CN114616025A - 诱导眼睛和眼眶的细胞和组织发生表观遗传改变的系统和方法 - Google Patents

Abstract

用于引起眼睛内或眼睛相邻细胞或组织发生改变的方法、系统和设备。所述系统包括配置为发射RF信号的外部RF线圈。所述系统还包括配置为可移除地设置在眼睛上的可穿戴设备，所述可穿戴设备包括配置为从外部RF线圈接收RF信号的多个内部射频(RF)线圈和配置为通过电磁刺激眼睛的一部分或眼睛相邻区域的多个刺激电极，引发眼睛内或眼睛相邻的细胞或组织发生改变。

Description

诱导眼睛和眼眶的细胞和组织发生表观遗传改变的系统和 方法

交叉引用

本申请请求2019年10月28日提交的序列号为62/927038，标题为“诱导眼睛和眼眶的细胞和组织表观遗传改变的系统和方法”的美国临时申请的利益和优先权，其内容通过引用全部并入本文。

政府许可权

本发明是在美国政府的支持下，根据美国国家科学基金会授予的第1933394号合同完成的。美国政府对这项发明有一定的权利。

背景技术

1.技术领域

本说明书涉及诱导眼睛或眼睛相邻区域改变的系统和方法。

2.相关技术的描述

视网膜失明，例如视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)和青光眼(POAG)是多阶段病症，其特征是神经元持续死亡(RP和AMD中的光感受器丧失以及POAG中神经节细胞丧失)。神经元重新布线、重新编程和迁移可以在这些病症的早期表现出来。已经确定了许多机制来解释为什么在这些不同的视网膜致盲障碍中会发生神经元死亡(例如，RP的基因突变、AMD的脂质代谢异常和炎症，以及POAG的高眼压等)。尽管存在改善这些病症的治疗方法，但对于许多受折磨的人来说，没有治愈的方法。因此，需要改进对这些病症的治疗。

发明内容

本发明描述了一种用于引起眼睛内或眼睛相邻的细胞或组织改变的系统。所述系统包括配置为发射RF(射频)信号的外部RF线圈。所述系统还包括配置为可移除地设置在眼睛上的可穿戴设备，所述可穿戴设备包括配置为从外部RF线圈接收RF信号的多个内部RF线圈和配置为通过电磁刺激眼睛的一部分或眼睛相邻的区域的多个刺激电极，引起眼睛内部或与眼睛相邻的细胞或组织发生改变。

本发明还描述了一种用于引起眼睛内部或眼睛相邻的细胞或组织发生改变的方法。所述方法包括通过外部RF线圈发射RF信号。所述方法还包括通过可移除地设置在眼睛上的可穿戴设备的多个内部RF线圈接收来自外部RF线圈的RF信号。所述方法还包括通过多个刺激电极刺激眼睛或与眼睛相邻的区域，从而引起眼睛内部或眼睛相邻的细胞或组织的改变。

本发明还描述了一种具有外表面和内表面的可穿戴设备，所述内表面配置为可移除地接触用户的眼睛。所述可穿戴设备还包括被配置为通过电磁刺激眼睛或与眼睛相邻的区域的多个刺激电极，从而引起眼睛内部或眼睛附近的细胞或组织改变。

附图说明

本发明的其他系统、方法、特征和优点对于本领域的技术人员在检查以下附图和详细描述后将是显而易见的。附图中所示的组成部分不一定按比例绘制，并且可能被放大以更好地说明本发明的重要特征。

根据本发明的各种实施方案，图1图示了所述系统的过程的概述。

根据本发明的各种实施方案，图2A图示了用于诱导眼睛或周围/相邻区域改变的系统。

根据本发明的各种实施方案，图2B图示了在图2A所述的系统中使用的可穿戴设备。

根据本发明的各种实施方案，图2C图示了所述可穿戴设备的刺激电极。

根据本发明的各种实施方案，图3图示了可以由所述系统治疗的眼睛的一部分。

根据本发明的各种实施方案，图4图示了位于设备上的外部RF线圈。

根据本发明的各种实施方案，图5A-5C图示了所述系统的多个实施方案。

根据本发明的各种实施方案，图6A图示了使用所述系统引起改变的过程。

根据本发明的各种实施方案，图6B图示了验证所述系统诱导的表观遗传改变的过程。

根据本发明的各种实施方案，图7A-7L图示了所述系统的电路示意图和这些组件的特性。

根据本发明的各种实施方案，图8A-8D图示了所述系统的电路示意图和这些组件的特性。

根据本发明的各种实施方案，图9A-9B图示了对所述系统的模拟。

根据本发明的各种实施方案，图10图示了最显著的差异甲基化区域(DMR)的无监督层次聚类的热图。

根据本发明的各种实施方案，图11图示了一个散点图，其示出了源自全基因组甲基化测序(WGBS)和靶向亚硫酸氢盐测序的甲基化β值之间的相关性。

根据本发明的各种实施方案，图12图示了在经角膜电刺激(TES)后多个时间点通过视网膜变性大鼠视网膜的定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)测定的选定基因的表达水平。

根据本发明的实施方案，图13A-13B图示了被鉴定为在电刺激后改变最显著的差异甲基化区域(DMR)。

具体实施方式

虽然经典表观遗传学领域已得到广泛研究，但神经表观遗传学(有关有丝分裂后神经元的表观遗传学研究)是一个相对新生和新兴的研究领域。此外，被认为是中枢神经系统(CNS)的产物的视网膜表观遗传学的数据尤其匮乏。对视网膜或培养的Muller细胞的电刺激可能导致反映神经保护改变的转录组变化，包括促凋亡基因如Bax的下调和促生存基因如脑源性神经营养因子(bdnf)的上调。本文描述的系统和方法首次表明，受控的非侵入性电刺激可以导致视网膜表观遗传学改变，并影响神经保护。本文所述的系统和方法允许视网膜神经保护系统化，因此更可靠和可重复。

因此，本文所述的系统和方法基于通过受控电刺激诱导的视网膜的神经表观遗传和染色质重塑，这是神经保护的关键分子决定因素。这对于视网膜退行性疾病的治疗至关重要，如图1所示。本文描述的系统和方法使用非侵入性可穿戴设备来控制电刺激以诱导眼睛的表观遗传改变，从而减缓神经变性的进展。在一些实施方案中，可穿戴设备是一种夜间佩戴的、柔软的、具有线圈和电极的环形接触式眼镜，在本文中可称为“电子透镜(e-lens)”。

流行的视网膜疾病(例如，光感受器变性(例如视网膜色素变性(RP)(和老年眼底黄斑变性(AMD)或原发性开角型青光眼(POAG))的病理机制被更好地理解。尽管如此，例如，由于有100多个突变可引起RP，因此在罕见的一次性基因治疗Leber先天性黑蒙病症(RPE65突变)中成功之外，治愈这一突变家族一直是一项艰巨的任务。同样，随着青光眼的进展，眼压控制变得更加困难，需要神经保护。

先前对视网膜进行电磁刺激的利用仅限于康复设备，通常用于绕过受损神经元，以恢复近乎完全失明的患者的部分视力。本文所述的系统和方法通过范式转移引入了不同的方法，以预防或延缓在无法治愈的疾病如RP、AMD和POAG中经历的神经元损失。受控的电磁场可以通过利用染色质包装和表观基因组重塑增强的基因表达的转录调控来调节功能和形态的神经改变。这种方法既可以在视网膜疾病的早期用于减缓进展，也可以在疾病的晚期用于补充药物和手术治疗。重要的是要注意，本文使用的电刺激形式非常不同，不是神经修复学中使用的类型，所述神经修复学中使用的类型使用电刺激绕过受损的感光器并激活剩余的视网膜神经元以恢复视觉功能。

经角膜电刺激(TES)可以降低光感受器的死亡率并延缓视网膜退行性疾病的进展。其他非侵入性方法可能对视网膜产生多种影响，从促进轴突切断的视网膜神经节细胞的存活到拯救光感受器。然而，对造成这些影响的原因的描述不足，对基本机制的理解也有限。

图2A图示了用于经角膜电刺激(TES)的系统200。所述系统200包括被配置有可移除地设置在眼睛203上的可穿戴设备202。也就是说，所述可穿戴设备202可以放置在眼睛203上和从眼睛203上移除。所述可穿戴设备202可以在材料、形状和尺寸上与接触式眼镜相似。在一些实施方案中，在所述可穿戴设备202的中心具有允许角膜氧合的孔207。孔207还可以为角膜、虹膜和瞳孔(在眼睛203的其他部分中)提供开口，使用户能够通过可穿戴设备202看见。

所述可穿戴设备202包括与多个刺激电极206连接的多个内部射频(RF)线圈204。所述可穿戴设备202还与内部RF线圈204连接。所述刺激电极可以是一个或多个电容器和二极管210。

所述刺激电极206被设计成如通过本文所述的计算模拟所确定的，不覆盖或损坏角膜的最大化的视网膜中的电流。

内部RF线圈204被配置为从外部RF线圈208电感地接收能量。也就是说，外部RF线圈208将RF信号发送到内部RF线圈204，内部RF线圈204接收RF信号。从外部RF线圈208接收的能量被提供给刺激电极以刺激眼睛203的各个部分。

可以有任意数量的刺激电极206位于可穿戴设备202上的不同位置。所述刺激电极206可以具有适合治疗眼睛203的任何形状。也可以有任意数量的具有任意匝数的内部RF线圈204。所述内部RF线圈204和刺激电极206的确切数量可以基于所述系统200的应用和/或用户的眼睛203的大小或尺寸而变化。类似地，外部RF线圈208的确切数量也可以变化。

图2B图示了没有内部RF线圈204的可穿戴设备202。所述可穿戴设备202具有外表面212和内表面214。所述内表面214被配置为与用户的眼睛203接触。所述外表面212与所述内表面214相对并且所述外表面212面向外部RF线圈208。所述可穿戴设备202还可以包括用于接收和容纳内部RF线圈204的多个凹槽216。所述多个凹槽216可以位于外表面212或内表面214上。在一些实施方案中，所述多个凹槽216是在可穿戴设备202内形成的通道，并且内部RF线圈204嵌入可穿戴设备202的外表面212和内表面214之间。

所述刺激电极206以及电容器和二极管210可以位于可穿戴设备202的外表面212或内表面214上，或者在一些实施方案中，可以嵌入可穿戴设备202的材料中，使得它们位于外表面212和内表面214之间。与刺激电极位于眼睛外部且眼睑位于眼睛和刺激电极之间的系统相比，位于眼睛203上的刺激电极206有助于有效地降低阻抗。在眼睑将眼睛和刺激电极分开的系统中，眼睑和用户的其他部位可能会给系统带来阻抗，从而降低效率和功效。

图2C图示了所述可穿戴设备202的刺激电极206(例如，负极206A、正极206B、接地极206C)的示例布局。可以存在位于可穿戴设备202的上半部的弧形接地极206C。还可以存在位于可穿戴设备202的右下象限的负极206A和位于可穿戴设备202的左下象限的正极206B。所述刺激电极206的位置可以导致刺激集中在眼睛的特定位置218上。

图2C所示的实施方案是用于将刺激集中在位置218的刺激电极206的位置和形状的示例实施方案，用于将刺激集中在其他位置的其他实施方案也是可能的。

染色质和表观基因组动力学的改变与电磁场暴露之间可能存在联系，特别是将电磁场暴露应用于视网膜时。虽然遗传和表观遗传改变涉及视网膜变性的起始和进展，但没有基于表观遗传的疗法来减缓或阻止视网膜在感光细胞或神经节细胞水平上的退行性改变的不断的进展。本文描述的系统和方法是一种完全不同的使用电磁场的方法，并且非侵入地诱导具有神经保护作用的表观遗传改变(即，使用具有生物相容性线圈和电极的定制透镜来诱导表观遗传改变以保护动物模型光感受器和神经节细胞变性的动物模型中的视网膜神经元)。这种方法既可以用于早期疾病，例如RP、AMD和POAG，也可以作为晚期视网膜疾病与药物、设备或手术相结合的辅助手段。例如，所述可穿戴设备202可以佩戴过夜，因为它没有完全覆盖角膜，因此不会干扰角膜氧合。过夜使用使其容易遵守，因为它不会干扰例如阅读等日间活动。

本文所述的系统和方法也可以用于其他神经退行性疾病和神经损伤，例如中风或闭合性颅脑损伤。所述系统和方法的益处为也可以用于已知表观遗传改变参与其进展的疾患，例如癌症。例如，早期胶质母细胞瘤(脑癌的一种)可以被延缓进展，癌症周围的神经元也可以免受细胞死亡。

图3图示了可以使用所述系统200刺激眼睛203和眼睛的各个区域。特别地，可以刺激视网膜302和视神经304以治疗视网膜失明，例如视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)和青光眼(POAG)。可以刺激睫状体306以治疗或延缓老花眼。可以治疗眼睛的一部分或眼睛内，也可以治疗与眼睛的相邻区域。产生眼泪的泪腺(未示出)也可以被刺激以治疗干眼症。还可以治疗角膜上皮。

图4图示了可以容纳外部RF线圈208的示例设备。例如，外部RF线圈208可以被容纳在面罩402或眼镜404中。所述系统200可以在用户睡觉时使用。因此，可以使用在对应于用户眼睛的位置处具有RF线圈208的面罩402。类似地，当用户不睡觉时可以使用眼镜404，其中RF线圈208位于对应于用户眼睛的位置。所述RF线圈208可以在到内部RF线圈204的足够距离内以在用户佩戴面罩402或眼镜404时电感地向刺激电极206提供能量。容纳外部RF线圈208的装置可以包含电源或可以与电源连接以向外部RF线圈208提供电流。

图5A图示了如本文所述具有可穿戴设备202和外部RF线圈208的系统500。所述可穿戴设备202如本文所述可以具有与内部RF线圈204连接的刺激电极206。内部RF线圈204可以由外部RF线圈208感应供电。内部RF线圈204可以为刺激电极206供电以刺激眼睛的一部分，如本文所述。

图5B图示了不包括电感能量传输的系统520。可穿戴设备202包括刺激电极206并且还包括被配置为向刺激电极206提供能量的内部电源502。所述内部电源502可以设置在可穿戴设备202之上或之内。在一些实施方案中，所述内部电源502是电池。在一些实施方案中，所述内部电源502是基于运动产生电力的装置，例如摩擦发电机。电力可以基于用户的运动来产生，包括眼睛的运动。这样，所述系统520是一种独立的处理设备。在内部电源502是发电设备的实施方案中，所述内部电源502还可以包括能量存储设备，例如电池。

图5C图示了也不包括电感能量传输的系统540。可穿戴设备202包括与外部电源504连接的刺激电极206，所述外部电源504被配置为向刺激电极206提供能量。在一些实施方案中，所述外部电源504是电池。在一些实施方案中，所述外部电源504是基于太阳能发电的装置，例如太阳能电池板。在一些实施方案中，所述外部电源504是基于运动产生电力的装置，例如摩擦发电机。可以基于用户的运动来产生电力。所述外部电源504可以位于用户佩戴的设备上，例如眼镜或帽子或放置在用户皮肤上的粘附贴片。在外部电源504是发电设备的实施方案中，外部电源504还可以包括能量存储设备，例如电池。

在一些实施方案中，诸如智能手机、笔记本电脑或平板电脑之类的外部移动计算设备可以控制可穿戴设备202，包括例如提供用于控制刺激电极的指令。所述外部移动计算设备可以使用有线连接或无线连接与可穿戴设备202可通信地连接，并且可以使用诸如收发器之类的适当硬件和诸如蓝牙之类的相应通信协议来执行通信。

图6A图示了用于引起眼睛内或眼睛相邻细胞或组织发生变化的过程600。外部射频(RF)线圈(例如，外部RF线圈208)传输RF信号(步骤602)。多个内部RF线圈(例如，内部RF线圈204)从外部RF线圈接收RF信号(步骤604)。内部RF线圈位于可穿戴设备(例如，可穿戴设备202)上，所述可穿戴设备可移除地设置在眼睛(例如，眼睛203)上。多个刺激电极(例如，刺激电极206)刺激眼分或患者/用户的眼睛相邻区域，引发眼睛内或眼睛相邻细胞或组织发生改变(步骤606)。如本文所用，“与眼睛相邻的细胞或组织”是指在眼睛邻近、周围、在其附近、相邻或围绕的任何细胞或组织，并且“患者或用户的眼睛相邻区域”是指眼睛邻近、周围、在其附近、相邻或围绕的任何身体区域。

图6B图示了用于验证由本文所述的系统诱导的表观遗传改变的过程620。特别地，所述过程600的一个或多个步骤可以使用具有计算机处理器和由计算机处理器执行的非暂态存储器存储指令的计算设备来执行。

使用全基因组硫酸氢盐测序测量差异甲基化区域(DMR)，以响应电刺激(步骤622)。使用靶向亚硫酸盐扩增子高通量测序验证DMR(步骤624)。转录变化被确认(步骤626)，并且DMR被用作响应电刺激的生物标志物和用于在分子水平上监测作用的持续时间(步骤628)。

关于内部RF线圈204和外部RF线圈，可以使用各种电气部件。传统上，半波整流器是无线无源电极的流行解决方案。但是，半波整流器(HWR)解决方案不提供电荷平衡的波形。也就是说，HWR在每个周期中始终是单相的。使用电荷平衡的波形对于避免不平衡电荷通过眼组织传输很重要。每个周期的电荷平衡的波形都是双相的。

图7中所示的电路700可用于本文所述的系统和方法。所述电路700包括发射器部分702和接收器部分704。所述发射器部分702可以与外部RF线圈206一起使用，并且接收器部分704可以与内部RF线圈204一起使用。对于给定的负载和输入条件，电路700能够传递电荷平衡和比半波整流器系统更高的输出电压。负载电阻两端的输出电压是节点OUT_p和OUT_n之间的电压差。所述电路700假定电流刺激系统的负载以kΩ为单位。在HWR电路中，负载电阻的一端接地，负载电阻的另一端根据二极管极性切换为正值或负值。负载电阻的接地侧也连接到接收器线圈的一端以完成电路。然而，与HWR不同，电路700通过在不损失效率的情况下产生负电压来实现负载电阻器(R_load)两端的更高电压。负载两端的电压由V(a)-V(b)给出。

接收电感L_Receiver、D1、C_s1和C_L1在节点OUTp形成HWR电荷平衡正整流电路。类似地，接收电感L_Receiver、D2、C_s2和C_L2在节点OUT_n形成HWR电荷平衡的负整流电路。通常，与单个HWR电路串联的串联电容器会降低输出电压。然而，在电路700中，当负载电压被抽头差分时，有效输出电压增加。连接负载电阻，使其充当RF阻断器。图7B-7E图示了电路700的性能。可以通过调节诸如电容器的组件来调整波形。

此外，还可能采取进一步的步骤，使输出电压比电路拓扑提供的电压进一步增加。这些进一步的步骤的效果在图7F-7I中图示。发送的输入信号可以是脉冲RF信号。使用3型RF信号不仅会导致更高的感应电压，还会导致次级线圈开路电压的不对称感应。感应电压的这种不对称性增加了负载输出电压。所有信号的峰间电压可能相同(例如，5V)。3型信号引起的不对称性可归因于诱导过程的分化特性。

可以通过添加如图7所示的二极管D3来进一步修改电路700，以在不影响阴极电压的情况下增加阳极电压。修改后的电路对负载电压和电荷的影响如图7K和7L所示。参考图7K和7L的电路A，是不存在二极管D3的图7J的电路，参考图7K和7L的电路B是图7J的电路。这种修改还有助于独立于阴极电荷衰减率来控制阳极电荷衰减率。这在调整刺激波形的形状而不影响系统效率时很有用。在现有的单相半波整流器和倍压电路中，无法独立调整阳极衰减率。

与C_L1和C_L2相比，可以为C_s1和C_s2选择更大的电容值。更大的串联电容值可以导致较高的负载电流和负载电压。这为流过二极管的电流提供了较小的阻力。而且，这导致阴极脉冲的快速充电和放电。

可以通过增加二极管D₂的传导来增加3型RF电压输入的输出电压，即电路700中所示的线圈相对极性。例如，用MBR745二极管代替1N5819二极管会增加输出电压。此外，与D₂和C_s2对并联的二极管和电容器可以增加输出电压。

HWR和电路700的输出电压和电荷平衡波形如下所示。这两个系统在相似的输入波形、发射器-接收器线圈和负载条件下进行了比较。下表给出了模拟参数的详细信息。所提出电路的输出电压高于HWR。此外，与HWR不同，电路700实现了电荷平衡。

本文描述所提出的系统与HWR之间的输出电压和电荷的比较示于图7H和7I中。

图8A中所示的电路800可以用于本文所述的系统和方法。所述电路800包括发射器部分802和接收器部分804。所述发射器部分802可以与外部RF线圈206一起使用，所述接收器部分804可以与内部RF线圈204一起使用。

与电路700类似，电路800是电荷平衡的。然而，电路700会根据负载电阻产生不同的波形，负载电阻是来自眼睛的电阻。因此，不同的眼睛和眼睛的不同状态可能导致不同的负载电阻，并且来自接收器部分704的波形的形状可能基于眼睛而变化。

相比之下，电路800是独立负载的。即，不管来自用户眼睛的负载电阻如何，从接收器部分804实现相同的波形形状。图8B图示了输入电压的波形。图8C和8D图示了不管负载电阻如何，在接收器部分804处实现的相同波形，证明了电路800独立负载的能力。

将焦点转移到电刺激的影响上，神经元通过电信号进行交流，电刺激已被证明可以诱导包括视网膜的神经可塑性和保护受损的神经系统。虽然对眼睛的电刺激已被证明是有效的，但重要的是要避免刺激其他神经元，包括中枢神经系统中的神经元。因此，使用COMSOL Multiphysics软件设计了一种接地系统配置，可以显著限制电压分布以及大脑中的感应电场。图9A示出了包括设计的接地系统和刺激电极的人体头部模型。图9B描绘了进入眼睛的聚焦电压分布。最初的模拟结果证明了选择性刺激眼睛和进一步增强沿视网膜的电压梯度的潜力。这显示了使用设计的地面几何形状对刺激视网膜以及避免诱发人体其他部位神经活动的最大功效。

初步计算结果表明，在尺寸适合大鼠眼睛(直径约8mm)的电子透镜上使用12匝电感为5μH的线圈，使用外部线圈通过1A电流供电的约100μA的交流电，这与目前商业化的人工视网膜系统所使用的电流大小相当，并且在极低频率下被证明是安全的。为了进一步改善外部线圈和透镜线圈之间的耦合，可以使用直接适用于所提出的几何形状的解决方案。在一些实施方案中，每天佩戴无线透镜一段有限的时间(主要是在晚上)，同时将发射外部线圈集成在可佩戴面罩或类似设备上。

染色质是DNA和蛋白质的紧密而高度有序的分层组装体，它们被错综复杂地折叠成三维，在细胞核内形成不同层次的组织。染色质堆积密度对基因表达的概率具有非单调影响，在染色质堆积密度低于染色质体积浓度的约35％时提高表达率，并由于分子拥挤的两种后果的竞争效应抑制较高染色质密度下的表达，增加转录复合物的结合并抑制扩散。最近的证据表明，染色质包装缩放(chromatin packing scaling)同时调节转录多样性(基因表达的动态范围)和基因转录中的细胞间变异。染色质包装调节细胞对其基因组空间的转录访问，并有望对广泛的细胞过程(例如，细胞分化、可塑性、组织再生和包括神经退行性疾病在内的许多疾病)产生影响。根据其在基因组中的位置，DNA甲基化还可以影响近端染色质结构并调节基因表达，在胚胎发育、X染色体失活、基因组印记和染色体稳定性等生物过程中发挥关键作用。因此，在基因组中以单个碱基分辨率确定甲基化状态是阐明其在调节许多细胞过程及其在疾病的状态破坏中的作用的重要步骤。

为了开始探索DNA甲基化变化在多大程度上可以响应体内电刺激而改变，对3只TES处理的和3只假手术处理的视网膜变性(RCS)大鼠视网膜进行全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)。WGBS能够以单碱基对分辨率检测DNA甲基化。用亚硫酸氢钠处理DNA可以区分CpG二核苷酸中的甲基化和未甲基化胞嘧啶。比较表观基因组学表明，某些基因组元件DNA甲基化的全基因组模式在脊椎动物中是保守的，这表明DNA甲基化的调节作用在物种之间也是保守的。简而言之，基因组DNA被剪切、末端修复、3'-腺苷酸化并与适配体连接。然后用亚硫酸氢钠处理与适配体连接的DNA，并进行PCR扩增以达到测序所需的产量。在NovaSeq 6000系统上进行亚硫酸氢盐转化文库的双端测序。使用开源Bismark Bisulfite Read Mapper的Bowtie2比对算法，将WGBS读数与褐家鼠RNOR6基因组组装体进行比对。

使用软件包metilene进行的数据分析确定了TES和假手术处理视网膜之间的2996个具有统计学意义的DNA甲基化差异。最显著的差异甲基化区域(DMR)和相关基因的无监督聚类分析将对照假手术组与电刺激组精确地分离(图10)。为了初步研究电刺激的分子机制，将与最重要的DMR相关的基因提交给通路分析软件(IPA)核心分析。最相关的是，p值小于10-3的最丰富的疾病类别与神经系统障碍有关，包括许多遗传性和X联障碍。与神经疾病进展有关的最显著的高甲基化基因是Kcnab2、Cnr和Nfia(图10)。肌动蛋白细胞骨架和pdgf信号是最丰富的典型通路，细胞骨架重塑在视网膜发育和神经元功能的多个方面都很重要。此外，还鉴定了促存活基因(prosurvival gene)bdnf和pdgfa的低甲基化，这些基因先前已被证明是电诱导的。重要DMR中的其他基因包括视网膜GTP酶调节因子基因(rpgr)和rpgr相互作用蛋白1(rpgrip1)的高甲基化。对这些DMR中的18个进行了靶向亚硫酸氢盐扩增子测序，以确认在独立的RCS大鼠视网膜组中响应TES刺激的DNA甲基化改变。在这18个DMR中，9个在全基因组和靶向亚硫酸氢盐测序运行之间显示出良好的一致性，相关性为0.725(图11)，验证了TES处理后鉴定DMR一致性的方法。

为了开始阐明观察到的表观遗传失调的功能后果，并提供有功能改变的差异甲基化基因与和神经保护靶向基因表达的更直接联系，在独立的TES(n＝2)组和假手术处理(n＝2)组RCS大鼠视网膜的与DMR相关的30个基因上进行定量逆转录聚合酶链式反应(qRTPCR)并进行了检测。检查响应随时间的持久性，据此在刺激后的同一天(第1、3和6天)收获大鼠视网膜。将基因表达标准化为内参基因(Gapdh)，然后将表达标准化为假刺激对照。通过主成分分析(PCA)绘制和分析与DMR相关的30个基因的RNA表达。在30个基因中，27个(90％)基因在任何时间点过表达n＝19或下调(n＝8)至少20％(图12)。三个基因的基因表达没有表现出改变。与假对照相比，PCA揭示了由表达改变的时间和持续时间定义的三种不同的表达潜力。有12个基因在TES处理后立即表现出快速(第0-1天)诱导，但表达是短暂的，并在第3-6天恢复到对照水平。这包括与健康视网膜发育相关的基因，例如Rpgr和Ablim123的上调，以及与细胞骨架重塑相关的基因，例如Sept9和Mpp6的上调，这也被证明在斑马鱼24的视网膜再生中很重要。另一组7个基因示出了快速和持续诱导表达直至第6天。这组基因包括Pdgfa和Slco5a1上调(图11)。Pdgfa不仅会受到电刺激3的刺激，而且会吸引星形胶质细胞并促进细胞存活。Slco5a1是在杆状细胞功能中功能已知的基因。

与对照相比，最后一组8个基因被下调，但表达减少被延迟并且直到TES后第6天才明显。这些包括已知促进血管生成和新生血管的基因的下调，例如Fgf8和Fech(图12)。由血管生成因子驱动的异常眼睛的一部分的新血管形成已被证明是几种致盲眼病的原因27，目前正在探索对这些因素(包括Fech28)的抑制作为潜在的治疗方法。此外，还发现促凋亡基因例如Rassf129(图11)被下调。由于在甲基化和基因表达分析中都鉴定了与细胞增殖和凋亡相关的基因，我们探索了TES处理也可以抑制视网膜细胞凋亡的可能性。为了实现这一点，在刺激后的多个时间点，对来自TES或假手术处理大鼠的全眼切片进行了裂解的胱天蛋白酶3)caspase-3，凋亡细胞的标志物)的免疫组织化学(IHC)染色。每只眼睛检查了三个不同的视野，每只眼睛的视网膜的所有层中平均计数了1353个细胞。在第6天后，在对照大鼠中发现的凋亡细胞百分比为1.46％，而TES处理的大鼠中为0.89(p值为0.021)。

总的来说，这些初步数据提供了令人信服的证据，证明TES可以诱导表观遗传和染色质水平的改变(图10-12)。最重要的是，研究表明，这些改变转化为功能改变，相应的基因表达改变可以直接与视网膜再生、细胞存活增加和细胞凋亡抑制、细胞骨架重塑和眼睛的一部分的新生血管形成抑制相关联，这支持了TES诱导神经表观遗传重塑导致视网膜的存活和再生的观点。因此，初步数据表明TES引发了视网膜中一系列有益的分子变化。

图13A-13B图示了被鉴定为在电刺激后被最显著改变的差异甲基化区域(DMR)，并且这些DMR可以用作推定的反应的生物标志物。图13A-13B的列表不是排他性列表。

方法/系统的示例性实施方案已经以说明性方式公开。因此，应以非限制性方式理解通篇使用的术语。尽管精通本领域的技术人员会想到对本文教导的微小修改，但应理解，旨在限制在本文所保证的专利范围内的是所有此类合理地落入根据本文做出贡献的本领域改进范围内的实施方案。除了根据所附权利要求及它们的等同物，所述范围不应受到限制。

Claims (20)

1.一种系统，包括：

外部射频(RF)线圈，用于发射RF信号；和

一种可穿戴设备，所述可穿戴设备被配置为可移除地设置在眼睛上，所述可穿戴设备包括配置为接收来自外部RF线圈的RF信号的多个内部RF线圈，以及配置为对眼睛的一部分或眼睛相邻区域进行电磁刺激的多个刺激电极，引起眼睛细胞或组织发生改变，或引起眼睛相邻的细胞或组织发生改变。

2.根据权利要求1所述的系统，所述系统还包括与所述多个内部RF线圈连接的一个或多个电容器。

3.根据权利要求1所述的系统，其中，接触式眼镜包括多个凹槽，所述多个内部RF线圈中的每个内部RF线圈被配置为位于所述多个凹槽的相应凹槽中。

4.根据权利要求1所述的系统，其中，所述内部RF线圈由金属或其他导电材料制成。

5.根据权利要求1所述的系统，其中电荷平衡波形用于刺激眼睛的一部分或与眼睛相邻的区域。

6.根据权利要求1所述的系统，其中，所述外部RF线圈被集成到被配置为由用户佩戴的面罩或眼镜框中。

7.根据权利要求1所述的系统，其中与眼睛相邻的区域是用于治疗干眼症的泪腺。

8.根据权利要求1所述的系统，其中所述眼睛的一部分是视网膜和视神经。

9.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述眼睛的一部分是睫状体。

10.一种引起眼睛内或眼睛相邻的细胞或组织发生改变的方法，所述方法包括：

通过外部RF线圈发射RF信号；

通过可移除地设置在眼睛上的可穿戴设备的多个内部RF线圈接收来自外部RF线圈的RF信号；和

通过多个刺激电极刺激眼睛的一部分或与眼睛相邻的区域，引起眼睛内或眼睛相邻的细胞或组织发生改变。

11.根据权利要求10所述的方法，所述方法还包括：

使用全基因组亚硫酸氢盐测序测量响应电刺激的差异甲基化区域(DMR)；

使用靶向亚硫酸氢盐扩增子测序验证DMR；

确认转录变化；和

使用DMR作为对电刺激反应的生物标志物，并在分子水平上监测作用持续时间。

12.根据权利要求10所述的方法，其中电荷平衡波形用于刺激眼睛的一部分或与眼睛相邻的区域。

13.根据权利要求10所述的方法，还包括由用户佩戴具有所述外部RF线圈的面罩或眼镜框。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述眼睛的一部分是视网膜和视神经。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述眼睛的一部分是睫状体。

16.一种可穿戴设备，包括：

外表面和内表面，所述内表面被配置为可移除地接触用户的眼睛；和

被配置为通过电磁刺激眼睛的一部分或眼睛相邻区域的多个刺激电极，引发眼睛内或眼睛相邻的细胞或组织发生变化。

17.根据权利要求16所述的可穿戴设备，所述可穿戴设备包括多个内部RF线圈，所述内部RF线圈被配置为从外部RF线圈接收RF信号。

18.根据权利要求17所述的可穿戴设备，其中所述多个内部RF线圈位于所述内表面上的凹槽内。

19.根据权利要求16所述的可穿戴装置，其中所述多个刺激电极由电池提供能量。

20.根据权利要求16所述的可穿戴设备，其中，所述多个刺激电极由摩擦发电机提供能量。

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