CN114632144B - Il-3在制备治疗或评估心脏损伤的产品中的应用 - Google Patents

Il-3在制备治疗或评估心脏损伤的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了IL‑3在制备治疗或评估心脏损伤的产品中的应用，属于医用配制品领域。本发明提供了IL‑3在制备治疗心脏损伤或促进心脏损伤后血管侧支新生的药物中的应用；本发明还提供了IL‑3和/或检测血小板中IL‑3含量的物质在制备评估或辅助评估心脏损伤患者预后的产品中的应用；本发明还提供了一种治疗心脏损伤或/和促进心脏损伤后血管新生的药物，所述药物含有所述IL‑3。本发明通过试验证明IL‑3具有治疗心脏损伤的效果，可显著促进心脏损伤后血管侧支新生，IL‑3可用于治疗心脏损伤及改善血管侧支新生。

Description

IL-3在制备治疗或评估心脏损伤的产品中的应用
技术领域
本发明属于医用配制品领域，具体涉及IL-3在制备治疗或评估心脏损伤的产品中的应用。
背景技术
据《中国心血管病报告2018》统计，我国现有冠心病患者 1100 万，每年超过 70万死于急性心肌梗死和心源性猝死，并且呈现快速上升趋势。心肌梗塞、慢性冠脉闭塞性病变等所引起的心脏损伤主要是表现为冠脉的急/慢性闭塞引起心肌缺血缺氧，最终导致心功能不全。经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI) 显著降低急性心肌梗死患者急性期死亡率，但部分患者接受PCI 血运重建后，仍会因缺血再灌注损伤发生无复流、心功能衰竭等恶性心血管事件，这可能与血管新生不够完善有关；且仍有大量患者不能或者不宜通过手术予以再灌治疗。因此亟需寻找内科药物干预靶点，通过改善心脏损伤后血管新生促进心功能的恢复。
调控血管侧支新生促进心脏损伤后心肌氧供对心功能的恢复至关重要，心脏损伤后存在多种病理机制，包括可能起到双向作用的炎症反应，促进修复的血管侧支新生以及导致重塑的纤维化等过程。其中血管新生受到多种因子以及浸润的炎症细胞的调控。急性的缺血缺氧导致心肌细胞死亡后释放大量细胞内容物，在损伤早期阶段会招募大量以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润来清理碎片，随着病情的进展，陆续浸润大量以促进损伤修复的单核巨噬细胞为主，而这种具有促血管侧支新生功能的巨噬细胞受到多种炎症因子(IL-10/IL-4/TGF-β)的调节。
冠脉损伤时血小板是与内皮粘附并趋化炎症细胞浸润的首要成分，在血管内皮损伤时血小板会与内皮相互吸附并可吸附相关炎症细胞向损伤部位浸润；白细胞介素-3(interleukin-3,IL-3)是集落刺激因子家族一员，在调控炎症细胞增殖浸润、炎症反应的过程中起到重要作用，研究表明，IL-3有助于白细胞的产生、增殖和存活，参与感染等炎症过程。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何有效的治疗或评估心脏损伤。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供如下应用，所述应用可为A1)至A6)中任一种：
A1)、IL-3在制备治疗心脏损伤的产品中的应用；
A2)、IL-3在制备促进心脏损伤后的血管侧支新生的产品中的应用；
A3)、IL-3或/和调控IL-3活性或含量的物质在制备调控心脏损伤恢复的产品中的应用；
A4)、IL-3或/和调控IL-3活性或含量的物质在制备调控心脏损伤后的血管侧支新生的产品中的应用；
A5)、IL-3和/或检测IL-3含量的物质在制备评估或辅助评估心脏损伤患者预后的产品中的应用；
A6)、IL-3作为标志物在制备评估或者辅助评估心脏损伤患者预后的产品中的应用。
进一步地，上述的应用中，所述心脏损伤可为心肌缺血导致的心脏损伤。
所述心脏损伤可为陈旧性心肌梗塞或慢性冠脉闭塞性病变或急性心肌梗死或急性冠脉综合征。
所述心脏损伤可体现为左室射血分数(LVEF)和/或左室短轴缩短率(LVFS)降低和/或左室收缩末期直径(LVIDS)增加。
进一步地，上述的应用中，所述IL-3可为IL-3重组蛋白。
IL-3也称白细胞介素-3，人IL-3 的分子量为 14-30 KDa，天然 IL-3 与重组 IL-3 糖基化差异很大，但是否糖基化或糖基化的程度并不影响 IL-3 的特异性活性和靶特异性，且 IL-3 蛋白分子中二硫键的存在对维持生物活性是十分重要的。纯化的鼠IL-3 为多聚体蛋白分子，分子量为 28 KDa，其中糖链约占38%。
在本发明的一个实施例中，所述IL-3重组蛋白为Bio-techne公司的货号为403-ML-100/CF的产品。
所述IL-3重组蛋白的NCBI 参考序列为NP_034686.2。
进一步地，上述的应用中，所述调控IL-3活性或含量的物质可为提高IL-3活性或含量的物质，所述调控心脏损伤恢复可为促进心脏损伤恢复。
进一步地，上述的应用中，所述调控IL-3活性或含量的物质可为提高IL-3活性或含量的物质，所述调控心脏损伤后的血管侧支新生可为促进心脏损伤后的血管侧支新生。
在本发明的一个实施例中，通过外源性添加IL-3重组蛋白的方式提高IL-3的含量。
上述调控IL-3的活性或含量的物质可为IL-3编码基因。
在本发明的一个实施例中，所述促进心脏损伤后恢复的主要表现为：外源补充IL-3后可明显升高左室射血分数、左室短轴缩短率，上述数据指征外源性补充IL-3后减轻了心脏损伤。
在本发明的一个实施例中，所述促进血管侧支新生的具体表现为：心脏中可反应血管侧支情况的内皮细胞(CD31+)明显增加，心脏损伤交界区内皮成管数目明显增加。
进一步地，上述的应用中，所述调控IL-3活性或含量的物质可为抑制或降低IL-3活性或含量的物质，所述调控心脏损伤恢复可为抑制心脏损伤恢复。
进一步地，上述的应用中，所述调控IL-3活性或含量的物质可为抑制或降低IL-3活性或含量的物质，所述调控心脏损伤后的血管侧支新生可为抑制心脏损伤后的血管侧支新生。
进一步地，上述的应用中，所述抑制或降低IL-3活性或含量的物质可为与IL-3竞争性结合其受体的物质。
进一步地，上述的应用中，所述抑制或降低IL-3活性或含量的物质可为IL-3特异性受体亚基IL-3Rα的抗体(anti-IL-3Rα)。
IL-3R 属于细胞因子受体超家族成员，由α、β两个亚基组成。其中α亚基是 IL-3所特有的，决定 IL-3 作用的特异性，其与 IL-5R、GM-CSF 的α链有一定的同源性，其基因与 GM-CSFRα链紧密相连；β亚基又称 KH97，是 IL-3、IL-5、GM-CSF 共有的，它本身不能结合 IL-3。IL-3R 在发挥作用时，首先形成异源二聚体或寡聚体；受体寡聚化后即激发细胞内的信号传导。IL-3 受体α链和β链的胞浆内部分均没有激酶活性，α链没有信号转导功能，细胞内信号主要由β链传递。
中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面表达高亲和力的 IL-3R，随着细胞的成熟，细胞表面的 IL-3R 逐渐减少。在骨髓中，一些细胞亚群(髓样细胞、单核细胞和胚细胞) 表面的 IL-3R 很多，而淋巴细胞系和较成熟的红细胞系不表达 IL-3R。
进一步地，上述的应用中，所述检测IL-3含量的物质包括IL-3特异性抗体。
进一步地，上述的应用中，所述检测IL-3含量的物质还包括IL-3标准品。
在本发明的一个实施例中，所述检测IL-3含量的试剂盒为Bio-techne公司制备的货号为Catalog No. D3000的检测人IL-3的含量ELISA试剂盒。
在本发明的一个实施例中，所述检测IL-3含量的试剂盒为Bio-techne公司制备的货号为Catalog No. M3000的检测小鼠血IL-3的含量ELISA试剂盒。
上述应用中，所述产品可为药品、试剂、试剂盒。
在本发明的一个实施例中，检测了心脏损伤患者和健康人外周血血浆以及血小板中IL-3的改变，发现血浆中IL-3的浓度极低，基本检测不到；而血小板中IL-3浓度很富集并且在冠脉血血小板中浓度较高，该结果表明：参与到心脏损伤心功能修复的IL-3，可能的主要来源是循环中的血小板。进一步在心脏损伤1天时分离了野生鼠以及IL-3 KO鼠的血小板在体外与细胞共培养，来明确携带IL-3的血小板对血管新生的影响，结果表明携带IL-3的血小板具备促进血管新生的功能。
为解决上述技术问题，第二个方面本发明提供一种治疗心脏损伤或/和促进心脏损伤后血管侧支新生的药物，所述药物含有所述IL-3。
进一步地，上述的药物中，所述IL-3可为IL-3重组蛋白。
本发明所述药物中，IL-3可作为有效成分之一。
本发明中，制备上述药物时，还可加入载体材料。
所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋 酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等。
本发明取得的有益技术效果如下：
1、本发明提供了IL-3的新用途，并设计了验证实验验证其功能，实验结果表明：IL-3能显著的提高心脏损伤的恢复，并且显著促进心脏损伤后的血管侧支新生水平；
2、本发明还提供了IL-3作为标志物在制备评估或辅助评估心脏损伤预后的产品中应用；
3.本发明还提供了一种治疗心脏损伤或/和促进心脏损伤后血管侧枝新生的药物，所述药物含有所述IL-3，IL-3可用于治疗心脏损伤及改善血管侧支新生。
附图说明
图1为野生型小鼠和IL-3 KO小鼠的心脏损伤模型的生存率结果。
图2为心脏损伤模型小鼠中添加IL-3Rα中和抗体(anti-IL-3Rα)组和对照组的左室射血分数(%)测定结果。
图3为心脏损伤模型小鼠中添加IL-3Rα中和抗体(anti-IL-3Rα)组和对照组的左室短轴缩短率(%)测定结果。
图4为流式分析野生型和IL-3 KO小鼠心脏中内皮细胞改变情况的测定结果。
图5为心脏损伤模型小鼠中外源性补充IL-3重组蛋白后左室射血分数(%)和左室短轴缩短率(%)测定结果。
图6为外源性补充IL-3重组蛋白促进心脏损伤后的血管侧支新生的实验结果，图中标尺为200μm。
图7为心脏损伤患者与健康人血浆中IL-3表达水平的比较。
图8为心脏损伤模型构建不同时长血浆中IL-3表达水平的测定结果。
图9为患者外周血血小板以及冠脉血血小板中IL-3的含量及改变测定结果的电泳图谱。
图10为患者外周血血小板以及冠脉血中血小板中IL-3的含量及改变测定结果的柱形图。
图11为在心脏损伤1天时分离的野生鼠以及IL-3 KO鼠的血小板体外与巨噬、内皮细胞共培养显微镜照片。
图12为在心脏损伤1天时分离的野生鼠以及IL-3 KO鼠的血小板体外与巨噬、内皮细胞共培养的内皮细胞成管数目统计。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中IL-3全身敲除鼠(B10.129S2(B6)-Il3tm1Tyb/J,023816)(简称IL-3KO)购买于Jackson Laboratory。
下述实施例中野生型小鼠B6小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司（简称WT）。
下述采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t检验，*表示具有显著性差异(P＜0.05)，**表示具有极显著性差异(P＜0.01)，***表示具有极显著性差异(P＜0.001)。
实施例1、IL-3影响心脏损伤后小鼠的远期生存率
一、实验步骤
(一)实验小鼠
IL-3全身敲除鼠(B10.129S2(B6)-Il3tm1Tyb/J,023816)(简称IL-3 KO)购买于Jackson Laboratory。雄性野生型小鼠(B6，简称WT)购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
IL-3 KO是将野生型B6小鼠(WT)的IL-3基因敲除得到的小鼠，IL-3 KO与WT的区别仅在于IL-3 KO不含有IL-3基因。
(二)心脏损伤动物模型的构建
通过结扎小鼠冠脉前降支方案建立小鼠心脏损伤模型，以下手术过程均为无菌环境下操作：
(1) 选取8-10周龄、体重20-22 g 的雄性WT小鼠28只和IL-3 KO小鼠22只饲养于SPF级动物房中，在计划手术的前一天使用脱毛膏进行胸部脱毛、备皮；
(2) 术中使用2%的异氟烷进行持续性吸入麻醉，待小鼠稳定后固定体位使用75%酒精进行消毒心前区局部皮肤；
(3) 在持续性吸入麻药的条件下，使用手术剪在左胸开一个1.2cm左右的小口；
(4) 使用手术镊钝性分离胸大肌和胸小肌，可见明显搏动的肋间隙，用弯血管钳穿破肋间隙，顺势轻柔挤出心脏；
(5) 利用7号外科手术针线，方结结扎冠脉左前降支后，可见被结扎后远端的心肌迅速变为白色，剪线后速将心脏恢复原位紧接着将胸腔挤一下排空胸腔中气体；
(6) 使用4号外科手术针线对手术开口处皮肤进行间断缝合；
(7) 模型评估：冠脉结扎术后半小时内通过遥测心电图仪评价模型建立，术后观察到心电图中ST段明显抬高提示模型构建成功，可进入后续实验；得到心脏损伤模型雄性WT小鼠和心脏损伤模型雄性IL-3 KO小鼠；
(8) 将心脏损伤模型小鼠置于保温垫上待小鼠苏醒后，放回饲养笼中，术后两天内予以镇痛药丁丙诺啡(0.05 mg/kg/12h,i.p.)，在SPF环境。
二、实验结果
将心脏损伤模型雄性WT小鼠28只和心脏损伤模型雄性IL-3 KO小鼠22只正常喂养4周，观察小鼠在造模期间自然死亡，记录死亡时间和死亡原因(是否因心脏损伤而死)；生存率结果如图1所示，图1表明，心脏损伤后IL-3 KO小鼠的生存率显著低于野生型小鼠。表明IL-3敲除后明显加剧心脏损伤后小鼠死亡率(P<0.05)
未死亡小鼠，在4周后将小鼠处死，收集所有小鼠心脏及血液进行后续实验。
实施例2、予以IL-3受体的中和抗体加重心脏损伤后远期心功能改变
在模型构建成功的前提下，为了明确IL-3是否通过与其受体结合来起到作用以及干扰二者之间的结合，利用IL-3特异性受体亚基IL-3Rα的中和抗体(anti-IL-3Rα，公司：Bio-techne；货号：MAB983)处理心脏损伤小鼠，并在心脏损伤模型构建4周时进行心动图检测。
一、实验步骤
(一)心脏损伤小鼠体内予以IL-3Rα中和抗体(anti-IL-3Rα)处理
(1) 选取8-10周龄、体重20-22 g 的雄性野生型B6小鼠20只按照实施例1中心脏损伤动物模型构建方式构建心脏损伤小鼠模型；
(2)anti-IL-3Rα的配制：将anti-IL-3Rα从4℃冰箱中取出后，使用12000rpm低温高速离心1分钟，使粉末聚集于管底，使用无菌的PBS进行溶解，浓度为1mg/mL，所有操作均于冰上处理；对照组的注射液将anti-IL-3Rα替换为anti-IgG，配制方式相同；
(3)anti-IL-3Rα的注射：将配制好的anti-IL-3Rα吸入1mL的胰岛素注射器中，并将刻度进行标记。使用气体麻醉系统，利用异氟烷麻醉心脏损伤后12小时的小鼠，根据所标记的分组，实验组共计10只小鼠，通过小鼠内眦静脉分别将anti-IL-3Rα，每只小鼠注射100μL，浓度为1μg/μL；对照组共计10只小鼠，处理方式为将与实验组anti-IL-3Rα等量的anti-IgG注射入小鼠体内。分别再于术后1天、3天时各注射一次。注射过程中为避免小鼠产生不良反应以及保证不引起小鼠眼睛受损，一定保证注射器液体中不存在气体、注射总量不高于100μL以及速度不宜过快；
(4)注射后处理：将小鼠放置于37℃保暖垫待小鼠苏醒后，继续观察半小时，无出血等异常后放入饲养笼中。
(二)经胸超声心动图检测
为了评估小鼠基础水平、心脏损伤模型构建手术以及anti-IL-3Rα的处理对小鼠心脏功能改变的影响，对步骤(4)处理后的喂养4周的小鼠进行无创的超声心动图检测。小鼠心功能相关指标包括左心室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)的检测数据。所有样本结果的测试采用同样的超声参数，对每个样本至少测量3-5个连续性周期，取平均值。
小动物超声心动图的操作步骤如下：
(1) 提前一天对喂养在SPF环境中的小鼠使用脱毛膏脱毛、备皮，脱去小鼠颈、前胸部分毛发；
(2) 使用三溴乙醇(0.25g/kg)腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉成功后将小鼠仰卧位固定于检查台上；
(3) 调试使用小动物高分辨超声成像系统(Visual Sonic 2100)，30MHz的探头进行心功能检测；
(4) 将耦合剂涂于小鼠胸部表面，避免其中有气泡存在，待探头与耦合剂接触后轻微调节体位，首先使小鼠心脏长轴与探头平行获取胸骨旁左室长轴切面；
(5) 此时将探头顺时针旋转约90°，获得M型二尖瓣腱索水平切面，以视野中可看到乳头肌为准留图进行后续的分析采值。
二、实验结果
结果如图2和图3所示，超声心动图结果表明，通过IL-3Rα中和抗体阻断IL-3的作用可明显加重心脏损伤(心梗)后心功能的损伤，包括明显降低了左室射血分数(图2)和左室短轴缩短率(图3)，加重了心功能的损伤；
实施例3、IL-3的缺失抑制血管新生过程
一、流式分析心脏中内皮细胞的改变
(1) 选取8-10周龄、体重20-22 g 的雄性野生型B6小鼠3只和IL-3 KO小鼠3只，按照实施例1中所述方法构建心脏损伤模型；
(2) 在心脏损伤后7天时收取小鼠心脏组织和骨髓制备成细胞悬液；
(3) 向每管细胞中加入CD45(炎症细胞标志物)、CD31(内皮细胞标志物)、CD140a抗体(成纤维细胞)，其中CD45阴性的细胞群中CD31阳性的为内皮细胞，轻微混匀，避光放置于4℃冰箱中孵育30分钟；
(4) 取出细胞后向每管细胞悬液中各加入2mL含2%FBS的PBS，轻吹细胞混匀，洗去未结合的抗体；于4℃离心机中、1500rpm离心5分钟;
(5) 弃上清后用500μL含2%FBS的PBS重悬细胞，用滤纸进行过滤到新的流式管中后上机进行检测分析数据。
二、实验结果
结果如图4所示，流式细胞分析结果表明在心脏损伤后7天时敲除IL-3后心脏中可反应血管侧支情况的内皮细胞(CD45-CD31+)明显减少，表明敲除IL-3后可显著抑制心脏损伤后的血管侧支新生。
实施例4、外源性补充IL-3重组蛋白可有效促进心脏损伤后心功能的修复
实施例3中试验结果表明敲除IL-3以及中和其特异受体后明显加重心脏损伤后小鼠的死亡率和心功能损伤，进一步为明确补充IL-3的重组蛋白是否具备减轻心脏损伤的治疗作用，在模型构建成功的前提下，利用IL-3重组蛋白在心脏损伤后12小时、1天以及3天时分别通过内眦静脉注射处理心脏损伤小鼠，并在心脏损伤模型后4周时评估心功能改变。
一、实验步骤
(1) 选取8-10周龄、体重20-22 g 的雄性野生型B6小鼠20只，按照实施例1中所述方法构建心脏损伤模型；
(2) IL-3重组蛋白(公司：Bio-techne；货号：403-ML-100/CF)的配制：从-20℃冰箱中取出鼠IL-3重组蛋白，离心将粉末聚集于管底后，用无菌的PBS进行溶解，浓度为100μg/mL；利用已报到的蛋白载体肝素纳米颗粒(HepNp)携带蛋白，使用重量比例为HepNp vsIL-3=100:6，每只鼠所用蛋白量为0.6μg、总量为100μL，配制好蛋白载体复合物后轻轻混合，于无菌环境室温放置反应半小时后进行注射使用；
(3) 重组蛋白的注射使用：器材及麻药条件同上，在心脏损伤后12小时、1天以及3天时气麻的条件下通过内眦静脉给药；注射过程中为避免小鼠产生不良反应，同样首先保证注射器中不存在气体以及注射速度不宜过快；
(4) 注射后处理：将小鼠放置于37℃保暖垫保温待小鼠苏醒后，继续观察半小时，无异常后放入饲养笼中；
(5) 饲养到4周时通过小动物超声评估心功能改变并分析数据。
二、实验结果
如图5所示，发现在体内补回IL-3重组蛋白后可显著促进心脏损伤后4周时的心功能的恢复，具体表现为明显升高了左室射血分数和左室短轴缩短率，表征减轻了心功能的损伤。
实施例5、外源性补充IL-3重组蛋白可促进心脏损伤后的血管侧支新生
一、免疫组化分析心脏中内皮细胞的改变
(1) 选取8-10周龄、体重20-22 g 的雄性野生型B6小鼠3只，按照实施例1中所述方法构建心脏损伤模型；体内补充IL-3重组蛋白步骤同实施例4；
(2) 于心脏损伤后第7天时收集小鼠心脏组织通过内皮细胞的特异性表面标志物CD31 检测新生血管情况；
(3) 在心脏损伤后第7天时收取小鼠心脏，冲洗心脏及循环中的血液后取出心脏；剪去心脏表面黏连的结缔组织，置于生理盐水中清洗心脏，使用吸水纸吸去心脏表面以及心腔中水分后置于福尔马林组织固定液中，保持心脏处于舒张形态进行过夜脱水固定；
(4) 取出心脏进行石蜡包埋、切片、制片、脱蜡至水；
(5) 首先使用1×柠檬酸溶液在高压锅中加热90秒对切片进行细胞表面抗原的修复，恢复室温后使用双蒸水ddH2O清洗3次，3分钟每次；
(6) 用内源性过氧化物酶阻断剂3%的去离子H2O2水溶液室温孵育20分钟，擦掉阻断剂后用1×PBS清洗3次，3分钟每次；
(7) 使用进口羊血清室温封闭30分钟，甩干切片上的血清；
(8) 用PBS配制内皮细胞特异性标志物CD31(公司：Abcam；货号：ab182981)的抗体(比例为1:500)，在4℃冰箱中湿盒孵育过夜；取出切片后恢复室温30分钟，1×PBS清洗3次，3分钟每次；
(9) 室温孵育加辣根过氧化物酶标记的免疫组化二抗30分钟，1×PBS清洗3次，3分钟每次；
(10) 用DAB试剂盒进行显色，按照说明书将A/B/C三种液体按照1:20的比例混溶于ddH2O中(现配现用)，在显微镜下显色约2分钟，以观察到组织切片稍微变黄色为准，迅速将切片置于ddH2O清洗3次，3分钟每次；
(11) 利用苏木素染液染核3分钟，自来水冲去染色；利用浓盐酸和乙醇配制盐酸酒精分化液，将切片在分化液中处理2秒，低速流动自来水返蓝5分钟；
(12) 取出切片后依次在95%酒精中迅速蘸3次5秒/次，100%无水乙醇中浸泡5分钟；最终浸于二甲苯中10分钟后使用中性树胶及盖玻片进行封片，置于通风橱中待中性树胶硬化后在200倍镜下进行采图，每张切片随机选取8-10个视野进行数据采集和分析。
二、实验结果
结果如图6所示，图6中箭头指示的含义为新生的血管，免疫组化分析表明补充了IL-3重组蛋白后在心脏损伤后7天时心脏中可反应血管侧支情况的内皮细胞(CD31+)明显增加，表明补充IL-3可显著促进心脏损伤后的血管侧支新生。
实施例6、心脏损伤后IL-3在冠脉血血小板中明显高表达
以上结果表明IL-3在心脏损伤过程中可通过促进血管新生过程促进心功能的修复，但是尚不明确IL-3可能的来源，于是检测了健康人和心脏损伤患者外周血血浆以及血小板中IL-3的改变，发现血浆中IL-3的浓度极低，基本检测不到；而血小板中IL-3浓度很富集并且在冠脉血血小板中浓度较高。
一、实验步骤
根据性别年龄匹配的原则，选择7名健康人和10名心脏损伤患者(待检者知情，且心脏损伤患者已经鉴定)，通过ELISA检测待检者血浆IL-3水平。
利用ELISA试剂盒(公司：Bio-techne；货号：Catalog No. D3000)检测人血浆中IL-3的含量。
(1) 在加入标准品，样品(用样品稀释缓冲液稀释至少1/2)和对照(空白)孔之前洗涤板2次；
(2) 向每个孔中加入200μL标准品或样品，并在37℃下孵育2小时。抽吸并清洗板4次。
(3) 向每个孔中加入200μL生物素标记的抗体工作溶液，并在37℃下孵育2小时。抽吸并清洗板4次。
(4) 将200μL Substrate工作溶液加入每个孔中，并在室温下避光孵育20分钟。
(5) 加入50μL停止溶液。立即在450nm处读取并计算。
结果如图7所示，与健康人相比，心脏损伤患者血浆中IL-3表达水平较健康人均无明显改变(NS)。
同样利用检测小鼠外周血浆IL-3的ELISA试剂盒(公司：Bio-techne；货号：Catalog No. M3000)，检测心脏损伤后不同时间点血浆中IL-3的改变，具体检测步骤如下所述：
(1) 向每个孔中加入50μL的Assay Diluent RD1W；
(2) 向每个孔中加入50μL标准品或样品，并在37°C下孵育2小时。抽吸并清洗板5次；
(3) 向每个孔中加入100μL生物素标记的抗体工作溶液，并在37°C下孵育2小时。抽吸并清洗板5次；
(4) 将100μL Substrate工作溶液加入每个孔中，并在室温下避光孵育30分钟；
(5) 加入100μL停止溶液，立即在450nm处读取并计算；
结果如图8所示，与对照小鼠相比，心脏损伤模型中不同时间点血浆中IL-3表达水平均无明显改变(NS)。
进一步检测了患者外周血血小板以及冠脉血中血小板中IL-3的含量及改变，检测结果表明血小板中IL-3的含量较高，并且在冠脉血小板中含量较外周高(p<0.05)，具体检测步骤如下：
(1) 在患者知情同意的情况下获得新鲜血液约5毫升，通过梯度离心(100G，10分钟；5000G，2分钟)获得血小板沉淀；
(2) 配制蛋白裂解液：计算好所需的裂解液用量后将100×蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂以及EDTA按照1:100的比例稀释于组织总蛋白提取液(T-per)中，冰上放置待用；
(3) 向每份血小板中加入20μL配制好的裂解液，盖紧管盖后冰上放置裂解10分钟，期间进行震荡助于裂解，之后于4℃离心机中12000 rpm 离心15分钟；
(4) 弃去杂质沉淀，留取上层蛋白液体移至新的1.5mL离心管中，进行后续蛋白浓度测定；
(5) 使用BCA试剂盒对每个样本进行蛋白浓度的测定：取96孔板，依次加入配制好的梯度标准品A-I液，每孔10μL，每个浓度均设置2个复孔；用试剂盒中的样本稀释液(A液)稀释蛋白样本：组织样本的稀释比例为1:20，细胞样本的稀释比例为1:10；每个样本都设置2个复孔，加样量均为10μL稀释后的样本；配制显色液(现配现用)按照每孔需要190μL进行计算，其中稀释液A液和显色液B液按照50:1的比例进行配制，混匀后利用排枪迅速加到每个孔中；轻微震荡混匀后，放置于37℃孵箱中避光孵育30分钟；
(6) 使用Biotech Synergy 全波长多功能酶标仪在540nm波长条件下检测吸光度值及对应的浓度值；
(7) 根据所测得浓度，按照每份一定质量30μg进行变性固定，其中5×SDS蛋白上样缓冲液按照总体积的五分之一加入，剩余的体积用组织蛋白裂解液补充；充分混匀后，稍微离心至管底后在100℃中加热煮沸5分钟；将变性后的蛋白储存于负80℃冰箱或者直接上样跑电泳检测；
(8) 电泳结束后采用湿转的方法将蛋白条带从凝胶中转移到硝酸纤维素膜(NC膜6cm×9cm)上；配制1×电转液：首先取200mL甲醇，加700mL的ddH2O后再加入100mL 10×电转液充分混匀(此过程避免将甲醇与电转液直接接触混匀，会产生大量热量)；设置条件为200mA恒定电流下转膜，时间为60-90分钟；
(9) 封闭及杂交后图像数据的采集： 封闭NC膜减少非特异条带，使用脱脂奶粉和1×TBST溶液配制成5%的封闭液，将电转后的NC膜取出，在配制好的TBST液中刷洗一下后室温浸泡于封闭液中60分钟；
(10) 杂交：将NC膜转移至装有IL-3的一抗(公司：SANTA CRUZ；货号：sc-28342)(使用1×TBST溶液配制的抗体)的杂交盒中，置于4℃冰箱中孵育过夜；从冰箱取出后置于室温放置大约半小时后回收一抗，用1×TBST溶液漂洗3次，每次10分钟；加入对应的荧光二抗(用1×TBST溶液稀释，稀释比例为1:5000 -- 1:10000)，避光室温孵育1小时；用1×TBST溶液漂洗3遍，每次10分钟；
(11) 图片的采集和处理：在避光的环境下采用双色红外荧光成像系统Odyssey扫描及拍照，保存黑白图片结果后使用Photoshop软件进行灰度值统计。
结果如图9和图10所示，静脉血、动脉血以及冠脉血中血小板中均可检测到富集的IL-3，并且发现冠脉血小板中IL-3含量更高 (p<0.05)。
实施例7、IL-3是介导心脏损伤后血小板促进内皮细胞增殖形成新生血管的关键因子
以上结果表明参与到心脏损伤心功能修复的IL-3，可能的主要来源是循环中的血小板。但是血小板携带IL-3是否具备促进血管新生的功能尚有需要进一步明确，所以在心脏损伤1天时分离了野生鼠以及IL-3 KO鼠的血小板在体外与细胞共培养，来明确血小板携带IL-3对血管新生的影响。
一、实验步骤：
(1)选取8-10周龄、体重20-22 g 的雄性WT小鼠和IL-3 KO小鼠构建心脏损害模型(方法同上) 选取8-10周龄、体重20-22 g 的雄性WT小鼠3只和IL-3 KO小鼠3只，按照实施例1中所述方法构建心脏损伤模型；
(2)在心脏损伤后第1天时收集小鼠的血液并提取血小板(步骤同实施例6)；
(3)将血小板重选于磷酸盐缓冲液(PBS pH7.2-7.4；0.01M；公司：Solarbio；货号：P1020)中；
(4)首先将不同组的血小板(约1x106个)加入到六孔板的巨噬细胞中处理6个小时；添加野生鼠来源血小板的实验组命名为野生来源组，添加IL-3 KO鼠来源血小板的实验组命名为IL-3 KO来源组，对照组添加等体积的PBS，6个小时之后将细胞上清加入到内皮细胞培养孔中；
(5)在超净台中使用同样在4℃冰箱中处理过的无菌枪头将Matrigel胶迅速加如到96孔板中，每孔100μL保证胶里面没有气泡和空隙，放置于细胞孵箱中30分钟待胶稍固定；
(6)将共培养处理过的内皮细胞消化下来，种植于铺有Matrigel胶的孔板中，每孔细胞数约2x104个细胞，继续放置于孵箱中培养；
(7)继续在细胞孵箱中培养约6小时后取出细胞，直接在显微镜下观察并统计各个孔中成管个数，每个孔中至少取3个视野；
(8)之后分别在8小时的时候统计成管情况。
二、实验结果
与对照组相比，野生鼠来源的血小板共培养后的内皮细胞均出现成管增多，并且发现IL-3敲除后的血小板促进内皮细胞成管能力显著减弱(图11和图12)。
其中图11中箭头所示为内皮细胞增殖出芽形成的管，箭头数目的多少代表成管水平。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (3)

1.检测血小板中IL-3含量的物质在制备评估或辅助评估心脏损伤患者预后的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述心脏损伤为心肌缺血导致的心脏损伤。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测IL-3含量的物质包括IL-3特异性抗体。
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