CN114605852A - 一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法 - Google Patents

一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，以蓝靛果为原料，应用低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理，以及低温等离子体辅助酶解提取蓝靛果花色苷，第一阶段采用低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理蓝靛果原料，破坏细胞网状结构，从而加速干燥，第二阶段采用低温等离子体预处理蓝靛果粉末，使粉末表面粗糙度增加，使粉末亲水性增大，促进胞内花色苷向提取溶剂溶出；第三阶段选用合适的酶对预处理后的蓝靛果粉末进行处理，通过本发明的方法从蓝靛果中提取花色苷提取量最高为42.26mg/g，高于本领域其他方法的提取量。本发明操作工艺简单、提取量高、耗时短、溶剂消耗量少，且降低了花色苷的生产成本，有利于实现花色苷的工业化生产。

Description

一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法
技术领域
本发明涉及一种提取花色苷的方法，特别涉及一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法。
背景技术
蓝靛果(Lonicera caerulea L.)作为一种新兴野生浆果资源，含有多种活性成分，尤其是含有远高于蓝莓、蔓越莓等浆果的高浓度花色苷，是一种作为提取花色苷的优良原料。花色苷是一种天然的水溶性植物着色剂，随pH值变化，可能会出现红色、紫色、蓝色或黑色。有改善高血压、提高肝脏解毒能力、抗病毒、预防肿瘤、抗高血脂、抵御疲劳、抗氧化作用，在食品、医药以及化妆品等行业有着巨大的应用潜力。
目前，对蓝靛果花色苷的提取方法主要是利用以酸化乙醇等有机试剂为提取溶剂进行提取，但存在提取时间长，所需有机溶剂量大，提取效率低等缺点。虽有研究学者辅以超高压、超声波、微波、高压脉冲电场等技术，但也由于成本、环境、工艺条件等因素限制，提取率难以大幅提高，较难实现产业化。此外，还有生物酶解提取，由于生物酶解提取可在非有机试剂下进行，具有高效、专一和反应温和的特点，所得产物纯度、稳定性、活性都较高，无污染，可以解决有机溶剂回收困难，用量大的缺点；但是，生物酶法也存在催化效率低，提取时间长的缺点。
由于蓝靛果会在短时期内发生大面积成熟，使得其采摘周期非常短，鲜果含水量极高，包括采摘过程处理、储存设施不当，运输不方便等原因，果实易腐烂变质，新鲜果实难以储存，所以只有一小部分新鲜的蓝靛果在当季被食用，大部分在收获后立即冷冻保存以延长其保质期。研究发现，冷冻储存的蓝靛果也将降解极大部分活性成分，在提取蓝靛果花色苷的过程中不同干燥方法对蓝靛果物理品质、活性成分等也会有显著影响，为了能够制得具有较好物理特性、高含量生物活性成分化合物以及更易保存的蓝靛果干制品，选择一种合适的干燥方式同样非常重要。在现有的提取蓝靛果花色苷方法中，常用的干燥方式包括真空冷冻、真空、热风干等，但这些方法所得蓝靛果干制品物理特性、复水性、活性成分保留量等均较差，不利于花色苷等活性成分的提取且降低经济效益。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明将低温等离子体技术与生物酶技术联合提取蓝靛果中花色苷，得到一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：
将冷冻蓝靛果进行低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理，干燥后进行粉碎、过筛制备成干燥的蓝靛果粉末；
(2)低温等离子体前处理：
将蓝靛果粉末(均匀平铺在容器中，放入低温等离子处理仪中)在真空度80-95Pa，放电电源功率为100-300W，进气量为120-200mL/min条件下处理时间15-45s，进行改性；
(3)酶解：
将经步骤(2)低温等离子体预处理后的蓝靛果粉末按1：30-50g/mL的料液比加入复合酶提取溶液中进行酶解提取，酶解温度为40-60℃，酶解pH为1-3，酶解时间为40-80min；
(4)离心提取：
酶解后灭酶处理，离心分离得到蓝靛果花色苷提取液。
进一步的，步骤(1)中，低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理步骤包括：先在真空度100Pa以下、等离子体放电电源功率为200W、进气量为150mL/min条件下，预处理30-45s；再在-80℃、真空度100Pa条件下进行冷冻干燥，以湿基计含水率低于5％时终止；干燥后粉碎至过40目筛。
进一步的，步骤(3)中，所述复合酶为纤维素酶与果胶酶按质量比为1:2的比例混合；提取液中复合酶的含量为蓝靛果粉末质量的3％。
进一步的，步骤(4)中，灭酶10min，然后在9000r/min条件下离心处理15min，分离取提取液。
本发明工作原理及有益效果：
低温等离子体技术通过蚀刻增大植物表面粗糙度及亲水性，促进活性成分溶出，具有处理时间短、操作工艺简单、无化学污染、高效快速、干法化、适用范围广泛等优点，从而可以较好保持样品原有质量属性，适于在食品领域应用，尤其在非热加工、材料表面改性和增强活性成分提取领域具有广泛的应用前景。
本发明首次采用低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷，将低温等离子体与复合酶联用，使非热加工技术与生物酶技术有机结合。
本发明所述方法第一阶段采用低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理蓝靛果原料，可破坏细胞网状结构，促进胞内水分向外迁移，从而加速干燥，使得干燥时间缩短，促进多酚氧化酶和过氧化物酶的降解，提高活性成分保留量，增大自由基清除活性；其蓝靛果干制品物理特性、复水性更优，低温等离子体辅助真空冷冻干燥45s干燥样品表现出最高的活性成分保留和自由基清除活性。
第二阶段采用低温等离子体预处理蓝靛果粉末，通过其蚀刻作用使粉末表面粗糙度增加，形成裂缝、孔洞，同时其活性物种使粉末亲水性增大，水化特性提高，促进胞内花色苷向提取溶剂溶出；同时其活性粒子降解酚氧化酶和过氧化物酶，增强苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶活性，抑制花色苷的降解。
第三阶段选用合适的酶对预处理后的蓝靛果粉末进行处理，通过酶对蓝靛果细胞壁特定活性位点结合，使得细胞壁成分(纤维素、半纤维素及果胶等)发生降解，减少细胞壁与细胞间质的阻力，从而促进花色苷的溶出，并提高提取效率，缩短提取时间，减少溶剂消耗，从而达到高效提取。
本发明的方法具有操作工艺简单、易行、安全，对蓝靛果花色苷的提取更为精准，有助于提高工业生产中花色苷的提取效率。所采用的试剂均为无毒、廉价、量产的化学试剂，不需要使用强烈的提取溶剂，既有效地保护了花色苷的结构，又减少了环境中废弃物的排放，满足了环保和工业化的要求，从而达到绿色提取。
附图说明
图1为本发明不同干燥方式对微观结构的影响(a：热风干燥HD；b：真空干燥VD；c：真空冷冻干燥FD；d：低温等离子体辅助真空冷冻干燥CPFD-45s)；
图2为本发明不同干燥方式对多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD的影响；
图3为本发明不同干燥方式对活性成分的影响；
图4为本发明低温等离子体预处理(a：预处理功率、b：预处理时间、c：进气量、d：预处理重量)对蓝靛果花色苷提取量的影响效果图；
图5为本发明酶解过程(a：酶添加量、b：酶解时间)对蓝靛果花色苷提取量的影响效果图；
图6为本发明料液比变化对蓝靛果花色苷提取量的影响效果图；
图7为本发明各因素(K：预处理功率、L：预处理时间、M：进气量、N：预处理重量、O：酶添加量、P：酶解时间、Q：料液比)标准化效应的Pareto图。
具体实施方式
实施例一：
本实施例提供的一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：
将冷冻蓝靛果进行低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理：利用低温等离子处理仪，先在真空度100Pa以下、等离子体放电电源功率为200W、进气量为150mL/min条件下，预处理45s；再在-80℃、真空度100Pa条件下进行冷冻干燥；干燥后粉碎至过40目筛，制备成干燥的蓝靛果粉末；
(2)低温等离子体前处理：
称取步骤(1)中已处理的蓝靛果粉末0.5g，将蓝靛果粉末均匀平铺在容器中，放入低温等离子处理仪内，在真空度80-95Pa，放电电源功率为186W，进气量为160mL/min条件下处理时间28s，进行改性；
(3)酶解：
将经步骤(2)低温等离子体预处理后的蓝靛果粉末按1：41g/mL的料液比加入复合酶提取溶液中进行酶解提取，酶解温度为40-60℃，酶解pH为1-3，酶解60min；所述复合酶为纤维素酶与果胶酶按质量比为1:2的比例混合；提取液中复合酶的含量为蓝靛果粉末质量的3％；
(4)离心提取：
酶解后灭酶10min，然后在9000r/min条件下离心处理15min，分离得到蓝靛果花色苷提取液。
取提取液分别与pH 1.0的氯化钾-盐酸缓冲溶液和pH 4.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液混合，稀释90倍，于40℃恒温振荡箱中平衡反应20min。以蒸馏水为空自对照分别在510nm和700nm下测定吸光值，通过pH示差法计算花色苷提取量。
此条件下蓝靛果花色苷提取量为42.26mg/g。
实施例二：
本实施例提供的一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：
将冷冻蓝靛果进行低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理：利用低温等离子处理仪，先在真空度100Pa以下、等离子体放电电源功率为200W、进气量为150mL/min条件下，预处理45s；再在-80℃、真空度100Pa条件下进行冷冻干燥；干燥后粉碎至过40目筛，制备成干燥的蓝靛果粉末；
(2)低温等离子体前处理：
称取步骤(1)中已处理的蓝靛果粉末0.5g，将蓝靛果粉末均匀平铺在容器中，放入低温等离子处理仪内，在真空度80-95Pa，放电电源功率为200W，进气量为160mL/min条件下处理时间30s，进行改性；
(3)酶解：
将经步骤(2)低温等离子体预处理后的蓝靛果粉末按1：40g/mL的料液比加入复合酶提取溶液中进行酶解提取，酶解温度为40-60℃，酶解pH为1-3，酶解60min；所述复合酶为纤维素酶与果胶酶按质量比为1:2的比例混合；提取液中复合酶的含量为蓝靛果粉末质量的3％；
(4)离心提取：
酶解后灭酶10min，然后在9000r/min条件下离心处理15min，分离得到蓝靛果花色苷提取液。
取提取液分别与pH 1.0的氯化钾-盐酸缓冲溶液和pH 4.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液混合，稀释90倍，于40℃恒温振荡箱中平衡反应20min。以蒸馏水为空自对照分别在510nm和700nm下测定吸光值，通过pH示差法计算花色苷提取量。
此条件下蓝靛果花色苷提取量为41.95mg/g。
实施例三：
本实施例提供的一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：
将冷冻蓝靛果进行低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理：利用低温等离子处理仪，先在真空度100Pa以下、等离子体放电电源功率为200W、进气量为150mL/min条件下，预处理45s；再在-80℃、真空度100Pa条件下进行冷冻干燥；干燥后粉碎至过40目筛，制备成干燥的蓝靛果粉末；
(2)低温等离子体前处理：
称取步骤(1)中已处理的蓝靛果粉末0.5g，将蓝靛果粉末均匀平铺在容器中，放入低温等离子处理仪内，在真空度80-95Pa，放电电源功率为200W，进气量为160mL/min条件下处理时间15s，进行改性；
(3)酶解：
将经步骤(2)低温等离子体预处理后的蓝靛果粉末按1：50g/mL的料液比加入复合酶提取溶液中进行酶解提取，酶解温度为40-60℃，酶解pH为1-3，酶解60min；所述复合酶为纤维素酶与果胶酶按质量比为1:2的比例混合；提取液中复合酶的含量为蓝靛果粉末质量的3％；
(4)离心提取：
酶解后灭酶10min，然后在9000r/min条件下离心处理15min，分离得到蓝靛果花色苷提取液。
取提取液分别与pH 1.0的氯化钾-盐酸缓冲溶液和pH 4.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液混合，稀释90倍，于40℃恒温振荡箱中平衡反应20min。以蒸馏水为空自对照分别在510nm和700nm下测定吸光值，通过pH示差法计算花色苷提取量。
此条件下蓝靛果花色苷提取量为40.23mg/g。
实施例一至三所用的pH示差法计算公式为：
Figure BDA0003573946090000081
式中：△A＝(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5；A510为510nm下蓝靛果花色苷的吸光度值；A700为700nm下蓝靛果花色苷的吸光度值；M为矢车菊-3-葡萄糖苷相对分子质量，449.2mg/mol；f为稀释倍数；V为缓冲溶液定容后的体积，mL；m为蓝靛果干果质量，g；ξ为矢车菊-3-葡萄糖苷摩尔消光系数，26900；b为光程，1cm。
本发明对于不同干燥方式对干燥蓝靛果花色苷保留率的影响进行了对比实验，测定四种干燥方式(热风干燥HD、真空干燥VD、真空冷冻干燥FD和低温等离子体辅助真空冷冻干燥CPFD)对所制得的干燥蓝靛果中花色苷保留率的影响，热风干燥温度设定为50℃，风速为2m/s；真空干燥温度设定为50℃，真空度设定为：0.01MPa；真空冷冻干燥温度设定为-80℃，真空度100Pa；低温等离子体辅助真空冷冻干燥方法如本发明步骤(1)中所述。结果见图1-3和表1所示。
由图1可知，通过热风干燥HD的蓝靛果样品表面呈现出比真空干燥VD和真空冷冻干燥FD样品更致密的结构和细胞收缩，这导致干燥产品的硬度更高。真空干燥VD具有不规则的较大孔隙和结构塌陷，真空冷冻干燥FD出现大而清晰的网状细胞壁结构，从而导致更厚的孔壁和均匀的多孔性。相比之下，HD的紧凑结构可能阻碍了活性成分的提取。相对于FD样品均匀的网状结构而言，等离子体预处理使细胞壁网状结构受损、变形从而变得松散，这有助于干燥过程中水分的转移，从而提高干燥速率，缩短干燥时间。通常情况下，冷等离子体预处理会产生不同的电子和离子，破坏细胞壁间氢键与其他非共价键，这种中断通过降低细胞壁的硬度并导致细胞内空间和空洞来减少干燥时间。这也可能与等离子体处理过程中产生大量形成的活性物质(主要是臭氧)有关，这些活性物质会使植物组织的细胞壁降解。等离子体预处理诱导的样品表面改性通过破坏细胞内键、缩小细胞壁、产生细胞内空间和在细胞壁中产生微孔来改善干燥过程。
由图2可知，CPFD则降低了蓝靛果样品PPO和POD的活性。相对于只进行FD而言，等离子体预处理分别降低了57.14％PPO(CPFD-45s)和54.81％POD(CPFD-60s)的酶活性。
由图3可知，等离子体预处理对花色苷同样表现出良好的保留效果，预处理15-45s均表现出显著优于FD的花色苷提取量，等离子体预处理同样在多酚保留方面显示出优良的性能，45s预处理组显示出最大多酚提取量(35.97±1.34mg/g)，分别高于其他三种干燥方式87.10％(HD)，13.72％(VD)，12.85％(FD)，表明等离子体预处理可以改善干燥样品中酚类化合物的保存。
表1不同干燥方式对干燥蓝靛果花色苷保留率的影响
Figure BDA0003573946090000101
由表1可知，低温等离子体辅助真空冷冻干燥的蓝靛果中花色苷保留率最高，达89.63％。表明低温等离子体辅助真空冷冻干燥相比于其他三种干燥方法，可以极大提高干燥蓝靛果中花色苷的保留率，这有利于后续花色苷的高效提取。所以将低温等离子辅助真空冷冻干燥用于干燥蓝靛果的制备。
实验一、低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷单因素试验
(1)预处理功率对蓝靛果花色苷提取量的影响
根据上述提取方法，将5组0.5g的蓝靛果粉末，分别在预处理时间30s，进气量160mL/min，复合酶添加量3％，酶解时间60min，料液比1：40g/mL的条件下，研究预处理功率分别为100、200、300、400和500W时对蓝靛果花色苷提取量的影响。
单因素试验中预处理功率对蓝靛果花色苷提取量的影响如图4a所示，当预处理功率在100-200W之间时，随着功率的增加，花色苷提取量呈现逐渐上升的趋势，当功率达到200W后，花色苷提取量开始逐渐下降。预处理功率在100-300W之间的提取量较高，因此根据结果，选择预处理功率为100-300W进行后续试验。
(2)预处理时间对蓝靛果花色苷提取量的影响
根据上述提取方法，将5组0.5g的蓝靛果粉末，分别在预处理功率100W，进气量160mL/min，复合酶添加量3％，酶解时间60min，料液比1：40g/mL的条件下，研究预处理时间分别为15、30、45、60和75s时对蓝靛果花色苷提取量的影响。
单因素试验中预处理时间对蓝靛果花色苷提取量的影响如图4b所示，当预处理时间在15-30s之间时，随着时间的增加，花色苷提取量呈现上升的趋势，当时间达到30s后，花色苷提取量开始降低。预处理时间在15-45s之间的提取量较高，因此根据结果，选择预处理时间为15-45s进行后续试验。
(3)进气量对蓝靛果花色苷提取量的影响
根据上述提取方法，将5组0.5g的蓝靛果粉末，分别在预处理功率100W，预处理时间30s，复合酶添加量3％，酶解时间60min，料液比1：40g/mL的条件下，研究进气量分别为40、80、120、160和200mL/min时对蓝靛果花色苷提取量的影响。
单因素试验中进气量对蓝靛果花色苷提取量的影响如图4c所示，当进气量在40-160mL/min之间时，随进气量增加，花色苷提取量逐渐增大，当进气量达到160mL/min后，花色苷提取量开始降低。进气量在120-200mL/min之间的提取量较高，因此根据结果，选择进气量为120-200mL/min进行后续试验。
(4)预处理重量对蓝靛果花色苷提取量的影响
根据上述提取方法，将5组蓝靛果粉末，分别在预处理功率100W，预处理时间30s，进气量160mL/min，复合酶添加量3％，酶解时间60min，料液比1：40g/mL的条件下，研究预处理重量分别为0.5、1、1.5、2和2.5g时对蓝靛果花色苷提取量的影响。
单因素试验中预处理重量对蓝靛果花色苷提取量的影响如图4d所示，随预处理重量增加，花色苷提取量逐渐减小。预处理重量在0.5-1.5g之间的提取量较高，因此根据结果，选择预处理重量为0.5-1.5g进行后续试验。
(5)酶添加量对蓝靛果花色苷提取量的影响
根据上述提取方法，将5组0.5g的蓝靛果粉末，分别在预处理功率100W，预处理时间30s，进气量160mL/min，酶解时间60min，料液比1：40g/mL的条件下，研究复合酶添加量分别为1、2、3、4和5％时对蓝靛果花色苷提取量的影响。
单因素试验中复合酶添加量对蓝靛果花色苷提取量的影响如图5a所示，当复合酶添加量在1-3％之间时，随复合酶添加量增加，花色苷提取量逐渐增大，当添加量达到3％后，花色苷提取量趋于稳定。复合酶添加量在2-4％之间的提取量较高，因此根据结果，选择复合酶添加量为2-4％进行后续试验。
(6)酶解时间对蓝靛果花色苷提取量的影响
根据上述提取方法，将5组0.5g的蓝靛果粉末，分别在预处理功率100W，预处理时间30s，进气量160mL/min，复合酶添加量3％，料液比40g/mL的条件下，研究酶解时间分别为20、40、60、80和100min时对蓝靛果花色苷提取量的影响。
单因素试验中酶解时间对蓝靛果花色苷提取量的影响如图5b所示，当酶解时间在20-60min之间时，随酶解时间增加，花色苷提取量显著增大，当时间达到60min后，花色苷提取量逐渐降低。酶解时间在40-80min之间的提取量较高，因此根据结果，选择酶解时间为40-80min进行后续试验。
(7)料液比对蓝靛果花色苷提取量的影响
根据上述提取方法，将5组0.5g的蓝靛果粉末，分别在预处理功率100W，预处理时间30s，进气量160mL/min，复合酶添加量3％，酶解时间60min的条件下，研究料液比分别为1：20、1：30、1：40、1：50、和1：60g/mL时对蓝靛果花色苷提取量的影响。
单因素试验中料液比对蓝靛果花色苷提取量的影响如图6所示，当料液比在1∶20-1∶40g/mL之间时，随料液比增加，花色苷提取量显著增大，当料液比达到1∶40g/mL后，花色苷提取量逐渐降低。料液比在1∶30-1∶50g/mL之间的提取量较高，因此根据结果，选择料液比为1∶30-1∶50g/mL进行后续试验。
实验二、低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷Plackett-Burman试验
在单因素基础上，采用Plackett-Burman试验进一步研究七个因素对花色苷提取量的重要影响，从而筛选显著因素进行进一步的优化。表2列出了以花色苷提取量为响应值的Plackett-Burman模型的预测值和测量值。
表2Plackett-Burman编码及其预测值和实测值
Figure BDA0003573946090000131
注：K-预处理功率；L-预处理时间；M-进气量；N-处理重量；O-酶添加量；P-酶解时
间；Q-料液比。
通过Plackett-Burman建立的TAC的一阶模型为：
Y1＝32.13+0.01329K+0.06506L-0.00023M-0.00246N-0.0761O+0.01162P+0.0467Q
图7为各变量标准化效应的Pareto图。花色苷提取量受K、L、P和Q的积极影响，以及M、N和Q的消极影响。且由于K、L和Q因素的值超过了临界值(2.78)，它们对花色苷提取量的积极影响是显著的(P<0.05)。因此，K、L和Q被选为进一步响应面优化的关键因素。
实验三、低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷响应面优化试验
根据Plackett-Burman试验结果，选取对蓝靛果花色苷提取量影响显著的预处理功率(R)、预处理时间(S)和料液比(T)三个因素，根据Box-Behnken设计原则设计响应面优化试验，利用Design Expert软件处理数据。响应面试验变量与编码及结果见表3。
表3响应面试验设计及结果
Figure BDA0003573946090000141
对表3试验数据进行回归分析，得到响应变量(预处理功率、预处理时间和料液比)与响应值(花色苷提取量)之间的二次多项回归方程：
Y2＝41.61+0.46R-0.29S+0.23T-0.081RS+0.11RT+0.16ST-0.33R2-1.18S2-0.99T2
二次回归模型显著性检验与方差分析结果见表4。由表4可知，模型F值为61.75，P值<0.0001，回归模型极显著模型，说明该模型有统计学意义；方程一次项中R为极显著因素,S、T为显著因素，因素对TAC影响的主次顺序为：R＞S＞T；方程二次项中R2、S2、T2均为极显著因素。模型失拟项的P值为0.6304和F值为0.64可以看出，失拟项与纯误差之间差异不显著(P＞0.05)。模型决定系数R2＝0.9876，表明响应值与自变量之间的线性关系显著，模型拟合度较好，可用于花色苷提取的理论预测；模型的调整确定系数AdjR2＝0.9716，说明回归方程与实验值的拟合程度较高，试验误差较小，说明该模型能够较好的解释TAC的变化。模型的变异系数C.V.为0.51％，表明模型充分性、可靠性较好，精度较高。此外，信噪比是信号与噪音比率，大于4是理想的。AQ＝22.073远大于4，说明模型具有足够信号响应。综上，可以用于分析低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷工艺研究。
表4二次回归模型的方差分析
Figure BDA0003573946090000161
注：R-压力；S-保压时间；T-料液比。显著性水平：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
通过响应面模型分析得到低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的最佳提取条件为：预处理功率186.38W，预处理时间27.93s，料液比41.44g/mL，花色苷提取量的理论值为41.81mg/g。基于实验的可操作性对预测最佳参数进行微调且进行三次平行试验：预处理功率186W，预处理时间28s，料液比41g/mL。在调整后的最优参数条件下，花色苷提取量为42.26mg/g。实际值与理论值的偏差为1.08％，表明优化模型准确可靠。
实验四、蓝靛果中提取花色苷对比试验
对比酶解蓝靛果提取花色苷和低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷两种方法：
酶解法：与本发明实施例1基本一致，区别在于无步骤(2)，且料液比为1：40g/mL；
低温等离子体辅助酶解法：即本发明实施例一。
以花色苷提取量为主要指标，同时测定提取液中黄酮、多酚提取量以及DPPH和ABTS自由基清除活性，并通过超高效液相色谱质谱联用仪测定两种方法的单体数量。从多方面对比分析酶解蓝靛果提取花色苷和低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷在最优条件下的效果。测定结果表示为三次平行试验的平均值，结果如表5所示。
表5提取方法对比结果
Figure BDA0003573946090000171
由表5可知，本发明提出的双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的提取量最高，达到了42.26mg/g，比单独使用酶解提高了约26.83％，其提取液抗氧化活性也比酶解法提高了约43.85％(DPPH)，19.24％(ABTS)；
低温等离子体辅助酶解的花色苷提取液中黄酮、多酚提取量也显著高于酶解；且花色苷单体数量也高于酶解。

Claims (4)

1.一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)原料预处理：
将冷冻蓝靛果进行低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理，干燥后进行粉碎、过筛制备成干燥的蓝靛果粉末；
(2)低温等离子体前处理：
将蓝靛果粉末在真空度80-95Pa，放电电源功率为100-300W，进气量为120-200mL/min条件下处理时间15-45s，进行改性；
(3)酶解：
将经步骤(2)低温等离子体预处理后的蓝靛果粉末按1：30-50g/mL的料液比加入复合酶提取溶液中进行酶解提取，酶解温度为40-60℃，酶解pH为1-3，酶解时间为40-80min；
(4)离心提取：
酶解后灭酶处理，离心分离得到蓝靛果花色苷提取液。
2.根据权利要求1所述的一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，其特征在于：步骤(1)中，低温等离子体辅助真空冷冻干燥处理步骤包括：先在真空度100Pa以下、等离子体放电电源功率为200W、进气量为150mL/min条件下，预处理30-45s；再在-80℃、真空度100Pa条件下进行冷冻干燥，以湿基计含水率低于5％时终止；干燥后粉碎至过40目筛。
3.根据权利要求1所述的一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述复合酶为纤维素酶与果胶酶按质量比为1:2的比例混合；提取液中复合酶的含量为蓝靛果粉末质量的3％。
4.根据权利要求1所述的一种双重低温等离子体辅助酶解蓝靛果提取花色苷的方法，其特征在于：步骤(4)中，灭酶10min，然后在9000r/min条件下离心处理15min，分离取提取液。
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