CN114599397B - Tau蛋白病的预防或治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有电压门控钙离子通道的α2δ抑制剂的Tau蛋白病的预防或治疗剂。

Description

Tau蛋白病的预防或治疗剂
技术领域
本发明涉及一种针对Tau蛋白病的新型预防或治疗剂。更具体而言，本发明涉及一种含有抑制钙离子流入细胞内的抑制剂的Tau蛋白病的预防或治疗剂。
背景技术
随着社会的老龄化，痴呆症患者不断增加，推测大部分痴呆症患者属于Tau蛋白病(Tauopathy)患者。Tau蛋白病是一种神经退行性疾病的总称，该疾病伴随着Tau蛋白在脑内聚集及在细胞内累积，一般认为，Tau蛋白的聚集与发病相关。作为典型的疾病，可列举阿尔茨海默氏病或表现为Tau蛋白病的额颞叶退化症(Frontotemporal lobar degeneration-Tau；FTLD-Tau)。这些疾病都没有确立有效的治疗法，因此，迫切希望开发具有治疗或预防效果的药剂。
近年来，由于人工多能性干细胞(iPS细胞)技术的进步，制成了许多神经退行性疾病的细胞模型。目前，本发明人等报道了，通过在人工多能性干细胞中强制表达神经原素2(Neurogenin2，Ngn2)，能够使该细胞快速且高效地向谷氨酸能大脑皮质神经细胞分化诱导(专利文献1)。并且证明了，使用该方法由来自家族性FTLD-患者的iPS细胞所制作的大脑皮质神经细胞中，自发产生Tau蛋白寡聚化并导致细胞死亡，即，该细胞是优异的Tau蛋白病细胞模型(专利文献2)。
并且，本发明人等通过利用抑制性的人工受体(仅由设计药物激活的设计受体，designer receptors exclusively activated by designer drug；DREADD)hM4Di进行分析证明了，在上述Tau蛋白病细胞模型中，若抑制神经活动，则会减轻Tau蛋白寡聚化及细胞死亡(专利文献3，非专利文献1)。还证明了，NMDA型或AMPA型谷氨酸受体的拮抗剂(AP5(APV,R-2-氨基-5-膦酰基戊酸酯，R-2-amino-5-phosphonopentanoate)、CNQX(6-氰基7-硝基喹喔啉2,3-二酮，6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione))也可以减轻Tau蛋白寡聚化及细胞死亡(专利文献2、3、非专利文献1)。
基于以上理解表明，能够抑制伴随神经活动的钙流入的药剂可以作为Tau蛋白病的预防或治疗药物。然而，依然不清楚参与钙流入的蛋白质中哪些对于Tau蛋白病的病变特别重要。
此外，作为打破目前新药开发研究僵局的方法，探讨了药物再定位(DR)这一新的研究概念。药物再定位是指从已经通过实际效果确认了人体中的安全性和体内药代动力学的现有药物中发现新的药效并实现实用化。可以使用许多现有的数据，因此可以降低开发成本，还具有存在积累的技术和材料(外围化合物等)等进一步的优点。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2014/148646
专利文献2：WO 2016/076435
专利文献3：WO 2018/066701
非专利文献
非专利文献1：Imamura,K.,et al.,Calcium dysregulation contributes toneurodegeneration in FTLD patient iPSC-derived neurons.Sci.Rep.,6:34904-34913,2016.
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的课题在于通过药物再定位提供一种Tau蛋白病的预防或治疗手段，该手段利用已经通过实际效果确认了人体中的安全性和体内药代动力学的现有药物。
解决问题的方法
虽然本发明的发明人已经证明了AP5和CNQX对Tau蛋白病模型细胞的细胞死亡抑制效果，但这些药剂仅被用于人类以外的实验用途，因此距实际用作预防、治疗剂还具有很长的距离。因此，本发明的发明人尝试了从现有药物的中寻找起到相同效果的药剂。具体而言，分析了约200种不同的现有药物和6种癫痫治疗药物对上述Tau蛋白病细胞模型的细胞死亡抑制效果。结果意外发现加巴喷丁具有显著的细胞死亡抑制效果，而加巴喷丁不是电压门控钙离子通道的直接抑制剂，而仅是其辅助亚基之一的α2δ的配体。并且，确认加巴喷丁还具有抑制Tau低聚物形成的效果。
另外还确认，与加巴喷丁一样已知作为α2δ抑制剂的普瑞巴林和米洛巴林也具有显著抑制上述Tau蛋白病细胞模型中的细胞死亡和Tau低聚物形成的效果。
并且表明，加巴喷丁还能够抑制Tau蛋白病小鼠模型的脑内中所产生的Tau蛋白的聚集。基于以上结果完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种Tau蛋白病的预防或治疗剂，含有电压门控钙离子通道的α2δ抑制剂而成。
[2]根据[1]所述的预防或治疗剂，其中，所述α2δ抑制剂为式(1)所表示的化合物或其的盐，
式(I)中，
R1为碳原子数1～6的直链或支链状的烷基；
R2为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基，或R1和R2键合而形成任选与5元碳环缩合的碳原子数4～6的环烷烃，该5元碳环任选被碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基或碳原子数3～7的环烷基取代；
R3为氢原子、甲基或羧基；
R4为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基；
R5为氢原子或式(II)所表示的基团，
式(II)中，
n为0或1；
R6为氢、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、酰基、取代酰基、烷氧基羰基、取代烷氧基羰基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、氨基甲酰基、取代氨基甲酰基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基，或R6和R7任选与它们所键合的原子一同形成环杂烷基或取代环杂烷基环；
R7为氢、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基；
R8和R9独立地为氢、烷基、取代烷基、烷氧基羰基、取代烷氧基羰基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、氨基甲酰基、取代氨基甲酰基、环烷基、取代环烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基，或R8和R9任选与它们所键合的原子一同形成环烷基、取代环烷基、环杂烷基或取代环杂烷基环；
R10为酰基、取代酰基、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基。
[3]根据[2]所述的预防或治疗剂，其中，上述α2δ抑制剂为选自加巴喷丁、普瑞巴林、米洛巴林和加巴喷丁恩那卡比、以及它们的类似物的一种以上化合物或其的盐。
[4]根据[3]所述的预防或治疗剂，其中，上述α2δ抑制剂为选自加巴喷丁和普瑞巴林中的一种以上化合物或其的盐。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的预防或治疗剂，其为Tau蛋白的错误折叠的抑制剂。
[6]根据[1]～[4]中任一项所述的预防或治疗剂，其中，上述Tau蛋白病为阿尔茨海默氏病或呈现出Tau蛋白病的额颞叶退化症(FTLD-Tau)。
[7]根据[6]所述的预防或治疗剂，其中，Tau蛋白病由MAPT基因突变引起。
[8]一种Tau蛋白病的预防或治疗剂的筛选方法，包括以下的工序：
(1)使电压门控钙离子通道的α2δ与供试物质接触的工序；和
(2)将工序(1)中与α2δ结合后的供试物质选作Tau蛋白病的预防或治疗剂的工序。
[9]一种哺乳动物的Tau蛋白病的预防或治疗方法，包括：
向哺乳动物投予有效量的α2δ抑制剂。
[10]根据[9]所述的方法，其中，上述α2δ抑制剂为式(1)所表示的化合物或其的盐，
式(I)中，
R1为碳原子数1～6的直链或支链状的烷基；
R2为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基，或R1和R2键合而形成任选与5元碳环缩合的碳原子数4～6的环烷烃，该5元碳环任选被碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基或碳原子数3～7的环烷基取代；
R3为氢原子、甲基或羧基；
R4为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基；
R5为氢原子或式(II)表示的基团，
式(II)中，
n为0或1；
R6为氢、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、酰基、取代酰基、烷氧基羰基、取代烷氧基羰基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、氨基甲酰基、取代氨基甲酰基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基，或R6和R7任选与它们所键合的原子一同形成环杂烷基或取代环杂烷基环；
R7为氢、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基；
R8和R9独立地为氢、烷基、取代烷基、烷氧基羰基、取代烷氧基羰基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、氨基甲酰基、取代氨基甲酰基、环烷基、取代环烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基，或R8和R9任选与它们所键合的原子一同形成环烷基、取代环烷基、环杂烷基或取代环杂烷基环；
R10为酰基、取代酰基、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基。
[11]根据[9]或[10]所述的方法，其中，上述α2δ抑制剂为选自加巴喷丁、普瑞巴林、米洛巴林和加巴喷丁恩那卡比、以及它们的类似物的一种以上化合物或其的盐。
[12]一种用于治疗或预防Tau蛋白病的α2δ抑制剂。
[13]根据[12]所述的α2δ抑制剂，其中，上述α2δ抑制剂为式(1)所表示的化合物或其的盐，
式(I)中，
R1为碳原子数1～6的直链或支链状的烷基；
R2为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基，或R1和R2键合而形成任选与5元碳环缩合的碳原子数4～6的环烷烃，该5元碳环任选被碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基或碳原子数3～7的环烷基取代；
R3为氢原子、甲基或羧基；
R4为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基；
R5为氢原子或式(II)所表示的基团，
式(II)中，
n为0或1；
R6为氢、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、酰基、取代酰基、烷氧基羰基、取代烷氧基羰基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、氨基甲酰基、取代氨基甲酰基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基，或R6和R7任选与它们所键合的原子一同形成环杂烷基或取代环杂烷基环；
R7为氢、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基；
R8和R9独立地为氢、烷基、取代烷基、烷氧基羰基、取代烷氧基羰基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、氨基甲酰基、取代氨基甲酰基、环烷基、取代环烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基，或R8和R9任选与它们所键合的原子一同形成环烷基、取代环烷基、环杂烷基或取代环杂烷基环；
R10为酰基、取代酰基、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基。
[14]根据[12]或[13]所述的α2δ抑制剂，其中，上述α2δ抑制剂为选自加巴喷丁、普瑞巴林、米洛巴林和加巴喷丁恩那卡比、以及它们的类似物的一种以上化合物或其的盐。
[15]α2δ抑制剂在制造Tau蛋白病的预防或治疗剂中的应用。
发明的效果
根据本发明，可以预防和/或治疗Tau蛋白病。特别是以已经确认安全性的现有药物为有效成分的药物的副作用较少。
附图说明
图1示出大脑皮质神经细胞的βIII微管蛋白(TUBB3)和NeuN的双重免疫荧光染色的结果，其中，大脑皮质神经细胞由来自MAPT基因具有内含子突变(内含子10+14C→T)或外显子突变(R406W)中的任意一种的FTLD-Tau患者的iPS细胞诱导而来。比例尺＝100μm
图2示出针对已知用作离子通道或离子交换转运蛋白的抑制剂等的6种现有药物分析其对于大脑皮质神经细胞的细胞死亡的抑制效果而得到的结果，其中，大脑皮质神经细胞由来自具有内含子突变(内含子10+14C→T)的FTLD-Tau患者的iPS细胞分化诱导而来。横轴表示各化合物的浓度，纵轴表示上述神经细胞的存活率(＝Day21的存活细胞数/Day8的存活细胞数)×100)(n＝3；one-way ANOVA,p<0.05；post hoc test,*p<0.05)。误差条表示标准误差(SEM)。
图3示出分析加巴喷丁对于大脑皮质神经细胞中产生的Tau蛋白的错误折叠的抑制效果而得到的结果，其中，大脑皮质神经细胞由来自具有外显子突变(R406W)的FTLD-Tau患者的iPS细胞分化诱导而来。图3中，左图示出蛋白质印迹分析的结果，中间图示出斑点印迹分析的结果，右图示出上述斑点印迹分析的结果的定量化图表(n＝3；one-way ANOVA,p<0.05；post hoc test,*p<0.05)。误差条表示标准误差(SEM)。图3的中间图及右图中，上图表示使用培养上清液作为样品时的结果，下图表示使用细胞裂解物作为样品时的结果。
图4示出针对普瑞巴林和米洛巴林分析其对于大脑皮质神经细胞的细胞死亡的抑制效果而得到的结果(n＝6；one-way ANOVA,p<0.05；post hoc test,*p<0.05)，其中，大脑皮质神经细胞由来自FTLD-Tau患者的iPS细胞分化诱导而来。详细内容与图2相同。
图5示出分析普瑞巴林对于大脑皮质神经细胞中产生的Tau蛋白的错误折叠的抑制效果而得到的结果(斑点印迹分析)，其中，大脑皮质神经细胞由来自FTLD-Tau患者的iPS细胞分化诱导而来。详细内容与图3相同。
图6示出分析米洛巴林对于大脑皮质神经细胞中产生的Tau蛋白的错误折叠的抑制效果而得到的结果(斑点印迹分析)，其中，大脑皮质神经细胞由来自FTLD-Tau患者的iPS细胞分化诱导而来。详细内容与图3相同。
图7是使用正电子发射断层扫描(PET)对加巴喷丁(口服给药)对于Tau蛋白病小鼠模型的脑内产生的Tau蛋白聚集的抑制效果进行分析而得到的结果。图7A表示加巴喷丁给药小鼠及非给药小鼠的[18F]PM-PBB的时间-放射性曲线数据。图7B分别表示[18F]PM-PBB3静脉注射40-60分钟后包括海马体和大脑皮质在内的脑剖面中以小脑为目标区域的标准化摄取值(Standardized uptake value ratio，SUVR)图像(上段)、和上述SUVR图像和MRI图像的重叠图像(下段)。图7C为表示图7B的SUVR图像中得到的放射性(radioactivity)的平均值的图表(加巴喷丁给药小鼠：n＝2，非给药小鼠：n＝1)。
发明的具体实施方式
1.本发明的药剂
本发明提供一种Tau蛋白病的预防或治疗剂(以下，有时使用“本发明的药剂”这一术语来表示包含预防剂和治疗剂的制剂。)，其含有电压门控钙离子通道的α2δ抑制剂而成。在另一方案，本发明提供一种用于治疗或预防Tau蛋白病的α2δ抑制剂。在又一方案中，本发明还提供一种α2δ抑制剂在制造Tau蛋白病的预防或治疗剂中的应用。
<<Tau蛋白>>
Tau蛋白是主要在神经系统中表达的微管结合蛋白，促进微管蛋白的聚合并使微管稳定，有助于神经轴突的构建及保持。其被MAPT基因编码，并通过选择性剪接在人类脑中表达6种异构体(亚型，isoform)。特别是，外显子10的选择性剪接非常重要，若外显子被剪接，则产生具有3个与微管结合相关的重复序列的3R型(3重复Tau蛋白)，若外显子不被剪接，则产生具有4个该序列的4R型(4重复Tau蛋白)。通常，在人类成人脑中，4重复Tau蛋白的表达量和3重复Tau蛋白的表达量基本处于相同水平。
已知无论哪一种异构体被过磷酸化，都将失去与微管的结合能力而产生自凝集(Lee V.M.,et al.,Annu.Rev.Neurosci.,24:1121-159,2001)。
<<Tau蛋白病>>
如上所述，Tau蛋白病是神经退行性疾病的总称，该疾病伴随Tau蛋白在脑内聚集和细胞内累积，一般认为，Tau蛋白的聚集与发病有关。作为代表性Tau蛋白病，可列举：阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease；AD)、表现为Tau蛋白病的额颞叶退化症(Frontotemporal lobar degeneration tauopathy；FTLD-tau)、额颞痴呆(Frontotemporal dementia；FTD)、皮克病(Pick’s disease)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy；PSP)、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration；CBD)、嗜银颗粒痴呆(嗜银颗粒病)、神经原纤维变化型痴呆症、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症(Diffuse neurofibrillary tangles with calcification；DNTC)、肌强直性营养不良、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(Pantothenate kinase-associatedneurodegeneration；PKAN)、β螺旋蛋白相关性神经变性病(β-propeller protein-associated neurodegeneration；BPAN)、脑铁沉积神经退行性病变(neurodegenerationwith brain iron accumulation；NBIA)、亨廷顿氏病等。17号染色体连锁额颞叶痴呆合并相关的帕金森综合征(frontotemporal dementia with Parkinsonism linked tochromosome 17；FTDP-17)是FTLD-tau的一种，从该综合征患者中鉴定出很多MAPT基因突变，有效地分析了Tau蛋白的异常与发病的关系。该突变大致分为产生突变型Tau蛋白的类型(外显子突变)、和产生外显子10的剪接异常的类型(主要为内含子突变)，有报道指出，在不仅是外显子突变，内含子也突变的情况下，Tau蛋白会聚集并累积(Hutton,M.,et al.,Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with theinherited dementia FTDP-17.Nature 393,702-705,1998.)。
α2δ抑制剂或本发明的药剂能够用作上述任意Tau蛋白病的预防或治疗剂，优选阿尔茨海默氏病和FTLD-tau。这些疾病的患者的MAPT基因上可以具有，也可以不具有突变。另外，可以是家族性，也可以是散发性。并且，在MAPT基因上具有突变的情况下，可以为外显子的突变(例如，R406W的突变)、内含子的突变(例如，内含子10+14C→T的突变，即，MAPT基因的内含子10的第14个碱基胞嘧啶被取代为胸腺嘧啶)中的任意种。
<<电压门控钙离子通道>>
电压门控钙离子通道(voltage-dependent calcium channel；VDCC)是感知质膜的去极化而激活打开，使Ca2+选择性从细胞外向细胞内渗透的离子通道。根据打开电位的不同，VDCC被大致分为在高电位(～-20mV)下激活的L型及非L型、和在低电位(～-60mV)被激活的T型，非L型进一步分为N型、P/Q型、R型。VDCC由形成通道本身(channel pore)的巨大的α1亚基、及两种或三种辅助亚基(α2δ、β、γ)形成。一般认为，其中，决定通道的特性的是α1亚基，辅助亚基有助于α1亚基的表达调节及细胞内定位等(Bauer CS.,et al.,A new lookat calcium channelα2δsubunits.Curr Opin Neurobiol.,20:563-71,2010.)。
α2δ亚基(本说明书中，有时省略“α2δ”)是由单一的基因编码的α2及δ通过二硫键连接而成的二聚物，已知有四种异构体(α2δ-1、α2δ-2、α2δ-3、α2δ-4)。编码α2δ-1的基因已知为CACNA2D1(GeneBankAcecession No:NM_000722(人类))，编码α2δ-2的基因已知为CACNA2D2(GeneBank AcecessionNo:NM_001005505(人类))，编码α2δ-3的基因已知为CACNA2D3(GeneBankAcecession No:NM_018398(人类))，编码α2δ-4的基因已知为CACNA2D4(GeneBank Acecession No:NM_172364(人类))。作为α2δ，根据编码α2δ的基因，以α2和δ融合的形式(Pro-form)表达后，通过翻译后修饰切割为α2和δ，在α2和δ之间形成二硫键，从而形成二聚物(Dolphin A.C.,Biochim BiophysActa.,1828(7):1541-9(2013))。已知α2δ亚基有助于α1亚基向质膜转运(Davies A.,et al.,Trends Pharmacol Sci.,28(5):220-8(2007))。本发明中使用的α2δ抑制剂所靶向的α2δ异构体没有特别限定，优选在中枢神经系统中高表达的α2δ-1、α2δ-2和α2δ-3，其中，更优选α2δ-1和α2δ-2。
<<α2δ抑制剂>>
在本说明书中，“α2δ抑制剂”(也称为“本发明的化合物”。)表示抑制α2δ的功能(例：α1亚基的表达诱导、α1亚基向质膜的转运等)的化合物，通过该抑制可以间接抑制钙离子经由VDCC流入细胞内。因此，在本说明书中，α2δ抑制剂不包括与VDCC通道本身结合而直接抑制钙经由VDCC流入的物质。该α2δ抑制剂包括α2δ配体、针对α2δ的抗体、适体、α2δ的表达抑制剂等。
在本说明书中，“α2δ配体”表示能够与α2δ结合并抑制α2δ的功能的化合物，作为本发明中使用的α2δ配体，只要其能够抑制α2δ的功能，则没有特别限制，但从降低开发成本的观点出发，优选已经通过实际效果确认了人体中的安全性及体内药代动力学的现有药物。另外，从减少副作用的观点出发，优选为与α2δ特异性结合的化合物。具体而言，可列举例如：式(1)所表示的化合物，
式(I)中，
R1为碳原子数1～6的直链或支链状的烷基；
R2为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基，或R1和R2键合而形成可以与5元碳环缩合的碳原子数4～6的环烷烃，该5元碳环可以被碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基或碳原子数3～7的环烷基取代；
R3为氢原子、甲基或羧基；
R4为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基；
R5为氢原子或式(II)所表示的基团，
式(II)中，
n为0或1；
R6为氢、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、酰基、取代酰基、烷氧基羰基、取代烷氧基羰基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、氨基甲酰基、取代氨基甲酰基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基，或R6和R7任选与它们所键合的原子一同形成环杂烷基或取代环杂烷基环；
R7为氢、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基；
R8和R9独立地为氢、烷基、取代烷基、烷氧基羰基、取代烷氧基羰基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、氨基甲酰基、取代氨基甲酰基、环烷基、取代环烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基，或R8和R9任选与它们所键合的原子一同形成环烷基、取代环烷基、环杂烷基或取代环杂烷基环，
R10为酰基、取代酰基、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、杂烷基、取代杂烷基、杂芳基、取代杂芳基、杂芳基烷基或取代杂芳基烷基。
式(I)的R5为式(II)表示的基团的化合物用作R5为氢原子的化合物的前药。作为用作前药的化合物的进一步的具体例，可列举例如如下化合物等：(1)化合物，其中，R8为氢；R9为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环己基或苯基；R10为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,1-二甲氧基乙基、1,1-二乙氧基乙基、环丁基、环戊基、环己基、苯基、4-甲氧基苯基、苄基、苯乙基、苯乙烯基或3-吡啶基；(2)化合物，其中，R8和R9为甲基；R10为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,1-二甲氧基乙基、1,1-二乙氧基乙基、环丁基、环戊基、环己基、苯基、4-甲氧基苯基、苄基、苯乙基、苯乙烯基或3-吡啶基；(3)化合物，其中，R8为甲基；R9为甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基或环己基氧基羰基；R10为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,1-二甲氧基乙基、1,1-二乙氧基乙基、环丁基、环戊基、环己基、苯基、4-甲氧基苯基、苄基、苯乙基、苯乙烯基或3-吡啶基；(4)化合物，其中，R9和R8与它们所键合的原子一同形成环己基环；R10为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,1-二甲氧基乙基、1,1-二乙氧基乙基、环丁基、环戊基、环己基、苯基、4-甲氧基苯基、苄基、苯乙基、苯乙烯基或3-吡啶基；(5)化合物，其中，R8为氢；R9为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；R10为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、1,1-二甲氧基乙基、1,1-二乙氧基乙基、环丁基、环戊基或环己基；(6)化合物，其中，R8为氢；R9为甲基、正丙基或异丙基；R10为乙基或异丙基；(7)化合物，其中，R8为氢，R9为甲基；R10为异丙基；(8)化合物，其中，R8为氢；R9为甲基；R10为乙基或异丙基；(9)化合物，其中，R8为氢；R9为甲基；R10为异丙基。进一步具体而言，作为式(I)所表示的化合物，可列举加巴喷丁恩那卡比。
上述对式(I)的各基团的说明中记载的各个术语依据日本特表2005-529941中的定义或说明。上述式(1)所表示的化合物可以通过自身公知的方法来制造，可列举例如日本特表2005-529941中所述的方法等。
在本说明书中，“被取代”(有时也简称为“取代”)表示一个以上氢原子被替换为取代基。典型的取代基包括但不限定于：-M、-R60、-O-、＝O、-OR60、-SR60、-S-、＝S、-NR60R61、＝NR60、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-S(O)2O-、-S(O)2OH、-S(O)2R60、-OS(O2)O-、-OS(O)2R60、-P(O)(O-)2、-P(O)(OR60)(O-)、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(S)R60、-C(O)OR60、-C(O)NR60R61、-C(O)O-、-C(S)OR60、-NR62C(O)NR60R61、-NR62C(S)NR60R61、-NR62C(NR63)NR60R61、-C(NR62)NR60R61(其中、M独立地为卤素；R60、R61、R62及R63独立地为氢、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基，或者R60和R61任选与它们所键合的氮原子一同形成环杂烷基或取代环杂烷基环；R64和R65独立地为氢、烷基、取代烷基、芳基、环烷基、取代环烷基、环杂烷基、取代环杂烷基、芳基、取代芳基、杂芳基或取代杂芳基，或者R64和R65任选与它们所键合的氮原子一同形成环杂烷基或取代环杂烷基环。)。优选地，取代基包括-M、-R60(＝O)-OR60、-SR60、-S-、＝S、-NR60R61(＝NR60)-CF3(-CN)-OCN-(-SCN)-NO、-NO2、＝N2、-N3、-S(O)2R60、-OS(O2)O-、-OS(O)2R60、-P(O)(O-)2、-P(O)(OR60)(O-)、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(S)R60、-C(O)OR60、-C(O)NR60R61、-C(O)NR60R61、-C(O)O-、-NR62C(O)NR60R61；进一步优选包括-M、-R60、＝O、-OR60、-SR60、-NR60R61、-CF3、-CN、-NO2、-S(O)2R60、-P(O)(OR60)(O-)、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(O)OR60、-C(O)NR60R61、-C(O)O-；最优选包括-M、-R60、＝O、-OR60、-SR60、-NR60R61、-CF3、-CN、-NO2、-S(O)2R60、-OP(O)(OR60)(OR61)、-C(O)R60、-C(O)OR60、-C(O)O-(其中、R60、R61、R62定义如上。)。
在本说明书中，在R6～R10、R60～R65包含碳原子的情况下，每个碳原子数典型地为1～20个，优选为1～10个，进一步优选为1～6个。
另外，作为式(1)的R5为氢原子的化合物，可列举例如：加巴喷丁、普瑞巴林、米洛巴林、它们的类似物等。
作为加巴喷丁的类似物，可列举：上述式(I)的R1和R2键合而形成碳原子数4～6的环烷烃、优选碳原子数6的环烷烃；R3为氢原子、甲基或羧基、优选氢原子；R4为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基、优选为氢原子的化合物。上述式(I)的R1和R2键合而形成碳原子数6的环烷烃且R3和R4为氢原子的化合物是加巴喷丁。加巴喷丁及其类似物能够通过自身公知的方法来制造，可列举例如日本特开昭51-88940中所述的方法等。
作为普瑞巴林的类似物，上述式(I)的R1为碳原子数1～6的直链或支链状的烷基、优选异丁基；R2为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基、优选氢原子；R3为氢原子、甲基或羧基、优选为氢原子，R4为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基、优选为氢原子。上述式(I)的R1为异丁基且R2～R4为氢原子的化合物是普瑞巴林。普瑞巴林及其类似物能够通过自身公知的方法来制造，可列举例如日本特开2000-34226中所述的方法等。
作为米洛巴林的类似物，可列举下述式(III)所表示的化合物，
式中，R3为氢原子、甲基或羧基，优选为氢原子；
R4为氢原子或者碳原子数1～6的直链或支链状的烷基，优选为氢原子；
R11为碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基或碳原子数3～7的环烷基，优选为乙基。上述式(I)的R3为氢原子、R4为氢原子、R11为乙基的化合物是米洛巴林。米洛巴林及其类似物能够通过自身公知的方法来制造，可列举例如WO2009/041453中所述的方法等。
本发明的化合物中，不仅包含自由体，还包括其药理学上可接受的盐。药理学上可接受的盐根据化合物的种类而不同，可列举例如：碱金属盐(钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(钙盐、镁盐等)、铝盐、铵盐等无机碱盐；以及三甲胺、三乙胺、吡啶、皮考啉、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、N,N’-二苄基乙二胺等的有机碱盐等碱加成盐；或盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐；柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等有机酸盐等酸加成盐。
在本发明的化合物具有光学异构体、立体异构体、位置异构体、阻转异构体等异构体的情况下，本发明的化合物也包括任意一种异构体及其混合物。例如，在本发明的化合物存在光学异构体的情况下，本发明的化合物也包括从外消旋体拆分出的光学异构体。
这些异构体可以通过自身公知的合成方法、分离方法(例如，浓缩、溶剂提取、柱层析、重结晶等)、光学拆分方法(例如，分离重结晶法、手性柱法、非对映体法等)等分别作为单品而获得。
本发明的化合物可以为结晶，本发明的化合物包括单一晶型，也包括晶型混合物。结晶可以通过应用自身公知的晶析法进行晶析来制造。
本发明的化合物可以为溶剂化物(例如，水合物等)，也可以为无溶剂化物(例如，非水合物等)，它们均包含在本发明的化合物中。
另外，本发明的化合物也包括被同位素(例如，3H、14C、35S、125I等)等标记的化合物。
本发明中使用的抗α2δ抗体能够使用公知的手段作为多克隆或单克隆抗体获得。或者也可以使用市售品。本发明中使用的抗体的来源没有特别限定，优选来自哺乳动物，更优选为来自人类的抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，可以为由杂交瘤产生的抗体、及由通过基因工程方法被包含抗体基因的表达载体转化后的宿主产生的抗体的任意一种。产抗体杂交瘤可以通过自身公知的方法来制作，例如，将α2δ或其的一部分用作抗原，按照常用的免疫方法将该抗原免疫，通过常用的细胞融合法使得到的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，并通过常用的筛选法筛选出单克隆的产抗体细胞，由此制造产抗体杂交瘤。
本发明中使用的适体可以为核酸适体，也可以为肽适体。在为核酸适体时，该核酸可以为DNA，也可以为RNA，或者还可以为DNA/RNA嵌合体。另外，还可以为对核糖、磷酸骨架、核酸碱基、氨基酸残基、两末端部分施加了修饰的核酸或肽。核酸适体可以为双链，也可以为单链，优选单链。本发明的适体能够使用本领域技术人员熟知的方法来筛选。能够通过例如SELEX法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)(Tuerk,C.and Gold,L.,1990,Science,249:505-510)及酵母的Two-hybrid法筛选，但不限定于此。
本发明中使用的α2δ表达抑制剂可以是在编码α2δ的基因的转录水平、转录后调节的水平、向蛋白质翻译的水平、翻译后修饰的水平等任意阶段起作用的物质。因此，α2δ表达抑制剂包括例如：抑制编码α2δ的基因转录的核酸(例：抗原)、抑制从初始转录产物向mRNA加工的核酸、抑制从mRNA向蛋白质翻译的(例：反义核酸，miRNA)或分解mRNA的(例：siRNA，核酶，微小RNA(miRNA))核酸等。
可以基于α2δ基因的cDNA序列信息，按照例如Elbashir等(Genes Dev.,15,188-200(2001))所提倡的规则来设计siRNA。另外，适当选择能够形成环结构的任意的接头序列(例如，5-25碱基左右)，并将siRNA的正义链和反义链经由该接头序列连接，由此，能够设计作为siRNA前体的短发夹RNA(shRNA)。
可以使用各种web网站上免费提供的检索软件来检索siRNA和/或shRNA的序列。作为这些的网站，可列举例如：Dharmacon提供的siDESIGNCenter(http://dharmacon.horizondiscovery.com/jp/design-center/？rdr＝true&LangType＝1041&pageid＝17179928204)、GenScript提供的siRNA Target Finder(https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder)等，但不限定于此。
可以使用各种web网站上免费提供的标靶预测软件来检索miRNA。作为这样的网站，可列举例如：美国怀特黑德研究所公开的TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、希腊亚历山大·弗莱明生物医学研究中心公开的DIANA-micro-T-CDS(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php？r＝microT_CDS/index)等，但不限定于此。或者，也可以使用色萨利大学-巴斯德研究所等的公开的数据库TarBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php？r＝tarbasev8/index)来检索靶向编码α2δ的mRNA的miRNA，其中，该数据库涉及已通过实验证明可以作用于靶mRNA的miRNA。
通过DNA/RNA自动合成机分别合成mRNA上的靶序列的正义链及反义链，在合适的退火缓冲液中，在约90～约95℃下变性约1分钟左右后，在约30～约70℃下退火约1～约8小时，由此，能够制备siRNA。另外，也可以通过合成作为siRNA前体的shRNA，并使用dicer酶切割该shRNA来制备siRNA。miRNA及pre-miRNA可以基于它们的序列信息，通过DNA/RNA自动合成机来合成。
反义核酸可以为DNA，也可以为RNA，还可以为DNA/RNA嵌合体。在反义核酸为DNA时，由靶RNA和反义DNA形成的RNA:DNA杂交物能够被内源性RNase H识别并引起靶RNA的选择性分解。作为反义核酸的靶区，只要通过该反义核酸与之杂交来抑制向蛋白质翻译，则其长度没有特别限制，可以为编码蛋白质的mRNA的全序列，也可以为其的部分序列，较短者可列举约10碱基左右，较长者可列举mRNA或者初始转录产物的全序列。另外，反义核酸还可以为不仅与靶mRNA或初始转录产物杂交来抑制它们向蛋白质翻译，还能够与双链DNA即靶mRNA或初始转录产物的基因结合并形成三链(三重)而抑制它们向RNA转录的物质(抗原)。
基于靶基因的cDNA序列或者基因组DNA序列确定mRNA或者初始转录产物的靶序列，使用市售的DNA/RNA自动合成机合成与它们互补的序列，由此，能够制备反义核酸。
作为本发明的药剂，可以单独直接口服或非口服给药作为有效成分的本发明的化合物，或将本发明的化合物与药理学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等混合制成合适的剂型的药物组合物后口服或非口服给药。
作为用于口服给药的组合物，可列举：固体或液体剂型，具体而言，片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。另一方面，作为用于非口服给药的组合物，使用例如注射剂、栓剂等，注射剂可以包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这些制剂可以使用下述添加剂通过公知的方法来制造：赋形剂(例如，乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇等糖衍生物；玉米淀粉、马铃薯淀粉、α淀粉、糊精等淀粉衍生物；结晶纤维素等纤维素衍生物；阿拉伯树胶；葡聚糖；普鲁兰等有机类赋形剂；以及、轻质无水硅酸、合成硅酸铝、硅酸钙、偏硅酸铝镁等硅酸盐衍生物；磷酸氢钙等磷酸盐；碳酸钙等碳酸盐；硫酸钙等的硫酸盐等无机类赋形剂)、润滑剂(例如，硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁等硬脂酸金属盐；滑石；胶体二氧化硅；蜂蜡、鲸蜡等蜡类；硼酸；己二酸；硫酸钠等硫酸盐；二醇；富马酸；苯甲酸钠；DL亮氨酸；月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁等月桂基硫酸盐；硅酸酐、硅酸水合物等硅酸类；及、上述淀粉衍生物)、结合剂(例如，羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、以及与上述赋形剂相同的化合物)、崩解剂(例如，低取代度羟基丙基纤维素、羧基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钙、内部交联羧基甲基纤维素钠等纤维素衍生物；羧基甲基淀粉、羧基甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉及纤维素类)、乳化剂(例如，膨润土、蜂胶等胶体粘土；氢氧化镁、氢氧化铝等金属氢氧化物；月桂基硫酸钠、硬脂酸钙等阴离子表面活性剂；苯扎氯铵等阳离子表面活性剂；以及聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等非离子型表面活性剂)、稳定剂(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇、苄基醇、苯基乙基醇等醇类；苯扎氯铵；苯酚、甲酚等苯酚类；硫柳汞；脱氢乙酸；及、山梨酸)、矫味矫臭剂(例如，常用的甜味剂、酸味剂、香料等)、稀释剂等。
本发明的药剂的有效成分、即本发明的化合物的给药量可以根据化合物的种类、给药对象的症状、年龄、体重、药物接受度等多种条件而变化，在口服给药的情况下，成人可以每日给药1至6次，每次的下限为0.1mg(优选为0.5mg)，上限为1000mg(优选为500mg)；在非口服的给药的情况下，成人可以每日给药1至6次，每次下限为0.01mg(优选为0.05mg)，上限为100mg(优选为50mg)。也可以根据症状增量或者减量。特别是，在本发明的化合物是已经作为针对上述疾病以外的疾病的药物上市的情况下，各化合物可以在已确认安全性的范围内适当选择给药量。
并且，本发明的药剂还可以与其它药剂连用，例如，选择性血清素再摄取抑制剂(例：氟伏沙明、帕罗西汀、舍曲林等)、血清素2A拮抗剂/再摄取抑制剂(例：曲唑酮等)等。本发明的药剂及这些其它药剂可以同时、依次或单独给药。
本发明还包括向哺乳动物(作为治疗或预防对象的动物)投予本发明的化合物的有效量或本发明的药剂的治疗和/或预防方法。作为该动物，可列举小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、绵羊、猴、人)，优选人。
2.本发明的方法
本发明还提供Tau蛋白病的预防或治疗剂的筛选方法(以下，有时简称为“本发明的方法”)，包括下述工序。
(1)使电压门控钙离子通道的α2δ与供试物质接触的工序；和
(2)将工序(1)中与α2δ结合后的供试物质选作Tau蛋白病的预防或治疗剂的候选的工序。
如下述实施例所示，本发明的发明人证明了辅助亚基α2δ的配体加巴喷丁显示出显著的细胞死亡抑制效果，其中，辅助亚基α2δ用于对组成钙通道的亚基的定位等进行调节。一般认为，加巴喷丁通过与α2δ结合抑制其功能，从而间接抑制钙离子经由VDCC流入细胞内，进而发挥Tau蛋白病的预防或治疗效果。因此，只要能够筛选出与α2δ结合的物质，则能够将该物质用作Tau蛋白病的预防或治疗剂的候选。
本发明的方法中使用的α2δ可以为α2δ-1、α2δ-2、α2δ-3、α2δ-4中的任意一种，优选α2δ-1、α2δ-2和α2δ-3，特别优选α2δ-1和α2δ-2。另外，也可以为它们的一部分，可列举例如：α2结构域的全部或一部分、各δ结构域的全部或一部分等。另外，α2δ也可以为例如上述Pro-form等α2和δ的融合蛋白质的形式，另外，还可以由α2和δ通过二硫键等结合。另外，在以融合蛋白质的形式提供时，α2和δ可以经由GS接头等接头融合。
上述α2δ可以通过基因工程方法或化学合成法来制造。作为基因工程方法，例如，基于公知的序列信息，制作编码α2δ的核酸，使用细胞或通过无细胞系统由该核酸合成蛋白质，由此能够制得上述α2δ。
本发明中，α2δ与供试物质“结合”(也称为“具有结合性”)表示形成如下状态：以在使两种物质接触后在这些物质之间可以产生相互作用的程度互相接近或缔合的状态。作为该相互作用，可列举例如：共价键、配位键、离子键、氢键、范德华键、疏水相互作用等。
另外，可以通过测定结合活性或亲和性的指标来确定α2δ和供试物质有无结合性。作为结合亲和性的指标，可列举例如：解离常数(KD)或作为其倒数的结合常数(也称为缔合常数)等。解离常数能够通过自身公知的方法来测定，可列举例如：使用表面等离子共振的方法、等温滴定量热法等。
作为用于测定和计算表面等离子共振的系统，可列举例如Biacore系统(GEHealthcare公司)等，但不受特别限定。在使用Biacore系统的情况下，例如可以通过下面的流程来测定KD。(1)通过胺偶联等将α2δ固定化在Biacore系统的传感器芯片上；(2)使α2δ与供试物质在制备为多种浓度的含供试物质溶液中接触；(3)通过表面等离子共振检测两者的相互作用；(4)绘制一系列结合和解离反应的传感图，其中，以时间为横轴，结合量(RU)为纵轴；(5)根据在各浓度下制成的传感图，使用软件(例：BIAevaluation软件(GEHealthcare公司)等)，拟合1：1朗缪尔模型，计算各种速度参数；(6)根据各种速度参数计算解离常数。
作为等温滴定量热法中使用的系统，可列举例如MicroCal·系统(GE Healthcare公司)等，但不受特别限定。在使用MicroCal系统的情况下，例如能够通过下面的流程来测定KD。(1)向保持为一定温度的包含α2δ的样品池中滴加包含供试物质的溶液，并进行搅拌；(2)通过分子间相互作用产生与结合量成正比的热量的发生或吸收，样品池中的溶液温度变化；(3)细胞反馈网络(CFB)感知与参考池的温度差(ΔT)；(4)将参考池或样品池加热至ΔT达到0；(5)测定保持ΔT＝0所需的反馈功率，从而得到相互作用产生的发热量或吸热量；(6)将产生热量作为纵轴，α2δ和供试物质的摩尔比作为横轴，根据结合等温线计算解离常数。
在本说明书中，在使用表面等离子共振测定的情况下，如果KD为1500nM以下，则能够评价对α2δ具有结合性，KD的值越低，可以评价对于α2δ的结合性越高。KD优选为1000nM以下，更优选为500nM以下，进一步优选为300nM以下，特别优选为100nM以下。
作为本发明的方法中使用的供试物质，例示例如：细胞提取物、细胞培养上清液、微生物发酵产物、来自海洋生物的提取物、植物提取物、纯化蛋白或粗蛋白、肽、非肽化合物、合成低分子化合物、及天然化合物。上述供试物质可以使用本技术领域公知的组合库法中的多种方法中的任意一种，该方法包括(1)生物库、(2)利用反卷积的合成库法、(3)“一珠一化合物(one-bead one-compound)”库法、及(4)使用亲和层析分选的合成库法。使用亲和层析分选的生物库法仅限于用于肽库，但其它四种方法也能够适用于肽、非肽低聚物、或化合物的低分子化合物库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145-67)。本技术领域中可以找到分子库的合成方法的例子(DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909-13；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422-6；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37:2678-85；Cho et al.(1993)Science 261:1303-5；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233-51)。化合物库可以制成溶液(参见Houghten(1992)Bio/Techniques 13:412-21)或微珠(Lam(1991)Nature 354:82-4)、芯片(Fodor(1993)Nature 364:555-6)、细菌(美国专利第5,223,409号)、胞子(美国专利第5,571,698号、美国专利第5,403,484号、及美国专利第5,223,409号)、质粒(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-9)或者噬菌体(Scott and Smith(1990)Science 249:386-90；Devlin(1990)Science 249:404-6；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-82；Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-10；美国专利申请第2002-103360号)。
针对通过本发明的方法选作Tau蛋白病的预防或治疗剂候选的供试物质(以下，也称为“候选物质”)，可以进一步评价其对神经细胞中的Tau蛋白的错误折叠的抑制效果。该抑制效果可以作为错误折叠后的Tau蛋白在细胞内累积或向细胞外释放的抑制效果来进行评价。作为该评价方法，可列举例如包括下述工序的方法：(1)将候选物质添加于伴随Tau蛋白病病变的神经细胞，检测或测定错误折叠Tau蛋白在细胞内的量或培养基中的含量(培养基中的量)；和(2)将上述细胞内的量或培养基中的量成为比添加该候选物质前或未添加该候选物的对照组低的值的候选化合物评价为抑制错误折叠Tau蛋白在细胞内累积或向细胞外释放的化合物。在此，低的值是指，相对于对照组的细胞内的量或培养基中的量(对照值)为90％、80％、70％、60％、50％或40％以下的值。
本发明中的“错误折叠Tau蛋白”优选为“Tau低聚物”。“Tau低聚物”是指3-50个Tau蛋白(单体)缔合后的缔合体，可以为可溶性Tau低聚物，也可以为不溶性Tau低聚物。可溶性Tau低聚物可以为例如溶解于1％聚氧乙烯(10)辛基苯醚(Polyoxyethylene(10)Octylphenyl Ether，Triton X-100,CAS No.9002-93-1)后，通过10,000xg左右的离心操作回收至上清液中的低聚物，另外，不溶性Tau低聚物可以为该离心操作后作为沉淀所回收的低聚物。需要指出，本发明的Tau低聚物不包括Tau蛋白纤维(例如，PHF等)，Tau蛋白纤维是不溶性Tau低聚物彼此结合而成的纤维状结构物。
本发明中的Tau低聚物可以进行包括磷酸化在内的各种化学修饰。另外，也可以与其它蛋白质和/或核酸(DNA,RNA)形成复合体。
错误折叠Tau蛋白的量可以通过本领域技术人员熟知的方法来测定(例如，专利文献2、专利文献3)。可列举例如：使用抗Tau蛋白抗体的斑点印迹分析(Dot blot analysis)、使用对于错误折叠Tau蛋白特异性的抗体(例如，TOC1抗体、WO2011/026031中所述的抗体等)的蛋白质印迹法、ELISA法等，但不限定于此。
上述评价方法中使用的伴随Tau蛋白病病变的神经细胞可以为从多能干细胞(iPS细胞)分化诱导而来的神经细胞，其中，从多能干细胞由从Tau蛋白病患者采集的体细胞所建立。iPS细胞可以使用从Tau蛋白病患者中采集的体细胞通过自身公知的方法适当制作。作为将iPS细胞分化诱导为神经细胞的方法，可以适当选用各种公知的分化诱导方法，可列举例如如下方法：在细胞中强制表达Ngn2(例如，人Ngn2蛋白质：NP_076924、小鼠Ngn2蛋白质：NP_033848)，以使其向大脑皮质神经细胞分化。作为Tau蛋白病患者，没有特别限定，如上所述优选阿尔茨海默氏病或FTLD-tau患者，并且，特别优选MAPT基因上具有突变的FTLD-Tau患者(例如，FTDP-17患者)。
下面，将列举实施例对本发明进行更具体说明，但这些仅为例示，不对本发明有任何限制。
实施例
实施例1：在Tau蛋白病细胞模型中的效果
[材料及方法]
伦理学声明
人iPS细胞的使用已经获得京都大学医学部·医学研究科伦理委员会批准。全部方法按照批准的指南实施。并从所有供试者处获得正式的知情同意。
通过Ngn2的表达诱导来制作来自iPS细胞的大脑皮质神经细胞
使用通过非专利文献1中所述的方法建立的两种iPS细胞株(FTLD-Tau1及FTLD-Tau2)进行下面的实验。FTLD-Tau1是向由MAPT上具有内含子突变(内含子10+14C→T)的FTLD-Tau患者的细胞所建立的iPS细胞株中导入在四环素诱导型启动子控制下的Ngn2基因而成的稳定iPS细胞系(stable iPScell line)。FTLD-Tau2是向由MAPT上具有外显子突变(R406W)的FTLD-Tau患者的细胞所建立的iPS细胞株中导入上述Ngn2基因而成的稳定iPS细胞系。使用纤维蛋白溶酶(Actase)将这些iPS细胞株解离为单一细胞，使用包含1：1比的DMEM/F12(Life Technologies)和Neurobasal(Life Technologies)、1％N2补充剂、2％B27补充剂、10ng/ml来自脑的神经营养因子(BDNF、R&D Systems)、10ng/ml来自神经胶质细胞的神经营养因子(GDNF、R&D Systems)及10ng/ml神经营养素-3(NT-3；R&D Systems)的神经培养基，与1μg/ml多西环素(Clontech)一起，将单一细胞接种在被基质胶包被的塑料板或盖玻片上。在该方法中，通常，用包含多西环素的培养基开始培养7天后，90％以上的细胞分化为大脑皮质神经细胞。另外，通过该方法得到的大脑皮质神经细胞大部分为谷氨酸能细胞(专利文献1)。在本申请实施例中，有时将通过上述方法由FTLD-Tau1或FTLD-Tau2分化诱导而来的大脑皮质神经细胞称为Tau蛋白病神经细胞。
需要指出，在本申请实施例中，有时将通过包含多西环素的培养基开始培养当天(＝开始分化诱导当天)作为Day0，将该开始当天以后的天数用“Day”+“数字”来表示。
免疫细胞化学
将细胞在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS清洗，并在包含0.2％TritonX-100的PBS中在室温下浸透10分钟。接下来，用Block Ace(Yukijirushi)封闭30分钟。与一抗在4℃下孵育一晚后，将细胞用PBS清洗3次，与合适的二抗一同在室温下孵育1小时。从Delta Vision(Applied Precision)或IN Cell Analyzer 6000(GE Healthcare)获得细胞图像。用IN Cell Analyzer 6000及IN CELL Developer toolbox software 1.9(GEHealthcare)将细胞数定量化。在该测定中，将使用一抗：βIII微管蛋白(1:2,000,Covance)、NeuN(1:500,Millipore)。染色的结果示于图1。如图1所示，神经细胞的细胞体及神经突起变为βIII微管蛋白阳性(图像上为绿色)，上述细胞体内的细胞核变为NeuN阳性(图像上，因与细胞体颜色(绿色)重叠而变为黄色～橙色)。由此，在本申请实施例中，测量βIII微管蛋白阳性的存活细胞体数、或βIII微管蛋白·NeuN双阳性的点数，将其作为存活神经细胞数(微管蛋白阳性的神经细胞体数)。
蛋白质印迹分析
回收细胞，将其溶解于包含0.1％SDS、150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸、50mM Tris-HCl(pH8.0)、蛋白酶抑制剂(Roche)、及磷酸酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液。超声波处理后，将试样按照13,000×g在4℃下离心分离15分钟，回收上清液。使用二辛可宁酸(BCA)测定试剂盒(Pierce)测定上清液中的蛋白质浓度，在非还原条件下进行SDS-PAGE(每泳道20μg)，使用特异性识别错误折叠Tau蛋白的TOC1抗体进行蛋白质印迹。使用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)分析信号强度。本文中使用的Tau蛋白抗体使用表3。
[表1]
抗体 标靶 宿主种类 供应源
Tau12 人Tau蛋白 Ms(IgG) Millipore
TOC1 Tau蛋白低聚物 Ms(IgM) Kanaan/Binder Lab
斑点印迹分析
＜培养基上清液的制备＞
从细胞培养系统回收培养基，进行低速离心(1,000rpm，3分钟)使细胞碎片沉淀，回收所得到的上清液，将其作为培养上清液。将各培养上清液中的500μl转移至带有超滤过滤器的试管(Vivaspin，截留分子量：10kD，GE Healthcare公司)，浓缩至50μl。将各浓缩样品2μl转印至硝基纤维素膜上。
＜细胞提取液的制备＞
从上述细胞培养系统中回收细胞，并将其悬浮在含有蛋白酶(protease)抑制剂和磷酸酶(phosphatase)抑制剂的TBS(Tris缓冲生理盐水，Tris buffered saline)中，然后进行超声波处理将细胞破碎。对该细胞破碎液进行离心(13,000xg，15分钟)，回收上清液，将其作为细胞提取液。将各细胞提取液以1.2μg protein/spot的方式转印在硝基纤维素膜(孔径0.45μm，GE Healthcare公司)上。
针对通过上述方法得到的硝基纤维素膜，按照规定方法进行各种Tau蛋白抗体处理、检测(Western Lightning Plus-ECL，PerkinElmer公司)、及信号定量(ImageQuantLAS4000，GE Healthcare公司)。作为人类的Tau蛋白特异性抗体，使用Tau12，作为Tau低聚物特异性抗体，使用TOC1抗体。在本申请实施例中，使用Department of TranslationalScience and Molecular Medicine,College of Human Medicine,Michigan StateUniversity(USA)的Nicholas Kanaan博士提供的TOC1抗体(非专利文献1)。
细胞存活测定
向Day8的FTLD-Tau1或FTLD-Tau2的培养基中添加供试化合物，在Day21将细胞固定并进行βIII微管蛋白的免疫染色(Day0接种时的细胞密度为5×104细胞/孔)。作为对照，固定未添加供试化合物的Day8的细胞，冷冻保存后，与上述Day21的细胞同时进行免疫染色。用IN Cell Analyzer6000(GE Healthcare)测量βIII微管蛋白阳性细胞数(＝存活神经细胞数)，将通过下述式子算得的值作为细胞存活率。
需要指出，在使用普瑞巴林和米洛巴林进行测定时，向Day10的FTLD-Tau2的培养基中添加供试化合物，在Day21固定细胞进行上述分析。
Tau低聚物形成的分析
对通过上述细胞存活测定所得到的Day21的细胞进行前述的蛋白质印迹分析和斑点印迹分析，从而分析Tau低聚物量。
细胞存活率(％)＝(Day21的βIII微管蛋白阳性细胞数/Day8的βIII微管蛋白阳性细胞数)×100
统计分析
为了确定统计上显著差异，使用one-way ANOVA、及Tukey post hoc分析或学生t检验依次对结果进行分析。差异很显著，p<0.05。分析是使用SPSS software(IBM)来进行的。全部柱状图表示平均±SEM。
癫痫治疗药物
下面示出实施例中使用的6种癫痫治疗药物的作用效果。
[表2]
上述中，氯硝西泮(Clonazepam)是最为熟知的GABA能神经细胞的突触后膜的苯二氮卓受体的激动剂，通过上述方法得到的大脑皮质神经细胞大部分是谷氨酸能细胞(专利文献1)，因此，本文中，记载了作为线粒体Na/Ca交换转运蛋白的抑制剂的作用。另外，表中的文献如下。
文献1：加巴喷丁片医药品Interview form 2017年4月修订(第11版)
文献2：Topina片医药品Interview form 2017年4月修订
文献3：卡马西平片医药品Interview form 2018年6月修订(第5版)
文献4：Ekepla片医药品Interview form 2018年6月修订(第17版)
文献5：敌百痉片医药品Interview form 2019年7月修订
文献6：Elinor J.Griffiths et al.,Inhibition of mitochondrial calciumefflux by clonazepam in intact single rat cardiomyocytes and effects on NADHproduction.Cell Calcium,21(4):321-329,1997.
[结果]
针对约200种现有药物、及已知作为癫痫治疗药物的6种现有药物(加巴喷丁(Gabapentine)、托吡酯(Topiramate)、卡马西平(Carbamazepine)、左乙拉西坦(Levetiracetam)、丙戊酸(Valproic Acid)、及氯硝西泮(Clonazepam))，使用上述方法分析它们对于来自Tau蛋白病患者的大脑皮质神经细胞(Tau蛋白病神经细胞)的细胞死亡抑制效果。
结果，在约200种现有药物的分析中，未发现显示出非常显著的细胞死亡抑制效果的药物(未公开结果)。
并且，在6种癫痫治疗药物中，已知作为电压门控钙离子通道的L型(托吡酯)、N型(左乙拉西坦)、T型(丙戊酸)的抑制剂的现有药物，即使对其分析至50μM，也未发现显著的细胞死亡抑制效果(图2)。另外，利用抑制负责从线粒体释放钙的Na/Ca交换转运蛋白(mitochondrial Na/Ca exchanger)、还用于治疗躁郁症的氯硝西泮、及作为钠通道的抑制剂的卡马西平进行处理时，也没有发现细胞死亡抑制效果(图2)。
而令人意外的是，发现加巴喷丁(Gabapentine)具有非常显著的细胞死亡抑制效果。如图2所示，加巴喷丁在12-50μM这一广泛的范围内显著抑制Tau蛋白病神经细胞的自发性细胞死亡。
加巴喷丁是高亲和性地与电压门控钙离子通道的辅助亚基之一的α2δ亚基结合的配体。α2δ亚基不是离子通道的组成成分，其负责组成通道的α1亚基向质膜的转运等，有报道称，虽然通过结合加巴喷丁会抑制其的转运，但电压门控钙离子通道电流大部分不会被直接抑制(Hendrich J et al.,Pharmacological disruption of calcium channeltrafficking by the alpha2delta ligand gabapentin.Proc Natl AcadSci U S A.105:3628-33,2008.)。
由此，上述结果表明，令人意外的是，Tau蛋白病神经细胞的细胞死亡会被电压门控钙离子通道的辅助亚基α2δ的配体有效地抑制，而不是被能够直接抑制电压门控钙离子通道的现有药物抑制。
接着，探讨了上述加巴喷丁是否会在抑制细胞死亡的同时抑制Tau低聚物的形成。通过上述蛋白质印迹分析及斑点印迹分析进行验证。将结果示于图3。蛋白质印迹分析及斑点印迹分析均发现，在加巴喷丁存在下培养的细胞(经10μM加巴喷丁处理)中，与加巴喷丁非处理的细胞相比，Tau低聚物量显著减少。并且，斑点印迹分析显示，在经加巴喷丁处理的细胞中，培养上清液中的Tau低聚物量和细胞内的Tau低聚物量均显著减少。
因此表明，加巴喷丁会显著抑制Tau蛋白病神经细胞内产生的Tau蛋白的错误折叠和Tau低聚物形成。
接下来，对抑制作为α2δ抑制剂的其它化合物进行上述分析。加巴喷丁恩那卡比为加巴喷丁的前药，因此，对普瑞巴林和米洛巴林进行分析。将细胞存活测定的结果示于图4，蛋白质印迹分析及斑点印迹分析的结果分别示于图5。
普瑞巴林和米洛巴林在6-50μM的广泛范围内非常显著地抑制Tau蛋白病神经细胞的自发性细胞死亡(图4)。并且，在经这些药剂处理的细胞中，培养上清液中的Tau低聚物量和细胞内的Tau低聚物量均非常显著地减少(图5)。特别是，对细胞内Tau低聚物量的效果极其显著，表明通过用普瑞巴林或米洛巴林处理将细胞内累积的Tau低聚物量减少了约84～90％。
因此表明，不仅是加巴喷丁，普瑞巴林和米洛巴林也能够显著抑制Tau蛋白病神经细胞内中产生的Tau蛋白的错误折叠和Tau低聚物形成，从而能够有效抑制细胞死亡。
综上所述，与作为电压门控钙离子通道的辅助亚基的α2δ亚基结合的药剂抑制Tau蛋白的寡聚化，进而有效抑制大脑皮质神经细胞的细胞死亡，因此能够作为Tau蛋白病的预防或治疗剂。
实施例2：Tau蛋白病动物模型中的效果
接下来，对α2δ抑制剂的体内效果进行分析。具体而言，对Tau蛋白病小鼠模型口服投予加巴喷丁，并分析对脑内Tau蛋白凝集的抑制效果。
[材料及方法]
小鼠模型
作为Tau蛋白病小鼠模型，使用大脑皮质/海马体区过表达人P301L突变型Tau蛋白的rTg4510小鼠(Santacruz,K.,et al.,Science,309:476-481,2005)。在本小鼠中，大脑皮质/海马体区自2-3月龄起发现Tau蛋白病变(Tau蛋白的结构异常及聚集)，5-6月龄时表现出伴随神经脱落的进行性脑萎缩。
药剂给药
向约4月龄的rTg4510小鼠每周口服投予4次40mg/kg加巴喷丁，投予6周(给药浓度参见Reda,H.M.,et al.,Eur J Pharmacol,771:162-172,2016)。将100mg加巴喷丁溶解于超纯水2.5ml，即将给药前，用饮水稀释到10倍，按照体重(g)x 10μl的量口服摄取(加巴喷丁给药组；3只)。作为非给药对照，按照相同的时间表使相同日龄的rTg4510小鼠口服相同量的饮用水(对照；1只)。
需要指出，在该Tau蛋白病小鼠模型中，Tau蛋白病变会在2-3个月的短期内快速发展，因此为了实现分析结果的准确性，必须严格使用日龄一致的小鼠。另外，性别也统一为雄性。
通过正电子发射断层扫描(PET)评价Tau蛋白病变
将口服给药后的小鼠(约5.5月龄)在麻醉下由尾静脉注入放射性配体[18F]PM-PBB3，使用Focus 220PET scanner(Siemens)进行拍摄(Tagai et al.,2020,MedRxiv)。已知PM-PBB3与从Tau低聚物进一步延伸而成的Tau蛋白纤维到Tau蛋白纤维进一步凝集化而产生的神经原纤维变化的伴随着Tau蛋白病产生的各种Tau蛋白凝集体选择性结合。由此，通过向生物体内注入[18F]PM-PBB3，并使用PET检测该放射性(radioactivity)，能够高灵敏度地检测Tau蛋白结构凝集体的生成和累积。
通过核磁共振成像(MRI)测定脑体积
使用7T horizontal MRI scanner(Brucker)实施T2加权像(T2-weighted)MRI，根据拍摄图像确定感兴趣区ROIs(region of interests)，计算大脑皮质、海马体、小脑的体积。
[结果]
在加巴喷丁给药小鼠(3只)中，1只小鼠开始给药时的体重比其他2只的平均体重少约9％，之后体重也未恢复，因此从本分析中排除。由此，本分析中使用的全部小鼠的体重范围(开始给药时)非常小，-2.1％～+2.9％，因此成为更适合药效评价的分析系统。
针对加巴喷丁给药小鼠和非给药对照小鼠，经时测定从放射性配体静脉注射后至60分钟后之间的海马体、大脑皮质、小脑中的[18F]radioactivity，将结果(时间-放射性曲线)示于图7A。由此可知，所有小鼠的全部部位中，在静脉注射后立即检测到radioactivity，随后快速衰减，该时间曲线在给药-非给药小鼠间基本是相同的。需要指出，在本分析的给药-非给药小鼠之间，确认海马体、大脑皮质、小脑的体积没有显著差，但未示出结果。
将放射性配体静脉注射40～60分钟后包括大脑皮质和海马体的脑剖面的标准摄取值比率Standardized uptake value ratio(SUVR)图像示于图7B。上段仅为SUVR，下段为SUVR图像和核磁共振成像(MRI)图像的重叠图像，SUVR图像分别为以小脑为目标区域所计算的图像。可知在加巴喷丁给药小鼠中，与非给药小鼠相比，海马体和大脑皮质中的[18F]radioactivity较低(图像上较黑)。
图7B中得到的40～60分钟后的值的平均值的图表示于图7C。可知与非给药小鼠相比，加巴喷丁给药小鼠的海马体，大脑皮质中的[18F]radioactivity均较低。
以上结果显示，在加巴喷丁给药小鼠中，与非给药小鼠相比，大脑皮质和海马体中的Tau蛋白凝集体的集聚较少。由此表明，通过口服摄取加巴喷丁，能够有效抑制Tau蛋白病小鼠模型的脑内产生的Tau蛋白病变。
综上所述，与作为电压门控钙离子通道的辅助亚基的α2δ亚基结合的药剂能够有效抑制生物体脑中产生的Tau蛋白病变，可以用作Tau蛋白病的预防或治疗药物。
工业上可利用性
电压门控钙离子通道的α2δ抑制剂可以用于预防和/或治疗Tau蛋白病，将针对α2δ的结合性作为指标的筛选方法可以用于筛选Tau蛋白病的预防和/或治疗剂。
本申请以在日本申请的日本特愿2019-194758(申请日：2019年10月25日)为基础，其全部内容通过引用包含在本说明书中。

Claims (3)

1. 普瑞巴林、米洛巴林或其盐在制造Tau 蛋白病的预防或治疗剂中的应用，其中，所述Tau蛋白病为表现为Tau蛋白病的额颞叶退化症（FTLD-Tau）。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药剂为Tau蛋白的错误折叠的抑制剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，Tau蛋白病由MAPT基因突变引起。
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