CN114616246A

CN114616246A - 卷曲受体抗体及其用途

Info

Publication number: CN114616246A
Application number: CN202080071440.XA
Authority: CN
Inventors: 萨奇德夫·西杜; 潘国华; 詹森·莫法特; 阿曼迪普·加哈尔; 斯蒂法尼·安格斯; 扎卡里·斯坦哈特; 兹韦兹丹·帕夫洛维奇; 贾勒特·亚当斯
Original assignee: Maude Mabel Therapy
Current assignee: Maude Mabel Therapy
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2022-06-10
Also published as: CA3147689A1; EP4013793A4; EP4013793A1; JP2022551380A; WO2021026652A9; WO2021026652A1; AU2020328475A1; US20220356256A1

Abstract

分离的抗体和免疫缀合物，其特异性结合卷曲受体(FZD)4富含半胱氨酸的结构域(CRD)，包含轻链可变区和重链可变区，重链可变区包含互补决定区CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3，轻链可变区包含互补决定区CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3，并且所述CDR的氨基酸序列包含选自表1a或表3a中的序列的序列或由选自表1a或表3a中的序列的序列组成。还提供了使用抗体和免疫缀合物的方法。

Description

卷曲受体抗体及其用途

领域

本公开内容涉及结合卷曲受体(frizzled receptor)的抗体并且特别是与卷曲受体4富含半胱氨酸结构域结合的抗体及其用途。

相关申请的引用

本申请要求2019年8月12日提交的美国临时申请62/885,781和2019年8月13日提交的美国临时申请62/886,292的优先权日的权益，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。

背景

卷曲受体(FZD)，是七跨膜受体的重要类别，参与许多重要的生物学过程，诸如发育、细胞增殖、存活、迁移和干细胞维持。当Wnt配体与七跨膜受体的卷曲受体家族相互作用时，信号传导途径被活化，并控制胚胎发育和成年动物的组织稳态期间干细胞和祖细胞的更新和细胞分化。这些受体及它们的配体(Wnt)的异常的表达和信号传导与许多癌症相关，包括结肠癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌。通常，多于一种Wnt配体和/或卷曲受体被上调，并导致驱动肿瘤发生的异常信号传导。因此，抑制多于一种卷曲受体可能是实现更好的抗癌效果所必需的。此外，卷曲受体也与癌症干细胞(被认为是导致耐药性、肿瘤复发和转移的一小群癌细胞)有关。因此，抑制包括FZD4在内的FZD受体(一种或多于一种受体)可能是靶向癌症干细胞和治疗各种癌症类型的有效方法。

Wnt信号传导导致典型和非典型信号传导途径的活化。非典型途径活化不参与细胞核或转录而是活化调节细胞骨架和钙水平的细胞质信号的信号分子。该途径主要在调节细胞极性或迁移中起作用。

典型途径主要通过调节β-联蛋白的细胞质水平来控制转录活性。在未刺激的条件下，β-联蛋白与破坏复合物(包含Axin、APC、CD1和GSKβ)缔合，这导致β-联蛋白的磷酸化、泛素化和蛋白酶体降解。当Wnt与7次跨膜受体卷曲受体(FZD)结合并与共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP5或LRP6)结合时，Wnt信号传导活化。这种信号传导使破坏复合物去稳定化，部分通过将散乱蛋白(disheveled，Dsh/Dvl)吸引到质膜上，导致β-联蛋白的积累，然后β-联蛋白行进到细胞核并活化TCF/LEF介导的转录。

人类的数种癌症是由WNT途径的细胞质组分内的突变引起的，这些突变导致配体非依赖性Wnt靶基因活化。例如，失活性APC突变和活化性β-联蛋白突变是人类结肠直肠癌的主要潜在原因。由于该途径在细胞表面受体的下游被活化，因此开发针对Wnt途径的靶向疗法已被证明具有挑战性。然而，最近已经鉴定出Wnt信号传导负调节因子RNF43(结肠癌、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌)及其同源物ZNRF3(肾上腺皮质癌和骨肉瘤)中引起癌症的突变，并且所述突变与配体依赖性肿瘤生长有关。事实上，RNF43和ZNRF3是编码靶向卷曲受体的跨膜E3泛素连接酶的Wnt靶基因，RNF43和ZNRF3的功能缺失突变导致FZD的高表达，并可能使肿瘤细胞对抑制Wnt依赖性信号传导敏感。

概述

以下概述旨在向读者介绍本公开内容的各方面而非定义或限定任何发明。

在一方面，本公开内容提供了抗体，其特异性结合选自FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9的一种或多于一种人类卷曲受体中每一种的富含半胱氨酸的结构域(CRD)，抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，重链可变区包含互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区包含互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且所述CDR的氨基酸序列包含选自表1a或表3a中的序列的序列或由选自表1a或表3a中的序列的序列组成。在一种实施方案中，CDR包含选自表1a或表3a中鉴定的抗体的(a)全序列集或(b)轻链序列集或(c)重链序列集。

在另一种实施方案中，CDR包含以下序列或由以下序列组成，其中：

CDR-H1选自由以下组成的组：ISYYYM、IYSYYM、LSYYYM、IYYYSI、LYSYYM、LSSYSM、ISYYYI、LSYSSM、IYYYYM、LYYYSI、ISSYYI、FSSSSI、LSYYSI、LYSYYI、LSSYYM、LSYYYI、ISSYYM、LSYYSM、LYSYSI、LYYYYI、IYSYYI、ISYSYI和ISYYSM；

CDR-H2选自由以下组成的组：SIYSYYGYTY、SIYSSSSSTY、SIYPSSSYTY、SIYSSSSYTS、YISSYSGSTY、SIYSSYGYTY、YISSYYGYTY、SIYPSSSSTY、SIYSSSGYTY、YISSYSGSTS、SISSYYGSTY、SIYSYYGSTY、SIYPYSGYTY、YISPYYGYTS、SISSSSGYTY、SIYSYSSSTY、SISPSSSYTY、YISPYYGYTY、SISPYSSSTY、SIYSSYGSTY、SIYSSSSYTY、SIYPSSGYTY、SIYPYSGSTY、SIYPSYGSTY、YISSYSSYTY、SIYSYYSSTY、YISSSYGYTS、SISPYSSYTY、YISPYSGYTS、SIYPYYSYTY、SISPYYGYTS、SISPSYSSTY、SISSSYSSTY、SIYPYSGSTS、SISSYYSSTS和SIYSYSGYTY；

CDR-H3选自由以下组成的组：SSFSWAM、SSFYWAL、SWFGWGI、YWFSYGYASYPAF、HPWYGM、SAFYWAL、PAPGHWGF、SSFFWAM、SAFYWAM、HFFAM、SWWAWAF、SAFGWAL、SSFFFAM、PYYWSGGF、HPSSSWFSFGAL、SAFYWAF、SSYAWAM、SSFYWAI、SPWGSGWAGF、PAVWVGL、SWVFWAL、SWVYWGM、SWVYWAL、SSYAWAI、SSFYWAM、HGASFGSGAPAF、SCFFWAM、WAFFGL、SSFYFAM、SAFSWAI、SGFYWAL、PSVGYAAF、SWVGWGL、SSVGYVAM、SWVYWAF、YYYSSSVYFWYAAL、SSFFWAI、SWVYWAI、SWVGWGI、SSVYWAL、WGGWGSGGYFYAAL、FWYPGM和SSFAWAF；

CDR-L1是SVSSA；

CDR-L2是SASSLYS；和

CDR-L3选自由以下组成的组：HPWSGGYLI、PVGYWGVPI、VSGGAHALI、VSSAYPI、FWGVPI、SYYHYAALI、WYYAPI、SHSYSLI、SGYGPF、SWSSPI、HYSVYASLI、PHPPSLI、VAYSHVGLI、GYGAPI、SWYSLI、PGYLF、VWFGLI、VYYGSPLF、HAHSPLI、SSAYYPF、GHASPI、SSGGWSLI、VAWSSFLI、SVAAASLI、SGWWGVSLI、SYAAYLF、HGSLF、YAGVSNLF、GWPYSALF、SGYYPSLF、SYHSGSGLI、HGYSASLI、APGWALF、GHSSPI、GWPSLF、VPGYPVPI、HYYSHLI、GPASSLI、SVGSSYYLI、YYGPWVLI、AASWGYPF、HWSYPI和GGWGPF。

在又另一种实施方案中，CDR包含以下序列或由以下序列组成，其中：

CDR-L1是SVSSA；

CDR-L2是SASSLYS；和

在另一种实施方案中，本公开内容提供了如先前描述的抗体，该抗体包含重链可变区的，该重链可变区包含：

i)如表2中列出的重链氨基酸序列；

ii)与如表2中列出的重链氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或

iii)i)的保守取代的氨基酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集。

在另一种实施方案中，本公开内容提供了还包含轻链可变区的抗体，该轻链可变区包含：

i)如表2中列出的轻链氨基酸序列；

ii)与如表2中列出的轻链氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集；或

在另一种实施方案中，本公开内容提供了特异性结合FZD4的抗体。在另一种实施方案中，特异性结合FZD4的抗体CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072、5077-5080或5081。

在另一种实施方案中，本公开内容提供了特异性结合FZD4和选自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9的至少一种其他受体的抗体。在又另一种实施方案中，CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。在又另一种实施方案中，相对于另一种FZD受体，抗体优先结合卷曲受体4(FZD4)。在又另一种实施方案中，CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5028、5029、5031、5034、5035、6497、6498、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067、5073、5074、5075。在又另一种实施方案中，抗体具有通过表面等离子体共振测量的约0.2nM和约15.3nM之间的结合亲和力。

在又另一种实施方案中，CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072、5077-5080或5081。

在又另一种实施方案中，抗体是单克隆的、人源化的、单链的、抗体片段、多价的、双特异性的、包含非天然糖基化模式、包含半胱氨酸取代或添加或者阻断Wnt与FZD的结合。在又另一种实施方案中，抗体片段选自由选自以下的片段组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv，其二聚体、纳米抗体、微型抗体、双抗体及多聚体。在又另一种实施方案中，多价抗体是二价、三价或四价的。在又另一种实施方案中，半胱氨酸取代存在于恒定区或框架区中。在又另一种实施方案中，双特异性抗体还结合LRP 5和/或LRP 6。在又另一种实施方案中，抗体包含非天然糖基化模式。在又另一种实施方案中，半胱氨酸取代在恒定区或框架区中。在又另一种实施方案中，如本文描述的抗体阻断Wnt与FZD的结合。

另一方面，本公开提供了包含如本文描述的抗体和可检测标记物或细胞毒性剂的免疫缀合物。在一种实施方案中，细胞毒性剂选自美登素生物碱(maytansinoid)、澳瑞他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、tubulysin、念珠藻素、吡咯并苯二氮卓类(PBD)二聚体、吲哚并苯二氮卓类二聚体、α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)、trichothene、SN-38、倍癌霉素、CC1065、卡奇霉素(calicheamicin)、烯二炔(enediyne)抗生素、紫杉烷、多柔比星衍生物、蒽环类和它们的立体异构体、azanofide、电子等排体、类似物或衍生物。

在另一方面，本公开内容提供了编码如本文描述的抗体的核酸。在一种实施方案中，由核酸编码的一种或更多种CDR序列在表1b、表1c、表3b和表3c中描述。

在另一种实施方案中，由核酸编码的抗体包含由核酸编码的重链可变区，该核酸包含：

i)如表2中列出的重链核酸序列；

ii)与如表2中列出的重链核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％序列同一性的核酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或

iii)i)的密码子简并核酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集。

在另一种实施方案中，由核酸编码的抗体包含由核酸编码的轻链可变区，该核酸包含：

i)如表2中列出的轻链核酸序列,

ii)与如表2中列出的轻链核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％序列同一性的核酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或

在又另一方面，本公开内容提供了载体，其包含与编码本文描述的抗体的核酸可操作地连接的表达控制序列。

在又另一方面，本公开内容提供了宿主细胞，该宿主细胞包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含与编码本文描述的抗体的核酸可操作地连接的表达控制序列。在一种实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在又另一方面，本公开内容提供了用于制备抗FZD抗体的方法，该方法包括培养如本文描述的宿主细胞。

在又另一方面，本公开内容提供了组合物，其包含本文描述的一种或更多种抗体、免疫缀合物、核酸、载体或宿主细胞，以及任选地合适的稀释剂。在一种实施方案中，组合物包含一种或更多种抗体或免疫缀合物，任选地其中组合物是药物组合物。

在又另一方面，本公开内容提供了试剂盒，其包含本文描述的一种或更多种抗体、免疫缀合物、核酸、载体或宿主细胞。

在又另一方面，本公开内容提供了检测FZD表达的方法，该方法包括在允许形成抗体:细胞复合物的条件下，使包含一个或更多个细胞的样品与本文描述的一种或更多种抗体或免疫缀合物接触，并检测任何抗体复合物的存在。在一种实施方案中，检测方法是通过免疫荧光。在另一种实施方案中，检测方法是通过流式细胞术。在又另一种实施方案中，该方法用于检测FZD4表达，并且抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081。

在又另一方面，本公开内容提供了抑制Wnt配体与FZD受体结合、破坏Wnt信号传导途径、抑制Wnt诱导的转录活性、抑制散乱蛋白(disheveled)活化、促进β-联蛋白破坏复合物的保持、促进β-联蛋白积累或抑制细胞生长的方法，该方法包括使表达FZD受体的细胞与本文描述的抗体或免疫缀合物接触。在另一方面，本公开内容提供了本文描述的抗体或免疫缀合物，用于抑制Wnt配体与FZD受体结合、破坏Wnt信号传导途径、抑制Wnt诱导的转录活性、抑制散乱蛋白活化、促进β-联蛋白破坏复合物的保持、促进β-联蛋白积累或抑制细胞的生长。在另一方面，本公开内容提供了本文描述的抗体或免疫缀合物用于抑制Wnt配体与FZD受体结合、破坏Wnt信号传导途径、抑制Wnt诱导的转录活性、抑制散乱蛋白活化、促进β-联蛋白破坏复合物的保持、促进β-联蛋白积累或抑制细胞生长的用途。在又另一方面，本公开内容提供了本文描述的抗体或免疫缀合物在制备用于抑制Wnt配体与FZD受体结合、破坏Wnt信号传导途径、抑制Wnt诱导的转录活性、抑制散乱蛋白活化、促进β-联蛋白破坏复合物的保持、促进β-联蛋白积累或抑制细胞生长的药物中的用途。在一种实施方案中，Wnt配体是Wnt3a。在另一种实施方案中，抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：a)5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081，或者b)5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。

在又一方面，本公开内容提供了治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含如本文描述的抗体或免疫缀合物的药物组合物。在另一方面，本公开内容提供了如本文描述的抗体或免疫缀合物用于治疗癌症的用途。在又另一方面，本公开内容提供了用于治疗癌症的如本文描述的抗体或免疫缀合物。在又另一方面，本公开内容提供了如本文描述的抗体或免疫缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一种实施方案中，癌症选自急性髓性白血病、神经母细胞瘤、肝癌、肺癌、子宫内膜癌、唾液腺样囊性癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、胶质瘤、胃癌、星形细胞瘤和骨肉瘤。在另一种实施方案中，该方法或用途包括抗体或免疫缀合物，该抗体或免疫缀合物在至少一种测定中特异性结合FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9，并在至少一种测定中抑制Wnt3a诱导的信号传导，任选地其中该抗体或免疫缀合物是本文描述的抗体或免疫缀合物。在又另一种实施方案中，该方法或用途的抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：a)5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081，或者b)5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。在又另一种实施方案中，抗体或免疫缀合物包含对应于选自5019和5020的抗体的CDR序列集。在又另一种实施方案中，通过该方法或用途治疗的癌症包含一种或更多种包含RNF43基因的突变的癌细胞，并且抗体或免疫缀合物包含对应于抗体5020的CDR序列集。

本公开内容的其他特征和优点将从以下详细描述变得明显。然而，应理解详细描述和特定实例在指示实施方案的同时仅以说明的方式提供，权利要求书的范围不应被实例中阐述的实施方案所限制，而应提供与作为整体的描述一致的最宽泛的解释。

附图简述

现在将结合附图描述本公开内容的实施方案，在附图中：

图1是示出噬菌体克隆与FZD4-CRD-Fc和Fc的结合的图。使用单菌落接种96孔培养板，并且过夜噬菌体上清液以1:2稀释于0.05％Tween20/0.5％BSA/PBS(稀释缓冲液)中，以在ELISA中测试结合。用抗M13-HRP二抗(1:5000于稀释缓冲液中)检测噬菌体，并将板用TMB底物和酸终止显色。读取FZD4-Fc包被孔和对照Fc包被孔在450nm处的吸光度，如所示的。

图2是示出抗FZD4 Fab的竞争性ELISA结合的图。进行ELISA以评估FZD4 Fab组的亲和力。将384孔ELISA板用PBS中的2μg/ml FZD4 CRD-Fc(R&D systems)在4℃包被过夜。将板用0.5％BSA/PBS在室温封闭1小时，并且然后用0.05％Tween20/PBS洗涤三次。在非结合性96孔ELISA板中，将0.5μg/ml的最终浓度的Fab与溶液(0.05％Tween20/0.5％BSA/PBS)中指定浓度的FZD4 CRD-Fc一起在室温预孵育1小时。将该Fab抗原混合物转移到384孔板中，并在室温孵育20分钟。洗涤板六次，并用0.05％Tween20/0.5％BSA/PBS中的1:5000的抗FLAG-HRP二抗(Sigma)检测结合Fab。二抗在室温孵育45分钟，洗涤板，并且然后用TMB底物和酸终止显色。读取450nm处的吸光度。结合％计算为含有竞争性可溶性FZD4 CRD-Fc的Fab孔的吸光度除以不存在竞争性可溶性FZD4 CRD-Fc的Fab孔的吸光度乘以100。

图3是示出抗FZD4 Fab与CHO细胞上表达的FZD的结合的一系列免疫荧光染色照片。通过免疫荧光染色(IF)测试来自FZD4选集的Fab对稳定表达FZD4 CRD区(作为带有myc标签的GPI连接的结构域)的CHO过表达系的反应性。用抗F(ab')₂-FITC二抗(JacksonImmuno)检测Fab，并且白色区域指示FITC染色。

图4是示出抗FZD4 Fab与CHO细胞的结合的一系列免疫荧光染色照片。通过免疫荧光染色(IF)测试来自FZD4选集的Fab对稳定转染了GPI接头和myc标签的对照CHO细胞系的反应性。用抗F(ab')₂-FITC二抗(Jackson Immuno)检测Fab，并且白色区域指示FITC染色。

图5是示出通过IF染色确定的Fab与FZD的结合的表。

图6是示出Fab 5019和Fab 5020与多种人类胰腺癌细胞系中的FZD的结合的一系列免疫荧光染色照片。

图7是示出通过流式细胞术确定的Fab 5019和Fab 5020与胰腺细胞系的结合的一系列图。数字指示对比二抗对照的MFI增加倍数。

图8A-D是示出抗FZD4 Fab与FZD的结合的一系列图。

图9A-B是示出通过IF确定的抗FZD4 Fab与FZD的结合的表。CHO myc GPI细胞系。200nM Fab。-＝无结合；+＝非常弱的结合物；++＝弱结合物；+++＝好的结合物；++++＝非常好的结合物。

图10是示出通过SPR确定的抗FZD4 Fab与FZD4的结合亲和力的表。

图11是示出通过流式细胞术确定的抗FZD4 Fab与胰腺癌细胞的结合的图。

图12A-B是示出抗FZD4 Fab对WNT5A结合的抑制的一系列图。(A)使用商业试剂盒(Thermo 21329EZ-连接NHS-PEG4-生物素)将Wnt5a(R&D systems)生物素化，并使用3000MWCO Amicon过滤器通过缓冲液交换去除过量的生物素。将FZD4-CRD-Fc或对照Fc蛋白(R&D systems)在1％BSA/0.05％Tween20/PBS(稀释缓冲液)中稀释至指定浓度，并与恒定量的生物素化Wnt5a一起在BSA封闭的96孔TC处理的板中在室温孵育1小时。还包括其中添加单独的缓冲液代替生物素化wnt5a的对照孔。生物素化Wnt5a以150ng/ul的最终浓度添加。将样品转移到预封闭的链霉亲和素包被的板(R&D systems)，并允许在室温捕获1小时。用0.05％Tween20/PBS洗涤孔四次，并且然后将抗Fc-HRP(1:5000于稀释缓冲液中，JacksonImmuno)添加到孔中，在室温持续45分钟。将孔洗涤四次，并用TMB试剂和酸终止显色。读取450nm处的吸光度。(B)将FZD4-CRD-Fc稀释至先前在(A)中确定的浓度，以提供线性范围内的ELISA信号，并与所需的Fab或缓冲液对照一起在用1％BSA预封闭的96孔TC板中在室温孵育1小时。如以上，还包括含有Fc蛋白的对照孔。将生物素化wnt5a添加到孔中，并将板再孵育1小时。还包括其中添加单独的缓冲液代替生物素化wnt5a的对照孔。生物素化Wnt5a以150ng/ul的最终浓度添加。Fab蛋白的最终浓度为400nM，但有以下例外：Fab 6494以180nM、Fab 6406以135nM、并且Fab 6500以159nM。对不同蛋白抗原特异的阴性对照Fab以及针对来自Fab蛋白储存于其中的中和洗脱缓冲液的影响的对照(Fab缓冲液对照)被包括在内。计算结合百分比。

图13是示出Fab对β-联蛋白驱动的转录的影响的表(TOPFLASH测定)。

图14A-H是示出抗FZD4 Fab对癌细胞增殖的影响的一系列图。

图15是示出如通过SRB(磺酰罗丹明B)测定确定的抗FZD4 Fab对胰腺癌细胞增殖的影响的表，其中“na”表示未测试。

图16是抗FZD4 Fab的概述表，其中na表示未测试。抗增殖活性表现为与对FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9的结合和对wnt3a活性的抑制相关。如本测定示出的，最有效的抑制剂是5014、5019-5023和6495。

图17是示出抗FZD4抗体抑制人类胰腺癌细胞系(HPAF II)中Wnt途径调节基因Axin2的表达的图。用200nM Fab/IgG处理后的基因表达(RT-qPCR)针对β肌动蛋白归一化。

图18A-B是示出IgG 5019和IgG 5020增殖抑制的一系列图。A)示出IgG 5019和IgG5020抑制胰腺癌细胞增殖，使用阿尔玛蓝增殖测定(200nM Fab/IgG)，并且B)示出IgG 5020以剂量依赖性方式抑制细胞增殖。

图19是示出IgG 5020抑制菌落形成的一系列菌落照片。

图20是示出Fab 5019和Fab 5020与PDAC患者来源的异种移植物(PDX)细胞系(GP2A和GP14A)中的FZD的结合的一系列免疫荧光染色照片。

图21是示出阿尔玛蓝增殖测定(200nM Fab/IgG)中Fab 5019、Fab 5020和IgG5020对PDAC PDX细胞系增殖的影响的图。

图22示出Wnt典型信号传导途径的示意图。

公开内容的详述

I.定义

除非另有定义，否则结合本公开内容使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。例如，术语“细胞”包括单个细胞以及多于一个细胞或细胞群体。一般来说，本文描述的结合细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交使用的命名和技术是本领域熟知且常用的那些(参见，例如，Green和Sambrook，2012)。

如本文使用的，术语“多肽”是指具有通过肽键连接的天然和/或非天然氨基酸的序列的分子。术语“肽”是指短多肽，通常长度不多于30个氨基酸。多肽的氨基酸序列被称为其“一级结构”。术语“蛋白”是指具有二级、三级和/或四级结构(例如，通过氢键稳定的结构、二级结构之间的关系和由多于一个蛋白形成的结构)的多肽。蛋白可以被其他附接部分(诸如碳水化合物(糖蛋白)、脂质(脂蛋白)、磷酸基团(磷酸化蛋白(phosphoprotein))等)进一步修饰。

如本文使用的，氨基酸序列仅“由该序列中的氨基酸组成”。

如本文使用的，如果第一氨基酸序列(1)包含第二氨基酸序列，并且(2)比第二氨基酸序列长不超过1个、不多于2个或不多于过3个氨基酸，则第一氨基酸序列“主要由第二氨基酸序列组成”。

如本文使用的，如果第二氨基酸序列包含第一氨基酸序列，则第一氨基酸序列是第二氨基酸序列的“片段”。在某些实施方案中，是第二氨基酸序列的片段的第一氨基酸序列可以比第二氨基酸序列少不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任一种。

如本文使用的，参考氨基酸序列的“功能等同物”是与参考序列不相同但包含微小的改变，诸如，例如，一个或少量(a few)氨基酸的插入、缺失或取代的序列，。功能等同的序列保留了与其等同的参考序列的功能(例如，免疫原性)。如果功能等同的氨基酸序列包含相对于参考序列的一个或更多个氨基酸的取代，则这些一般将是保守氨基酸取代。

如本文使用的，“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基替换而不消除蛋白的期望特性的氨基酸取代。合适的保守氨基酸取代可以通过用疏水性、极性和R链长度相似的氨基酸彼此取代来进行。参见，例如，Watson等人,“Molecular Biology ofthe Gene,”第四版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,Menlo Park,CA,第224页。保守氨基酸取代的实例包括以下(注意，一些类别并不相互排斥)：

如本文使用的，术语“基本相同”是指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的同一性，第一氨基酸序列含有足够或最少数目的i)与比对的第二氨基酸序列中的氨基酸残基相同，或ii)为比对的第二氨基酸序列中的氨基酸残基的保守取代的氨基酸残基，使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性和/或共同的免疫原性。例如，含有具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的共同结构或抗原结构域的氨基酸序列被称为充分或基本相同。在核苷酸序列的上下文中，术语“基本相同”在本文中用于指第一核酸序列含有足够或最少数目的与比对的第二核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸，使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同结构多肽结构域或共同功能多肽活性，或编码具有相同免疫原性的多肽。

如本文使用的，术语“抗原”、“免疫原”和“抗体靶”是指被抗体识别(即，可以被抗体结合)的分子、化合物或复合物。该术语可以指能够被抗体识别的任何分子，例如，多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质、化学部分或其组合(例如，磷酸化多肽或糖基化多肽等)。本领域技术人员将理解，该术语并不指示该分子在每种情况下都是免疫原性的，而只是指示它可以被抗体靶向。

如本文使用的，术语“表位”是指抗原上被抗体识别和结合的定位位点。表位可以包含少量氨基酸或少量氨基酸的部分，例如，5个或6个或者更多个，例如，20个或更多个氨基酸，或这些氨基酸的部分。在一些情况下，表位包含非蛋白组分，例如，来自碳水化合物、核酸或脂质的组分。在一些情况下，表位是三维部分。因此，例如，当靶是蛋白时，表位可以包含连续的氨基酸，或者通过蛋白折叠而接近的来自蛋白不同部分的氨基酸(例如，不连续的表位)。

如本文使用的，术语“抗体”是指识别并特异性结合一个或更多个靶抗原(诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或其组合)的免疫球蛋白。这种结合通过免疫球蛋白可变区内的至少一个抗原识别位点在抗原上的一个或更多个表位处发生。可变区在结合特异性和亲和力方面最为关键。如本文使用的，术语“抗体”包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、杂种抗体、融合蛋白和任何其它包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子，只要抗体表现出期望的生物活性。抗体可以(i)基于其重链恒定结构域的身份属于五大类免疫球蛋白中的任一种——α(IGA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IGg)和μ(IGm)，或(ii)其亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。轻链可以是λ或κ。抗体可以是裸的或者与其他分子诸如毒素、药物、放射性同位素、化学治疗剂等缀合。

在一种实施方案中，“完整抗体”包含由两对相同的多肽链组成的四聚体，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。重链和轻链通过共价键和非共价键(例如，二硫键)连接，这些键在不同免疫球蛋白类别之间的数目和量不同。在一种实施方案中，每条链包含可变区和恒定区。可变区的抗原识别位点由高变区或互补决定区(CDR)和框架区组成。框架区通常不与抗原接触，而是为CDR提供结构支持。恒定区与身体的其他免疫细胞相互作用。恒定区和可变区之间(仅IgG、IgD、IgA，而非IgM或IgE)是位于两条重链之间的中心的铰链区，铰链区为铰接(articulate)抗原结合提供柔性。

以下是不同抗体形式的非穷尽列表，所有都保留了抗原结合活性：

(1)全免疫球蛋白(也称为“完整”抗体)(两条轻链和两条重链，例如，四聚体)。

(2)免疫球蛋白多肽(轻链或重链)。

(3)抗体片段，诸如Fv(单价或二价可变区片段，并且可以仅包含可变区(例如，V_L和/或V_H)、Fab(V_LC_L V_HC_H)、F(ab')2、Fv(V_LV_H)、scFv(单链Fv)(包含通过接头(例如，肽接头)连接的V_L和V_H的肽)、(scFv)2、sc(Fv)2,双特异性sc(Fv)2、双特异性(scFv)2、微型抗体(minibody，与CH3结构域融合的sc(FV)2)，三抗体(triabody)是三价sc(Fv)3或三特异性sc(Fv)3。

(4)多价抗体(包含结合两种不同表位或蛋白的结合区的抗体，例如,“蝎形”抗体)。

(5)融合蛋白，其包含与另一氨基酸序列(诸如荧光蛋白)融合的免疫球蛋白的结合部分。

如本文使用的，术语“抗体片段”是指抗体或抗体链的一些或一部分，其包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基，并且其结合抗原或与完整抗体竞争。片段可以经由对完整或完全的抗体或抗体链的化学或酶处理获得。片段也可以通过重组手段获得。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体来产生F(ab')2片段。所得的F(ab')2片段可以被处理以还原二硫桥从而产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以导致Fab片段的形成。Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其他片段也可以通过重组表达技术构建。

虽然在完整抗体的消化产物方面定义了各种抗体片段，但技术人员将理解，这样的片段也可以从头化学合成或利用重组DNA方法构建和表达被。

单链抗体(scFv)是指包含由接头(例如，肽接头)连接的V_L和V_H的多肽。ScFv也可以用于形成串联(或二价)ScFv或双抗体。串联scFv和双抗体的产生和特性在以下中描述：例如，Asano等人J Biol.Chem.286:1812(2011)；Kenanova等人(2010)Prot Eng Design Sel23:789；Asano等人(2008)Prot Eng Design Sel 21:597。

抗体片段还包括Fd(包含在Fab片段中的重链部分)和单结构域抗体。单结构域抗体(sdAb)是通过重组方法产生的重链或轻链的可变结构域。

如本文使用的措辞“CDR序列集”是指本文描述的特定抗体的3个重链CDR和/或3个轻链CDR。“轻链”CDR序列集是指轻链CDR序列。“重链”CDR序列集是指重链CDR序列。“全”CDR序列集是指重链CDR序列和轻链CDR序列两者。例如，对于如表1a中示出的抗体5017，全CDR序列集包含以下或由以下组成：SVSSA(CDR L1)、SASSLYS(CDR L2)、AAYHWPPLF(CDR L3)、LYYTDM(CDR H1)、SISLFFGYVS(CDR H2)和YLAM(CDR H3)。每个CDR的CDR序列可以，例如，包含表1a或表3a中的CDR、主要由表1a或表3a中的CDR组成或由表1a或表3a中的CDR组成。基于IMGT序列比对预测CDR。

如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指对抗原上的特定表位具有单一结合特异性和亲和力的抗体克隆制品或组合物(“单克隆抗体组合物”)。“多克隆抗体”是指针对单一抗原产生，但具有不同的结合特异性和亲和力的抗体制品或组合物(“多克隆抗体组合物”)。

如本文使用的，术语“嵌合抗体”是指具有源自两个或更多个物种的氨基酸序列的抗体。在一种实施方案中，轻链和重链两者的可变区对应于源自一个物种的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有期望的特异性、亲和力和能力(capability)的抗体的可变区，而恒定区与源自另一物种(通常为接受治疗的受试者，例如，人类)的序列同源以避免引发免疫应答。

如本文使用的，术语“人源化抗体”是指其中从具有期望的特异性、亲和力和能力的从非人类抗体的VH区和VL区获得的CDR被嫁接到人类框架序列上的嵌合抗体。在一种实施方案中，人源化抗体的框架残基被修饰以改进和优化抗体的特异性、亲和力和能力。人源化，即，将非人类CDR序列取代为人类抗体的相应序列，可以按照以下中描述的方法进行：例如，美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,633,425号、第5,661,016号；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14:845-51(1996)。

如本文使用的，术语“人类抗体”是指由人体产生的抗体或通过本领域已知的任何技术制备的具有与由人体产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。

如本文使用的，术语“杂种抗体(hybrid antibody)”是指这样的抗体，其中来自具有不同抗原决定区的抗体的重链和轻链对被组装在一起，使得所得的四聚体可以识别和结合两种不同的表位或两种不同的抗原。杂种抗体可以是双特异性的(结合2种不同的抗原或表位)或多特异性的(>1种不同的抗原或表位)。

如本文使用的，如果抗体的所有抗原结合位点都与相同的表位结合，则该抗体是“单特异性的”。

如本文使用的，如果抗体具有各自与不同的表位或抗原结合至少两个不同的抗原结合位点，则该抗体是“双特异性的”。

如本文使用的，如果抗体具有多于一个抗原结合位点，则该抗体是“多价的(polyvalent)”。例如，四价的抗体具有四个抗原结合位点。

结合的特异性可以根据与抗体和环境中其它物质或一般无关分子的解离常数相比抗体(或其它靶向部分)对靶的比较解离常数(K_d)来定义。较大(较高)的K_d是描述较低亲和力相互作用的K_d。相反，较小(较低)的K_d是描述较高亲和力相互作用或较紧密结合的K_d。仅以实例的方式，抗体与靶特异性结合的K_d可以是飞摩尔浓度、皮摩尔浓度、纳摩尔浓度或微摩尔浓度，而抗体与无关物质结合的K_d可以是毫摩尔浓度或更高。结合亲和力可以在微摩尔浓度范围(kD＝10^-4至10^-6)、纳摩尔浓度范围(kD＝10^-7M至10^-9M)、皮摩尔浓度范围(kD＝10^-10M至10^-12M)或飞摩尔浓度范围(kD＝10^-13M至10^-15M)内。

如本文使用的，如果抗体以小于10^-4M(即，微摩尔浓度范围内)的Kd结合抗原或表位，则该抗体“结合”或“识别”该抗原或表位。对于细胞类型(例如，结合癌细胞的抗体)，术语“结合”通常指示剂结合这些细胞的纯群体中的大多数细胞。例如，结合特定细胞类型的抗体通常结合该指定细胞群体中至少2/3的细胞(例如，67％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。在一些情况下，与多肽的结合可以通过比较抗体与呈现该多肽的细胞的结合和抗体与不表达该多肽的细胞的结合(或缺乏结合)来测定。技术人员将认识到，取决于确定结合的方法和/或阈值，会出现一些可变性。抗体对靶的亲和力可以根据本领域已知的方法来确定，例如，如Ernst等人Determination ofEquilibrium Dissociation Constants,Therapeutic Monoclonal Antibodies(Wiley&Sons ed.2009)中评述的。

如本文使用的，术语“更大的亲和力”是指其中抗体X与靶Y的结合比与靶Z的结合更强(K_on)和/或具有更小的解离常数(K_off)的抗体结合的相对程度，并且在这种情况下抗体X对靶Y比对靶Z具有更大的亲和力。同样，术语“更小的亲和力”在本文中是指其中抗体X与靶Y的结合比与靶Z的结合强度更小和/或具有更大的解离常数的抗体结合的程度，并且在这种情况下抗体X对靶Y比对靶Z具有更低的亲和力。抗体与其靶抗原之间的结合亲和力可以表示为K_A等于1/K_D，其中K_D等于k_on/k_off。k_on和k_off值可以使用表面等离子体共振技术来测量，例如，使用分子亲和筛选系统(Molecular Affinity Screening System，MASS-1)(Sierra Sensors GmbH,Hamburg,Germany)。拮抗剂或阻断性抗体是相对于相似生理条件下抗体不存在时的活性，部分或完全阻断抑制或中和与靶抗原相关的生物活性的抗体。拮抗剂可以是竞争性的、非竞争性的或不可逆的。竞争性拮抗剂是在与天然配体-受体相互作用相同的位点处与天然配体或受体结合的物质，或以诱导变化以阻止正常结合的方式别构结合的物质。非竞争性拮抗剂在不同于天然配体-受体相互作用的位点处结合，但使相互作用产生的KD或信号降低。不可逆抑制剂引起对受体的共价修饰，阻止任何后续结合。

如本文使用的，术语“亲合力(avidity)”是指抗体和靶抗原之间的结合复合物的总体稳定性。它由三个因素控制：(i)抗体对抗原的固有亲和力，(2)抗体的价，和(3)相互作用组分的几何排列。亲和力是抗体和单个靶之间相互作用的强度，而亲合力是多于一个亲和力的累积强度。在一种实施方案中，本文公开的抗体是二价的。

如本文使用的，如果抗体以比其结合第二抗原更大的亲和力结合第一抗原，则相对于第二抗原，抗体“优先结合”第一抗原。优先结合可以是以至少2倍、5倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1000倍大的亲和力中的任一种。因此，例如，如果抗体以比其结合第二FZD蛋白更大的亲和力结合第一FZD蛋白，则相对于第二FZD蛋白，抗体优先结合第一FZD蛋白。

如本文使用的，如果抗体以1×10^-6M、1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M中的至少任一种亲和力结合靶抗原或靶抗原组中的每个成员，并且例如以对与靶抗原进行比较的对非靶抗原的亲和力至少2倍大的亲和力结合靶抗原或者靶抗原组中的每个成员，则抗体“特异性结合”靶抗原或靶抗原组或者对靶抗原或靶抗原组是“特异性的”。通常，特异性结合的特征在于以足够的亲和力结合抗原，使抗体可用作检测抗原或表位的诊断剂和/或可用作靶向抗原或表位的治疗剂。

如果抗体特异性结合靶蛋白组(例如，卷曲受体蛋白家族的一些或所有成员)，则抗体对与其结合最弱的靶组成员的结合亲和力大于抗体对非靶抗原的结合亲和力。在一种实施方案中，特异性结合选自FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8、FZD9的一种或多于一种人类卷曲(FZD)受体中每一种的富含半胱氨酸的结构域(CRD)的抗体意指与未选择的组成员或更一般地其他抗原相比，抗体特异性结合该组中所选择的成员。因此，例如，特异性结合由FZD1、FZD2、FZD4、FZD5和FZD7组成的靶组的富含半胱氨酸的结构域的抗体特异性结合这些蛋白而不是FZD3、FZD8、FZD9和FZD10。

如本文使用的，当抗体竞争性地减少或阻止所有配体与受体的相互作用时，抗体“阻断”或“拮抗”配体与受体的结合。在实施方案中，测量到的减少水平可以是对照(例如，未处理的)细胞的至少5％、10％、25％、50％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％、99.9％中的任一种。例如，拮抗或阻断Wnt配体与FZD受体结合的抗体竞争性地减少或阻止Wnt蛋白与FZD受体的相互作用。这导致与Wnt信号传导相关的下游信号传导事件的减弱或阻断。这包括，例如，散乱蛋白的活化，β-联蛋白破坏复合物的溶解，β-联蛋白的较低胞质水平，和/或TCF/LEF介导的转录的较低活性。

对于抗体靶(例如，抗原、分析物、免疫复合物)，术语“捕获”通常指示抗体结合纯群体中的大多数抗体靶(假设适当的摩尔比)。例如，与特定抗体靶结合的抗体通常与溶液中至少2/3的抗体靶(例如，至少67％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种)结合。技术人员将认识到，取决于确定结合的方法和/或阈值，会出现一些可变性。

术语“缀合物”是指与部分(诸如可检测标记物或生物活性部分，诸如药物、毒素或化学治疗剂或细胞毒性剂)化学偶联的第一分子，例如，抗体(“免疫缀合物”)。因此，本公开内容设想了与一种或更多种部分缀合的抗体。此外，抗体可以是“缀合抗体”或“非缀合抗体”(即，不与部分缀合)。

如本文使用的，术语“抗体-药物缀合物”或(“ADC”)是指与药物缀合的抗体。通常，缀合包括通过接头的共价结合。

如本文使用的，术语“标记的”分子(例如，核酸、蛋白或抗体)是指与可检测标记物共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子键、范德华键、静电键或氢键)结合的分子，使得分子的存在可以通过检测与该分子结合的可检测标记物的存在来检测。

如本文使用的，术语“可检测标记物”是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。本文描述了可检测标记物的实例，并且其包括但不限于比色标记物、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物和放射性标记物。为了本公开内容的目的，可检测标记物也可以是本身不产生信号但结合能够产生信号的第二部分(例如，标记的亲和素)的部分(例如，生物素)。

关于抗体的术语“交联”是指抗体与固体或半固体基质(例如，琼脂糖凝胶、珠、微量滴定板)或另一种蛋白或抗体的附接。例如，抗体可以多聚体化以产生具有多个(多于2个)抗原结合位点的抗体复合物。抗体可以通过将抗体表达为高价同种型(例如，IgA或IgM，它们通常分别形成2个或5个抗体的复合物)来多聚体化。抗体多聚体化也可以通过使用包含能够连接蛋白的反应性基团的交联剂(例如，碳二亚胺、NHS酯等)来进行。用于使抗体与基质交联的方法和组合物在例如Abcam和New England Biolab目录和网站(在abcam.com和neb.com可获得)中描述。具有各种反应性基团的交联剂化合物在例如Thermo FisherScientific目录和网站(在piercenet.com可获得)中描述。

如本文使用的，术语“免疫测定”是指通过检测识别分析物的抗体和分析物之间的结合来检测分析物的方法。

如本文使用的，术语“表达构建体”是指包含与将是表达对象的异源核苷酸序列(即，在自然界中表达控制序列通常不与之连接的序列)可操作地连接的表达控制序列的多核苷酸。如本文使用的，术语“表达载体”指包含表达构建体和足以在宿主细胞中复制或插入到宿主染色体中的序列的多核苷酸。质粒和病毒是表达载体的实例。如本文使用的，术语“表达控制序列”是指调节与其可操作地连接的核苷酸序列的转录和/或翻译的核苷酸序列。表达控制序列包括启动子、增强子、阻遏子(转录调节序列)和核糖体结合位点(翻译调节序列)。

如本文使用的术语“载体”包括核酸分子的任何中间媒介物，其使得所述核酸分子能够例如被引入到原核细胞和/或真核细胞中和/或整合到基因组中，并且包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体，诸如基于逆转录病毒的载体、腺相关病毒载体等。如本文使用的术语“质粒”一般指染色体外遗传物质的构建体，通常是环状的DNA双链体，其可以独立于染色体DNA复制。

如本文使用的，当表达控制序列在细胞中起调节核苷酸序列转录的作用时，核苷酸序列与表达控制序列“可操作地连接”。这包括通过聚合酶和启动子之间的相互作用来促进核苷酸序列的转录。

如本文使用的，“宿主细胞”是指包含表达构建体的重组细胞。

如本文使用的，术语“生物样品”是指含有细胞(例如，肿瘤细胞)或源自细胞的生物分子的样品。生物样品可以从受试者(例如，患者)、从动物(诸如，动物模型)或从培养的细胞(例如，细胞系或从患者中取出并在培养基中生长以供观察的细胞)获得。生物样品可以包括组织和/或液体。它可以从任何生物来源获得，包括但不限于血液、血液级分(例如，血清或血浆)、脑脊液(CSF)、淋巴、眼泪、唾液、痰、颊拭子、乳液、尿液或粪便。生物样品可以是活检样品，诸如组织活检样品，诸如针穿刺活检样品、细针穿刺活检样品、手术活检样品等。样品可以包括带有病变或可疑病变的组织样品，尽管生物样品也可以源自另一个部位，例如怀疑的转移部位、淋巴结或来自血液。生物样品可以是取自受试者的样品的一部分。组织样品的实例包括脑组织样品或神经组织样品。获得这样的生物样品的方法是本领域已知的，包括但不限于标准的血液回收程序。

如本文使用的，术语“诊断”是指受试者患有紊乱诸如癌症的相对概率。类似地，术语“预后”是指受试者可能出现某种未来结果的相对概率。例如，在本公开的上下文中，预后可以指个体将发展出癌症、复发、癌症将转移、癌症将被治愈的可能性，或者疾病的可能严重程度(例如，症状的严重程度、功能下降的速率、存活等)。这些术语并不意图是绝对的，如医学诊断领域的任何技术人员都将理解的。

如本文使用的，术语“疗法”、“治疗”、“治疗性干预”和“改善”是指导致症状严重程度减少的任何活动。在癌症的情况下，治疗可以指例如减少肿瘤尺寸、癌细胞数目、生长速率、转移活性、减少非癌细胞的细胞死亡、减少恶心和其他化学疗法或放射疗法副作用等。术语“治疗”和“预防”不意图是绝对术语。治疗和预防可以指任何发作的延迟、症状的改善、患者存活的提高、存活时间或存活率的增加等。治疗和预防可以是完全的(检测不到赘生性细胞的水平)或部分的，使得在患者体内发现的赘生性细胞比没有本发明干预时出现的更少。治疗的效果可以与未接受治疗的个体或个体的集合进行比较，或者与同一患者治疗前或治疗期间不同时间进行比较。在一些方面，与例如施用前的个体或未经历治疗的对照个体相比，疾病的严重程度减少至少10％。在一些方面，疾病的严重程度减少至少25％、50％、75％、80％或90％，或者在一些情况下，使用标准诊断技术不再可检测到。

如本文使用的，术语“有效量”、“有效剂量”和“治疗有效量”是指足以产生期望的响应(诸如减少或消除状况的病征或症状或改善紊乱)的剂(诸如抗体或免疫缀合物)的量。在一些实例中，“有效量”是治疗(包括预防)任何紊乱或疾病的一种或更多种症状和/或潜在原因和/或预防疾病进展的量。例如，对于特定参数，治疗有效量将显示出治疗效果的至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％中的任一种的增加或降低。治疗效力也可以被表示为增加或降低“...倍”。例如，治疗有效量相比于对照可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍效果中的任一种。

如本文使用的，术语“药物组合物”是指包含药物化合物(例如，药物)和药学上可接受的载体的组合物。

如本文使用的，术语“药学上可接受的”是指与药物组合物的其他成分相容并且可以安全地向受试者施用的载体。该术语与“生理学上可接受的”和“药理学上可接受的”同义使用。药物组合物及它们的制备和使用技术是本领域技术人员根据本公开内容已知的。对于合适的药理组合物和它们的施用技术的详细列表，人们可以参考诸如以下的教科书：Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版1985；Brunton等人,“Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,”McGraw-Hill,2005；University of the Sciences in Philadelphia(编著),“Remington:The Science andPractice of Pharmacy,”Lippincott Williams&Wilkins,2005；和University of theSciences in Philadelphia(编著),“Remington:The Principles of PharmacyPractice,”Lippincott Williams&Wilkins,2008。

药学上可接受的载体一般将是无菌的，至少对于人类使用是如此。根据施用途径，药物组合物一般将包含用于在储存中缓冲和防腐的剂，并且可以包含用于适当递送的缓冲剂和载体。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生理(0.9％)盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克氏平衡盐溶液(HBSS)和多种电解质溶液，诸如PlasmaLyte ATM(Baxter)。

可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒性的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸(phosphate)、柠檬酸(citrate)和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸和柠檬酸；防腐剂(诸如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，诸如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其他碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，诸如明胶或血清白蛋白；螯合剂，诸如EDTA；糖类诸如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，诸如Tween、Pluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。

术语“剂量(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可互换使用。剂量是指每次施用时给予个体的活性成分的量。对于本发明，剂量可以指抗体或相关组分的浓度，例如治疗剂的量或放射性标记物的剂量。剂量将根据许多因素而变化，包括施用频率、个体的尺寸和耐受性、状况的严重程度、副作用的风险、施用途径和可检测标记物(如果存在的话)的成像模式。本领域的技术人员将认识到，剂量可以根据以上因素或基于治疗进展进行修改。术语“剂型”是指药物的特定形式并取决于施用途径。例如，剂型可以是呈液体，例如，用于注射的盐水溶液。

如本文使用的，术语“受试者”是指个体动物。如本文使用的术语“患者”是指处于健康护理提供者诸如医生或护士的护理或监督下的受试者。受试者包括哺乳动物，诸如人类和非人灵长类动物，诸如猴，以及狗、猫、马、牛、兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物物种。受试者也可以包括禽类。患者可以是寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等的个体。术语“癌症受试者”是指已经被诊断为患有癌症的个体。癌症患者可以包括尚未接受治疗的个体、目前正在接受治疗的个体、已经做过手术的个体以及已经停止治疗的个体。

在治疗癌症的背景下，需要治疗的受试者可以指患有癌症或癌前状况的个体、已经患有癌症并且处于复发风险的个体、怀疑患有癌症的个体、正在经受标准癌症治疗(诸如放射疗法或化学疗法等)的个体。

“癌症”、“肿瘤”、“转化的”等术语包括癌前细胞、赘生性细胞、转化细胞和癌性细胞，并且可以指实体瘤或非实体癌(参见，例如，Edge等人AJCC Cancer Staging Manual(第7版2009)；Cibas和Ducatman Cytology:Diagnostic principles and clinicalcorrelates(第3版2009))。癌症包括良性和恶性赘生物(异常生长)两者。“转化”是指自发或诱导的表型变化，例如细胞的无限增殖化(immortalization)、形态学变化、异常细胞生长、接触抑制和锚定的减少和/或恶性肿瘤(参见，Freshney,Culture of Animal Cells aManual of Basic Technique(第3版1994))。虽然转化可以由感染转化性病毒和掺入新的基因组DNA或摄取外源DNA引起，但转化也可以自发发生或在暴露于致癌物后发生。

术语“癌症”可以指任何癌症，包括但不限于白血病、癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、实体癌和淋巴样癌等。不同类型癌症的实例包括但不限于肺癌(例如，非小细胞肺癌或NSCLC)、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、肝癌(liver cancer，即，hepatocarcinoma)、肾癌(即，肾细胞癌)、甲状腺癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、食管癌、胃(stomach，gastric)癌、肾癌、中枢神经系统癌、皮肤癌、胶质母细胞瘤和黑素瘤。

如本文使用的，如果化学实体，诸如多肽，是组合物中该种类(例如，多肽)的主要化学实体，则它是“基本上纯的”。这包括代表组合物中的该种类的化学实体的多于50％、多于80％、多于90％、多于95％、多于98％、多于99％、多于99.5％、多于99.9％或多于99.99％的化学实体。

措辞“分离的抗体”是指在体内或体外产生的已从产生抗体的来源(例如动物、杂交瘤或其他细胞系(诸如产生抗体的重组昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞))中取出的抗体。

“基本上纯的”或“分离的”意指目标物类是存在的主要物类(即，在摩尔基础上，比组合物中任何其它个别个体大分子物类更丰富)，并且基本上纯化的级分是其中目标物类构成存在的所有大分子物类的至少约50％(在摩尔基础上)的组合物。一般来说，基本上纯的组合物意味着组合物中存在的大分子物类的约80％至90％或更多是纯化的感兴趣的物类。如果组合物主要由单一大分子物类组成，则目标物类被纯化至基本的均一性(通过常规检测方法不能在组合物中检测出污染物类)。就本定义而言，溶剂物类、小分子(<500道尔顿)、稳定剂(例如，BSA)和元素离子物类不被认为是大分子物类。

如本文使用的术语“序列同一性”是指两个多肽序列或两个核酸序列之间序列同一性的百分比。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后将对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同重叠位置数目/位置总数目乘以100％)。在一种实施方案中，两个序列长度相同。两个序列之间的同一性百分比的确定也可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性的实例是以下的算法：Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268,如Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中修改的。这样的算法被并入Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST核苷酸程序参数集进行，例如评分＝100，字长＝12，以获得与本申请的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序参数集进行，例如评分＝50，字长＝3，以获得与本文描述的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的GappedBLAST。可选地，PSI-BLAST可以用于进行检测分子之间的距离关系的迭代检索(同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序的默认参数(例如，XBLAST和NBLAST的默认参数)(参见，例如NCBI网站)。用于序列比较的数学算法的另一种优选的非限制性实例是Myers和Miller,1988,CABIOS 4:11-17的算法。这样的算法被并入作为GCG序列比对软件包一部分的ALIGN程序(2.0版)中。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。两个序列之间的同一性百分比可以使用类似于以上描述的那些的允许空位或不允许空位的技术来确定。在计算同一性百分比时，通常仅对准确匹配计数。

对于抗体，当抗体序列通过IMGT最大程度地对齐时，可以确定百分比序列同一性。比对后，如果受试抗体区域(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域进行比较，则受试抗体区域和参考抗体区域之间的序列同一性百分比是受试抗体区域和参考抗体区域两者中被相同氨基酸占据的位置的数目除以两个区域的比对位置的总数，乘以100以转化成百分比。

氨基酸序列同一性百分比也可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))来确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可以从美国国家卫生研究院(National Institute of Health,Bethesda,Md.)获得。NCBI-BLAST2使用几个检索参数，其中所有这些检索参数都被设置为默认值，包括，例如，未屏蔽(unmask)＝是，链＝全部，预期出现＝10，最小低复杂度长度＝15/5，多遍e值(multi-pass e-value)＝0.01，多遍常数＝25，最终空位比对下降(dropoff)＝25和评分矩阵＝BLOSUM62。

在采用NCBI-BLAST2进行氨基酸序列比较的情况下，特定氨基酸序列A对、与或相对于特定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(也可以替代地表述为特定氨基酸序列A对、与或相对于特定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)计算如下：

100乘以分数X/Y

其中X是序列比对程序NCBI-BLAST2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应理解当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的氨基酸序列同一性％将不等于B对A的氨基酸序列同一性％。如本文使用的术语“核酸序列”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)连接组成的核苷或核苷酸单体的序列，并且包括cDNA。该术语还包括包含非天然存在的单体或其部分的修饰或取代的序列。本申请的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列也可以含有修饰的碱基。这样的修饰的碱基的实例包括氮杂和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。应理解，包含不可转录的核苷酸碱基的多核苷酸可用作例如杂交测定中的探针。核酸可以是双链或单链的，并且代表正义或反义链。此外，术语“核酸”包括互补核酸序列以及密码子优化的或同义密码子等同物。

如本文使用的术语“分离的核酸”是指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞物质或培养基的核酸，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质的核酸。分离的核酸也基本上不含核酸所源自的、天然位于核酸的侧翼的序列(即位于核酸的5'端和3'端的序列)。

“至少中等严格的杂交条件”意味着选择促进溶液中两种互补核酸分子之间选择性杂交的条件。杂交可以发生于核酸序列分子的全部或一部分。杂交部分的长度通常为至少15个(例如，20个、25个、30个、40个或50个)核苷酸。本领域技术人员将认识到，核酸双链体或杂交体的稳定性由Tm决定，在含钠缓冲液中，Tm是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/l)，或类似方程)。因此，洗涤条件中决定杂交体稳定性的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子相似但不相同的分子，可以假设1％的错配导致Tm降低约1℃，例如，如果寻找具有>95％同一性的核酸分子，最终洗涤温度将减少约5℃。基于这些考虑，本领域技术人员将能够容易地选择适当的杂交条件。在优选的实施方案中，选择严格的杂交条件。以实例的方式，可以采用以下条件来实现严格杂交：基于以上方程，在5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5×Denhardt’s溶液/1.0％SDS于Tm -5℃杂交，然后在60℃0.2×SSC/0.1％SDS洗涤。中等严格杂交条件包括在42℃以3×SSC的洗涤步骤。然而，应理解，可以使用替代的缓冲液、盐和温度来实现等同的严格性。关于杂交条件的其他指导可以在以下中找到：Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.,2002,和Sambrook等人,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,2001。

如本文使用且本领域熟知的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指用于获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益或期望的临床结果可以包括但不限于减轻或改善一种或更多种症状或状况、减少疾病的程度、使疾病状态稳定(即不恶化)、预防疾病传播、延缓或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态、减少疾病复发以及缓解(无论是部分或全部)，无论是可检测的还是检测不到的。“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还可指与如果不接受治疗预期的存活相比延长的存活。如本文使用的“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”也包括预防性治疗。例如，患有癌症的受试者可以用本文描述的抗体、免疫缀合物、核酸或组合物治疗以预防进展。

如本文使用的，术语“施用”意指通过有效途径(诸如瘤内或静脉内施用途径)向受试者提供或给予剂，诸如包含有效量的抗体的组合物。

如本文使用的，术语“稀释剂”是指药学上可接受的载体，其不抑制待施用的活性化合物(诸如抗体或免疫缀合物)的生理活性或特性，并且不刺激受试者，并且不消除所施用的化合物的生物活性和特性。稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐性盐、防腐剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、类似材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Science,第18版.MackPrinting Company,1990,第1289-1329页,通过引用并入本文)。任何常规的载体除非与活性成分不相容，否则预期其在药物组合物中的使用。

“包含”或“包括”一个或更多个列举的要素的组合物或方法可以包括未具体列举的其他要素。例如，“包含”或“包括”抗体的组合物可以含有单独的抗体或与其他成分组合的抗体。

在理解本公开内容的范围时，如本文使用的术语“由...组成”及其衍生形式意图是封闭的术语，其指定所陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在，并且还排除其他未陈述的特征、要素、组分、组、整数和/或步骤的存在。

本文中通过端点阐述的数值范围包括归入该范围内的所有数字和分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解，所有数字及其分数都被假定为是由术语“约”修饰的。此外，应理解冠词的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“抗体”或“至少一种抗体”可以包括多于一种抗体，包括其混合物。

根据上下文，术语“卷曲受体(Frizzled)”和“FZD”是指卷曲受体家族的任何基因或蛋白成员。卷曲受体蛋白参与胞质溶胶中散乱蛋白的活化。卷曲受体是指卷曲受体-1、卷曲受体-2、卷曲受体-3、卷曲受体-4、卷曲受体-5、卷曲受体-6、卷曲受体-7、卷曲受体-8、卷曲受体-9和卷曲受体-10中的任一种。卷曲受体4(“FZD4”)(也称为CD344、EVR1、FEVR、FZD4S、Fz-4、Fz4、FzE4、GPCR、hFz4和卷曲类受体4)，是卷曲受体基因家族蛋白的成员。该基因具有ENTREZ基因ID：8322。该蛋白具有NCBI参考序列：NP_036325.2。

“脂蛋白受体相关蛋白”、“低密度脂蛋白受体相关蛋白”(HGNC)或“前低密度脂蛋白受体相关蛋白”(UniProt)，缩写为“LRP”，是一组基因和蛋白。它们包括：LRP1、LRP1B、LRP2(巨蛋白(megalin))、LRP3、LRP4、LRP5、LRP6、LRP8(载脂蛋白e受体)、LRP10、LRP11和LRP12。LRP5和LRP6是参与典型Wnt途径的LRP5/LRP6/卷曲受体共受体组的部分。LRP5也称为LRP5、BMND1、EVR1、EVR4、HBM、LR3、LRP-5、LRP7、OPPG、OPS、OPTA1、VBCH2和LDL受体相关蛋白5。LRP5基因具有ENTREZ基因ID：4041，并且该蛋白具有NCBI参考序列：NP_002326。LRP6基因具有ENTREZ基因ID：4040，并且该蛋白具有NCBI参考序列：NP_002327。LRP6也称为ADCAD2、STHAG7。

II.与FRZ信号传导失调相关的紊乱

Wnt与FZD的结合使β-联蛋白结合复合物去稳定化，导致β-联蛋白降解。效果是细胞内β-联蛋白水平增加。因此，本文提供了阻断Wnt与卷曲受体蛋白(特别是与FZD4，但也与卷曲受体家族的其他成员，诸如FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9)结合的方法。

“FZD相关紊乱”(例如，“FZD4相关紊乱”或“FZD5相关紊乱”)是指与提及的特定FZD受体的失调相关的状况或疾病。失调是指增加由这些受体控制的正常的β-联蛋白介导的转录变化或任何其他细胞内信号传导途径的异常信号传导。

不同卷曲受体与不同癌症相关。更具体地，FZD1与神经母细胞瘤相关。FZD2与肝癌、肺癌、子宫内膜癌和唾液腺样囊性癌相关。FZD3与结肠直肠癌相关。FZD4与急性髓性白血病、前列腺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌和宫颈癌相关。FZD5与胰腺癌、结肠癌和前列腺癌相关。FZD6与结肠直肠癌和乳腺癌相关。FZD7与食管癌、胶质瘤、乳腺癌、胃癌和结肠直肠癌相关。FZD8与前列腺癌、乳腺癌和肺癌相关。FZD9与星形细胞瘤和骨肉瘤相关。FZD10与结肠直肠癌和滑膜肉瘤相关。

III.抗FZD4抗体

A.抗体

本文描述了针对卷曲受体(FZD)的抗体，包括结合多于一种FZD的抗体和优先结合FZD4的其他抗体。这些抗体与卷曲受体结合，阻断配体WNT结合并调节卷曲受体信号传导。这些抗体还显示出抗增殖性效果，具有治疗其中卷曲受体失调的癌症和其他疾病的潜力。

相应地，本公开内容的一方面包括分离的抗体，该分离的抗体特异性结合卷曲受体(FZD)富含半胱氨酸的结构域(CRD)，该分离的抗体包含轻链可变区和重链可变区，重链可变区包含互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区包含互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且所述CDR的氨基酸序列包含选自表1a或表3a中的序列的序列，主要由选自表1a或表3a中的序列的序列组成，或者由选自表1a或表3a中的序列的序列组成。

在实施方案中，抗体包含选自表1a中的CDR序列集(即，克隆5016至5037和6498至6500)的CDR序列集。

表1a–FZD4抗体的CDR氨基酸序列

表1b–FZD4抗体的CDR核酸序列

表1c–FZD4抗体的CDR核酸序列

本文还描述了重链可变区和轻链可变区。表2提供了来自克隆5017的Fab重链和轻链的示例性可变结构域序列。还设想了包含表2中的序列或与其基本相同的序列的抗体，其中CDR是表1a或表3a中鉴定的CDR序列集。在另一种实施方案中，抗体包含重链可变区，该重链可变区包含：i)如表2中列出的重链氨基酸序列；ii)与如表2中列出的重链氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或iii)i)的保守取代的氨基酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集。

在另一种实施方案中，抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含i)如表2中列出的轻链氨基酸序列，ii)与如表2中列出的轻链氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或iii)i)的保守取代的氨基酸序列，其中CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集。

表2–FZD4抗体5017的全长序列的实例

在另一种实施方案中，抗体包含选自表3a中的CDR序列集(即，克隆5038至5081)的CDR序列集。

表3a–FZD4抗体的CDR氨基酸序列

表3b-FZD4抗体的CDR轻链核酸序列

表3b-FZD4抗体的CDR核酸序列

在一些实施方案中，可变结构域序列在CDR区之外至少95％、96％、97％、98％或99％相似，并且CDR序列集与表1a或表3a中提供的氨基酸序列100％相同。

表3c-FZD4抗体的CDR重链核酸序列

表3c-FZD4抗体的CDR核酸序列

在另一种实施方案中还提供了竞争抗体，其与包含本文描述的CDR序列集的抗体竞争结合。例如，在一种实施方案中，竞争抗体使包含CDR序列集的抗体与FZD4 CDR的结合减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。

所描述的一些抗体能够结合多于一种FZD。相应地，在一些实施方案中，抗体是特异性结合FZD4并另外特异性结合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9中的一种或更多种的抗体。例如，抗体可以是其中CDR序列是选自抗体5016、5018-5023、5025、6495、6496、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076的抗体的CDR序列集的抗体。

所描述的一些抗体优先结合FZD4。在实施方案中，抗体是与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10中的任一种相比，优先结合卷曲受体4(FZD4)的抗体。在实施方案中，与FZD1、FZD5、FZD7和FZD9相比，抗体优先结合FZD 4。在一方面，抗体包含抗体6497的CDR序列集。在另一种实施方案中，与FZD1和FZD7相比，抗体优先结合FZD4。在一方面，抗体包含选自5028、5035、5039、5073的抗体的CDR序列集。在又另一种实施方案中，与FZD9相比，抗体优先结合FZD4。在一方面，抗体包含抗体5029的CDR序列集。在又另一种实施方案中，与FZD1、FZD2和FZD7相比，抗体优先结合FZD4。在一方面，抗体包含选自5031、6498、5054或5075的抗体的CDR序列集。在又另一种实施方案中，与FZD1、FZD2、FZD5和FZD7相比，抗体优先结合FZD4。在一方面，抗体包含抗体5034的CDR序列集。在又另一种实施方案中，与FZD1相比，抗体优先结合FZD4。在一方面，抗体包含抗体5045或5048的CDR序列集。在又另一种实施方案中，与FZD1、FZD7和FZD9相比，抗体优先结合FZD4。在一方面，抗体包含抗体5056的CDR序列集。在又另一种实施方案中，与FZD9和FZD10相比，抗体优先结合FZD4。在一方面，抗体包含抗体5057的CDR序列集。在又另一种实施方案中，与FZD1和FZD2相比，抗体优先结合FZD4。在一方面，抗体包含抗体5067的CDR序列集。

与FZD4相比，某些抗体，诸如具有来自抗体5018、5019、5022、6494和5025的CDR集的抗体，优先结合其他FZD蛋白。(参见，例如，图5)。

在另一种实施方案中，抗体包含选自抗体5022、5031、6497、6498和6500的抗体的CDR序列集的CDR序列。

如本文展示的，本文描述的抗体对FZD4具有高亲和力。例如，在一种实施方案中，抗体具有通过表面等离子体共振测量的约0.2nM和约15.3nM之间的结合亲和力。

抗体可以是如本文描述的人源化抗体或嵌合抗体。

在一些实施方案中，抗体是单链抗体，其可以例如通过将重链和轻链或其部分融合在一起而获得。

在一些实施方案中，抗体是选自以下的抗体结合片段：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv，其二聚体、纳米抗体、微型抗体、双抗体及多聚体。

在一些其他的实施方案中，抗体是结合片段Fab。对于一些实施方案，结合片段是优选的。

在其他实施方案中，可以优选具有多价抗体或包含Ig部分的抗体。

如实施例中展示的，本公开内容的Fab片段可以与免疫球蛋白(Ig)恒定区诸如IgG组合。在实施方案中，IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

B.可检测地标记的抗体

可检测的标记物可以包括肽序列(诸如myc标签、HA-标签、V5-标签或NE-标签)、荧光蛋白或发光蛋白(例如绿色荧光蛋白或萤光素酶)，它们可以附加到或引入到本文描述的抗体中，并且它们能够直接或间接产生可检测的信号。例如，标记物可以是辐射不透明的(radio-opaque)、发射正电子的放射性核素(例如，用于PET成像)，或放射性同位素，诸如³H、¹³N、¹⁴C、¹⁸F、³²P、³⁵S、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。

C.抗体-药物缀合物

另一方面包括包含本文描述的抗体和可检测的标记物或细胞毒性剂的免疫缀合物。

化学治疗(抗癌)剂可以是能够减少癌症生长、干扰癌细胞复制、直接或间接杀伤癌细胞、减少转移、减少肿瘤血液供应等的任何剂。化学治疗剂因此包括细胞毒性剂。细胞毒性剂包括但不限于皂草素、紫杉烷、长春花生物碱、蒽环类和基于铂的剂。化学治疗剂的类别包括但不限于烷化剂、抗代谢物(例如，氨甲蝶呤)、植物生物碱(例如，长春新碱)和抗肿瘤抗生素诸如蒽环类(例如，多柔比星)以及不属于特定类别的各种药物，诸如羟基脲。以顺铂和奥沙利铂例示的基于铂的药物代表一类重要的化学治疗剂。这些药物与DNA结合并干扰复制。以紫杉醇例示的紫杉烷代表另一类重要的化学治疗剂。这些化合物通过干扰细胞骨架和纺锤体的形成起作用来抑制细胞分裂，并从而阻止快速分裂的癌细胞的生长。其他化学治疗药物包括激素疗法。化学治疗剂还包括抑制微管蛋白组装或聚合的剂，诸如美登素、mertansine和澳瑞他汀。化学治疗剂还包括DNA损伤剂，诸如卡奇霉素(calicheamicin)。

化学治疗剂可以包括美登素生物碱、澳瑞他汀、多拉司他汀、tubulysin、念珠藻素、吡咯并苯二氮卓类(PBD)二聚体、吲哚并苯二氮卓类二聚体、α-鹅膏蕈碱、trichothene、SN-38、倍癌霉素、CC1065、卡奇霉素、烯二炔抗生素、紫杉烷、多柔比星衍生物、蒽环类和它们的立体异构体、azanofide、电子等排体、类似物或衍生物。

IV.核酸

其他方面包括如本文描述的核酸分子或多核苷酸、重组核酸分子、表达构建体和载体。

A.核酸分子

另一方面包括如表1b、表1c、表3b和表3c中列出的核酸分子以及例如在严格的杂交条件下与所述序列之一杂交的多核苷酸。CDR和可变结构域核酸序列可用于例如制备表达构建体。

B.表达构建体和载体

核酸分子可以以已知的方式掺入确保蛋白表达的适当的表达构建体或表达载体中。表达构建体可以包含表达控制序列，例如启动子，其与包含编码本公开内容的抗体的核苷酸序列的多核苷酸可操作地连接。可能的表达载体包括但不限于黏粒、质粒或修饰的病毒(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。载体应当与所用的宿主细胞相容。表达载体“适于转化宿主细胞”，这意味着表达载体含有编码对应于本文描述的表位或抗体的肽的核酸分子。

在实施方案中，载体适于通过基因疗法表达例如单链抗体。在实施方案中，载体包含IRES并允许表达轻链可变区和重链可变区。这样的载体可用于在体内递送抗体。

合适的调节序列可以源自各种来源，包括细菌基因、真菌基因、病毒基因、哺乳动物基因或昆虫基因。

这样的调节序列的实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。此外，根据所选择的宿主细胞和采用的表达载体，其他序列(诸如复制起点、另外的DNA限制性位点、增强子和赋予转录诱导性的序列)可被掺入表达载体中。

在实施方案中，调节序列指导或增加神经组织和/或细胞中的表达。

载体可以是任何载体，包括适于产生本文描述的抗体的载体。

在实施方案中，载体是病毒载体。

重组表达载体还可以含有标志物基因，标志物基因有助于选择用表达本文描述的抗体或表位肽的载体转化、感染或转染的宿主细胞。

重组表达载体还可以含有编码融合部分(即“融合蛋白”)的表达盒，其提供重组肽的增加的表达或稳定性；重组肽的增加的溶解度；并且通过在亲和纯化中充当配体(包括例如本文描述的标签和标记物)来帮助靶重组肽的纯化。此外，可以将蛋白水解裂解位点添加到靶重组蛋白，以允许在纯化融合蛋白后将重组蛋白与融合部分分离。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.,Melbourne,Australia)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到重组蛋白。

用于在体外和体内转移基因的系统包括基于病毒的载体，最值得注意的是单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒包括慢病毒。基因递送的可选的方法包括使用裸质粒DNA以及脂质体-DNA复合物。

在一方面，本公开内容包括用于制备本文描述的抗体的方法，该方法包括合成包含本文描述的抗体框架和CDR序列集的核酸分子。

V.重组细胞

另一方面是表达本文描述的抗体的重组宿主细胞。

如本文描述的抗体可以通过编码抗体序列的核酸的重组表达来制备。

如本文公开的抗体可以通过培养被工程化以表达编码免疫球蛋白多肽的核酸构建体的细胞来制备。

重组宿主细胞可以使用适于产生多肽(例如，适于产生抗体)的任何细胞产生。例如，为了将核酸(例如，载体)引入细胞中，细胞可以被转染、转化或感染，取决于所采用的载体。

合适的宿主细胞包括各种各样的原核和真核宿主细胞。例如，本文描述的蛋白可以在细菌细胞(诸如大肠杆菌，E.coli)、昆虫细胞(使用杆状病毒)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。

在实施方案中，细胞是选自酵母、植物、蠕虫、昆虫、禽类、鱼类、爬行动物和哺乳动物细胞的真核细胞。

在另一种实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、骨髓瘤细胞、脾细胞或杂交瘤细胞。

适于表达抗体的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母(S.cerivisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)以及曲霉属(Aspergillus)的各物种。用于在酵母酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSec1、pMFa、pJRY88和pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)。用于转化酵母和真菌的方案是本领域普通技术人员熟知的。

可能合适的哺乳动物细胞包括，尤其是：COS(例如，ATCC No.CRL1650或1651)、BHK(例如，ATCC No.CRL 6281)、CHO(ATCC No.CCL 61)、HeLa(例如，ATCC No.CCL 2)、293(ATCCNo.1573)和NS-1细胞。用于在哺乳动物细胞中指导表达的合适的表达载体一般包含启动子(例如，源自病毒材料，诸如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40)以及其他转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8和pMT2PC。

VI.药物组合物

另一方面是组合物，其包含本文描述的抗体、免疫缀合物、核酸分子、载体或重组细胞，以及任选地合适的稀释剂，例如药学上可接受的载体。

组合物可以例如包含一种或更多种抗体或免疫缀合物。

用于多肽(包括抗体和/或细胞)的合适的稀释剂包括但不限于盐水溶液、pH缓冲溶液和甘油溶液或适用于冷冻多肽和/或细胞的其他溶液。

用于核酸的合适的稀释剂包括但不限于水、盐水溶液和乙醇。

在实施方案中，组合物是药物组合物，其包含本文公开的抗体、核酸或载体中的任一种，并且任选包含药学上可接受的媒介物，诸如稀释剂或载体。

本文描述的组合物可以通过本身已知的方法来制备，该方法用于制备可以施用至受试者的药学上可接受的组合物，使得有效量的活性物质与药学上可接受的媒介物以混合物的形式组合。

药物组合物包括但不限于冻干粉末或水性或非水性无菌可注射溶液或悬浮液，其可以还含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与预期接受者的组织或血液基本上相容的溶质。可以存在于这样的组合物中的其它组分包括水、表面活性剂(诸如Tween)、醇、多元醇、甘油和植物油。即时注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒和片剂或浓缩溶液或悬浮液制备。组合物可以，例如但不以限制的方式，以冻干粉末提供，其在向患者施用之前用无菌水或盐水重构。

药物组合物可以包含药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体包括基本上化学惰性且无毒性的组合物，其不干扰药物组合物的生物活性的有效性。合适的药物载体的实例包括但不限于水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2,3-二油氧基)丙基)N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和脂质体。这样的组合物应含有治疗有效量的化合物以及合适的量的载体，以便提供用于直接施用至患者的形式。

组合物可以是以药学上可接受的盐的形式，包括但不限于那些与游离氨基基团形成的那些盐，诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，和与游离羧基基团形成的那些盐，诸如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基乙醇胺的那些盐。

在实施方案中，组合物包含本文描述的抗体。在另一种实施方案中，组合物包含本文描述的抗体和稀释剂。在实施方案中，组合物是无菌组合物。

另一方面包括抗体复合物，其包含本文描述的与FZD蛋白(例如FZD4)结合的抗体。复合物可以在溶液中或包含在组织中，任选地在体外。

还提供了用于制备和使用本文描述的试剂的方法。

VII.施用和使用方法

本发明的抗FZD抗体可以有效地将治疗组合物体内递送至经历Wnt信号传导的细胞。在一些实施方案中，治疗或使用的方法包括向个体施用或使用有效量的治疗性抗FZD缀合物，例如附接于治疗剂的抗FZD抗体。在一些实施方案中，个体已被诊断为患有癌症。在一些实施方案中，个体正在接受或已经接受癌症治疗，例如手术、放射疗法或化学疗法。在一些实施方案中，个体已经被诊断但癌症正在缓解。

在一些实施方案中，抗FZD缀合物包括脂质体。在一些实施方案中，该方法还包括监测个体的癌症进展。在一些实施方案中，每次施用的抗FZD缀合物的剂量基于个体的治疗进展来确定，例如，如果个体对治疗没有足够的响应，则施用更高剂量的化学治疗剂。

在一些实施方案中，本发明可以包括抗体或抗体靶向组合物和生理上(即，药学上)可接受的载体。术语“载体”是指用作诊断剂或治疗剂的稀释剂或媒介物的通常惰性的物质。该术语还包括赋予组合物粘聚性(cohesive quality)的通常惰性的物质。生理上可接受的载体可以是液体，例如生理盐水、磷酸盐缓冲液、生理缓冲盐水(135-150mM NaCl)、水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、提供增强的稳定性的糖蛋白(例如，白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)，等等。由于生理上可接受的载体部分地由施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法决定，因此存在本发明的药物组合物的多种多样的合适的制剂(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,1989)。

本发明的组合物可以通过常规的、熟知的灭菌技术灭菌，或者可以在无菌条件下产生。水性溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在施用前与无菌水性溶液组合。组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸失水山梨醇酯和三乙醇胺油酸酯。糖也可以被包括在内用于稳定组合物，诸如冻干抗体组合物的稳定剂。

剂型可以被制备用于向患者粘膜施用(例如，鼻、舌下、阴道、含服或直肠)、肠胃外施用(例如，皮下、静脉内、肌肉内或动脉内注射、团注或输注)、口服或透皮施用。剂型的实例包括但不限于：分散体、栓剂、软膏剂、泥敷剂(cataplasm，poultice)、糊剂、粉末、敷料、乳膏、硬膏剂(plaster)、溶液、贴剂、气雾剂(例如，鼻喷雾剂或吸入剂)、凝胶；适于向患者口服或粘膜施用的液体剂型，包括混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适于向患者肠胃外施用的液体剂型；和无菌固体(例如，结晶或无定形固体)，其可以被重构以提供适于向患者肠胃外施用的液体剂型。

可注射的(例如静脉内)组合物可以包含悬浮在可接受的载体(诸如水性载体)中的抗体或抗体靶向组合物的溶液。可以使用各种水性载体中的任一种，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.9％等渗盐水、0.3％甘氨酸、5％右旋糖等，并且可以包含用于增强稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常，将使用生理缓冲盐水(135-150mM NaCl)。组合物可以含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸失水山梨醇酯、三乙醇胺油酸酯等。在一些实施方案中，抗体靶向组合物可以配制在用于静脉施用的试剂盒中。

适于肠胃外施用(诸如，例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、肿瘤内、皮内、腹膜内和皮下途径)的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射溶液和悬浮液也可以从无菌粉末、颗粒和片剂来制备。在本发明的实践中，组合物可以例如通过静脉内输注、表面(topically)、腹膜内、膀胱内或鞘内施用。肠胃外施用和静脉内施用是优选的施用方法。靶向的组合物的制剂可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。

选择的靶向递送组合物单独地或与其他合适组分组合地可以制成经由吸入施用的气雾剂制剂(“雾化”)。气雾剂制剂可以放置于加压的可接受的喷射剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷和氮气。

药物制剂可以以单位剂型包装或制备。在这样的形式中，制剂被细分为含有适当量的活性组分的单位剂量，例如根据治疗剂的剂量或抗体的浓度。单位剂型可以是包装的制剂，包装含有离散量的制剂。如果需要，则组合物还可以含有其他相容的治疗剂。

抗体(或抗体靶向组合物)可以通过任何合适的途径(包括但不限于静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内途径)通过注射或输注施用或使用。药物组合物施用的实例包括将抗体以10mg/ml在用于注射的无菌等渗水性盐水溶液中储存于4℃，并在向患者施用前将其稀释在100ml或200ml的0.9％氯化钠中以用于注射。抗体以0.2mg/kg和10mg/kg之间的剂量通过静脉输注在1小时的过程中施用。在其他实施方案中，抗体通过静脉输注在15分钟和2小时之间的时间段内施用。在仍其他的实施方案中，施用程序是经由皮下团注。

选择抗体的剂量以便为患者提供有效的治疗，并且抗体的剂量在少于0.1mg/kg体重至约25mg/kg体重的范围内，或者在每个患者1mg-2g的范围内。在一些情况下，剂量在1-100mg/kg或约50mg-8000mg/患者的范围内。根据抗体的药代动力学(例如，抗体在循环中的半衰期)和药效学响应(例如，抗体治疗效果的持续时间)，可以以适当的频率重复剂量，该频率可以在每日一次至每三个月一次的范围内。在一些实施方案中，体内半衰期在约7天和约25天之间，并且抗体给药在每周一次和每三个月一次之间重复。

施用或使用可以是周期性的。根据施用途径，剂量可以例如每1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天或28天或更长时间一次(例如，每2个、3个、4个或6个月一次)施用。在一些情况下，施用更频繁，例如每日2或3次。如本领域技术人员将认识到的，可以根据治疗进展和任何不良副作用来监测患者以调整施用的剂量和频率。

因此，在一些实施方案中，另外的施用取决于患者的进展，例如在施用之间监测患者。例如，在第一次施用或一轮施用后，可以监测患者的肿瘤生长速率、复发(例如，在手术后患者的情况下)或一般疾病相关症状，诸如虚弱、疼痛、恶心等。

在用于治疗癌症的治疗用途中，抗体靶向组合物(例如，包括治疗剂和/或诊断剂)可以以每日约0.001mg/kg至约1000mg/kg的初始剂量施用，并随时间调整。可以使用约0.01mg/kg至约500mg/kg、或约0.1mg/kg至约200mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。剂量根据患者的需要、所治疗状况的严重程度和所采用的靶向组合物而变化。例如，剂量可以考虑在特定患者中诊断的癌症的类型和阶段根据经验确定。在本发明的情况下，向患者施用的剂量应足以随时间推移实现患者的有益治疗响应。如熟练从业者将认识到的，剂量的大小也将由特定患者中伴随特定靶向组合物施用的任何不良副作用的存在、性质和程度确定。

VIII.试剂盒

另一方面是试剂盒或包装，其包含本文包含的任何抗体、免疫缀合物、核酸分子、载体、重组细胞和/或组合物。抗体、免疫缀合物、核酸分子、载体、重组细胞和/或组合物可以包含在小瓶诸如无菌小瓶或其他壳体中。如本文使用的，术语“试剂盒”是指意图一起使用的物品的集合。试剂盒可以任选地包括参考剂和/或其使用说明书。试剂盒还可以包括适于容纳含有如本文公开的组合物的容器(诸如小瓶)的运输容器。

IX.使用抗体的方法

本文描述的抗体可用于许多体外和体内方法。

A.检测FZD表达的方法

如本文展示的，抗体可用于检测FZD表达。

相应地，本公开内容在一方面提供了检测FZD表达的方法，该方法包括在允许形成抗体:FZD复合物的条件下，使包含一个或更多个细胞的样品与本文描述的一种或更多种抗体或免疫缀合物接触，并检测任何抗体复合物的存在。通常，抗体是免疫缀合物的一部分，免疫缀合物包含与可检测的标记物偶联的抗体。

样品可以包含存活细胞或细胞提取物。抗体:FZD复合物可以通过免疫测定检测，诸如免疫荧光、流式细胞术、蛋白印迹、ELISA、SPR、和免疫沉淀然后进行SDS-PAGE、免疫细胞化学。在一些实施方案中，检测是通过免疫荧光。在一些实施方案中，检测是通过流式细胞术。

如本文展示的，一些鉴定的抗体优先识别FZD4。因此，在其中该方法用于检测FZD4表达的实施方案中，抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081。

B.抑制WNT与FZD结合的方法

本文公开的抗体抑制Wnt与卷曲受体特别是与FZD4的结合。不希望受理论限制，对Wnt与FZD蛋白结合的抑制影响其中FZD在启动中起作用的信号转导。例如，抗体与FZD受体的结合抑制FZD对β-联蛋白磷酸化的促进。未被磷酸化的β-联蛋白将在细胞中逃避破坏并积累。β-联蛋白的积累与恶性肿瘤相关。

通过FZD减少或抑制Wnt配体信号传导可能是合意的。因此，另一方面是抑制Wnt配体与FZD的结合或Wnt诱导的转录活性的方法，该方法包括使表达一种或更多种FZD多肽的一种或更多种细胞与有效量的本文描述的抗体或免疫缀合物接触。

在实施方案中，抗体或免疫缀合物包含对应于选自如本文描述的克隆(例如5014、5017-5023、5027-5031、5034、5036、5037、6496、6498、6499和6500、5035、6495和5025)的抗体的CDR序列集(全部、轻链或重链)。

在实施方案中，抗体或免疫缀合物包含对应于选自如本文描述的克隆(例如5014、5018-5023、5025、5036、5037、6495、5027-5031和6497-6499)的抗体的CDR序列集(全部、轻链或重链)。

接触可以例如通过向受试者施用抗体或免疫缀合物在体内完成。这样的抑制可能是合意的，特别是当如在癌细胞中wnt信号传导失调时。

C.治疗癌症的方法

治疗癌症的方法包括向有相应需要的受试者施用包含与FZD结合的本公开内容的抗体的药物组合物。其中的受试者可以是罹患癌症或有癌症风险(诸如癌症复发)的受试者，例如，人。

不希望受理论限制，这样的治疗可以通过抑制典型Wnt途径的活化来发挥作用，例如，通过抑制Wnt与FZD的结合，通过抑制Wnt诱导的转录活性，通过抑制散乱蛋白的活化，通过抑制对β-联蛋白破坏复合物的抑制和通过促进β-联蛋白的积累。

本公开内容在另一方面包括用于治疗癌症的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的抗体或免疫缀合物，该抗体或免疫缀合物在至少一种测定中特异性结合FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9，并在至少一种测定中抑制Wnt诱导的信号传导。本公开内容还包括有效量的抗体或免疫缀合物用于治疗癌症，该抗体或免疫缀合物在至少一种测定中特异性结合FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9，并在至少一种测定中抑制Wnt诱导的信号传导。本公开内容还提供了有效量的抗体或免疫缀合物用于治疗癌症的用途，该抗体或免疫缀合物在至少一种测定中特异性结合FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9，并在至少一种测定中抑制Wnt诱导的信号传导。本公开内容还提供了有效量的抗体或免疫缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，该抗体或免疫缀合物在至少一种测定中特异性结合FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9，并在至少一种测定中抑制Wnt诱导的信号传导。

在实施方案中，抗体或免疫缀合物，例如抗体-药物缀合物，包含在药物组合物中。

在一种实施方案中，癌症选自结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肾上腺皮质癌和成骨细胞瘤癌症，任选地癌症是胰腺癌。在实施方案中，抗体或免疫缀合物包含对应于选自5014、5017-5023、5025、5035-5037、6495和6500的抗体的CDR序列集(全部、轻链或重链)。

如本文展示的，抗体还能够抑制癌细胞增殖。因此，还提供了抑制癌细胞增殖的方法，该方法包括使一种或更多种表达FZD的癌细胞与有效量的抗体或免疫缀合物接触，该抗体或免疫缀合物在至少一种测定中特异性结合FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9，并在至少一种测定中抑制Wnt3a诱导的信号传导。

在实施方案中，抗体或免疫缀合物是本文描述的抗体或免疫缀合物，例如，包含对应于选自5014、5017-5023、5025、5035-5037、6495和6500的抗体的CDR序列集(全部、轻链或重链)的抗体或免疫缀合物。

在实施方案中，抗体包含如本文描述的可变区序列，对应于选自5014、5017-5023、5025、5035-5037、6495和6500的抗体的CDR序列集(全部、轻链或重链)。

在一种实施方案中，癌症选自急性髓性白血病、前列腺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌和宫颈癌。

在另一种实施方案中，癌细胞选自结肠癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、肾上腺皮质癌癌细胞和成骨细胞瘤癌细胞。

在另一种实施方案中，癌细胞是胰腺癌细胞。在实施方案中，抗体或免疫缀合物包含对应于选自5019和5020的抗体的CDR序列集(全部、轻链或重链)。

还展示了抗体5020对于治疗RNF43突变的癌症是有效的。因此，在一种实施方案中，癌细胞已知或已确定包含RNF43基因突变，并且使用的抗体或免疫缀合物包含对应于抗体5020的一组CDR。

在实施方案中，该方法包括确定受试者的癌症与Wnt信号传导失调相关；任选地确定失调的特定Wnt蛋白；任选地确定待靶向的FZD蛋白家族成员；以及向受试者施用抗FZD抗体以阻断选定的一种或更多种Wnt与选定的一种或更多种FZD受体的结合。

以上公开内容总体上描述了本公开内容。通过参考以下特定实施例可以获得更完全的理解。这些实施例仅为了说明的目的而被描述，并不意图限制本申请的范围。当情况可能提示或提供方便时，还设想了形式的变化和等同物的替换。虽然在本文中已经采用了特定术语，但是这样的术语意图是描述性意义，而不是为了限制的目的。

实施例

实施例1

抗体选择和FZD4 FAB的功能测试

抗体选择：进行两种选择方法来鉴定FZD4结合物。

1.选择是使用基于先前的FZD7来源的结合物设计的文库完成的。先前已经通过使用FZD7 CRD-Fc作为抗原进行的选择鉴定了抗体。这些抗体与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9结合，并显示出针对Wnt途径的拮抗活性和抑制胰腺癌细胞的增殖和肿瘤生长。该文库用于鉴定能与FZD4结合并具有wnt拮抗活性和抗肿瘤活性的抗体。

a).Fab噬菌体展示文库设计和制备。

Fab噬菌体展示文库设计和制备是用编码识别MBP的Fab的IPTG诱导型展示载体完成的。Fab模板与文库F相同，并包括加FLAG标签的轻链，并且突变为亲本Fab序列H1、H2和H3的二聚化结构域L1、L2、L3被软随机化(soft randomized)，以允许50％偏向野生型氨基酸和50％偏向任何其他氨基酸(使用70:10:10:10核苷酸混合)。所有六个CDR区都在单个kunkel诱变反应中突变。基于Fab拮抗剂组构建第二代文库。使用编码对麦芽糖结合蛋白特异性的Fab的IPTG诱导型展示载体作为文库模板。使用轻链寡核苷酸进行位点特异性kunkel诱变反应，以将CDR L1、L2和L3突变为亲本Fab序列并使CDR H1、H2和H3软随机化(50％野生型和50％任何其他氨基酸)。纯化的诱变反应物被电穿孔到预感染了M13 K07的SR320细胞中。将文库在500ml培养物中挽救(rescue)过夜，用PEG/NaCl双重沉淀，并重悬于含有50％甘油的PBS中，以储存于-20℃。

b).抗FZD4 Fab的选择和产生

汇集第二代文库(等cfu)并针对与Fc标签融合的重组FZD4富含半胱氨酸结构域(CRD)(R&D systems)进行四轮筛选。计算羧苄青霉素(carb)抗性文库噬菌体和卡那霉素(kan)抗性辅助噬菌体的输入和输出噬菌体滴度。在4度用PBS中的5μg/ml的FZD4-CRD-Fc或Fc蛋白包被Maxisorp板过夜并指定孔的编号，并用0.5％BSA封闭。包被的孔用PBS/0.5％Tween 20(洗涤缓冲液)洗涤四次，并将文库噬菌体(PEG沉淀并重悬于0.5％BSA/0.05％Tween20/PBS中)首先在Fc蛋白孔中室温孵育1hr。将未结合的噬菌体转移到封闭的FZD4-CRD-Fc板，并室温孵育1小时。如所示的洗涤孔，并且然后用100mM HCl洗脱。洗脱的噬菌体在实验室中使用标准方案进行扩增，用于随后的数轮选择。指定文库噬菌体(carb抗性)和辅助噬菌体(kan抗性)的输入和输出滴度。将来自FZD4选集的输出噬菌体库的位点特异性kunkel诱变反应(被设计为在噬菌体基因III和Fab CH1区之间添加His6-琥珀终止)的DNA转化到Omnimax细胞中，并铺板以获得单菌落。单菌落用于接种96孔培养盒，并将过夜噬菌体上清液以1:2稀释于0.05％Tween20/0.5％BSA/PBS(稀释缓冲液)中，以测试ELISA结合。用抗M13-HRP二抗(1:5000于稀释缓冲液中)检测噬菌体，并将板用TMB底物和酸终止显色。读取FZD4-Fc包被孔和对照Fc包被孔在450nm处的吸光度，如所示的。对重链和轻链进行测序，以确定个体Fab的CDR序列。还对CH1-基因III接头进行测序，以确定用于Fab表达的His标签和琥珀终止密码子的成功掺入。将噬菌体结合物克隆到细菌表达载体中，并作为Fab蛋白进行纯化以用于表征。

c).抗FZD4结合物的表征。

这里描述的抗体的CDR序列在表1中示出。首先，在ELISA测定中测试噬菌体结合物，以确认它们与抗原的结合。如图1中示出的，所有噬菌体克隆都与FZD4 CRD-Fc结合，但不与单独的Fc蛋白结合，表明这些噬菌体结合物与FZD4 CRD而不与Fc结合。其次，在竞争性ELISA测定中，在存在增量的非固定化抗原的情况下测试纯化的Fab，以评估它们的结合亲和力(图2)。在存在50nM竞争性游离抗原(FZD4 CRD)的情况下，所有Fab的结合减少多于50％。5种Fab(5022、5031、6497、6498和6500)的结合在存在10nM竞争抗原(FZD4 CRD)的情况下减少多于50％，表明这5种Fab可能比其余Fab具有更高的结合亲和力。应当注意在本测定中没有观察到Fab 5025和Fab 6494的结合。其原因不明，但可能是由于物理干扰。接下来，通过免疫荧光染色测试Fab与细胞表面上表达的FZD4的结合。在稳定表达FZD4的CHO细胞上观察到所有FZD4 Fab的膜染色模式(图3)，但在CHO细胞上没有(图4)。IF染色也用于确定这些Fab是否与其他FZD结合。在表面稳定表达个体FZD的10种CHO细胞系上测试了结合。如图5中示出的，Fab显示出不同的结合谱。Fab 5017、Fab 5027、Fab 5030和Fab 6499仅与表达FZD4的CHO细胞结合，而其他Fab(5014、5018-5023、5025、6495、6496)与包括FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9在内的多于一种FZD结合。然而，在本测定中没有Fab显示出与FZD3、FZD6或FZD10结合。接下来，将Fab 5019和Fab 5020用作实例，通过免疫荧光染色和流式细胞术两者测试它们与癌细胞的结合。如图6中示出的，在所测试的5种胰腺细胞系上，两种Fab都显示出清晰的集中于膜的染色。通过流式细胞术确认了这些Fab与这些癌细胞系的结合，如图7中示出的。

2.使用初始(naive)Fab文库(文库F)进行选择。

a).重组FZD4-CRD-Fc用于选择与FZD4结合的Fab。具体来说，Fab噬菌体文库(文库F)被预清除非相关蛋白的非特异性结合物。对预清除的Fab文库进行数轮选择，以富集与FZD4-CRD-Fc结合的结合物。来自选择的克隆噬菌体通过ELISA来筛选与FZD4-CRD-Fc但不与Fc特异性结合的结合物。鉴定出44种具有独特CDR序列的Fab(序列参见表3)。

b).抗FZD4 Fab的表征

然后将抗FZD4噬菌体结合物克隆克隆到细菌表达载体中，并且42种Fab被表达和纯化用于进一步表征。采用多于一种方法来确定对FZD的结合选择性。首先，在ELISA测定中测试纯化的Fab，以确认它们与重组抗原(FZD4-CRD-Fc)的结合以及它们与其他FZD(FZD1、2、5、6、7、8、9和10)的结合。如图8中示出的，观察到所有Fab都与FZD4-CRD-Fc(用于选择的抗原)结合，但很少与Fc或非相关蛋白BSA结合。此外，这些Fab还显示出不同程度地与其他FZD结合(图8)。例如，检测到Fab除了与FZD4-CRD-Fc结合之外，还与FZD2 CRD-Fc和FZD8CRD-Fc少量结合(图8A)。Fab 5076除了与FZD4结合之外，还与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8结合(图8D)。接下来，抗FZD4 Fab与各种FZD的结合通过对表达FZD的CHO细胞的免疫荧光染色来确定，并将结果概述在图9中。在本测定中，大多数Fab显示出仅与FZD4结合(包括Fab5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072、5077-5081)，而其他Fab与2种或更多种FZD结合。此外，使用表面等离子体共振(SPR)来确定抗FZD4 Fab与FZD4 CRD-Fc的结合亲和力。如图10中示出的。FZD4来源的Fab显示出对FZD4的高亲和力，范围为0.2nM至15.3nM。为了观察这些Fab是否与胰腺癌细胞上表达的FZD结合，使用流式细胞术测试它们的结合。如图11中概述的，大多数Fab能够结合HPAFII和PATU8988s。对于Fab5049、Fab 5064和Fab 5072观察到少量结合(PATU8988s细胞)。

FZD4 Fab的功能测试：进行了几种测定来表征抗FZD4 Fab。

1.抗FZD4 Fab对Wnt配体与FZD4-CRD结合的影响。为了优化测定条件，将递增浓度的FZD4-CRD-Fc或Fc与生物素化Wnt5A混合，并通过链霉亲和素包被的板捕获复合物。通过抗Fc-HRP检测FZD4-CRD-Fc或Fc的结合(图12A)。选择给出线性范围内的ELISA信号的FZD4-CRD-Fc浓度来测试抗FZD4 Fab的阻断活性。在存在指示的各种Fab的情况下，将FZD4-CRD-Fc与生物素化Wnt5A混合，并通过抗Fc-HRP检测结合的FZD4-CRD-Fc，如图12A所示。如图12B中示出的，对于Fab 5014、5017-5023、5027-5031、5034、5036、5037、6496、6498、6499和6500，观察到大于80％的结合抑制；对于Fab 5035和Fab 6495，观察到大于60％的结合抑制；对于Fab 5025，观察到～30％的抑制；以及对于Fab 6494和Fab 6497没有观察到抑制。

2.抗FZD4 Fab对β-联蛋白驱动的转录的影响。为了观察抗FZD4 Fab是否影响β-联蛋白依赖性信号传导，在TOPFLASH测定中测试了Fab对Wnt3a诱导的转录活性的影响。如图13中示出的，对于Fab 5014、5018-5023、5025、5036、5037和6495观察到有效的抑制活性(>80％)。对于Fab 5027-5031、6497-6499观察到较小量的抑制(10％-35％)；对于Fab 5017、5034和5035没有观察到抑制。

3.对癌细胞增殖的影响。为了测试抗FZD4 Fab是否影响癌细胞的增殖，用2μg/ml和10μg/ml的Fab处理胰腺癌细胞(HPAFII和PATU8988s)，并测量细胞增殖(参见图14A-H)。数据在图15中概述。以剂量依赖方式抗增殖的Fab包括：Fab 5018-5021、5023、5036和6495。Fab 5022和6500仅在单剂量水平(2μg/ml)测试，并对测试的两种细胞系均是抑制性的。在测定中，几种Fab(5017、5025、5035和5037)显示出对HPAFII细胞系是抑制性的。基于图16中概述的数据，抗FZD4 Fab的抗增殖活性显示为与以下观察结果相关：它们与FZD 1、FZD 2、FZD 4、FZD 5、FZD 7、FZD 8和FZD 9的结合，和它们抑制Wnt3a诱导的转录活性的能力。最有效的抗增殖性Fab包括5014、5019-5023和6495(图16)。

4.对Wnt调节基因Axin2表达的影响。为了进一步表征抗FZD4抗体，将几种Fab转化为IgG。在基因表达测定中测试IgG 5020和Fab 5019和Fab 5020，其中通过RT qPCR测量Axin2基因的mRNA水平。如图17中示出的，在抗体处理后，IgG5020、Fab 5019和Fab 5020均减少了HPAFII细胞中的Axin2 mRNA水平，表明这些抗体抑制Wnt途径。

5.抗FZD4 IgG对癌细胞增殖的影响。还测试了IgG对四种胰腺癌细胞系HPAFII、CAPAN2、AsPC11和PATU8988s的增殖的影响。已知这些细胞系都含有RNF43基因中的破坏性突变。如使用阿尔玛蓝测定的图18A中示出的，这些胰腺细胞的增殖被IgG 5019和IgG 5020以及它们对应的Fab抑制。此外，IgG5020显示出以剂量依赖的方式抑制癌细胞的增殖(图18B)。感兴趣的是，也测试了在RNF43基因中没有破坏性突变的几种胰腺癌细胞系(BxPC3和PANC 1)，但其对IgG5020不敏感，表明对FZD4抗体IgG 5020的敏感性可能取决于RNF43基因中的突变。RNF43和ZNRF3是编码靶向卷曲受体的跨膜E3泛素连接酶的Wnt靶基因，RNF43和ZNRF3的功能缺失突变导致FZD的高表达，并可能使肿瘤细胞对Wnt依赖性信号传导的抑制敏感。为了观察FZD4抗体是否也影响集落形成，在5种胰腺癌细胞系上测试了IgG5020(图19)。与图18中的结果一致，IgG5020抑制携带RNF43突变的细胞系(HPAFII、AsPC1和PATU8988s)的集落形成，但不抑制不携带RNF43突变的细胞系(BxPC3和PANC 1)的集落形成。

6.抗FZD4 Fab与胰腺癌患者肿瘤来源细胞结合对其增殖的影响。接下来，通过免疫荧光染色测试Fab 5019和5020与胰腺癌患者肿瘤来源细胞(PDX)的结合。如图20中示出的，对于两种Fab，在PDX细胞系GP2A和GP14A以及胰腺细胞系CAPAN 2上都清楚地显示出膜染色模式。此外，在细胞增殖测定中测试了这些抗体(图21)。与图18和19中的观察一致，Fab和IgG 5020两者都能够抑制PDX细胞系GP2A和GP14A的增殖，这两种PDX细胞系都含有RNF43基因中的突变。

体内功效研究正在进行以展示这些公开的抗FZD抗体的抗肿瘤活性。

XI.示例性实施方案

1.一种抗体，所述抗体特异性结合选自FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9的一种或多于一种人类卷曲受体中每一种的富含半胱氨酸的结构域(CRD)，所述抗体包含轻链可变区和/或重链可变区，所述重链可变区包含互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中所述CDR的氨基酸序列包含选自表1a或表3a中的序列的序列或由选自表1a或表3a中的序列的序列组成。

2.根据实施方案1所述的抗体，其中所述CDR的氨基酸序列包含选自如以下列出的序列的序列或由选自如以下列出的序列的序列组成：

CDR-H1选自由以下组成的组：LYYTDM、IYFSSI、IGSSSI、VNSSSI、IHFSSI、IYSASI、IHSSSI、IYFSSI、IYSSSI、LSYSFF、LSFYFL、LSSYYM、SSFYFM、LSYYYM、IASYFT、FSSSSI、LSYYFM、IYYYPM、FSAYNI、IYYFGM、IHSSSI和ISYHYM；

CDR-H2选自由以下组成的组：SISLFFGYVS、SNYPSFGSNS、SIYSAFASTS、AFYSSFGATS、AYYSAFASSS、CSYPSFGSTS、SRYPSFGSTS、AIYSSFSANS、SNYPAFGSTS、SIYSAFLSTT、SIYPSSGYTY、SIYPYSGYTY、SIYPFHASTY、TVYPYLDYTY、SIYPYSRNTF、SIYPFSGYST、SIYPYYAYTY、SIYLSFGYGY、CCNSAYRYGP、SIYPYAGNTY、SFYSYYSFTY、SLYTSYGYTY、YIYPFNGYSY、YIYPSYDYTY、YISPPYGFTY、ATYSSFGSIT和SIYPNLGYTY；

CDR-H3选自由以下组成的组：YHHPFGYAL、YLAM、YHFPFAYSL、YHFPFGFAL、YHFPFGHAL、YHYPFGHAL、YHYPFGHAL、YHYPFGTAL、YHYPFGYAL、YHYPFGYAM、YHYPHGHAL、PAPFSYHVL、AAPGSYHPM、AAPYFYGVM、AFPGSYHPM、AYPFSYHFM、PSAFSYHPM、PVAGAYHPM、SSLGFYNGM、TVRGSKKPYFSGWAM、TYPGYYYIL、SGVGGDHAL、VWYVVQ、GYFYTWGGM、GYFYTWGGM、GYYYSWGGM、YHHPFGYAL和AYPFSYHYM；

CDR-L1是SVSSA；

CDR-L2是SASSLYS；和/或

CDR-L3选自由以下组成的组：AAYHWPPLF、GVYLF、SSYSLI、WAYGPF、YYHPI和YYSLF。

3.根据实施方案1所述的抗体，其中所述CDR的氨基酸序列包含选自如以下列出的序列或由选自如以下列出的序列组成：

CDR-L1是SVSSA；

CDR-L2是SASSLYS；和/或

4.根据实施方案2或3所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：

i)如表2中列出的重链氨基酸序列；

ii)与如表2中列出的重链氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或

iii)i)的保守取代的氨基酸序列，其中所述CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集。

5.根据实施方案2至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：

i)如表2中列出的轻链氨基酸序列；

ii)与如表2中列出的轻链氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集；或

6.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体，其中所述CDR序列是选自表1a或表3a中鉴定的抗体的全CDR序列集。

7.根据实施方案1至5中任一项所述的抗体，其中所述CDR序列包含选自表1a或表3a中鉴定的抗体的轻链或重链CDR序列集。

8.根据实施方案1至7中任一项所述的抗体，其中抗体特异性结合FZD4。

9.根据实施方案8所述的抗体，其中所述CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072、5077-5080或5081。

10.根据实施方案1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合FZD4和选自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9的至少一种其他FZD受体。

11.根据实施方案9所述的抗体，其中所述CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。

12.根据实施方案1至11中任一项所述的抗体，其中与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8或FZD9相比，所述抗体优先结合卷曲受体4(FZD4)。

13.根据实施方案1至11中任一项所述的抗体，其中相对于另一种FZD受体，抗体优先结合FZD4。

14.根据实施方案13所述的抗体，其中所述CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5028、5029、5031、5034、5035、6497、6498、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067、5073、5074、5075。

15.根据实施方案1至13中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有通过表面等离子体共振测量的约0.2nM和约15.3nM之间的结合亲和力。

16.根据实施方案1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

17.根据实施方案1至16中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。

18.根据实施方案1至17中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单链抗体。

19.根据实施方案1至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自以下的抗体结合片段：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv，其二聚体、纳米抗体、微型抗体、双抗体及多聚体。

20.根据实施方案1至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体是为二价、三价或四价抗体的多价抗体。

21.根据实施方案1至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体是还与LPR 5/6结合的双特异性抗体。

22.根据实施方案1至18中任一项所述的抗体，所述抗体包含非天然糖基化模式。

23.根据实施方案1至18中任一项所述的抗体，所述抗体包含恒定区或框架区中的半胱氨酸取代或添加。

24.根据实施方案1至18中任一项所述的抗体，所述抗体阻断Wnt与FZD的结合。

25.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含实施方案1至21中任一项所述的抗体和可检测标记物或细胞毒性剂。

26.根据实施方案25所述的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含选自以下的细胞毒性剂：美登素生物碱、澳瑞他汀、多拉司他汀、tubulysin、念珠藻素、吡咯并苯二氮卓类(PBD)二聚体、吲哚并苯二氮卓类二聚体、α-鹅膏蕈碱、trichothene、SN-38、倍癌霉素、CC1065、卡奇霉素、烯二炔抗生素、紫杉烷、多柔比星衍生物、蒽环类和它们的立体异构体、azanofide、电子等排体、类似物或衍生物。

27.一种核酸分子，所述核酸分子编码实施方案1至21中任一项所述的抗体。

28.根据实施方案27所述的核酸分子，其中所述CDR序列中的一种或更多种由表1b、表1c、表3b或表3c中的核酸编码。

29.根据实施方案27所述的核酸分子，其中所述抗体包含由核酸编码的重链可变区，所述核酸包含：

i)如表2中列出的重链核酸序列；

ii)与如表2中列出的重链核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或

iii)i)的密码子简并核酸序列，其中所述CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集。

30.根据实施方案27所述的核酸分子，其中所述抗体包含由核酸编码的轻链可变区，所述核酸包含：

i)如表2中列出的轻链核酸序列,

ii)与如表2中列出的轻链核酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列，其中所述CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或

31.一种载体，所述载体包含与实施方案27至30中任一项所述的核酸可操作地连接的表达控制序列。

32.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含重组核酸分子，所述重组核酸分子包含与实施方案27至30中任一项所述的核酸可操作地连接的表达控制序列。

33.根据实施方案32所述的宿主细胞，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

34.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含实施方案31所述的载体。

35.一种用于制备抗FZD抗体的方法，所述方法包括培养实施方案32至34中任一项所述的宿主细胞。

36.一种组合物，所述组合物包含实施方案1至24中任一项或更多项所述的抗体、实施方案25-26所述的免疫缀合物、实施方案27-30所述的核酸分子、实施方案31所述的载体或实施方案34-34所述的宿主细胞，以及任选地合适的稀释剂。

37.根据实施方案3636所述的组合物，其中所述组合物包含一种或更多种抗体或免疫缀合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

38.一种试剂盒，所述试剂盒包含实施方案1至24中任一项或更多项所述的抗体、实施方案25-26所述的免疫缀合物、实施方案27-30所述的核酸分子、实施方案31所述的载体或实施方案所述34-34的宿主细胞。

39.一种检测FZD表达的方法，所述方法包括在允许形成抗体:细胞复合物的条件下，使包含一个或更多个细胞的样品与一种或更多种实施方案1至26中任一项所述的抗体或免疫缀合物接触，并检测任何抗体复合物的存在。

40.根据实施方案39所述的方法，其中所述检测是通过免疫荧光。

41.根据实施方案39所述的方法，其中所述检测是通过流式细胞术。

42.根据实施方案39至41中任一项所述的方法，其中所述方法用于检测FZD4表达，并且所述抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081。

43.一种抑制Wnt配体与FZD受体结合、破坏Wnt信号传导途径、抑制Wnt诱导的转录活性、抑制散乱蛋白活化、促进β-联蛋白破坏复合物的保持、促进β-联蛋白积累或抑制细胞生长的方法，所述方法包括使表达FZD受体的细胞与实施方案1至26中任一项所述的抗体或免疫缀合物接触。

44.根据实施方案43所述的方法，其中所述Wnt配体是Wnt3a。

45.根据实施方案43所述的方法，其中所述抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：a)5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081，或者b)5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。

46.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1至26中任一项所述的抗体或免疫缀合物。

47.根据实施方案46所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肾上腺皮质癌和成骨细胞瘤癌。

48.根据实施方案46所述的方法，其中所述癌症选自急性髓性白血病、神经母细胞瘤、肝癌、肺癌、子宫内膜癌、唾液腺样囊性癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、胶质瘤、胃癌、星形细胞瘤和骨肉瘤。

49.根据实施方案46所述的方法，其中所述抗体或免疫缀合物在至少一种测定中特异性结合FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9，并在至少一种测定中抑制Wnt3a诱导的信号传导，任选地其中所述抗体或免疫缀合物是实施方案1至26中任一项所述的抗体或免疫缀合物。

50.根据实施方案46所述的方法，其中所述抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：a)5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081，或者b)5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。

51.根据实施方案46所述的方法，其中所述抗体或免疫缀合物包含对应于选自5019和5020的抗体的CDR序列集。

52.根据实施方案51所述的方法，其中通过所述方法治疗的所述癌症包含一种或更多种包含RNF43基因的突变的癌细胞，并且所述抗体或免疫缀合物包含对应于抗体5020的CDR序列集。

如本文所使用的，除非另外指定，否则以下含义适用。词语“可以”用于允许性的含义(即，意指有可能)，而非强制性的含义(即，意指必须)。词语“包括/包含(include)”、“包括/包含(including)”和“包括/包含(includes)”等意指包括/包含但不限于。单数形式“一(a)”、“一(a)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“要素(an element)”包括两个或更多个要素的组合，尽管对于一个或更多个要素使用了其他术语和措辞，诸如“一个/种或更多个/种(one or more)”。措辞“至少一个/种(at least one)”包括“一个/种或更多个/种”、“一个/种或多于一个/种(one or a plurality)”和“多于一个/种(aplurality)”。除非另外指明，否则术语“或”是非排他性的，即，涵盖“和”和“或”两者。在修饰语和序列之间的术语“......中的任一个”意指修饰语修饰序列中的每一个成员。因此，例如，措辞“至少1、2或3中的任一个”意指“至少1、至少2或至少3”。术语“主要由......组成”是指包含所列举的要素和不实质上影响所要求保护的组合的基本特征和新颖特征的其他要素。

如本文使用的程度术语，诸如“约(about)”、“基本上(substantially)”和“大约(approximately)”意指被修饰术语的合理偏差量，使得最终结果不会显著改变。这些程度术语应被解释为包括被修饰术语的至少±5％的偏差，条件是这种偏差不会使它所修饰的词语的含义无效。

此外，如本领域技术人员将理解的，在特定部分中描述的定义和实施方案意图可应用于它们适用的本文描述的其他实施方案。例如，在以下段落中，更详细地定义本发明的不同方面。除非清楚指示相反情况，否则如此定义的每个方面可以与任何其他一个方面或更多个方面组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个特征或更多个特征组合。

应当理解，本说明书和附图并不意图将本发明限制于所公开的特定形式，而是相反，意图覆盖落入由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等同形式和替代形式。根据本说明书，本发明的各方面的其他修改和替代实施方案对于本领域技术人员将是明显的。因此，本说明书和附图应被解释为仅是说明性的，并且是为了教导本领域技术人员进行本发明的一般方式的目的。应理解，本文示出和描述的本发明的形式应被认为是实施方案的实例。本文说明和描述的要素和物质可以被替换，组成部分(part)和过程可以颠倒或省略，并且本发明的某些特征可以被独立使用，所有这些对了解本发明说明书的益处的本领域技术人员来说都将是明显的。在不脱离如所附权利要求书描述的本发明的精神和范围的情况下可以对本文描述的要素进行改变。本文使用的标题仅为了组织的目的，并不意味着用来限制本说明书的范围。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入。

Claims

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述CDR的氨基酸序列包含选自如以下列出的序列的序列或由选自如以下列出的序列的序列组成：

CDR-L1是SVSSA；

CDR-L2是SASSLYS；和/或

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述CDR的氨基酸序列包含选自如以下列出的序列或由选自如以下列出的序列组成：

CDR-L1是SVSSA；

CDR-L2是SASSLYS；和/或

4.根据权利要求2或3所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：

i)如表2中列出的重链氨基酸序列；

ii)与如表2中列出的重链氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或

5.根据权利要求2至4中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：

i)如表2中列出的轻链氨基酸序列；

ii)与如表2中列出的轻链氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述CDR序列是如表1a或表3a中列出的CDR序列集，或

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述CDR序列是选自表1a或表3a中鉴定的抗体的全CDR序列集。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述CDR序列包含选自表1a或表3a中鉴定的抗体的轻链或重链CDR序列集。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中抗体特异性结合FZD4。

9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072、5077-5080或5081。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合FZD4和选自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9的至少一种其他FZD受体。

11.根据权利要求9所述的抗体，其中所述CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中与FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8或FZD9相比，所述抗体优先结合卷曲受体4(FZD4)。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中相对于另一种FZD受体，抗体优先结合FZD4。

14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述CDR序列是选自以下抗体的抗体的CDR序列集：5028、5029、5031、5034、5035、6497、6498、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067、5073、5074、5075。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有通过表面等离子体共振测量的约0.2nM和约15.3nM之间的结合亲和力。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单链抗体。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自以下的抗体结合片段：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv，其二聚体、纳米抗体、微型抗体、双抗体及多聚体。

20.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体是为二价、三价或四价抗体的多价抗体。

21.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体是还与LPR 5/6结合的双特异性抗体。

22.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体，所述抗体包含非天然糖基化模式。

23.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体，所述抗体包含恒定区或框架区中的半胱氨酸取代或添加。

24.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体，所述抗体阻断Wnt与FZD的结合。

25.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含权利要求1至21中任一项所述的抗体和可检测标记物或细胞毒性剂。

26.根据权利要求25所述的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含选自以下的细胞毒性剂：美登素生物碱、澳瑞他汀、多拉司他汀、tubulysin、念珠藻素、吡咯并苯二氮卓类(PBD)二聚体、吲哚并苯二氮卓类二聚体、α-鹅膏蕈碱、trichothene、SN-38、倍癌霉素、CC1065、卡奇霉素、烯二炔抗生素、紫杉烷、多柔比星衍生物、蒽环类和它们的立体异构体、azanofide、电子等排体、类似物或衍生物。

27.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1至21中任一项所述的抗体。

28.根据权利要求27所述的核酸分子，其中所述CDR序列中的一种或更多种由表1b、表1c、表3b或表3c中的核酸编码。

29.根据权利要求27所述的核酸分子，其中所述抗体包含由核酸编码的重链可变区，所述核酸包含：

i)如表2中列出的重链核酸序列；

30.根据权利要求27所述的核酸分子，其中所述抗体包含由核酸编码的轻链可变区，所述核酸包含：

i)如表2中列出的轻链核酸序列,

31.一种载体，所述载体包含与权利要求27至30中任一项所述的核酸可操作地连接的表达控制序列。

32.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含重组核酸分子，所述重组核酸分子包含与权利要求27至30中任一项所述的核酸可操作地连接的表达控制序列。

33.根据权利要求32所述的宿主细胞，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

34.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求31所述的载体。

35.一种用于制备抗FZD抗体的方法，所述方法包括培养权利要求32至34中任一项所述的宿主细胞。

36.一种组合物，所述组合物包含权利要求1至24中任一项或更多项所述的抗体、权利要求25-26所述的免疫缀合物、权利要求27-30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体或权利要求34-34所述的宿主细胞，以及任选地合适的稀释剂。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物包含一种或更多种抗体或免疫缀合物，任选地其中所述组合物是药物组合物。

38.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至24中任一项或更多项所述的抗体、权利要求25-26所述的免疫缀合物、权利要求27-30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体或权利要求所述34-34的宿主细胞。

39.一种检测FZD表达的方法，所述方法包括在允许形成抗体:细胞复合物的条件下，使包含一个或更多个细胞的样品与一种或更多种权利要求1至26中任一项所述的抗体或免疫缀合物接触，并检测任何抗体复合物的存在。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述检测是通过免疫荧光。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述检测是通过流式细胞术。

42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述方法用于检测FZD4表达，并且所述抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081。

43.一种抑制Wnt配体与FZD受体结合、破坏Wnt信号传导途径、抑制Wnt诱导的转录活性、抑制散乱蛋白活化、促进β-联蛋白破坏复合物的保持、促进β-联蛋白积累或抑制细胞生长的方法，所述方法包括使表达FZD受体的细胞与权利要求1至26中任一项所述的抗体或免疫缀合物接触。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述Wnt配体是Wnt3a。

45.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：a)5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081，或者b)5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。

46.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至26中任一项所述的抗体或免疫缀合物。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肾上腺皮质癌和成骨细胞瘤癌。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述癌症选自急性髓性白血病、神经母细胞瘤、肝癌、肺癌、子宫内膜癌、唾液腺样囊性癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、胶质瘤、胃癌、星形细胞瘤和骨肉瘤。

49.根据权利要求46所述的方法，其中所述抗体或免疫缀合物在至少一种测定中特异性结合FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7、FZD8和FZD9，并在至少一种测定中抑制Wnt3a诱导的信号传导，任选地其中所述抗体或免疫缀合物是权利要求1至26中任一项所述的抗体或免疫缀合物。

50.根据权利要求46所述的方法，其中所述抗体或免疫缀合物包含对应于选自以下的抗体的CDR序列集：a)5017、5027、5030、6499、5038、5040-5044、5046、5047、5049-5053、5055、5058-5064、5066、5068-5072和5077-5081，或者b)5014、5016、5018-5023、5025、5028、5029、5031、5034、5035、5036、5037、6494、6495、6496、6497、6498、6500、5039、5045、5048、5054、5056、5057、5067和5073-5076。

51.根据权利要求46所述的方法，其中所述抗体或免疫缀合物包含对应于选自5019和5020的抗体的CDR序列集。

52.根据权利要求51所述的方法，其中通过所述方法治疗的所述癌症包含一种或更多种包含RNF43基因的突变的癌细胞，并且所述抗体或免疫缀合物包含对应于抗体5020的CDR序列集。