CN114601969B - 含黑磷复合材料及其制备方法、应用 - Google Patents

含黑磷复合材料及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含黑磷复合材料及其制备方法、应用。含黑磷复合材料的制备方法包括下述步骤：将磷酸镁骨水泥支架表面负载有BPP纳米片即可；磷酸镁骨水泥支架为孔径结构；BPP纳米片的制备方法包括下述步骤：黑磷与原花青素的混合物经超声后，第一次离心，收集上清液，第二次离心后，收集沉淀即为BPP纳米片。其具有优异的生物相容性，能够促进BMSCs的粘附、增殖与分化；光热抗肿瘤和抗菌效果显著，可用于骨髓炎或骨肿瘤切除后的骨缺损修复，为治疗肿瘤相关的骨缺损提供了一种有效的方法。

Description

含黑磷复合材料及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及一种含黑磷复合材料及其制备方法、应用。
背景技术
骨肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，给人类带来巨大痛苦，严重影响人们正常生活。手术切除是有效治疗的方法，但是会不可避免地导致骨缺损甚至术后细菌感染，同时还会有残余的肿瘤细胞存在。化疗和放疗虽然能在一定程度上杀死肿瘤细胞，但是对人体的副作用极大。光热疗法具有高效性和微创性，是一种很有前途的治疗方法。因此，制备具有光热效应的骨修复材料，赋予其抗癌和抗菌功能，可以用于杀死残余的癌细胞和感染细菌。
黑磷(BP)作为一种新型2D层状材料，具有高的NIR吸收和光热转换效率，是一种良好的光热材料，虽然在半导体材料、电子器件、光电能源转化、能源储存器件、骨修复、药理学、成像诊断领域，以及生物传感器和生物印刷等领域具有一定的应用。现有技术中有将纯BP纳米片应用于骨修复情况，例如是将纯BP纳米片添加到其他材料中，如3D打印生物玻璃，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)水凝胶等，以提高其成骨能力，用于骨修复。但是由于纯BP纳米片与氧、可见光和水的相互作用使BP纳米片容易被氧化和降解，成为磷酸盐和亚磷酸盐，从而导致光热性能衰减和治疗效果不佳，该不稳定性限制了它们的广泛应用。因此，研究者们通常对BP进行改性以提高其稳定性。例如：现有技术中利用聚合物(例如PLGA)包裹BP，使其无法接触空气或水进而稳定BP，但这种方法具有以下缺点：在聚合物降解后，BP在周围环境中又会很快降解，同时，聚合物的包裹对原始的BP二维结构造成破坏。
磷酸镁骨水泥(MPC)是由氧化镁(MgO)与酸性磷酸盐溶液反应形成的。首先，氧化物溶解到溶液中，形成阳离子与水的溶液。溶解的氧化镁阳离子与溶液中存在的磷酸盐阴离子反应，形成无定形凝胶。随着更多的溶解发生，凝胶溶解和水泥反应导致混合物增稠，生成结晶，反应约束导致水泥晶体在未反应的剩余氧化物核心周围生长。MPC由于具有凝结快、早期强度高、耐久性好的特点，被用作桥梁桥面、人行道、机场跑道等的快速修复材料。
目前临床上，针对骨肿瘤切除后的骨缺损修复问题，所植入的材料既需要具有骨修复能力，同时需要具有一定的抗癌、抗菌作用，以清除病灶周围残留的癌细胞及防止细菌感染。同样地，骨髓炎情况下的骨缺损修复也需要骨修复材料兼具成骨与抗菌的作用。虽然MPC具有良好的强度、生物相容性和可降解性，在骨修复领域也具有一定的应用。但是目前将MPC应用于骨修复时，仅具有一定促进成骨的作用，无法满足实际临床需求。该问题亟待解决。
原花青素(PC)是天然存在的化合物，在水果、坚果、蔬菜、花朵和树皮中广泛存在。它们是一类酚类化合物，由儿茶素、表儿茶素及表儿茶素没食子酸酯连接成不同聚合度的混合物。葡萄籽是原花青素的特别丰富的来源。葡萄籽原花青素(GPC)主要是单体儿茶素的二聚体、三聚体和高聚合寡聚体。单倍体儿茶素结构如下：
Figure BDA0003338685820000021
目前，现有技术中，将黑磷(BP)与磷酸镁骨水泥(MPC)复合，或者原花青素(PC)与磷酸镁骨水泥(MPC)复合制备骨修复复合材料尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术中缺少满足临床实际需求的骨修复材料的缺陷，提供了一种含黑磷复合材料及其制备方法、应用。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种含黑磷复合材料的制备方法，其包括下述步骤：
将磷酸镁骨水泥支架(MS)表面负载有BPP纳米片即可；
其中，所述磷酸镁骨水泥支架(MS)为孔径结构；其中，所述BPP纳米片的制备方法包括下述步骤：所述黑磷BP与所述原花青素PC的混合物经超声后，第一次离心，收集上清液，第二次离心后，收集沉淀即为BPP纳米片；
所述超声的温度为-2℃～10℃；所述黑磷与所述原花青素的混合物中的溶剂为极性溶剂；所述第一次离心的转速为1000～5000r/min。
本发明中，若BPP纳米片若只吸附于MPC片表面，会存在吸附量少、容易掉落的问题，因此所述磷酸镁骨水泥支架(MS)需为具有孔径的支架结构。
本发明中，所述磷酸镁骨水泥支架(MS)的空隙率可为60～90％，较佳地为75～85％，例如80％或者83％。
本发明中，所述磷酸镁骨水泥支架(MS)上的孔径较佳地在200μm～500μm，更佳地为300～400μm。大孔的支架结构一方面增加材料比表面积，同时增加BPP的吸附量；另一方面，大孔结构有利于骨组织的长入，刺激骨再生。
本发明中，所述磷酸镁骨水泥支架(MS)可通过本领域常规方法制备，较佳地通过下述步骤制备：
1)将磷酸镁骨水泥粉末(MPC粉末)和致孔剂的混合物压制成片，得MPC片；
2)所述MPC片先固化后，再在溶剂中溶解所述致孔剂形成孔，即得磷酸镁骨水泥支架(MS)。
步骤1)中，所述磷酸镁骨水泥粉末(MPC粉末)的制备方法较佳地包括下述步骤：将氧化镁、磷酸氢钙和磷酸二氢钠和羟基磷灰石混合均匀即可。
其中，所述氧化镁、所述磷酸氢钙和所述磷酸二氢钠的摩尔比可为本领域常规，较佳地为(1.5～2.5)：(1.5～2.5)：1，更佳地为2：2：1。
一实施例中，所述氧化镁通过下述步骤制得：碱式碳酸镁((MgCO3)4·Mg(OH)2·5H2O)经煅烧后即得。
所述煅烧的温度可为1500～1700℃，较佳地为1600℃。
所述煅烧的时间可为3.5～4.5，较佳地为4h。
其中，所述羟基磷灰石的用量较佳地为8～12wt.％，更佳地为10wt.％，上述百分比为羟基磷灰石占“氧化镁、磷酸氢钙和磷酸二氢钠”总量的重量百分比。
步骤1)中，所述磷酸镁骨水泥粉末和所述致孔剂的质量比可为本领域常规，较佳地为1：(1～4)，例如1:2或者1:3。若致孔剂用量过少，会导致骨水泥支架制备不完善，且支架内部的致孔剂颗粒无法完全溶解；而若致孔剂用量过高，则会导致骨水泥支架强度不够，影响后续应用。
一实施例中，磷酸镁骨水泥粉末和致孔剂的质量比为1：2时，所述含黑磷复合材料的孔径范围可为300-400μm，孔隙率略有升高，约83％。
一实施例中，磷酸镁骨水泥粉末和致孔剂的质量比为1：1时，所述含黑磷复合材料的孔径范围可为300-400μm，孔隙率约80％。
步骤1)中，所述致孔剂的粒径较佳地为250～350μm，更佳地为300μm。致孔剂粒径上述范围内，所得磷酸镁骨水泥支架(MS)上孔径分布大小更加均匀。
步骤1)中，所述致孔剂的种类可为本领域常规，例如氯化钠。
步骤1)中，所述压制成片的方法可为本领域常规，一般采用压片机。
步骤1)中，所述压制成片的过程中，采用的压力可为常规，例如3～5MPa，较佳地为4MPa。
步骤1)中，所述MPC片的尺寸或规格可根据实际需求进行制备，例如Φ12×3mm。
步骤2)中，所述固化的操作和条件可为本领域常规，一般使得MPC片内的物质充分反应成MPC骨水泥即可。
步骤2)中，所述固化的时间可为65～80h，较佳地为72h。
步骤2)中，所述固化的温度可为30～40℃，较佳地为37℃。
步骤2)中，所述固化的溶剂可为水。
一实施例中，所述固化的操作为：37℃，100％水环境中固化72h。
步骤2)中，所述在溶剂中溶解致孔剂形成孔的操作可为本领域常规，一般在溶剂中浸泡即可。所述浸泡的时间可为65～80h，较佳地为72h。采用的溶剂可为水。
本发明中，所述表面负载BPP纳米片的方法可为本领域常规，较佳地为浸泡。
其中，所述浸泡的方式可为本领域常规，较佳地按下述步骤进行：将所述磷酸镁骨水泥支架MS浸泡于含有BPP纳米片的溶液后，干燥、重复浸泡干燥即可。
所述浸泡的时间可根据实际需求调整，一般为5～20min，例如10min或者15min。
所述含有BPP纳米片的溶液中，BPP纳米片的浓度可根据实际需求调整，例如0.5～5mg/mL，较佳地为1mg/mL。
所述含有BPP纳米片的溶液中，采用的溶剂可为本领域常规，例如醇类溶剂，较佳地为乙醇。
所述含有BPP纳米片的溶液还可为含有BPP纳米片的植酸溶液或者含有BPP纳米片的聚多巴胺溶液。
所述BPP纳米片的植酸溶液的pH值较佳地为5～6。一较佳地实施例中，所述植酸溶液通过下述方法制得：调节原料植酸溶液的pH至5～6即可。其中，所述原料植酸溶液的质量分数可为70％，可市售获得，购于购于上海麦克林生化有限公司。
所述含有BPP纳米片的聚多巴胺溶液较佳地通过下述步骤制得：将盐酸多巴胺粉末溶解于PBS缓冲液中，混合反应得到聚多巴胺溶液；将BPP纳米片添加至聚多巴胺溶液中混合均匀即可。
所述干燥的方式可为本领域常规，例如真空干燥。
所述重复的次数可根据实际需求调整，例如2～5次，例如3次。
本发明中，较佳地，所述BPP纳米片横向尺寸为100-200nm，平均厚度约为13nm。
本发明中，所述BPP纳米片中一般含有P-O-C配位键。
本发明中，所述黑磷与所述原花青素的质量比较佳地≤1:1，更佳地为1:(1～2)，例如1:1或1:1.5。若原花青素所用比例过小，如1:0.5，则BP的稳定性达不到最优。原花青素的用量至少为1:1，所得BPP纳米片的稳定性、抗菌、抗肿瘤性能最优。
本发明中，所述原花青素可为本领域常规市售可得的原花青素，例如纯度＞95％的原花青素。一实施例中，原花青素购自上海迈瑞尔化学技术有限公司。
本发明中，所述黑磷可为本领域常规市售可得的黑磷。一实施例中，黑磷购自于南京先丰纳米材料科技有限公司。
本发明中，原花青素提供的酚羟基，与BP中的孤对电子配位，从根本上解决了BP稳定差的缺点，同时不会对BP原本的二维结构造成影响。
本发明中，较低的超声温度可以减少超声过程中产生的热量对黑磷剥离造成影响。所述超声的温度较佳地为-1～5℃，例如0℃。在一优选实施例中，在冰水浴的条件下进行超声。
本发明中，所述极性溶剂可为本领域常规的极性溶剂，例如DMF或NMP等。选择极性溶剂，是利用其具有合适的表面能，能够有利于BP的分散，使其在超声作用下能够克服层间弱的范德华力，且溶剂与黑磷及原花青素均不反应，仅起到分散作用。分散的过程中，磷原子表面的孤对电子与原花青素中酚羟基进行配位，进而使黑磷纳米片稳定。分散黑磷及原花青素后，混合液为棕黑色悬浮液。
本发明中，所述极性溶剂较佳地为DMF。与常用溶剂(如NMP)相比，其极性更强，所剥离出的黑磷纳米片粒径更小，剥离效率更高。
本发明中，所述混合物一般通过将所述黑磷与所述原花青素分散于所述极性溶剂中得到。
较佳地，所述混合物通过下述步骤得到：先将所述黑磷分散于极性溶剂中，然后再加入所述原花青素。
本发明中，所述极性溶剂的用量可为本领域常规用于分散的溶剂的用量。较佳地，所述黑磷的质量与所述极性溶剂的体积的比(mg:mL)较佳地为1:(1～2)，例如1:1或1:1.5。
本发明中，所述超声的频率较佳地为30～50kHz，例如40kHz。
本发明中，所述超声的功率较佳地为150～200W，例如180W。
本发明中，所述超声的时间较佳地为8～12h，例如10h。
低温超声的作用不仅是分散，更重要的是利用超声能量克服黑磷层间弱的范德华力，从而制备少层或单层黑磷。同时，超声的过程中通过控制分散液的温度，以减少剥离过程中黑磷的降解。而其它分散方式(如机械搅拌、球磨)很难同时满足这些要求。
本发明中，所述第一次离心的转速较佳地为2000～4000r/min，例如2500r/min、3000r/min或3500r/min。第一次离心的作用是去除未剥离的或尺寸较大的黑磷。第一次离心后，所得沉淀物为未剥离的大块黑磷或多层黑磷。
本发明中，所述第一次离心的时间较佳地为5～10min，例如5min。
本发明中，第二次离心的作用是将溶剂中粒径较小的黑磷分离出，第二次离心的转速较佳地大于第一次离心的转速。
本发明中，所述第二次离心的转速较佳地为8000～10000r/min，例如9000r/min或9500r/min。
本发明中，所述第二次离心的时间较佳地为10～20min，例如15min或20min。
本发明中，在收集沉淀后，还包括将所述沉淀进行洗涤的步骤。
所述洗涤的操作可为本领域常规的洗涤操作。
所述洗涤的试剂可为本领域常规用于洗涤的试剂，例如去离子水和/或无水乙醇。
所述洗涤的次数较佳地为2-3次，例如3次。
较佳地，所述洗涤包括如下步骤：依次使用去离子水和无水乙醇洗涤所述沉淀，每种溶剂洗涤2～3次。
本发明还提供了一种由上述制备方法制得的含黑磷复合材料。
本发明还提供了一种所述含黑磷复合材料在制备骨修复材料中的应用。所述骨修复材料可为骨水泥支架。
一实施例制得的骨水泥支架可为含黑磷复合骨水泥支架(MSP)。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明以MPC为基体，制得的含黑磷复合材料(实施例中制备了一种BPP复合骨水泥支架(MSP))具有优异的生物相容性，能够促进BMSCs的粘附、增殖与分化。更重要的是，含黑磷复合材料光热抗肿瘤和抗菌效果显著，为治疗肿瘤相关的骨缺损提供了一种有效的方法。即，本发明的含黑磷复合材料，可在促进骨愈合的同时(骨性能优于单一的MPC)，兼具光热抗菌、光热抗癌等作用，可用于骨髓炎或骨肿瘤切除后的骨缺损修复。
附图说明
图1为MS(图1a)和MSP(图1b)支架的数码照片。
图2为MS(图2a、图2c)、MSP(图2b、图2d)在不同倍数下的SEM图像。
图3为MS(图3a，图3c，图3e)和MSP(图3b，图3d，图3f)的EDS谱图(图3a，图3b)和Ca(图3c，图3d),P(图3e，图3f)元素分布图。
图4为MS、BPP、MSP的XRD(4a)和FTIR(4b)谱图。
图5为MS和MSP在干燥(5a)和湿润(5b)环境下的光热曲线(808nm，1.0W/cm2)。
图6为在MS(图6a，图6c)和MSP(图6b，图6d)上培养1天(图6a，图6b)和3天(图6c，图6d)的BMSCs的SEM照片。
图7为BMSCs在MS(图7a，图7c)和MSP(图7b，图7d)上培养1(图7a，图7b)，3(图7c，图7d)天的CLSM图像。
图8为BMSCs在样品上培养3，6，12h的细胞粘附率(图8a)；BMSCs在样品上培养1，3，7天的OD值(图8b)；BMSCs在样品上培养7，10，14d的ALP活性(图8c)(*p<0.05，vs.MS)。
图9为在MS(图9a，图9c)和MSP(图9b，图9d)上培养的Saos-2细胞有(图9c，图9d)或无(图9a，图9b)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的活/死染色图片(图9a-图9d)和相对细胞活力(图9e)(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs.MS)。
图10为在MS和MSP上培养的S.aureus(图10的A部分，图10的B部分，图10的E部分)和E.coli(图10的C部分，图10的D部分，图10的F部分)在有(图10的B部分，图10的D部分)或无(图10的A部分，图10的C部分)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的菌落照片(图10的A部分，图10的B部分，图10的C部分，图10的D部分)和抗菌率(图10E部分，图10F部分)(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs.MS)。
图11为在MS和MSP上培养的S.aureus(图11的A部分，图11B部分)和E.coli(图11的C部分，图11的D部分)在有(图11的B部分，图11的D部分)或无(图11的A部分，图11的C部分)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的活/死染色照片。
图12为BPP纳米片不同倍数下的SEM图像(图12a：低倍图像；图12b：高倍图像)。
图13为BPP的AFM图像(图13a)和A-B线(图13b)与C-D线(图13c)的高度分布。
图14为(图14a)BP、PC和BPP的FTIR光谱；(图14b)BP、BPP的拉曼光谱。
图15为BP与BPP水溶液暴露于空气中第0、4、8、12天的数码照片。
图16为BP(图16a)和BPP(图16b)溶液在空气中暴露不同天数的UV-VS-IR光谱分析。
图17为(图17a)纯水和不同浓度(25、50、75、100ppm)BPP溶液的光热曲线；(图17b)BPP溶液(100ppm)5次循环的光热稳定曲线。
图18为含不同浓度BPP的PBS溶液培养的BMSCs的细胞活力。
图19为空白组(图19a，图19d)、PBS(图19b，图19e)、PBS+BPP(图19c，图19f)培养的Saos-2细胞在有(图19d-图19f)或无(图19a-图19c)近红外光照时的活/死染色照片(图19a-图19f)和细胞活力(图19g)。
图20为在空白组，PBS和PBS+BPP中培养的S.aureus(图20的A部分，图20的B部分)和E.coli(图20的C部分，图20的D部分)在有(图20的B部分，图20的D部分)或无(图20的A部分，图20的C部分)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的菌落照片。
图21为在空白组，PBS和PBS+BPP中培养的S.aureus(图21a)和E.coli(图21b)在有或无近红外光照下(808nm，1.0W/cm2，10min)的抗菌率(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs.空白组)。
图22为在空白组，PBS和PBS+BPP中培养的S.aureus(图22的A部分，图22的B部分)和E.coli(图22的C部分，图22的D部分)在有(图22的B部分，图22的D部分)或无(图22的A部分，图22的C部分)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的活/死染色照片。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，采用的原料来源如下：碱式碳酸镁(MgCO3)4·Mg(OH)2·5H2O购于上海麦克林生化有限公；磷酸氢钙CaHPO4购于上海麦克林生化有限公司；磷酸二氢钠NaH2PO4购于上海麦克林生化有限公司；羟基磷灰石HA购于上海麦林生化有限公司；NaCl购于北京伊诺凯科技有限公司；黑磷晶体购于南京先丰纳米材料科技有限公司；N，N-二甲基甲酰胺DMF购于上海耐澄生物科技有限公司；原花青素PC购于上海迈瑞尔化学技术有限公司。
实施例1中将磷酸镁骨水泥制成支架(MS)浸泡于上章所制的BPP溶液中，制得复合支架(MSP)。通过SEM、EDS、XRD、FTIR表征支架的理化性能；在干燥和湿润的环境中观察支架的光热性能；通过体外细胞响应评价支架对BMSCs的粘附、增殖和分化；通过光热抗肿瘤和抗菌实验研究支架光热抗癌和光热抗菌效果。
实施例1
1、MPC粉末制备：
1)碱式碳酸镁((MgCO3)4·Mg(OH)2·5H2O)在1600℃煅烧4h获得MgO；
2)氧化镁(MgO)、磷酸氢钙(CaHPO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)、羟基磷灰石(HA)混合均匀后得MPC粉末；
其中，氧化镁、磷酸氢钙和磷酸二氢钠的摩尔比为2：2：1；羟基磷灰石的用量为10wt.％，上述百分比为羟基磷灰石占“氧化镁、磷酸氢钙和磷酸二氢钠”总量的重量百分比。
2、骨水泥支架(MS)的制备：
1)MPC粉末与氯化钠以1：2的质量比混合均匀，用压片机(4.0MPa)压制成Φ12×3mm的MPC片。
2)MPC片在37℃，100％水环境中固化72h，得MPC骨水泥(固化72h的作用为使MPC片内的物质充分反应，使其成为MPC骨水泥)；随后置于水溶液中以溶解NaCl以形成孔，浸泡72h后形成骨水泥支架(MS)(浸泡72h是为了溶解MPC骨水泥中的氯化钠(NaCl)，释放出孔洞，使其成为骨水泥支架MS)。
实施例1中，MPC粉末与氯化钠质量比为1:2时，MS支架的孔径范围仍为300-400μm，孔隙率略有升高，约83％。
3、BPP复合骨水泥支架(MSP)的制备：
1)BPP纳米片制备：
将玻璃管中的黑磷晶体放入手套箱中研磨，取研磨后的黑磷粉末20mg分散于20mLN，N-二甲基甲酰胺。随后加入20mg原花青素PC，封上封口膜后从手套箱中取出。冰浴超声(频率：40kHz，功率180W，0℃)10h后，以2000r/min的转速离心5min以去除未剥离的黑磷，所得沉淀物为未剥离的大块黑磷或多层黑磷，随后取上层清液继续以10000r/min的转速离心20min，收集沉淀(即产物BPP)，依次使用去离子水和无水乙醇洗涤所得沉淀，每种溶剂洗涤3次冷冻干燥后获得BPP纳米片。
经SEM图像可知，BPP纳米片为二维片状材料，横向尺寸约100-200nm，厚度约13nm，其具有良好的稳定性、细胞相容性和光热性能，具有优异的光热抗癌和光热抗菌效果。详见效果实施例7。
2)BPP纳米片配置成1mg/mL的BPP乙醇溶液。
3)骨水泥支架MS浸泡于该溶液中10min后，真空干燥，重复浸泡、干燥3次后制得BPP复合骨水泥支架(MSP)。
无特殊说明，简写“MS”均为MPC支架，简写“MSP”均为MPC支架负载BPP纳米片，简写“BPP”均为原料BPP纳米片。
效果实施例1复合骨水泥支架的数码照片及SEM、EDS分析
1拍摄MS、MSP的数码照片观察颜色变化。使用SEM观察MS、MSP的表面形貌。
图1为MS(图1a)和MSP(图1b)支架的数码照片。MS和MSP具有多孔表面，MS(图1a)为白色支架，而在BPP中浸泡后的MSP(图1b)为黑色支架。
图2为MS(图2a、图2c)、MSP(图2b、图2d)在不同倍数下的SEM图像。从图2a和图2b可以看出，骨水泥支架表面有许多大孔，尺寸在100-400μm之间。图2c为MS较高倍数下的SEM图像，能够观察到支架表面较为光滑。图2d显示MSP支架表面有明显的片状结构，纳米片的尺寸约为100-200nm，说明BPP成功负载到MS表面。
2使用能量色散X射线光谱仪(EDS，Hatachi S-4800，日本)分析MS、MSP元素成分。
图3为MS(图3a，图3c，图3e)和MSP(图3b，图3d，图3f)的EDS谱图(图3a，图3b)和Ca(图3c，图3d),P(图3e，图3f)元素分布图。Ca：浅蓝点，P：深蓝点。
图3a和图3b分别为MS和MSP的EDS谱图，MS的P，Ca峰强接近，而MSP中P峰明显比Ca峰强很多。元素分布结果显示，MS中P与Ca含量接近，MSP中P含量明显更多，分布更均匀。表1进一步证实了Ca元素百分含量减少，而P的含量增加了约一倍，说明成功制备了BPP负载的MSP。
表1 MS与MSP的Ca，P原子比
Figure BDA0003338685820000101
Figure BDA0003338685820000111
效果实施例2复合骨水泥支架的XRD、FTIR分析
使用XRD分析支架的晶型结构和成分组成，获得MS、原料BPP纳米片和MSP的XRD图谱。
使用FTIR分析支架的基团组成，获得MS、原料BPP纳米片和MSP的FTIR图谱。
图4为MS、BPP、MSP的XRD(4a)和FTIR(4b)谱图。
MS、BPP、MSP的XRD衍射图谱如图4a所示。MS中2θ＝11.6°、16.5°、21°、43°和62.5°处的衍射峰为MPC的特征峰。BPP的衍射峰与黑磷的标准卡片(JCPDS74-1878)相匹配，其中2θ＝16.8°、26.5°、34.1°、35°和55.5°处的峰分别对应于(0 0 2)、(0 1 2)、(0 0 4)、(1 11)和(2 0 0)晶面。MSP只显示出MS的晶型，可能是因为BPP负载量较少，特征峰没有显现。
图4b为MS、BPP、MSP的FTIR谱图。MS中983.5和1117.3cm-1处为磷酸根的峰。BPP中1001.6cm-1的峰对应于P-O-C的振动。MSP中各特征峰强度更强，1056.6cm-1处的峰出现重叠，证明MS上成功负载了BPP。
效果实施例3复合骨水泥支架的光热性能测试
为了研究骨水泥支架的光热性能，分别在干燥环境和模拟体内湿润环境下对MS、MSP进行光热性能测试，具体步骤：
为了研究骨水泥支架的光热性能，分别在干燥环境和模拟体内湿润环境下对MS、MSP进行光热性能测试。分别将MS、MSP骨水泥支架置于24孔板中，在干燥环境中研究其光热性能。随后在孔中加入1mLα-MEM溶液，以模拟体内湿润环境。使用功率密度为1.0W/cm2的808nm NIR激光器对样品分别照射300s(干燥环境)或150s(湿润环境)。利用红外热成像系统(T3Pro，IRay光电股份有限公司，中国)监测并记录复合骨水泥的温度变化。
图5为MS和MSP在干燥(5a)和湿润(5b)环境下的光热曲线(808nm，1.0W/cm2)。在干燥环境(图5a)下，MSP在30s内即可快速升温至122.9℃。在湿润环境(图5b)下，150s可从25.1℃升至52.4℃，而MS温度仅升高0.2℃，说明BPP的负载有效地提高了近红外吸收，促进光热转换，从而增强了MS的光热性能。
效果实施例4体外细胞响应
1细胞培养
实验所用的细胞是BMSCs，以评估样品的细胞相容性。具体步骤：
实验所用的细胞是骨髓间充质干细胞(BMSCs)，以评估样品的细胞相容性。体外细胞实验前，用75％乙醇和紫外照射对样品进行消毒。随后将样品置于24孔板中，每个孔约5×104个细胞接种于样品表面，在含10％胎牛血清(FBS)的α-MEM中，5％CO2，37℃环境下培养。培养基每3天更换一次。
2细胞粘附和形貌
细胞在样品表面培养3，6，12h后，在450nm处使用酶标仪测量光密度(OD)值，评估细胞在MS、MSP上3、6和12h的粘附率。具体步骤：
细胞在样品表面培养3，6，12h后，移除液体并用PBS轻洗，使用酶标仪(SynergyHTX,Bio-Tek,USA)在450nm处测量光密度(OD)值，评估细胞在样本上3、6和12h的粘附率。
细胞培养1、3d后，利用SEM观察样品表面BMSCs的形态，采用CLSM观察BMSCs染色后的形态。具体步骤：
培养1、3d后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，然后使用4％戊二醛溶液固定4h。随后用PBS轻洗，除去戊二醛溶液。然后，样品在10、30、50、70、85、90和100％的梯度乙醇中脱水。利用扫描电镜(SEM，S-3400，Hitachi，日本)观察样品表面BMSCs的形态。此外，使用异硫氰酸荧光素(FITC，Biotech，中国)和DAPI(4'，6'-diamidino2-phenylindole，BeyotimeBiotech，中国)分别对细胞质和细胞核进行染色。采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，A1R，Nikon，日本)观察BMSCs的形态。
3细胞增殖与ALP活性
采用CCK-8试剂盒测定BMSCs的增殖情况。用酶标仪在450nm处测定OD值。具体步骤：
采用CCK-8试剂盒(Dojindo，日本)测定BMSCs的增殖情况。细胞在样品表面培养3、6、12h后，使用PBS轻洗3次，以去除游离细胞。随后用α-MEM溶液(500μL)和CCK-8溶液(50μL)培养4h。提取100μL上清液，用酶标仪(Synergy HTX，Bio-Tek，美国)在450nm处测定OD值。
采用ALP活性评价BMSCs的成骨分化。具体步骤：
采用碱性磷酸酶(ALP)活性评价BMSCs的成骨分化。BMSCs在样品表面培养后7，10，14天后，用PBS溶液清洗3次。之后，加入200μL 1％的NP-40(Sangon，中国)以获得细胞裂解物并离心。此外，上层清液添加到96孔板中，加入含有甘氨酸(0.1mol/L)和MgCl2·6H2O(1mmol/L)的对硝基苯基磷酸酯(pNPP，Sangon，中国)，在37℃培养1h。最后，用NaOH溶液(2mol/L)终止反应。各样品上细胞的OD值使用酶标仪在450nm处测定。此外，用于归一化的总蛋白量由双喹啉酸蛋白测定试剂盒(BCA，Pierce Biotechnology，美国)测定。用OD值除以每分钟总蛋白量计算样品上BMSCs的ALP活性。
实验结果：
1BMSCs的形貌观察
图6为在MS(图6a，图6c)和MSP(图6b，图6d)上培养1天(图6a，图6b)和3天(图6c，图6d)的BMSCs的SEM照片。培养1d后，与MS培养的细胞数略少于MSP，MSP的细胞形态更加舒展。3d后，MS上的细胞呈扁平形态，MSP组的细胞铺展更优。
图7为BMSCs在MS(图7a，图7c)和MSP(图7b，图7d)上培养1(图7a，图7b)，3(图7c，图7d)天的CLSM图像。两组样品中BMSCs数量都随时间增加而增多。1d时，MSP上的细胞可以观察到更多的伪足。3d时，MSP上培养的细胞数量更多，形态更为铺展，说明MSP可以促进早期粘附。
2BMSCs的粘附、增殖与ALP活性
图8为BMSCs在样品上培养3，6，12h的细胞粘附率(图8a)；BMSCs在样品上培养1，3，7天的OD值(图8b)；BMSCs在样品上培养7，10，14d的ALP活性(图8c)(*p<0.05，vs.MS)。
图8a为BMSCs在MS和MSP上培养3，6，12h的细胞粘附率。细胞在两个样品上的粘附率随着时间的增长而增大，细胞在MSP上的粘附率总是高于在MS上的粘附率。
图8b为BMSCs在MS和MSP上培养1，3，7d的OD值。MS和MSP的OD值均随时间增加。1，3d时两组样品无明显差异，第7d时，MSP组OD值明显大于MS组
图8c是BMSCs在MS和MSP上培养7，10，14d的ALP活性。MS和MSP上BMSCs的ALP活性同样随时间增加。MSP上的ALP活性更佳，说明MSP可以促进BMSCs的分化。
植入材料的生物相容性是植入成功的关键。为了评价MS和MSP的生物相容性，利用BMSCs研究在材料上的粘附、增殖与ALP活性。结果表明，MS和MSP均能有效刺激BMSCs在材料表面的粘附与增殖，可能的原因是支架多孔结构增加了材料的表面积，更多的细胞粘附在材料表面，且100μm以上的大孔有利于骨组织长入，从而促进骨再生。粗糙度对细胞的粘附发挥着极其重要的作用。BMSCs在MSP上的铺展更好，细胞数量更多。原因可能是MSP表面负载的BPP进一步增加了材料的比表面积，提高了材料表面的粗糙度，更有利于细胞的粘附与增殖。ALP被认为是成骨分化的标志物。ALP活性结果表明，细胞在MS和MSP上的ALP活性均能随着时间增加，表明材料能促进成骨分化。细胞实验显示MS和MSP均有优异的生物相容性，并能刺激BMSCs的粘附、增殖与分化。
效果实施例5体外光热杀死骨肿瘤细胞
为了评估光热对肿瘤细胞的影响，在CLSM下观察在MS、MSP上培养的Saos-2细胞活/死染色情况。具体步骤：
将Saos-2细胞接种于48孔培养板中，使用含有10％FBS的α-MEM，在37℃，5％CO2环境中培养。为了评估光热对肿瘤细胞的影响，将Saos-2细胞(密度为1.0×105个/孔)在含有MS、MSP支架的孔板中培养12h。之后近红外光辐照样品(808nm，1.0w/cm2)10min，继续培养12h。光源与样品距离10cm。在相同条件下，没有近红外光谱辐照的样品上的细胞作为对照。细胞用4％戊二醛溶液固定后，取0.5mL含0.5μL(1mmol/L)碘化丙啶(PI)和0.5μL(2.5mg/mL)钙黄素乙酰氧基甲酯的染色液，37℃染色15min。随后，在CLSM下可以区分活细胞(绿色荧光)和死细胞(红色荧光)。
用CCK-8法检测细胞活力。用酶标仪测量MS、MSP培养的Saos-2细胞在450nm处的吸光度。具体步骤：
用CCK-8法检测细胞活力。将密度为1.0×105个/孔的Saos-2细胞在48孔板中培养12h。将MS、MSP支架放入孔板中。随后，用808nm激光照射样品(1.0W/cm2，10min)。无近红外照射样品培养的细胞作为对照。12h后，用酶标仪(Synergy HTX,Bio-Tek，美国)测量细胞在450nm处的吸光度。
体外光热杀死肿瘤细胞实验结果如下：
图9为在MS(图9a，图9c)和MSP(图9b，图9d)上培养的Saos-2细胞有(图9c，图9d)或无(图9a，图9b)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的活/死染色图片(图9a-图9d)和相对细胞活力(图9e)(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs.MS)。
图9a-图9d为MS和MSP上培养的Saos-2细胞在有或无近红外照射时的活/死染色照片。MS上培养的细胞无论是否有近红外照射时均能观察到大量绿色荧光，表明细胞存活率很高。MSP上培养的细胞无近红外光照射时，出现少量红色荧光，有近红外光照射时，表现为大量红色荧光。
图9e为MS和MSP上培养的Saos-2细胞的活力。无论是否有近红外照射，MS上培养的细胞活力都很强。有近红外照射时，MSP组的细胞活力只有8.3％，证明MSP具有优异的光热抗肿瘤效果。
实验结果表明MSP光热抗肿瘤效果显著，NIR照射后，Saos-2细胞活力降至8.3％，这归因于MSP表面负载的BPP。一方面BPP具有强的NIR吸收，并能在短时间内将光能转化为热能。过高的热量会对肿瘤细胞造成损伤，温度达到约43℃时，即可导致癌细胞长期失活。此外，高温导致生化反应的速率显著增加，癌细胞内ROS的密度增加，会对蛋白质、脂类和核酸造成氧化损伤，从而导致氧化应激。另一方面，PC也能抑制肿瘤细胞的增殖，促使肿瘤细胞凋亡。
效果实施例6体外光热抗菌
采用菌落计数法评价MS、MSP的光热抗菌性能。
用活/死BacLight试剂盒检测不同条件处理后的细菌存活率。具体步骤：
将金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 25923)和大肠杆菌(E.coli，ATCC 25922)分别加入到5ml LB肉汤中，在37℃培养12h。
采用菌落计数法评价MS、MSP支架的抗菌性能。实验前用75％乙醇和紫外照射对样品进行消毒，随后加入100μL细菌悬液于样品表面，浓度为1×106CFU/mL，37℃培养3h，然后用1.0W/cm2的近红外激光照射10min。未经过近红外照射的样品作为对照。处理后的样品浸泡于1ml PBS缓冲液中，超声2min将细菌从样品中分离。将得到的菌悬液稀释后涂于标准琼脂平板上，37℃孵育20h后计数琼脂平板上的菌落数。按以下公式计算抗菌率：
Figure BDA0003338685820000151
其中，Xs代表抗菌率；A代表MPC上无近红外照射的菌落数；B代表其他样品上的菌落数。
用活/死BacLight试剂盒(Invitrogen)检测不同处理后的细菌存活率。简单地说，将10μL碘化丙啶(PI)和10μL SYTO 9加入到10mL生理盐水中作为混合染料。然后将抗菌样品浸泡在500μL混合染料中，于黑暗中染色15min。然后用PBS轻轻洗涤样品3次，使用倒置荧光显微镜观察样品的荧光信号。
体外光热抗菌实验结果如下：
图10为在MS和MSP上培养的S.aureus(图10的A部分，图10的B部分，图10的E部分)和E.coli(图10的C部分，图10的D部分，图10的F部分)在有(图10的B部分，图10的D部分)或无(图10的A部分，图10的C部分)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的菌落照片(图10的A部分，图10的B部分，图10的C部分，图10的D部分)和抗菌率(图10的E，图10的F)(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs.MS)。
图10为在MS、MSP上培养的细菌菌落照片和抗菌率。MS对S.aureus和E.coli均没有抗菌效果。MSP无NIR照射时对S.aureus和E.coli的抗菌率分别为29.4％和20.8％，有激光照射时抗菌率分别为99.4％和99.2％。
图11为在MS和MSP上培养的S.aureus(图11的A部分，图11的B部分)和E.coli(图11的C部分，图11的D部分)在有(图1 1的B部分，图11的D部分)或无(图11的A部分，图11的C部分)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的活/死染色照片。与MS共培养的细菌均呈现绿色荧光，表明活菌大量存在。无NIR照射时，与MSP共培养的细菌显示为部分红色荧光；有NIR照射时，观察到大量红色荧光，表明细菌均为死菌。
光热抗菌结果显示，S.aureus和E.coli在MSP上近红外照射后抗菌率分别达到，证明MSP有很好的光热抗菌效果。MSP的抗菌机理可能有以下三种：一是MSP表面的BPP是纳米片结构，具有易接近的表面，有利于捕获细菌并随后形成团聚体，进行NIR照射后，局部热量集中，引起细菌蛋白变性，造成细菌死亡。二是过度热量加速GSH氧化形成GSSG，从而扰乱了细菌的稳态。三是有研究表明，PC可以通过影响生物膜蛋白抑制细菌，与光热效应协同抗菌。
统计学分析
所有实验至少重复三次，所有定量数据用Origin9进行分析，用M±SD的形式表示。P＜0.05表明差异具有统计学意义。
综上，实施例1通过压片法制备了骨水泥支架(MS)，该支架具有多孔结构，浸泡于原花青素(PC)修饰的黑磷(BPP)溶液中，合成BPP负载的复合支架(MSP)。结果表明：MS表面较为平整光滑，MSP具有100-400μm的大孔结构，表面存在尺寸约100-200nm的纳米片结构。MSP具有良好的生物相容性，能促进BMSCs的粘附、增殖与分化。MSP具有优良的光热性能，与MSP培养的Saos-2细胞在NIR照射下，存活率仅为8.3％，表明MSP具有优良的抗癌性能。MSP对S.aureus和E.coli的抗菌率分别为99.4％和99.2％，表明其具有优良的光热抗菌性能。因此，MSP作为治疗骨肿瘤的术后骨修复材料有很大潜力。
实施例2
将实施例1中的BPP乙醇溶液浓度调整为0.5mg/mL，浸泡时间为20min，浸泡次数为5次，制得BPP复合骨水泥支架(MSP)，其它实验条件均与实施例1相同。
实施例2制得的BPP复合骨水泥支架(MSP)与实施例1的MSP具有同样显著效果。
实施例3
将实施例1中的BPP乙醇溶液浓度调整为5mg/mL，浸泡时间为5min，浸泡次数为2次，制得BPP复合骨水泥支架(MSP)，其它实验条件均与实施例1相同。
实施例3制得的BPP复合骨水泥支架(MSP)与实施例1的MSP具有同样显著效果。
实施例4
1)含有BPP纳米片的植酸溶液制备：
首先，将植酸溶液(质量分数70％，购于上海麦克林生化有限公司)用1mol/L NaOH溶液稀释至pH＝5～6；随后，将BPP纳米片(1mg/mL)添加至植酸溶液中并在室温下匀速搅拌1h得到BPP浓度为1mg/mL的植酸溶液。
2)将骨水泥支架MS浸泡于该溶液中10min后，真空干燥，重复浸泡、干燥3次后制得BPP复合骨水泥支架。利用植酸粘附性，使BPP粘结在MS支架表面。
其它未提及的实验操作和条件均与实施例1相同。
实施例4制得的BPP复合骨水泥支架(MSP)与实施例1的MSP具有同样显著效果。
实施例5
1)含有BPP纳米片的聚多巴胺溶液制备：
首先，将1g盐酸多巴胺粉末(纯度98％，购于上海麦克林生化有限公司)溶解于200mL PBS缓冲液中，在室温下匀速搅拌1h得到聚多巴胺溶液；随后，将0.2g BPP纳米片添加至聚多巴胺溶液中并在室温下继续匀速搅拌1h得到BPP浓度为1mg/mL的聚多巴胺溶液；
2)将骨水泥支架MS浸泡于该溶液中10min后，真空干燥，重复浸泡、干燥3次后制得BPP复合骨水泥支架。利用聚多巴胺的粘附性，使BPP粘结在MS支架表面。
其它未提及的实验操作和条件均与实施例1相同。
实施例5制得的BPP复合骨水泥支架(MSP)与实施例1的MSP具有同样显著效果。
效果实施例7
本效果实施例中，所有实验至少重复三次，所有定量数据用Origin9进行分析，用M±SD的形式表示。P＜0.05表明差异具有统计学意义。
1.材料的SEM和AFM分析
使用SEM观察纳米片形貌和尺寸，使用AFM分析纳米片尺寸和厚度。
图12为BPP不同倍数下的SEM图像。从低倍图像(图12a)中可以看出，经过PC辅助，成功剥离出尺寸较为均匀的2D片状结构的BPP。高倍图像(图12b)可见BPP纳米片的横向尺寸约100-200nm。
图13为BPP的AFM图像(图13a)，对A-B与C-D线上纳米片的高度分布图分析如图13b和图13c。其中，标记1、2、3及对应的竖线为A→B或C→D线段上任取的几点，用以表征纳米片的高度分布。图13b中，竖线由左向右依次为A→B上对应的标记，图13c中竖线由左向右依次为C→D上对应的标记。结果显示，纳米片的平均宽度为152nm，与SEM观察结果一致。平均厚度为13.24nm，说明制备的BPP为少层黑磷。
2.材料的FTIR和拉曼分析
使用FTIR和拉曼分析材料的基团和结构。
图14a为BP、PC和BPP的FTIR谱图。BP位于1104、1182和1633cm-1的三个特征峰分别对应于P-O拉伸、P-P-O线性拉伸和P＝O拉伸模式[110]。PC的特征振动主要集中在700-850cm-1和1000-1650cm-1。其中，730-780cm-1的低频指纹区主要是芳香环的不饱和C-H面外变形振动产生的吸收。1442、1518cm-1对应于芳香环结构的振动，1611cm-1属于C＝O的伸缩振动，3423cm-1为-OH的振动。BPP中1091cm-1处的强峰归因于P-O-C键且BP和PC的特征峰都在BPP中出现，说明PC成功修饰到BP表面。
图14b为BP、BPP的拉曼光谱图。谱图显示了BP的位于358.9、434.8和462.6cm-1典型特征峰，分别对应于一个面外声子模式(A1 g)和两个面内模式(B2g和A2 g)。BPP的拉曼光谱与BP一致，表明剥离过程中保持了BP完整的层状结构。
3.材料的稳定性测试
将BP(未加PC的纯BP)与BPP分别制备成浓度为1mg/mL的水溶液，暴露于空气中，拍摄第0，4，8，12天的数码照片分析其稳定性。
使用UV-VS-IR分光光度计分析BP和BPP第0，4，8，12天在紫外到近红外区域的吸光度变化。
图15显示了暴露于空气中的BP和BPP水溶液第0、4、8、12d的数码照片。第0d时，BP和BPP水溶液均为深褐色。第12d时，BPP颜色几乎没有改变，而BP溶液颜色明显变浅。结果表明，未修饰的BP稳定性很差，PC修饰后的BPP具有良好的抗氧化性，没有发生降解。
图16为BP和BPP溶液的UV-VS-IR吸收光谱分析。BP(图16a)和BPP(图16b)表现出典型的宽吸收带，跨越紫外和近红外区域，类似于其他二维层状材料。BP的吸光度随着时间显著降低，说明BP发生降解，而BPP的吸光度在12d未发生明显下降，证明PC有效防止BP降解，BPP具有出色的稳定性。
4.材料的光热性能测试
分别配置25，50，75和100ppm的BPP溶液，各取1mL于石英管中，用功率为1.0W/cm2的808nm NIR照射各样品溶液10min，取1mL去离子水作为对照。利用红外热成像系统(T3Pro,IRay光电股份有限公司，中国)监测并记录溶液的温度变化。
对100ppm的BPP溶液进行光热稳定性测试。具体操作是：NIR照射样品10min后，关闭激光器，待溶液温度降至初始温度时再打开，如此进行5个循环，研究其光热稳定性。
图17a为纯水和不同浓度BPP溶液在808nm近红外光以1.0W/cm2的功率密度照射10min的光热曲线。随着BPP溶液浓度的增加，其相同照射时间下对应的温度不断上升。其中，100ppm的BPP溶液温度升高了20.2℃。相反地，纯水的温度仅仅升高了2.1℃，表明BPP溶液可以有效地将光能转化为热能，具有良好的光热效果。
图17b是浓度为100ppm的BPP溶液5次循环后的光热稳定性曲线。结果表明，每次循环后BPP溶液温度均能上升至约50℃，进一步证明BPP在5次循环的过程中没有发生降解，具有优异的稳定性。
5.体外细胞相容性
1)细胞培养
使用BMSCs来评价BPP的细胞相容性。
体外细胞实验前，用75％乙醇和紫外照射对BPP样品进行消毒。实验所用的细胞是骨髓间充质干细胞(BMSCs)，以评估样品的细胞相容性。将样品置于24孔板中，每个孔约5×104个细胞接种于样品表面，在含10％胎牛血清(FBS)的α-MEM中，5％CO2，37℃环境下培养。培养基每3天更换一次。
2)细胞活力测定
细胞培养12h后，每孔加入20μL BPP的PBS溶液(浓度分别为0、25、50、75和100ppm)。用样品培养细胞48h，然后在每孔中加入10μL CCK-8溶液，测定细胞活力。细胞在37℃下与CCK-8孵育2h后，在450nm测定与每个孔板中活细胞相关的吸光度。空白组作为对照。用以下公式计算细胞活力：
Figure BDA0003338685820000201
其中V代表细胞活力(％)；A代表对照组吸光度的平均值；B代表实验组吸光度值的平均值。
图18为在PBS溶液和不同浓度的BPP溶液中培养的BMSCs的细胞活力。虽然随着浓度的升高，细胞活力有所下降，但是即使高浓度100ppm的BPP溶液细胞活力也达到91.2％，表明BPP没有明显的细胞毒性，证明BPP良好的生物相容性和生物医学应用的适用性。
6.体外光热杀死骨肿瘤细胞
通过对Saos-2细胞活/死染色研究PBS、PBS+BPP溶液(100ppm)的光热抗癌性能。首先将Saos-2细胞接种于48孔培养板中，使用含有10％FBS的α-MEM，在37℃，5％CO2环境中培养。为了评估光热对肿瘤细胞的影响，将Saos-2细胞(密度为1.0×105个/孔)在含有不同样品的孔板中培养12h。之后近红外光辐照样品(808nm，功率1.0W/cm2)10min，继续培养12h。光源与样品距离10cm。在相同条件下，没有近红外光谱辐照的样品上的细胞作为对照。细胞用4％戊二醛溶液固定后，取0.5mL含0.5μL(1mmol/L)碘化丙啶(PI)和0.5μL(2.5mg/mL)钙黄素乙酰氧基甲酯的染色液，37℃染色15min。随后，在CLSM下可以区分活细胞(绿色荧光)和死细胞(红色荧光)。
用CCK-8法检测Saos-2细胞活力。将密度为1.0×105个/孔的Saos-2细胞在48孔板中培养12h后将BPP样品放入孔板中。随后，用808nm激光照射样品(1.0W/cm2，10min)。无近红外照射样品培养的细胞作为对照。12h后，用酶标仪(Synergy HTX,Bio-Tek，美国)测量细胞在450nm处的吸光度。
图19a-19f为空白组(图19a，图19d)、PBS(图19b，图19e)、PBS+BPP(图19c，图19f)培养的Saos-2细胞在有(图19d-图19f)或无(图19a-图19c)近红外光照时的活/死染色照片(图19a-图19f)。在没有近红外光照射的条件下，空白组和PBS组都显示强的绿色荧光，表明PBS对Saos-2细胞没有杀伤作用。相同条件下，PBS+BPP组出现部分红色荧光，说明BPP有一定的抗癌作用。有近红外照射时，空白组和PBS组依然显示绿色荧光，而PBS+BPP组表现为强烈的红色荧光，证明其具有优异的光热抗癌效果。
图19g为空白组、PBS、PBS+BPP培养的Saos-2细胞的活力。无论有无近红外光照射，空白组和PBS组的细胞都具有很强的活力。相比于空白组和PBS组，PBS+BPP组无近红外照射时，细胞活力有所下降；有近红外照射时，细胞活力下降至7.4％。
7.体外光热杀菌
采用菌落计数法评价PBS、PBS+BPP溶液(100ppm)的光热抗菌性能。实验前用75％乙醇和紫外照射对BPP样品进行消毒，随后加入100μL细菌悬液于样品表面，浓度为1×106CFU/mL，37℃培养3h，然后用1.0W/cm2的近红外激光照射10min。未经过近红外照射的样品作为对照。处理后的样品浸泡于1ml PBS缓冲液中，超声2min将细菌从样品中分离。将得到的菌悬液稀释后涂于标准琼脂平板上，37℃孵育20h后计数琼脂平板上的菌落数。按以下公式计算抗菌率：
Figure BDA0003338685820000211
其中，Xs代表抗菌率；A代表MPC上无近红外照射的菌落数；B代表其他样品上的菌落数。
用活/死BacLight试剂盒检测不同条件下处理后的细菌存活率。使用808nm激光(1.0W/cm2)照射细菌10min。将10μL碘化丙啶(PI)和10μL SYTO 9加入到10mL生理盐水中作为混合染料。然后将抗菌样品浸泡在500μL混合染料中，于黑暗中染色15min。然后用PBS轻轻洗涤样品3次，使用倒置荧光显微镜观察样品的荧光信号。
图20和图21显示了空白组、PBS组和PBS+BPP组在不同条件下的菌落图和抗菌率。其中，图20为在空白组，PBS和PBS+BPP中培养的S.aureus(图20的A部分，图20的B部分)和E.coli(图20的C部分，图20的D部分)在有(图20的B部分，图20的D部分)或无(图20的A部分，图20的C部分)近红外光照(808nm，1.0W/cm2，10min)情况下的菌落照片；图21为在空白组，PBS和PBS+BPP中培养的S.aureus(图21a)和E.coli(图21b)在有或无近红外光照下(808nm，1.0W/cm2，10min)的抗菌率(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，vs.空白组)。其中空白组和PBS组无论是否有NIR照射，均无抗菌效果。PBS+BPP组在无NIR照射时，对S.aureus和E.coli的抗菌率分别为33.2％和27.3％；有NIR照射时，抗菌率分别为97.7％和98.2％。
图22为空白组、PBS组和PBS+BPP组的细菌活/死染色照片。无NIR照射时，PBS+BPP组可以观察到少量红色荧光；NIR照射后，观察到大量红色荧光，而空白组和PBS组在任何情况下均表现为绿色荧光。
由以上结果分析可知：
本实施例中，利用PC辅助超声剥离BP。结果表明，制备的BPP纳米片尺寸均匀(平均横向尺寸为152nm，厚度约13.24nm)，为少层BP结构。PC上的Ar-OH与BP的磷酸根发生反应，形成P-O-C键，证明PC成功修饰到BP表面。
BP的稳定性对于维持其光热性能至关重要。然而，在氧和水的存在下，BP非常容易反应，从而导致其在水介质中光学性能的快速退化，这一问题阻碍了BP在生物纳米医学中的深入研究和应用。本实验中，PC的修饰极大地提高了BP的稳定性。未修饰的BP极易与O反应生成PxOy，当BP分散在水中时，水促进PxOy转化为PO4 3-，新的P原子持续暴露于氧气中，加速了BP的降解。而BPP中PC的Ar-OH与BP表面PO4 3-反应，有效防止内部P原子的氧化。
用于生物医学的材料必须具有足够的生物相容性。结果表明，较高浓度的BPP细胞活力为91.2％，生物相容性依然很好，没有表现出明显的细胞毒性，这是因为BP可以在水介质中降解，形成无毒的磷酸盐和亚磷酸盐。此外，磷是人体器官的基本元素之一，约占总体重的1％，具有内在的生物相容性。
优异的光热性能是材料用于PTT治疗的关键。实验证明，BPP具有优异的光热性能，可归因于近红外区域的明显吸收和较高的光热转换效率。体外光热抗癌实验表明无光照条件下PBS+BPP培养的Saos-2细胞活力比相同条件下PBS培养的细胞活力低，可能的原因是PC具有强的抗氧化和清除自由基的能力，从而抑制肿瘤细胞增殖，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡。有光照条件下，PBS+BPP培养的Saos-2细胞活力降至7.4％，这是光热效应和PC协同作用的效果。光热杀死肿瘤细胞可能的机制是高温会导致肿瘤细胞膜损伤和线粒体功能障碍，此外，高温破坏DNA的复制和RNA的合成。
抗菌能力是材料所需具备的又一重要功能。体外抗菌实验表明，即使在无NIR照射下，BPP也具有一定的抗菌效果，这主要归功于BPP上的PC与细菌通过氢键结合，吸附在细菌表面，从而实现抑菌。有NIR照射时，高温破坏细菌膜，使蛋白质变性，与PC协同引起细菌损伤。
总之，本发明利用PC辅助成功制备了BPP纳米片，其尺寸均匀，为少层黑磷结构；PC修饰BP表面，没有改变BP的层状结构且PC修饰后的BPP具有较好的空气稳定性。光热性能随浓度增加而增强，且BPP溶液具有良好的光热稳定性。较高浓度的BPP也几乎没有明显的细胞毒性，显示出优良的细胞相容性。BPP具有优异的光热抗癌和抗菌性能，通过PC和光热效应协同作用，Saos-2细胞活力显著降低，其对S.aureus和E.coli的抗菌率明显提高。因此，BPP是一种有效的光热剂，在PTT治疗中有很大的应用前景。

Claims (22)

1.一种含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
将磷酸镁骨水泥支架表面负载有BPP纳米片即可；
其中，所述磷酸镁骨水泥支架为多孔结构；
其中，所述BPP纳米片的制备方法包括下述步骤：黑磷与原花青素的混合物经超声后，第一次离心，收集上清液，第二次离心后，收集沉淀即为BPP纳米片；
所述超声的温度为-2℃～10℃；所述黑磷与所述原花青素的混合物中的溶剂为极性溶剂；所述第一次离心的转速为1000～5000r/min。
2.如权利要求1所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述磷酸镁骨水泥支架的孔隙率为60～90％；
和/或，所述磷酸镁骨水泥支架上的孔径在200μm～500μm；
和/或，所述磷酸镁骨水泥支架通过下述步骤制备：
1)将磷酸镁骨水泥粉末和致孔剂的混合物压制成片，得MPC片；
2)所述MPC片先固化后，再在溶剂中溶解所述致孔剂形成孔，即得磷酸镁骨水泥支架。
3.如权利要求2所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述磷酸镁骨水泥支架的孔隙率为75-85％；
和/或，所述磷酸镁骨水泥支架上的孔径为300μm～400μm。
4.如权利要求2所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述磷酸镁骨水泥支架的孔隙率为80％或者83％。
5.如权利要求2所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述磷酸镁骨水泥粉末的制备方法包括下述步骤：将氧化镁、磷酸氢钙和磷酸二氢钠和羟基磷灰石混合均匀即可。
6.如权利要求5所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述磷酸镁骨水泥粉末的制备方法中，所述氧化镁、所述磷酸氢钙和所述磷酸二氢钠的摩尔比为(1.5～2.5)：(1.5～2.5)：1；
和/或，所述磷酸镁骨水泥粉末的制备方法中，所述羟基磷灰石的用量为8～12wt.％，上述百分比为羟基磷灰石占“氧化镁、磷酸氢钙和磷酸二氢钠”总量的重量百分比。
7.如权利要求6所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述磷酸镁骨水泥粉末的制备方法中，所述氧化镁、所述磷酸氢钙和所述磷酸二氢钠的摩尔比为2：2：1；
和/或，所述羟基磷灰石的用量为10wt.％。
8.如权利要求5所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述磷酸镁骨水泥粉末和所述致孔剂的质量比为1：(1～4)；
步骤1)中，所述致孔剂的粒径为250～350μm；
步骤1)中，所述致孔剂为氯化钠；
步骤1)中，所述压制成片的过程中，采用的压力为3～5MPa；
步骤2)中，所述固化的时间为65～80h；
步骤2)中，所述固化的温度为30～40℃；
步骤2)中，所述固化的溶剂为水；
步骤2)中，所述在溶剂中溶解致孔剂形成孔的操作为：在溶剂中浸泡即可；所述浸泡的时间为65～80h。
9.如权利要求8所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述磷酸镁骨水泥粉末和所述致孔剂的质量比为1:2或者1:3；
步骤1)中，所述致孔剂的粒径为300μm；
步骤1)中，所述压制成片的过程中，采用的压力为4Mpa；
步骤2)中，所述固化的时间为72h；
步骤2)中，所述固化的温度为37℃；
步骤2)中，所述在溶剂中溶解致孔剂形成孔的操作在溶剂中浸泡的时间为72h。
10.如权利要求1所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，通过浸泡的方式在所述磷酸镁骨水泥支架表面负载有BPP纳米片。
11.如权利要求10所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述浸泡的方式按下述步骤进行：将所述磷酸镁骨水泥支架浸泡于含有BPP纳米片的溶液后，干燥、重复浸泡干燥即可；
所述浸泡的时间为5～20min；
所述含有BPP纳米片的溶液中，BPP纳米片的浓度为0.5～5mg/mL；
所述含有BPP纳米片的溶液中，采用的溶剂为醇类溶剂；
所述干燥的方式为真空干燥；
所述重复的次数为2～5次。
12.如权利要求11所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述浸泡的时间为10min或者15min；
和/或，所述含有BPP纳米片的溶液中，BPP纳米片的浓度为1mg/mL；
和/或，所述含有BPP纳米片的溶液中，采用的溶剂为乙醇；
和/或，所述重复的次数为3次。
13.如权利要求11所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述含有BPP纳米片的溶液为含有BPP纳米片的植酸溶液或者含有BPP纳米片的聚多巴胺溶液。
14.如权利要求13所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述BPP纳米片的植酸溶液的pH值为5～6；
所述含有BPP纳米片的聚多巴胺溶液通过下述步骤制得：将盐酸多巴胺粉末溶解于PBS缓冲液中，混合反应得到聚多巴胺溶液；将BPP纳米片末添加至聚多巴胺溶液中混合均匀即可。
15.如权利要求1所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述BPP纳米片横向尺寸为100-200nm，平均厚度为10～15nm；
和/或，所述极性溶剂为DMF或NMP；
和/或，所述混合物通过将所述黑磷与所述原花青素分散于所述极性溶剂中得到；
和/或，所述黑磷与所述原花青素的质量比为≤1:1；
和/或，所述黑磷的质量与所述极性溶剂的体积的比为1mg:(1～2)mL；
和/或，所述超声的频率为30～50kHz；
和/或，所述超声的功率为150～200W；
和/或，所述超声的时间为8～12h；
和/或，所述超声的温度为-1～5℃。
16.如权利要求15所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述黑磷与所述原花青素的质量比为1:(1～2)；
和/或，所述混合物通过下述步骤得到：先将所述黑磷分散于极性溶剂中，然后再加入所述原花青素；
和/或，所述黑磷的质量与所述极性溶剂的体积的比为1mg:1mL或1mg:1.5mL；
和/或，所述超声的频率为40kHz；
和/或，所述超声的功率为180W；
和/或，所述超声的时间为10h；
和/或，所述超声的温度为0℃。
17.如权利要求15所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述黑磷与所述原花青素的质量比为1:1或1:1.5。
18.如权利要求1所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述第一次离心的转速为2000～4000r/min；
和/或，所述第一次离心的时间为5～10min；
和/或，所述第二次离心的转速为8000～10000r/min；
和/或，所述第二次离心的时间为10～20min；
和/或，在收集沉淀后，还包括将沉淀进行洗涤的步骤。
19.如权利要求18所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述洗涤的试剂为水和/或醇类溶剂；
所述洗涤的次数为2-3次；
所述洗涤包括如下步骤：依次使用水和醇类溶剂洗涤所述沉淀，每种溶剂洗涤2～3次。
20.如权利要求18所述的含黑磷复合材料的制备方法，其特征在于，所述第一次离心的转速为2500r/min、3000r/min或3500r/min；
和/或，所述第一次离心的时间为5min；
和/或，所述第二次离心的转速为9000r/min或9500r/min；
和/或，所述第二次离心的时间为15min或20min；
和/或，所述洗涤的次数为3次。
21.一种如权利要求1～20任一项所述的含黑磷复合材料的制备方法制得的含黑磷复合材料。
22.一种如权利要求21所述的含黑磷复合材料在制备骨修复材料中的应用。
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