠茄发根TAs合成的影响

基于培养基中CaCl₂处理的实验结果，可以推测Ca²⁺是作为一种信号分子参与了调控TAs的生物合成。Ca²⁺信号的产生是由于细胞受某种刺激后，胞外Ca²⁺离子经细胞膜钙通道迅速进入细胞内而形成的，我们假定阻断钙通道也能和去除培养基中Ca²⁺离子一样，促进TAs的合成。Verapamil是一种广泛使用的细胞膜Ca²⁺离子通道抑制剂，培养15天的颠茄发根用0.8mM和1.2mM的Verapamil处理10天，TAs含量都得到了提高，且提高幅度与Verapamil使用浓度正相关。0.8mM处理的发根东莨菪碱含量提高极显著，莨菪碱和山莨菪碱仅有不显著的提高，而1.2mM处理的发根中，三种TAs含量提高都极显著，莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量分别比对照提高了1.3倍、1.4倍和1.2倍(图3，B)。两种浓度处理，发根形态和干重都没有显著的改变(图3，A和B)。另外，有趣的是，Verapamil处理使莨菪碱尤其是东莨菪碱大量的向培养基中分泌，浓度越大，分泌的的越多。0.8mM和1.2mM处理的培养基中莨菪碱含量分别是对照的3.2倍和3.6倍，而东莨菪碱含量是对照的6.6倍和9.9倍。山莨菪碱本底分泌量十分低，处理后没有显著差异(图3，C)。我们同时也使用了另外两种无机的Ca²⁺离子通道抑制剂La³⁺和Cd²⁺，但是颠茄发根对这两种试剂非常敏感，低浓度处理(0.4mM)就导致发根坏死，所以材料无法分析。以上结果表明在颠茄发根中抑制Ca²⁺信号正调控了TAs的生物合成。

C.钙调蛋白抑制剂trifluoperazine对颠茄发根TAs合成的影响

胞外涌入胞内的Ca²⁺离子作为信号分子必须与胞内的Ca²⁺受体相结合，然后将信号传递到下游过程，最终介导植物体产生特异的生理活动，如次生代谢产物的合成。钙调蛋白(Calmodulin,CaM)是研究的最多、最广泛和最深入的胞内Ca²⁺受体，为了研究Ca²⁺信号是否通过CaM的介导来调控TAs的生物合成，我们选择了一种CaM特异的抑制剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)来处理颠茄发根。培养15天的颠茄发根分别用20μΜ和40μΜ的TFP处理10天，发根中莨菪碱含量分别比对照提高了0.7倍和1.5倍，山莨菪碱和东莨菪碱只在40μΜ处理的发根中分别极显著的提高了1.1倍和1.2倍，但是发根干重降低了12％，20μΜ处理的发根干重无影响(图4，B)。和verapamil处理一样，TFP处理也促进了TAs向培养基中分泌，分泌量与TFP浓度成正比。20μΜTFP处理，只有莨菪碱的分泌量提高了40％，而40μΜTFP处理使莨菪碱和东莨菪碱分泌量都提高了70％(图4，C)。值得注意的是，发根在TFP处理后出现了生长加粗、根尖膨大和褐化等形态变化，表明发根生长受到了抑制(图4，A)。平板上的发根抑制实验同样表明TFP能够抑制发根的生长(图5)。以上结果表明，钙调蛋白作为胞内Ca²⁺受体介导了Ca²⁺信号对TAs生物合成的调控。

D.Verapamil和trifluoperazine诱导TAs合成途径基因的表达

为了探究抑制Ca²⁺信号提高TAs生物合成的分子机制，同时弄清是否在转录水平调控了合成途径的基因表达，采用qRT-PCR技术检测了Verapamil处理10天后颠茄发根中六个合成途径基因的诱导表达量，分别为：PMT，MPO，TRI，CYP80F1，H6H和ArAT4。除了MPO的表达量没有显著的变化外，其余5个基因的表达量都显著的上调。H6H表达量提高幅度最大，高于对照71倍；其次是PMT，比对照提高了21倍；另外三个基因TRI，CYP80F1和ArAT4表达量分别比对照提高了6倍、4倍和6倍(图6)。

TFP处理10天发根中的基因诱导表达模式和verapamil处理的相似，除了MPO的表达量反而有稍微的下调外，其余5个基因的表达量都显著的上调，但是幅度不同于verapamil处理(图7)。PMT是提高倍数最大的基因，其表达量比对照上调了9倍；其次是ArAT4基因上调了8倍；H6H基因上调了6倍；TRI和CYP80F1基因都上调了3倍。为了探明MPO基因表达是否受TFP处理的诱导，对MPO表达量进行了TFP诱导的时间梯度检测，结果表明MPO在诱导第1天和第2天表达量很稳定，没有显著变化，仅仅在第5天显著上调了1.3倍，然后在第10天表达量低于对照。另外5个合成途径基因在某个时间点(1天、2天或5天)均有不同程度的表达量上调，但上调幅度都显著低于第10天。综合以上结果，可以得出结论：抑制颠茄发根中Ca²⁺信号能全面的诱导TAs合成途径相关基因的表达，最终促进TAs的合成和积累。

Ca²⁺信号是植物界普遍存在的一种起调控作用的信号机制，几乎参与了植物生命活动的各个方面，包括介导胞外刺激对次生代谢产物的诱导合成。当植物体受到内部的生长发育指令和外界环境胁迫刺激时，胞外的Ca²⁺离子会迅速通过细胞膜进入细胞内形成特异性的Ca²⁺离子峰，这种胞内Ca²⁺离子浓度的变化作为一种信号通过下游Ca²⁺离子受体的传递形成特异的信号级联，最终使植物作出合适的生理反应。大量文献报道，提高胞外Ca²⁺浓度能够作为一种刺激子能促进多种次生代谢产物的合成，包括曼陀罗(Daturastramonium)、毛曼陀罗(Datura innoxia)、白花曼陀罗(Datura metel)、和天仙子(Hyoscyamus niger)等各种托品烷生物碱资源植物发根或细胞中的托品烷生物碱合成，长春花(Catharanthus roseus)细胞培养中的萜类吲哚生物碱合成，丹参(Panaxnotoginseng)细胞培养中的人参皂苷Rb1合成和灵芝(Ganoderma lucidum)中的灵芝酸合成等等。其中，一些深入的机制研究表明Ca²⁺信号正调控次生代谢产物的合成。提高丹参细胞培养的外界Ca²⁺浓度诱导提高了CaM的含量和CDPK的活性，这两种Ca²⁺受体通过未知的直接或间接途径增强了关键酶UGRdGT的活性，从而促进了人参皂苷Rb1的合成。灵芝培养系统中，添加外源Ca²⁺通过诱导CaM的表达激活量了3个合成途径基因的表达，最终大幅提高了5种人参皂苷Rb1的含量，添加CaM抑制剂则效果相反。然而本研究的结果恰好和上述研究相反，通过提高和降低外源Ca²⁺浓度两方面实验确凿地证明Ca²⁺信号负调控了TAs合成。

胞外Ca²⁺能够以信号分子和大量元素营养分子两种功能形式影响次生代谢物的合成，如果改变培养基中Ca²⁺浓度的实验还不足以说明Ca²⁺行使的功能角色的话，那接下来抑制质膜Ca²⁺通道和胞内Ca²⁺受体的实验则明确证明Ca²⁺是作为信号分子调控了TAs的合成。值得注意的是，虽然两种抑制剂verapamil和TFP都促进了颠茄发根中莨菪碱和东莨菪碱的合成和分泌，但是Ca²⁺通道抑制剂verapamil的作用要显著强于TFP，而且对东莨菪碱的诱导合成能力很惊人，使培养基中东莨菪碱提高了近10倍，而TFP处理最好的也仅提高了70％。低浓度的verapamil处理最先促进了发根中东莨菪碱含量的显著提高，而低浓度的TFP处理则对莨菪碱的诱导更显著，合成途径基因诱导表达的结果也与含量一致：verapamil对H6H基因的诱导表达最强烈，达到了70倍；TFP则对PMT基因的诱导最强烈，达到了9倍。另外，verapamil处理对发根形态和生长似乎没有影响，这些特点都表明verapamil可以作为一种强有效的刺激子应用于颠茄发根中东莨菪碱的生产。

另一个值得注意的问题是，钙信号抑制剂处理对TAs的调控是一个缓慢的过程，从TFP诱导基因表达的结果可以看出，TFP诱导第10天才极显著地上调了各合成途径基因的表达量，前期的实验也发现，verapamil和TFP诱导发根5天的效果要远弱于诱导10天，诱导2天的发根中TAs含量较对照几乎没有显著差异。这些结果表明，Ca²⁺信号似乎并不是直接调控TAs的合成，而是诱导了一种次级信号，或者重新调整了发根内的激素稳态和能量走向，因为TFP处理显著抑制了发根的生长和质地的变化，这是后续研究很有意思的一个方向。

总之，本研究结果表明，在胞外Ca²⁺浓度、细胞膜Ca²⁺通道和胞内Ca²⁺受体三个层面上阻断钙信号，都能诱导颠茄发根中TAs的合成和合成途径基因的表达，Ca²⁺信号在转录水平上负调控了颠茄发根中TAs的生物合成。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一种利用钙信号抑制剂提高颠茄发根中托品烷类生物碱含量的方法

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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Claims (1)

1.一种利用钙信号抑制剂提高颠茄发根中托品烷类生物碱含量的方法，其特征在于，利用钙信号抑制剂抑制颠茄发根中Ca²⁺/CaM信号途径，从而诱导托品烷类生物碱合成途径相关基因PMT，TRI，CYP80F1，H6H和ArAT4的表达，促进托品烷类生物碱莨菪碱或山莨菪碱或东莨菪碱的合成与积累；所述钙信号抑制剂为细胞膜Ca²⁺通道抑制剂维拉帕米，维拉帕米的浓度为0.8-1.2mM。

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