CN114591865A

CN114591865A - 一株解钾抗病的暹罗芽孢杆菌ky758及其应用

Info

Publication number: CN114591865A
Application number: CN202210301090.2A
Authority: CN
Inventors: 丁珊珊; 李俊; 唐珏晖; 朱俊睿; 康耀卫
Original assignee: Jiangxi Yidi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangxi Yidi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-24
Filing date: 2022-03-24
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2042-03-24
Also published as: CN114591865B

Abstract

本发明提供了一株解钾抗病的暹罗芽孢杆菌KY758及其应用，涉及微生物及其应用技术领域。本发明的暹罗芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24363。本发明筛选出一株既能够解钾又具有广谱抗病功能的暹罗芽孢杆菌菌株KY758；此外，该菌株同时可活化磷，具有良好的耐盐、耐酸碱性能，且具有植物根际促生作用。本发明的菌株KY758综合性能优异，是一株多功能菌株，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

一株解钾抗病的暹罗芽孢杆菌KY758及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及其技术领域，尤其是涉及一株解钾抗病的暹罗芽孢杆菌(Bacillu siamensis)KY758及其应用。

背景技术

土壤中化肥农药长期过量地使用，土壤的微粒结构受到严重破坏。随着时间的累积，土壤盐溃化现象加重，土壤营养比例发生失衡，土壤自我修复能力越来越低，病原菌的抗药性随之増强，土传病害病原物的优势进一步加大，加剧了土传病害的发生(罗晨，2021)。

土传病害一般是指生活于土壤中的植物病原性真菌、细菌、病毒和线虫侵染植物根茎部而发生的病害。真菌是土传病害的主要致病菌。常见的有镰刀属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizotonia)、疫霉(Phytophthora)、柱孢属(Cylindrocarpon)、腐霉属(Pythium)等(Mazzola，M.1998)。生理性土传病害主要是因土壤营养元素的缺乏或失衡、理化性质的改变以及植物根部分泌的自毒物质的积累等所致。土壤中营养物质的不平衡利用也是导致生理性土传病害的重要原因之一。最常见的是由于土壤氮、磷、钾等营养元素的不均衡消耗，导致植物发病。

针对土传病害问题，目前国内外主要采取农业防治和化学防治。其中农业防治主要包括抗病品种的使用、轮作倒茬和增施有机肥等，其优点是环保安全，对生理性和病理性重茬病害均有一定的防治，但其缺点也非常明显，抗病品种防效较低、轮作倒茬在中国特有的农业环境和耕种模式下难以得到全面应用，有机肥能改良土壤理化性状，提高土壤肥力，防治土壤污染，但是它的养分含量低、肥效迟缓，也存在供应不平衡问题。化学防治是针对病理及生理重茬病害施用化学农药等方式达到防治效果，但化学农药的高毒、高残留不仅对人、畜的健康造成危害，而且对土壤、水体、大气造成严重污染；同时由于病菌和害虫抗药性的不断增强，农药的使用量和使用频度不断加大，造成土壤肥力严重下降，土壤微生物区系紊乱，伤害非靶标生物，破坏生态平衡。另外，通过增施化肥提高土壤中营养物质也不可行，长期施氮肥或氮磷钾化肥能显著增加土壤中硝态氮和铵态氮含量，但对土壤有机氮含量的影响较小。长期施用磷肥，会导致土壤变酸，在中性或酸性土壤上连续施用氮肥将加速土壤磷素的耗竭。而施用无机肥，尤其是氮、磷肥，又会让土壤速效钾含量显著下降(WU L K等，2018)。因此增施化肥不但没有提高土壤中营养物质，还破坏了土壤(万连杰等，2021)。这一系列问题促使人们探寻一种对人类和环境友好并具良好防治效果的防治土传病害方法。生物防治因其对环境友好、有效、持久和无药物残留等特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题已成为目前最具前景的防治方法。

生物防治是指利用一种或多种微生物来抑制病原菌生命活力和繁殖能力的方法，拮抗菌通过分泌抗菌物质或种群竞争改变土壤微生物的种群结构和数量，降低病理性土传病害的发生，又能将土壤中被固定的矿物质养分释放出来，并加快有机物在土壤中的转化速度，从而达到优化土壤结构和理化性质效果并减轻生理性重茬病害的危害。因此，生物防治在控制植物土传病害具有重大的潜力。目前报道的生物防治主要有：芽孢杆菌属(Bacillus)、固氮菌属(Azotobacter)、小盾壳霉属(Conithyrium)、根瘤菌属(Rhizobium)、木霉属(Trichoderma)等(WU L K等，2018；何迎春等，2000以及李长松，1992)。

在用于生物防治的微生物中，针对解磷固氮功能的研究居多，而解钾功能的研究鲜见报道(Sumpavapol P等，2010和张爱民等，2015)。解钾微生物是能够在土壤中或者在纯培养条件下，将含钾矿物如钾长石、云母等不能被作物吸收利用的矿物态钾分解产生水溶性钾的微生物。目前被广泛应用于肥料市场的硅酸盐细菌(具有分解硅酸盐或铝硅酸盐岩石矿物能力)也有相关文献报道其应用效果不佳，甚至还有报道指出其不具备分解钾长石的能力(高俊程，2019)。另外，这类菌株在生防方面的报道鲜少。

因此，开发一株可活化钾、磷元素兼具广谱杀植物病原菌活性的功能微生物菌株对土壤修复、防治植物土传病害以及保证粮食安全等都具重大意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一株解钾抗病的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758及其应用。本发明筛选出一种可提高土壤中磷、钾等营养元素利用率同时具有广谱杀植物病原菌活性的微生物菌株，对土壤改良及修复以及促进植物生长有重要意义。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一株解钾抗病的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758，所述暹罗芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24363。

本发明通过富集法对259个土样近20万株菌株进行筛选，得到210株具有解钾功能菌株，在此基础上，再做进一步筛选出同时具备抗棉花枯萎、水稻纹枯拮抗菌株，最后对筛选获得的功能菌株再进行广谱杀病原菌功能测试，最终得到一株既解钾、活化磷同时又具有广谱抗病功能的菌株KY758。此外，本发明的菌株有较好植物根际促生作用。鉴定结果表明该菌株属于暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)KY758。上述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758是从河北省邯郸市采集的土壤中富集培养分离得到的。

本发明筛选出的所述暹罗芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。菌株KY758在R2A培养基上培养生长2天，菌落形态菌落呈菌落呈奶白色，圆形，微凸，湿润光滑，边缘整齐。经显微镜测定其菌体直径约2.26～2.61μm，其孢子直径约0.57～1.05μm。

在另一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含前述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758或者所述暹罗芽孢杆菌的培养物。所述培养物的制备方法包括将活化后的所述暹罗芽孢杆菌接种到培养基中培养得到。

本发明的微生物菌剂是前述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758作为活性成分，还可包含其他菌剂或辅料，例如可将本发明所述暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)KY758作为活性成分与其他微生物菌剂组成组合物等产品。所述生物制剂的制备方法可采用本领域常规的生物制剂的制备方法，本发明不另做限定。

所述微生物菌剂包括液体微生物菌剂和固体微生物菌剂。例如制备方法包括如下步骤：将所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)活化后培养得到液体微生物菌剂，将所述液体微生物菌剂干燥后获得固体微生物菌剂。干燥可采用喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥等本领域常规方法。

根据本发明菌株的功能和作用，含有本发明所述暹罗芽孢杆菌的微生物菌剂可以为包括但不限于：解钾剂、解磷剂、生防菌剂、土壤调理剂、土壤改良剂、植物促生剂、种子包衣剂、微生物肥料等。

在另一个方面，本发明提供了前述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758或前述微生物菌剂在如下任一种或多种中的应用：

(a)解钾或制备具有解钾功能的生物产品；

(b)抗植物病害或制备植物病害的病原菌的拮抗剂；

(c)促进植物生长或制备植物生长促进剂；

(d)除磷、通过活化土壤中的磷提高植物对磷肥的利用率或制备降解磷的产品；

(e)修复或改良土质。

本发明的菌株KY758解钾功能突出，不仅可以在含有钾长石的解钾固体培养基上生长并产生较大的透明水解圈，而且其降解钾能力明显强于对照商业解钾细菌3016、枯草芽孢杆菌92068及解淀粉芽孢杆菌DSM7。因此，本发明菌株或含有其的微生物菌剂可用于解钾或制备具有解钾功能的生物产品，例如溶解钾长石或含有其的物质。

在一个实施方案中，所述植物病害包括小麦根腐病、小麦纹枯病、棉花枯萎、西瓜枯萎、香蕉枯萎、水稻纹枯、灰霉、番茄早疫、梨黑斑和苹果落叶斑点病中的一种或多种。

在210株既安全又具有强解钾功能的微生物菌株中，本发明的菌株KY758同时具有拮抗棉花枯萎及水稻纹枯的功能，并且对其他广谱植物病原菌也产生拮抗作用。本发明菌株具有广谱抗菌活性。本发明的菌株可以作为拮抗菌在防治作物病害中发挥作用。

在一个实施方案中，本发明提供了前述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758或前述的微生物菌剂在促进植物生长中的应用，所述促进植物生长包括促进植物种子的萌发和/或幼苗的生长。在一个具体实施方案中，所述植物为玉米。

在一个实施方案中，本发明提供了前述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758或前述的微生物菌剂在改良或修复盐碱地中的应用。

本发明的菌株具有良好的耐盐以及耐酸碱特征(尤其是耐碱性能突出)。因此，本发明的菌株可用于改良盐碱地或进行土壤修复。例如所述应用至少包括如下步骤：将所述菌株的固体菌剂直接或用水悬浮成菌液后施至土壤中。例如当盐碱地的pH较高(pH为7-12)时，可使用本发明菌剂进行土壤调理与修复。或者，采用本发明的菌株或菌剂促进植物在盐碱胁迫条件下进行生长。

在一个实施方案中，本发明提供了前述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)或所述的微生物菌剂在溶磷/除磷中的应用，所述除磷包括降解无机磷酸盐。

本发明提供了前述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)或所述的微生物菌剂在解钾、抗植物病害、促进植物生长、改良盐碱地和溶磷方面的综合应用。

在另一个方面，本发明还提供了提高土壤钾磷利用率并防治植物土传病害的方法，所述方法包括采用前述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758或前述的微生物菌剂处理植物的种子或幼苗。

保藏信息：暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758，该菌株已于2022年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCCNo.24363；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。经保藏中心于2022年1月21日检测为存活菌株。

有益效果：

现有技术中公开的暹罗芽孢杆菌中，同时具有分解钾、活化磷，广谱抗植物病原菌以及促进植物耐盐碱环境生长等功能的暹罗芽孢杆菌还鲜有报道，本发明菌株具有较为全面功能，对于提高农作物抗逆性生长、改善盐碱土壤具有重要的意义。

本发明菌株既解钾(解K)活化磷同时兼具非常广谱杀植物病原微生物的功能，对于多种病原真菌生物活性等拮抗功能为首次报道。

本发明的菌株也具有良好的耐酸碱以及耐盐特性，也可以用于调节或改善土壤盐碱性，或解除/缓解盐以及高酸碱对作物生长抑制，对于植物栽培具有应用价值。

本发明的菌株具有多个应用场景，可增加土壤微生物的多样性，提高土壤中钾元素和磷元素的利用率，干扰土壤中植物病原菌的生长，降低土传病害的发生频率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的富集筛选得到的具有解钾活性的菌株的代表性示意图(图中红框所示为解钾菌株)；

图2为本发明实施例提供的重复验证菌株解钾的能力的示意图；

图3为本发明实施例提供的各病原微生物拮抗活性(其中菌株A：KY758；菌株B；菌株C；菌株D)；

图4为本发明实施例提供的菌株KY758在显微镜下的形态(10×100)；

图5为本发明实施例提供的KY758及各对照菌株解钾的能力测试结果；

图6为本发明实施例提供的各病原微生物拮抗活性对比(菌株A：KY758；菌株B：3016；菌株C：DSM7；菌株D：92068)；

图7为本发明实施例提供的KY758及各对照菌株解磷能力测试结果；

图8为本发明实施例提供的不同处理对玉米种子的促生结果；

图9为本发明实施例提供的KY758及各对照菌株对酸碱耐受性的测试结果；

图10为本发明实施例提供的KY758及各对照菌株对盐(KNO₃)耐受性的测试结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.筛选同时具有解钾功能及杀病原菌能力的功能菌株

1.1土样的采集

选择具有代表性的土壤，比如沙土、粘土、黑土等。样品可以来源于矿区、农田、牧草地、森林土等不同的区域，每个点采集15～20g样品，同时标明来源地(省，县)、采集年和月、土壤的来源(植物、沙土或其他)，放于80％甘油管中保藏在-80℃冰箱。

1.2筛选具有解钾功能微生物菌株

第一步富集：取1g土样于10mL纯净水中摇匀，取其中100μL混合液于矿物质钾液体培养基中(酵母粉0.5g、葡萄糖10g、磷酸氢二钠2g、硫酸氨1g、七水硫酸镁0.5g、碳酸钙1g、钾长石1g、水1L)，在30℃下200r/min震荡培养3天，取菌液稀释10^-6、10^-7、和10^-8倍后涂布于含钾固体培养基上(酵母粉0.5g、葡萄糖10g、磷酸氢二钠2g、硫酸氨1g、七水硫酸镁0.5g、碳酸钙1g、琼脂粉15g、钾长石1g、水1L)，挑取具有功能的菌株。

第二步富集：取上一步富集的菌液100μL于钾液培养基(酵母粉0.5g、葡萄糖10g、磷酸氢二钠2g、硫酸氨1g、七水硫酸镁0.5g、碳酸钙1g、钾长石1g、水1L)，在30℃下，200r/min震荡培养3天，取菌液稀释10^-6、10^-7、和10^-8倍后涂皿，挑取具有解钾水解圈的功能菌株。

第三步富集：取第二部富集的菌液100μL于解钾液体培养基，30℃，200r/min震荡培养3天，取菌液稀释10^-6、10^-7、和10^-8倍后涂皿，挑取具有解钾水解圈的功能的菌株。

1.2.1重复验证

为了确保菌株解钾能力的持续性，将从富集平皿上挑取的菌株，接种于含有0.1％钾长石的解钾固体培养基，30℃培养，每天观察实验结果，验证所挑取的菌落是否具有功能，排除假阳性菌落。

1.2.2菌种鉴定

①CTAB法提取细菌DNA：

接种一单菌落于5mL R2A中，30℃培养过夜；1.5mL的细菌培养液采用15000r/min离心2分钟，弃去上清。加入1mL的TE离心洗涤后，用1mL的TE溶解菌体，混匀。加入68μL 10％SDS，混匀，加入17μL 10mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时，加入210μL 5mol/L NaCl，再加入146μL CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，15000r/min离心5分钟，保留上清；上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀，15000r/min离心5分钟，保留上清；加入0.6倍的异丙醇，混匀，15000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀；用200μL TE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mL RNaseA，4℃保存。

②16sDNA扩增与测序:

采用16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，即SEQ ID No.2)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3',即SEQ ID No.3)进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。

将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序(北京美亿美生物技术有限公司)，根据获得的16S rDNA序列在与Chun’s实验室原核微生物16sDNA数据库进行比对，同时也参考GenBank中Blast搜索同源序列比对结果，来确定实验菌株的菌种名称。

1.2.3结果

通过上述方法对从全国不同省、市、区、县采集的具有地点特征等代表性的土壤如矿区土、草甸土、山林地土、田地土、泥流沙土等标的259个土样进行富集法筛选具有解钾功能的微生物菌种，经过多次的分离、筛选、纯化以及16SrDNA序列分析，结果获得了210株既安全又具有强解钾功能的微生物菌株。图1和图2为富集筛选得到具有解钾活性的菌株的代表性示意图以及重复验证菌株解钾的能力的示意图。

1.3解钾功能菌株进行杀菌活性能力筛选

对于上述获得的210株解钾功能菌株，进一步进行杀菌活性能力筛选。

1.3.1针对棉花枯萎、水稻纹枯为病原真菌进行拮抗菌株的筛选

(a)制备菌悬液：

棉花枯萎菌悬液的制备：刮取棉花枯萎病病原菌菌丝及孢子置于装有5mL灭菌水的离心管内，摇匀备用。

水稻纹枯菌悬液的制备：刮取水稻纹枯病原菌菌丝及其菌核(菌核需研磨成小碎粒)置于装有5mL灭菌水离心管内，摇匀备用。

(b)涂板：

分别在PDA平板中加入100μL上述菌悬液，涂布均匀，备用。

(c)拮抗实验：

把上述210株解钾菌株分别接种到已涂布棉花枯萎病病原、水稻纹枯病原菌的PDA平板，同一解钾菌株分别接种于此两种病原真菌PDA平板的同一位置。28℃培养3d～5d，观察是否产生抑菌圈。记录对此两种病原真菌有拮抗作用的菌株，每个处理30个解钾菌株做3个重复，排除假阳性。

结果获得了4株具有解钾功能并同时拮抗棉花枯萎及水稻纹枯的菌株(菌株B、菌株C、菌株D、菌株A(KY758)。

1.3.2通过平板对峙法筛选具有广谱抗病功能的菌株

对上述实验得到的4株拮抗菌株B、C、D、A(KY758)通过平板对峙法筛选具有广谱抗病功能的菌株(A、B、C、D菌株经鉴定属于不同的菌种)。

在培养基平板的中心位置接上病原真菌(小麦根腐病Bipolaris sorokiniana、小麦纹枯病Rizoctonia cerealis、棉花枯萎Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum、西瓜枯萎Fusarium oxysporum f.sp.Hiveum(E.F.Smith)Wollen、香蕉枯萎Fusariumoxysporum f.sp.、水稻纹枯Rhizoctonia solani、灰霉Botrytis cinerea、番茄早疫Altemaria solani、梨黑斑Alternaria alternate、苹果落叶斑点病Alternariabrassicae)的菌饼(直径d＝5mm)，在以病原真菌为中心的“十”字的4个点上接上上述4个细菌(距中心位置25mm)，每个处理做3个重复，28℃下恒温培养3d～5d，观察其是否对以上植物病原菌产生拮抗作用。

1.3.3结果

通过上述测试，从中图3以及表1结果可知，KY758具有强解钾能力及广谱抗病能力，该菌株为进一步研究对象，后续将对其展开研究。

表1.各病原微生物拮抗活性

实施例2.菌株KY758的鉴定结果

2.1菌株KY758的16sDNA序列：

经过对KY758菌株16sDNA序列(1407bp)的测定，获得了1446bp的部分序列，结果如下(SEQ ID No.1)：

AGCCATTGCGGCGCTATACTGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCGAACGTACAT。

2.2鉴定结果

通过对该序列的分析表明，该菌株与暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)具有99.97％以上的高度同源。

实施例3.菌株形态观察

将筛选的菌株KY758接种到R2A平板上，30℃培养2d，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、隆起形状、透明度、边缘特征及有无芽孢等。

菌株形态观察结果：

经观察菌株KY758(Bacillu siamensis，芽孢杆菌属)在R2A培养基上培养生长2d，菌落形态菌落呈菌落呈奶白色，圆形，微凸，湿润光滑，边缘整齐。经显微镜测定其菌体直径约2.26～2.61μm，其孢子直径约0.57～1.05μm(如图4)。

实施例4.菌株KY758解钾能力对比的测定

将在R2A培养基上培养生长2d的菌株KY758，接种于解钾培养基中。同时设置商业解钾细菌3016(硅酸盐细菌)及枯草芽孢杆菌92068、解淀粉芽孢杆菌DSM7为对照，这三株对照菌株都是来源于中国农科院。其中，3016菌株在商业应用中，用于其解钾功能和促进植物生长功能；92068是枯草芽孢杆菌，市面上常用于促进植物生长、防病、解钾和解磷功能；DSM7是解淀粉芽孢杆菌，市面上用于防病。室温下培养2d，用水冲洗掉菌落后测定解钾圈的直径，单位mm。

解钾能力＝解钾圈直径的毫米数+X。

(注：X为加权系数，根据菌株水解圈的透明程度，相应的为：-1、0、1、2。数字2代表水解圈全完全透明；数字1代表溶解圈半透明；0代表溶解圈不透明，但在培养基表面具有水解痕迹，基本人眼观察不到溶解圈，但把菌落用水冲洗以后，在接种细菌处有微弱的水解的痕迹，-1代表无任何水解活性。)

4.1菌株KY758解钾能力的测定结果

表2和图5结果表明，菌株KY758降解钾能力明显强于对照商业解钾细菌3016、枯草芽孢杆菌92068、及解淀粉芽孢杆菌DSM7。

表2.不同菌株降解钾能力的测试结果

实施例5.KY758对植物真菌杀菌活性与商业解钾细菌及商业生防细菌对比

将KY758与植物病原菌棉花枯萎病、水稻纹枯、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2、香蕉枯萎病专化型3、西瓜枯萎病、梨黑斑病、小麦纹枯病、小麦根腐病、番茄早疫病、苹果斑点落叶病、同时接种于PDA培养基上，观察菌株对植物病原菌产生拮抗的强弱。同时设置92068、DSM7和3016为对照。其中，3016是商业上用于解钾的微生物菌株；92068是枯草芽孢杆菌，市面上常用于促进植物生长、防病、解钾和解磷；DSM7是解淀粉芽孢杆菌，市面上用于防病。

实验结果：

由表3及图6可见，KY758杀菌活性强，杀菌谱非常广，比目前广泛应用于市场的生防菌株：枯草芽孢杆菌92068及解淀粉芽孢杆菌DSM7强，且杀菌谱更广。商业解钾细菌3016的生防能力较差，基本上不具备杀菌的能力。

表3.各病原微生物拮抗活性对比

实施例6.KY758解磷能力测试

化肥过量使用已经导致土壤营养失调，磷元素流失，解磷(活化磷)功能对本研究具有重要意义。因此，对KY758进行解磷能力测试。

6.1菌株活化

从-80冰箱中取出适量KY758、92068、DSM7，分别接种在固体R2A培养基上，室温下培养24小时。其中，KY758为试验菌株，枯草芽孢杆菌92068和解淀粉芽孢杆菌DSM7为对照菌株。(固体R2A培养基配制方法如下：0.25g蛋白胨、0.25g酵母、0.25g胰蛋白胨、0.25g葡萄糖、0.25g可溶性淀粉、0.15g丙酮酸钠、0.15g磷酸二氢钾、0.025g硫酸镁、500mL H₂O、7.5g琼脂，121.0℃高压灭菌30min。)

6.2无机磷固体培养基配制

配制方法：0.5g酵母、10g葡萄糖、0.5g(NH₄)₂SO₄、0.02gKCl、0.1gMgSO₄·7H₂O、1mL0.2％FeSO₄、1mL MnSO₄·H₂O、15g琼脂、5g Ca₃(PO₄)₂，121.0℃高压灭菌30min。)

接种：采用“三线法”将步骤“6.1”中微生物菌株接种于步骤“6.2”所述无机磷固体培养基中，30℃培养6天，取出观察。

结果：KY758、92068、DSM7除磷能力如图7所示。其中，微生物周边若出现透明圈，则表示该微生物具有除去无机磷的能力；除去无机磷的能力与透明圈大小相关，透明圈越大表明该菌株除磷能力越强。由图7可得到，菌株KY758、92068、DSM7周边均出现透明圈。因此，菌株KY758、92068、DSM7具有水解无机磷的能力。

实施例7.KY758对植物根际促生作用(PGPR)实验

7.1菌悬液的制备

将KY758和枯草芽孢杆菌92068接种到含50mL R2A液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下，200r/min培养48小时后分别配制成OD_600nm＝0.1的菌液备用。

7.2种子包衣

玉米种子的包衣，每100g种子喷洒300μL菌液，挑选颗粒饱满、大小均匀、未破碎经包衣处理的种子，接种到琼脂浓度为0.5％培养基中(琼脂5g，水1000L)进行发芽试验，每皿10粒，每个处理重复4次，避光培养。

设置枯草芽孢杆菌92068菌株包衣的种子为阳性对照，设置用R2A营养液包衣的种子为空白对照。从第2天起观察种子的根生长情况，计算种子的发芽指数。

玉米种子发芽指数G＝N*(0+X)+N*(1+X)+N*(2+X)+N*(3+X)+N*(4+X)(N表示该级别的个数，X表示该级别种子的侧芽及侧根总数)；

0代表未发芽；1代表芽长为0～0.5cm；2代表芽长为0.5～1.0cm；3代表芽长为1.0～1.5cm；4代表芽长为大于3cm。

7.3种子萌发实验结果

表4以及图8结果表明，KY758对玉米种子有促进萌发的作用，发芽指数明显高于对照枯草芽孢杆菌菌株92068。通过SPSS分析在P<0.05水平上达到显著差异性。

表4.不同处理对玉米种子发芽指数的影响

实验处理	玉米种子发芽指数
		R2A	77.33c
92068	90b
		KY758	118a

实施例8.对酸、碱、盐(KNO₃)的耐受性测试

8.1对酸、碱的耐受性测试

8.1.1菌株活化

从-80冰箱中取出适量KY758、92068、KY552，分别接种在固体R2A培养基上，室温下培养24小时。其中，KY758为试验菌株，92068和KY552(92068是枯草芽孢杆菌，市面上常用于促进植物生长、防病、解钾和解磷；KY552拉丁文为Paenibacillus polymyxa，文献报道其对酸碱盐敏感性较高)为对照菌株。固体R2A培养基配制方法如下：0.25g蛋白胨、0.25g酵母、0.25g胰蛋白胨、0.25g葡萄糖、0.25g可溶性淀粉、0.15g丙酮酸钠、0.15g磷酸二氢钾、0.025g硫酸镁、500mL H₂O、7.5g琼脂，121.0℃高压灭菌30min。

8.1.2培养基配制

配置固体R2A培养基，调节pH值为5、7、8、10、12，121.0℃高压灭菌30min。

8.1.3接种

采用“三线法”将步骤“8.1.1”中微生物菌株接种于步骤“8.1.2”所述无机磷固体培养基中，30℃培养2天，取出观察。

8.1.4结果

KY758、92068、KY552对酸碱的耐受性测试结果如图9所示。由图9可知，在pH5～pH12的条件下，KY758能够正常生长，且长出单菌落；在pH5～pH12的条件下，92068能够生长出单菌落，但在pH12时，92068生长受到抑制，长出单菌落有困难；在pH7～pH12的条件下，KY552能够生长，且长出单菌落，但在pH12时，KY552生长受到抑制，不能长出单菌落。结果证明，KY758对酸碱的耐受性不亚于92068，优于KY552。

8.2对盐(KNO₃)的耐受性测试

8.2.1菌株活化

从-80冰箱中取出适量KY758、92068、KY552，分别接种在固体R2A培养基上，室温下培养24小时。其中，KY758为试验菌株，92068和KY552(拉丁文为Paenibacillus polymyxa)为对照菌株。固体R2A培养基配制方法如下：0.25g蛋白胨、0.25g酵母、0.25g胰蛋白胨、0.25g葡萄糖、0.25g可溶性淀粉、0.15g丙酮酸钠、0.15g磷酸二氢钾、0.025g硫酸镁、500mLH₂O、7.5g琼脂，121.0℃高压灭菌30min。

8.2.2含硝酸钾(KNO₃)固体R2A培养基配置

往固体R2A中分别加入0％硝酸钾(KNO₃)、1％硝酸钾(KNO₃)、2％硝酸钾(KNO₃)、5％硝酸钾(KNO₃)，然后121.0℃高压灭菌30min得到含硝酸钾(KNO₃)固体R2A培养基。

8.2.3接种

采用“三线法”将“8.2.1”中微生物接种于“8.2.2”所述无机磷固体培养基中，30℃培养2天，取出观察。

8.2.4结果

KY758、92068、KY552对盐(KNO₃)的耐受性测试结果如图10所示。由图10可知，在浓度范围为0％～2％的KNO₃存在下，KY758、92068、KY552均能生长；当2％的KNO₃存在时，KY552生长受限，菌落明显变小，长出单菌落有困难。结果证明，KY758对盐(KNO3)的耐受性不亚于92068，优于KY552。

结论：本研究表明菌株KY758具有解钾、除磷、兼具广谱杀植物病原菌活性和促进植物生长的功能。它可以增加土壤微生物的多样性，提高土壤中钾元素和磷元素的利用率，干扰土壤中植物病原菌的生长，降低土传病害的发生频率，为植物生长营造有利的条件，减少农药化肥的使用，有效地解决土传病害问题。符合国家“双减”的大环境，进而为农业生产的优质、安全和低碳发展保驾护航。此外，KY758对酸、碱、盐具有的良好耐受性更是为其适用于多个应用场景提供了有利的保障。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江西益地生物科技有限公司

<120> 一株解钾抗病的暹罗芽孢杆菌KY758及其应用

<130> PA22003941

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> 菌株KY758的16sDNA序列

<400> 1

agccattgcg gcgctatact gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60

gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120

aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt 180

cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240

caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360

gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420

acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540

taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600

ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720

tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780

cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840

ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960

cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200

gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260

ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320

tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttaggagcca gccgccgaac 1440

gtacat 1446

Claims

1.一株解钾抗病的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.24363。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的活性成分包含权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)或者所述暹罗芽孢杆菌的培养物。

3.根据权利要求2所述微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括液体微生物菌剂和固体微生物菌剂。

4.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)或权利要求2或权利要求3所述的微生物菌剂在如下任一种或多种中的应用：

(a)解钾或制备具有解钾功能的生物产品；

(b)抗植物病害或制备植物病害的病原菌的拮抗剂；

(c)促进植物生长或制备植物生长促进剂；

(e)修复或改良土质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物病害包括小麦根腐病、小麦纹枯病、棉花枯萎、西瓜枯萎、香蕉枯萎、水稻纹枯、灰霉、番茄早疫、梨黑斑和苹果落叶斑点病中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述促进植物生长包括促进植物种子的萌发和/或幼苗的生长。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述除磷包括降解无机磷酸盐。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述修复或改良土质包括修复或改良盐碱地土质。

10.一种提高土壤钾磷利用率并防治植物土传病害的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)KY758或权利要求2或权利要求3所述的微生物菌剂处理植物的种子或幼苗。