CN114577934B - 促生长类抗菌药物的分离方法与检测方法及其用途 - Google Patents

促生长类抗菌药物的分离方法与检测方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物检测领域，具体涉及促生长类抗菌药物的分离方法与检测方法及其用途。分离方法采用超高效液相色谱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈‑甲酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，通过优化流动相种类、流动相pH、梯度洗脱程序及色谱柱，得到最佳色谱条件，通过上述方法得到的色谱图基线平稳，各主成分峰峰形好、各主成分峰与周围峰之间分离度高，且可实现2种以上促生长类抗菌药物的良好分离。

Description

促生长类抗菌药物的分离方法与检测方法及其用途
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体涉及促生长类抗菌药物的分离方法与检测方法及其用途。
背景技术
随着人们对细菌耐药认知的逐渐加深，同时为确保动物源性食品安全和公共卫生安全，并全面推进全国兽用抗菌药使用减量化行动，农业农村部相继发布了第194号公告和第246号公告，规定禁止使用仅具有促生长用途的抗菌药物饲料添加剂。
兽用促生长类抗菌药物主要包括土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽、黄霉素、杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽，这类药物的给药方式通常为混饲，常见制剂为预混剂。为确保全国兽用抗菌药使用减量化行动的落地落实，促生长类抗菌药物应作为兽药中非法添加物检查的重点筛查对象，兽用预混剂应作为重点筛查的目标制剂。
相关技术中，除了土霉素可采用农业农村部第361号公告的方法进行非法添加检测外，其余上述促生长类抗菌药物均无对应的非法添加检测方法。另外，土霉素预混剂(2017年版《兽药质量标准》)、喹烯酮预混剂(2017年版《兽药质量标准》)有相应的HPLC含量测定方法，维吉尼亚霉素预混剂(农业部公告第2582号)、那西肽预混剂(农业部公告第2382号)、黄霉素预混剂(农业部公告第2503号)有相应的HPLC组分测定方法，但是上述方法均仅能实现单种促生长类抗菌药物主成分的分离。
在实现本发明的过程中，发明人发现，相关技术中不存在分离2种以上促生长类抗菌药物的方法，也不存在同时检测2种以上促生长类抗菌药物的方法，因此相关技术中针对上述促生长类抗菌药物的检测效率较低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有方法无法分离2种以上促生长类抗菌药物、无法检测2种以上促生长类抗菌药物的缺陷。
为此，本发明提供了一种能够良好分离2种以上促生长类抗菌药物的分离方法，以及同时检测2种以上促生长类抗菌药物的检测方法。
在一个实施方案中，所述促生长类抗菌药物的分离方法采用超高效液相色谱，其中所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-甲酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0～1min，流动相中乙腈的体积百分比为12％；1.01～8min，流动相中乙腈的体积百分比为25％→30％；8.01～11min，流动相中乙腈的体积百分比为30％；11.01～14min，流动相中乙腈的体积百分比为42％；14.01～20min，流动相中乙腈的体积百分比为44％；20.01～25min，流动相中乙腈的体积百分比为70％；25.01～30min，流动相中乙腈的体积百分比为12％。
所述促生长类抗菌药物可以在一定的范围内选择，例如，所述促生长类抗菌药物可以包括土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽和黄霉素中的至少一种。
上述促生长类抗菌药物中，除喹烯酮为化学合成的单一化合物外，其余均为发酵来源的抗生素，每种抗生素除主成分外，均包含多种与主成分结构相似的小组分和/或杂质。多种促生长类抗菌药物在同一色谱条件下分离时，每种抗菌药物的主成分峰都可能受到自身小组分峰、自身杂质峰、其他抗菌药物的主成分峰、其他抗菌药物的小组分峰或杂质峰的干扰，分离难度较单种促生长类抗菌药物而言大大增加。
可选的，所述超高效液相色谱的色谱条件还满足以下条件中的至少一项：
1)色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；
2)所述甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度为0.04～0.06mol/L；
3)所述甲酸铵水溶液的pH值为3.6～4.0，可选的，采用甲酸调节所述甲酸铵水溶液的pH值；
4)流速为0.42ml/min～0.48ml/min；
5)柱温为25℃～35℃；
6)进样量为3～8μL。
本发明还提供了一种促生长类抗菌药物的检测方法，所述检测方法包括前述任一项所述的分离方法。
可选的，所述检测方法包括：采用上述任一项所述的分离方法对供试品溶液和对照品溶液进行分离，利用二极管阵列检测器进行检测，其中，所述对照品溶液中含有至少一种促生长类抗菌药物对照品。
可选的，所述二极管阵列检测器的采集波长可以为200～400nm，提取波长可以为252～256nm。
可选的，所述检测方法还可以包括采用供试品制备所述供试品溶液的步骤：取所述供试品，加溶剂，提取，固液分离，取液体，得到所述供试品溶液。
可选的，所述溶剂可以为乙腈与甲酸水溶液的混合溶液，所述甲酸水溶液中甲酸的体积百分含量可以为0.2～0.3％，所述乙腈与所述甲酸水溶液的体积比可以为(50～60)：(50～40)。
可选的，所述供试品与所述溶剂的相对用量可以在一定的范围内变化，例如，相对于0.1g所述供试品，所述溶剂的加入量可以为8～12ml。
可选的，所述提取的方式可以在一定的范围内选择，例如，所述提取可以为超声提取，提取时间可以为5～10分钟。
可选的，所述固液分离为室温下0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
可选的，所述供试品可以选自兽药原料、兽药中间品和兽药制剂。其中，兽药中间品可以是在利用兽药原料制备兽药制剂过程中产生的中间产品，例如预混颗粒。兽药制剂可以是由兽药原料按照药学上常规工艺，加入或不加药学上常规辅料制成的制剂。
优选的，兽药制剂可以选自但不局限于注射剂、溶液剂、浇淋剂、喷滴剂、散剂、可溶性粉剂、预混剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、软膏剂、浸膏剂或糊剂等制剂。
可选的，所述检测方法还可以包括采用至少一种促生长类抗菌药物对照品制备所述对照品溶液的步骤：取至少一种促生长类抗菌药物对照品，加溶剂，溶解，得到所述对照品溶液。
可选的，所述对照品溶液中，各促生长类抗菌药物对照品的浓度可以为0.04mg/mL～0.6mg/mL。
可选的，所述对照品溶液中含有土霉素对照品、恩拉霉素对照品、喹烯酮对照品、维吉尼亚霉素对照品、那西肽对照品和黄霉素对照品。其中，土霉素对照品的浓度可以为0.08mg/mL～0.12mg/mL，恩拉霉素对照品的浓度可以为0.4mg/mL～0.6mg/mL，喹烯酮对照品的浓度可以为0.04mg/mL～0.06mg/mL，维吉尼亚霉素对照品的浓度可以为0.08mg/mL～0.12mg/mL，那西肽对照品的浓度可以为0.04mg/mL～0.06mg/mL，黄霉素对照品的浓度可以为0.4mg/mL～0.6mg/mL。
可选的，所述对照品溶液中，土霉素对照品的浓度为0.1mg/mL，恩拉霉素对照品的浓度为0.5mg/mL，喹烯酮对照品的浓度为0.05mg/mL，维吉尼亚霉素对照品的浓度为0.1mg/mL，那西肽对照品的浓度为0.05mg/mL，黄霉素对照品的浓度为0.5mg/mL。
可选的，采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器法检测得到供试品图谱和对照品图谱，基于所述供试品图谱和所述对照品图谱，对供试品中的促生长类抗菌药物进行检测，所述供试品图谱可以包括供试品色谱图和供试品光谱图，所述对照品图谱可以包括对照品色谱图和对照品光谱图。
所述基于所述供试品图谱和所述对照品图谱，对供试品中的促生长类抗菌药物进行检测，包括：
确定所述供试品色谱图中是否存在与所述对照品色谱图中的目标对照色谱峰保留时间一致的目标供试色谱峰，其中，所述目标对照色谱峰包括所述对照品色谱图中的至少一个促生长类抗菌药物对照色谱峰；
在确定存在所述目标供试色谱峰的情况下，确定所述目标供试色谱峰是否为单一物质峰；
在确定所述目标供试色谱峰为单一物质峰的情况下，在所述供试品光谱图中确定与所述目标供试色谱峰对应的目标供试光谱图，以及在所述对照品光谱图中确定所述目标对照色谱峰对应的目标对照光谱图；
将所述目标供试光谱图与所述目标对照光谱图进行比对，并根据比对结果确定所述目标供试光谱图与所述目标对照光谱图是否一致，在所述目标供试光谱图与所述目标对照光谱图一致的情况下，确定供试品中存在与所述目标对照色谱峰对应的促生长类抗菌药物。
可选的，在确定所述供试品色谱图中不存在与所述对照品色谱图中的目标对照色谱峰保留时间一致的目标供试色谱峰的情况下，确定所述供试品中不存在与所述目标对照色谱峰对应的促生长类抗菌药物。
可选的，所述目标对照色谱峰为所述对照品色谱图中土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽和黄霉素的主成分峰中的至少一种。
可选的，可以采用本领域内的常用方法，确定所述目标供试色谱峰是否为单一物质峰，示例性地，可以采用液相软件计算目标供试色谱峰的纯度角度和纯度阈值，在纯度角度小于纯度阈值的情况下，确定所述目标供试色谱峰为单一物质峰，在纯度角度不小于纯度阈值的情况下，确定所述目标供试色谱峰为非单一物质峰。
可选的，可以采用本领域内的常用方法，确定所述目标供试光谱图与目标对照光谱图是否一致，示例性地，可以采用液相软件计算所述目标供试光谱图的PDA匹配角度和PDA匹配阈值，在PDA匹配角度小于PDA匹配阈值的情况下，确定所述目标供试光谱图与所述目标对照光谱图一致，在PDA匹配角度不小于PDA匹配阈值的情况下，确定所述目标供试光谱图与所述目标对照光谱图不一致。
可选的，所述基于所述供试品图谱和所述对照品图谱，对供试品中的促生长类抗菌药物进行检测，还包括：基于所述目标供试色谱峰的峰面积和所述目标对照色谱峰的峰面积，利用外标法计算所述供试品中促生长类抗菌药物的含量。优选的，所述利用外标法计算的促生长类抗菌药物为土霉素和喹烯酮中的至少一种。
本发明还提供了上述任一项所述的分离方法或者上述任一项所述的检测方法在兽药中非法添加促生长类抗菌药物检测中的用途。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的促生长类抗菌药物分离方法，采用超高效液相色谱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-甲酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，通过上述方法得到的色谱图基线平稳，各主成分峰峰形好、各主成分峰与周围峰之间分离度高，且可实现2种以上促生长类抗菌药物的良好分离。
2.本发明提供的促生长类抗菌药物检测方法，通过优化提取溶剂，确定了最佳的提取工艺，能够提取出供试品中含有的微量促生长类抗菌药物，显著提升了对促生长类抗菌药物的检测灵敏度。
3.本发明提供的促生长类抗菌药物检测方法，能够准确定位土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽和黄霉素的主成分峰的位置，具有专属性强、通量高的优点。
4.本发明提供的促生长类抗菌药物检测方法，各促生长类抗菌药物的线性浓度范围满足分析要求，且具有精密度高、准确度高、耐用性好的优点，为精准打击在兽药中添加促生长类抗菌药物的违法行为提供了技术保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1或实施例2中对照品溶液的对照品色谱图，其中：峰1为土霉素的主成分土霉素峰(CAS号：79-57-2)，峰2为恩拉霉素的主成分恩拉霉素A峰(CAS号：11115-82-5)，峰3为喹烯酮的主成分喹烯酮峰(CAS号：81810-66-4)，峰4为维吉尼亚霉素的主成分维吉尼亚霉素M1峰(CAS号：21411-53-0)，峰5为那西肽的主成分那西肽A峰(CAS号：56377-79-8)，峰6为黄霉素的主成分黄霉素A峰(CAS号：11015-37-5)；
图2是本发明实施例1中对照品溶液的对照品光谱图；
图3是本发明实验例1中溶剂空白对应的色谱图；
图4是本发明实施例1中阿苯达唑伊维菌素预混剂对应的供试品色谱图，或实验例1中阿苯达唑伊维菌素预混剂供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图；
图5是本发明实施例1中地克珠利预混剂对应的供试品色谱图，或实验例1中地克珠利预混剂供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图；
图6是本发明实施例1中莫能菌素预混剂对应的供试品色谱图，或实验例1中莫能菌素预混剂供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图；
图7是本发明实施例1中对乙酰氨基酚注射液对应的供试品色谱图，或实验例1中对乙酰氨基酚注射液供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图；
图8是本发明实施例1中止痢散对应的供试品色谱图，或实验例1中止痢散供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图；
图9是本发明实施例2中添加6种促生长类抗菌药物的莫能菌素预混剂的对应图谱，其中：图9A为光谱图；图9B为色谱图；图9C为PDA结果表；
图10是本发明对比例1中测得的对照品溶液色谱图；
图11是本发明对比例2中测得的对照品溶液色谱图；
图12是本发明对比例3中测得的对照品溶液色谱图；
图13是本发明对比例4中流动相A的pH为3.1时测得的对照品溶液色谱图；
图14是本发明对比例4中流动相A的pH为4.5时测得的对照品溶液色谱图；
图15是本发明对比例5中利用Phenomenex Luna Omega C18柱测得的对照品溶液色谱图；
图16是本发明对比例5中利用Waters Hss T3 C18柱测得的对照品溶液色谱图；
图17是本发明对比例6中测得的对照品溶液色谱图；
图18是本发明对比例7中测得的对照品溶液色谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明具体实施方式部分涉及的仪器及试剂如下所示：
仪器：超高效液相色谱仪为购自Waters公司的ACQUITY UPLC；二极管阵列检测器为购自Waters公司的2998PDA；液相软件为购自Waters公司的Empower II。
试剂：土霉素对照品(批号：K0031608，来源：中国兽医药品监察所，含量：86.6％)；恩拉霉素对照品(批号：K0661804，来源：中国兽医药品监察所，含量：968单位/mg)；喹烯酮对照品(批号：H0561704，来源：中国兽医药品监察所，含量：99.9％)；维吉尼亚霉素对照品(批号：K0411211，来源：中国兽医药品监察所，含量：2347单位/mg)；那西肽对照品(批号：K0431804，来源：中国兽医药品监察所，含量：984单位/mg)；黄霉素对照品(批号：K0291809，来源：中国兽医药品监察所，含量：2219单位/mg)；乙腈(批号：SHBN7205，厂家：Merck)；甲酸(批号：205178，厂家：Fisher)；甲酸铵(批号：186247，厂家：Fisher)；阿苯达唑伊维菌素预混剂(批号：20032104，厂家：河北威远动物药业有限公司)；地克珠利预混剂(批号：04204037，厂家：山东齐发动物药业有限公司)；莫能菌素预混剂(批号：10211588，厂家：山东齐发动物药业有限公司)；对乙酰氨基酚注射液(批号：20060201，厂家：南昌科王兽药厂)；止痢散(批号：20040801，来源：河北新世纪药业有限公司)。
实施例1
本实施例用于说明兽药中促生长类抗菌药物的分离及检测方法。
(1)对照品溶液的制备：分别精密称取土霉素对照品10mg、恩拉霉素对照品50mg、喹烯酮对照品5mg、维吉尼亚霉素对照品10mg、那西肽对照品5mg、黄霉素对照品50mg置于同一100mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，制成对照品溶液。其中，溶剂为乙腈-0.25％(体积百分含量，v/v)甲酸水溶液，且乙腈-0.25％甲酸水溶液的体积比为50:50，0.25％甲酸水溶液由2.5mL的甲酸置于1000mL的容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度制得。
(2)供试品溶液的制备：称取供试品0.1g，加入10mL步骤(1)中使用的溶剂，摇匀，300W功率超声5分钟，室温下利用0.22μm滤膜过滤，制得供试品溶液。其中，供试品包括市场上售卖的常见兽药：阿苯达唑伊维菌素预混剂(批号：20032104，厂家：河北威远动物药业有限公司)；地克珠利预混剂(批号：04204037，厂家：山东齐发动物药业有限公司)；莫能菌素预混剂(批号：10211588，厂家：山东齐发动物药业有限公司)；对乙酰氨基酚注射液(批号：20060201，厂家：南昌科王兽药厂)；止痢散(批号：20040801，来源：河北新世纪药业有限公司)。
(3)UPLC-PDA法检测：分别精密吸取对照品溶液和各供试品溶液5μL注入超高效液相色谱仪-二极管阵列检测器系统，按照如下的色谱条件进行测定，即得。
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流速：0.45mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL；以0.05mol/L的甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH至3.8)为流动相A，以乙腈为流动相B，按照表1进行梯度洗脱；采集波长为200～400nm；提取波长为254nm。
表1实施例1梯度洗脱表
检测得到对照品溶液的对照品色谱图和对照品光谱图，以及各供试品溶液的供试品色谱图，如图1-2以及图4-8所示。其中，图1为对照品色谱图，图2为对照品光谱图，图4为阿苯达唑伊维菌素预混剂对应的供试品色谱图，图5为地克珠利预混剂对应的供试品色谱图，图6为莫能菌素预混剂对应的供试品色谱图，图7为对乙酰氨基酚注射液对应的供试品色谱图，图8为止痢散对应的供试品色谱图。
由图1可以看出，本发明的方法能够在同一色谱条件下实现土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽和黄霉素主成分峰的良好分离，各主成分峰与周围峰之间的分离度良好。
分别将图4-8与图1进行比对，比对结果显示图4-8中均不存在与图1中的各目标对照色谱峰保留时间相同的色谱峰，由此确定本实施例中检测的阿苯达唑伊维菌素预混剂、地克珠利预混剂、莫能菌素预混剂、对乙酰氨基酚注射液和止痢散中均不存在土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽和黄霉素等促生长类抗菌药物中的任一种。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：本实施例使用的供试品为添加了6种促生长类抗菌药物的莫能菌素预混剂。
(1)对照品溶液的制备：同实施例1。
(2)添加有6种促生长类抗菌药物的莫能菌素预混剂供试品溶液的制备：分别精密称取土霉素对照品10mg、恩拉霉素对照品50mg、喹烯酮对照品5mg、维吉尼亚霉素对照品10mg、那西肽对照品5mg、黄霉素对照品50mg及莫能菌素预混剂1.0g，置于同一100mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，300W功率超声5分钟，室温下利用0.22μm滤膜过滤，制得供试品溶液。
(3)UPLC-PDA法检测同实施例1。
检测得到对照品溶液的对照品色谱图，如图1所示。对照品溶液的对照品光谱图如图2所示。供试品溶液的光谱图、色谱图及PDA结果表如图9所示，其中，图9A为供试品溶液的光谱图，图9B为供试品溶液的色谱图，图9C为供试品溶液的PDA结果表。
将图9B与图1进行比对，结果显示供试品溶液色谱图中存在6个与对照品色谱图中目标对照色谱峰保留时间一致的目标供试色谱峰，图9C显示液相软件所计算的6个目标供试色谱峰的纯度角度均小于对应纯度阈值，确定6个目标供试色谱峰均为单一物质峰，将图9A与图2进行比对，结果显示6个目标供试色谱峰对应的光谱图与6种促生长类抗菌药物的光谱图一致，图9C显示液相软件所计算的6个目标供试光谱图的PDA匹配角度均小于对应PDA匹配阈值，由此本实施例的供试品中检出土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽、黄霉素。
对比例1
按照实施例1的方法对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液进行检测，不同的是：将流动相B由乙腈替换为甲醇。
检测结果如图10所示，由图10可以看出，将流动相B由乙腈替换为甲醇后，所有对照品色谱峰的保留时间均有所延迟，且那西肽A峰、恩拉霉素A峰、维吉尼亚霉素M1峰和黄霉素A峰与周围峰之间的分离度变差，尤其是恩拉霉素A峰与维吉尼亚霉素M1峰完全重叠，无法分离。这说明甲醇不适用于分离促生长类抗菌药物。
对比例2
按照实施例1的方法对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液进行检测，不同的是：将流动相A中的甲酸铵替换为三乙胺。
检测结果如图11所示，由图11可以看出，将流动相A中的甲酸铵替换为三乙胺后，黄霉素A峰的保留时间有所延迟，其与自身小组分峰的分离度变差。这说明本发明流动相A中的甲酸铵对于促生长类抗菌药物的分离效果较好。
对比例3
按照实施例1的方法对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液进行检测，不同的是：将流动相A由0.05mol/L的甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH至3.8)替换为纯化水(用甲酸调节pH至3.8)。
检测结果如图12所示，由图12可以看出，去掉流动相A中的甲酸铵后，恩拉霉素与黄霉素在14.9min左右形成矮胖且不对称的混合物峰，两种抗菌药物无法分离，同时，那西肽A峰与周围小组分峰的分离度也变差。这说明本发明使用添加有甲酸铵的流动相A，对于促生长类抗菌药物的分离效果较好。
对比例4
按照实施例1的方法对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液进行检测，不同的是：调整流动相A的pH为3.1或4.5。
检测结果如图13和14所示，其中，图13为流动相A的pH为3.1时的对照品色谱图，图14为流动相A的pH为4.5时的对照品色谱图。由图13可以看出，调整流动相A的pH为3.1后，黄霉素A峰的保留时间延迟，其与自身小组分峰分离度变差；由图14可以看出，调整流动相A的pH为4.5后，恩拉霉素A峰的保留时间延迟，导致其与喹烯酮峰完全重叠，无法分离。这说明流动相A的pH在3.6～4.0范围内时，各促生长类抗菌药物色谱峰的分离效果较好。
对比例5
按照实施例1的方法对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液进行检测，不同的是：将色谱柱由Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)替换为不同厂家的Phenomenex Luna Omega C18柱(2.1mm×100mm，1.6μm)或不同型号的Waters Hss T3 C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。
检测结果如图15和16所示，其中，图15为利用Phenomenex Luna Omega C18柱(2.1mm×100mm，1.6μm)检测得到的对照品色谱图，图16为利用Waters Hss T3 C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)检测得到的对照品色谱图。由图15可以看出，使用Phenomenex LunaOmega C18柱时，那西肽A峰与周围小组分峰重合；由图16可以看出，使用Waters Hss T3C18柱时，喹烯酮峰与恩拉霉素小组分峰重合。这说明上述两种常用色谱柱对促生长类抗菌药物的分离效果较差，不适用于促生长类抗菌药物的分离。
对比例6
按照实施例1的方法对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液进行检测，不同的是：调整第1.01-8min内的流动相配比，按照表2进行梯度洗脱。
表2对比例6梯度洗脱表
检测结果如图17所示，由图17可以看出，按照表2的洗脱程序进行梯度洗脱后，恩拉霉素A峰与喹烯酮峰重合，无法分离；维吉尼亚霉素M1峰与周围小组分峰分离度变差。这表明上述梯度洗脱程序不适用于促生长类抗菌药物的分离。
对比例7
按照实施例1的方法对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液进行检测，不同的是：按照表3进行梯度洗脱。
表3对比例7梯度洗脱表
检测结果如图18所示，由图18可以看出，按照表3的洗脱程序进行梯度洗脱后，黄霉素A峰的保留时间延迟，与自身小组分峰的分离度变差。这表明上述梯度洗脱程序不适用于促生长类抗菌药物的分离。
对比例8
按照实施例1步骤(1)中的方法制备对照品溶液，不同的是：调整溶剂中乙腈和0.25％甲酸水溶液之间的体积比为70:30或者40:60。
结果显示：当乙腈：0.25％甲酸水溶液的体积比＞60：40(如70:30)时，恩拉霉素、黄霉素不能完全溶解，试管底部有可见的未溶解固体；当乙腈：0.25％甲酸水溶液的体积比＜50：50(如40:60)时，那西肽不能完全溶解，试管底部有可见的未溶解固体。
对比例9
按照实施例1步骤(1)中的方法制备对照品溶液，不同的是：调整超声处理的时间为3min。
结果显示，当超声时间小于5min，如3min时，土霉素、那西肽的回收率低于70％，这是由于这些化合物未能完全溶解造成的。
实验例1专属性考察
按照实施例1步骤(1)中的方法制备对照品溶液，按照实施例1步骤(2)中的方法分别制备阿苯达唑伊维菌素预混剂供试品溶液(制剂空白)、地克珠利预混剂供试品溶液(制剂空白)、莫能菌素预混剂供试品溶液(制剂空白)、对乙酰氨基酚注射液供试品溶液(制剂空白)、止痢散供试品溶液(制剂空白)。其中，制剂空白是指采用与供试品溶液相同的配制方法，利用不含有促生长类抗菌药物的制剂配制成的溶液。
取实施例1步骤(1)中的溶剂及上述各溶液，按照实施例1步骤(3)中的检测方法进行检测，检测结果如图1以及图3-8所示。其中，图1为对照品溶液对应的色谱图，图3为溶剂空白对应的色谱图，图4为阿苯达唑伊维菌素预混剂供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图，图5为地克珠利预混剂供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图，图6为莫能菌素预混剂供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图，图7为对乙酰氨基酚注射液供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图，图8为止痢散供试品溶液(制剂空白)对应的色谱图。
由图1以及图3-8可以看出，溶剂以及上述五种供试品溶液对应的色谱图中均不存在目标对照色谱峰，这说明溶剂空白及制剂空白对上述6种促生长类抗菌药物的检测无干扰。对照品溶液中上述6种药物的主成分峰与周围小组分或杂质峰分离良好。上述结果表明本方法的专属性良好。
实验例2精密度考察
按照实施例1步骤(3)中的检测方法，对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液连续进样6次进行测定，计算6次检测结果中上述6种促生长类抗菌药物的主成分峰保留时间RSD和主成分峰面积RSD，结果见表4。
表4 6种促生长类抗菌药物的精密度考察结果
由表4可以看出，6次检测结果中促生长类抗菌药物的保留时间的RSD均不大于0.2％，峰面积的RSD均不大于0.9％。在兽药检测领域，通常要求检测方法精密度考察的RSD≤2.0％(《中国兽药典》二〇二〇年版)，因此表4的考察结果表明本发明检测方法的精密度良好，可以用来检测兽药中的促生长类抗菌药物。
实验例3检测限考察
精密量取实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液适量，用溶剂(乙腈：0.25％甲酸水溶液＝50:50，v：v)分别稀释2倍、4倍、5倍、6倍和10倍。按照实施例1步骤(3)中的检测方法分别进样检测，并记录图谱。
检测图谱显示：当对照品溶液稀释6倍或10倍后，检测得到的各对照光谱图出现明显锯齿状，即发生谱图失真。当对照品溶液稀释2倍、4倍或5倍时，检测得到的各对照光谱图未发生谱图失真。以对照品溶液稀释5倍后的各促生长类抗菌药物的浓度作为本发明方法的浓度检测限。因此，本发明方法针对溶液中各促生长类抗菌药物的浓度检测限为：土霉素0.02mg/mL、恩拉霉素0.1mg/mL、喹烯酮0.01mg/mL、维吉尼亚霉素0.02mg/mL、那西肽0.01mg/mL、黄霉素0.1mg/mL。
在实施例1中，各制剂的配制浓度均为10mg/mL，因此，将本发明方法针对溶液中各促生长类抗菌药物的浓度检测限转换为针对制剂中各促生长类抗菌药物的添加检测限为：土霉素2mg/g、恩拉霉素10mg/g、喹烯酮1mg/g、维吉尼亚霉素2mg/g、那西肽1mg/g、黄霉素10mg/g。
实验例4线性和范围考察
取土霉素对照品10mg、恩拉霉素对照品50mg、喹烯酮对照品5mg、维吉尼亚霉素对照品10mg、那西肽对照品5mg、黄霉素对照品50mg，精密称定，置于同一50mL容量瓶中，用溶剂(乙腈：0.25％甲酸水溶液＝50:50，v：v)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液①。分别精密量取线性溶液①8mL、5mL、10mL、5mL分别置10mL、10mL、25mL、25mL容量瓶中，稀释至刻度，作为线性溶液②-⑤。按照实施例1步骤(3)中的检测方法分别进样检测，记录色谱图。
按照制剂配制浓度为10mg/mL计算，将线性溶液①-⑤中各促生长类抗菌药物的溶液浓度，转换成制剂中各促生长类抗菌药物的添加浓度x(mg/g)，并以各添加浓度x(mg/g)对峰面积y作图，进行统计学处理，分别得到6种促生长类抗菌药物的回归方程，并计算得到相关系数R2，结果见表5。
表5 6种促生长类抗菌药物的线性考察结果
对照品名称 线性范围(mg/g) R2
土霉素 4-20 1.0000
恩拉霉素 20-100 1.0000
喹烯酮 2-10 1.0000
维吉尼亚霉素 4-20 0.9999
那西肽 2-10 0.9994
黄霉素 20-100 1.0000
由表5可以看出，在制剂添加浓度为2-100mg/g的范围内，利用本发明方法检测得到的上述6种促生长类抗菌药物主成分的峰面积与制剂添加浓度呈良好的线性关系。
实验例5准确度考察
向不含促生长类抗菌药物的五种兽药(阿苯达唑伊维菌素预混剂、地克珠利预混剂、莫能菌素预混剂、对乙酰氨基酚注射液、止痢散)中分别添加80％、100％、120％浓度水平(“浓度水平”是指促生长类抗菌药物在供试品溶液中的浓度占其在对照品溶液中的浓度的百分比)的以上6种促生长类抗菌药物，以制备供试品溶液，每个浓度水平平行制备供试品溶液3份，按照实施例1步骤(3)中的检测方法分别进行检测，计算本发明方法对各兽药中各浓度水平的各促生长类抗菌药物的回收率，并分别计算平均收率，计算结果见表6。
表6各兽药中各浓度的各促生长类抗菌药物的回收率考察结果
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兽药检测领域用回收率来评价检测结果与真实值的接近程度，在约10mg/g的添加浓度下，其回收率应在92％-105％之间(《中国兽药典》二〇二〇年版一部)。表6的考察结果显示，本发明方法对上述五种兽药中6种促生长类抗菌药物的平均回收率均在此范围内，满足兽药检测中对回收率的要求，因此，本发明方法适用于兽药中6种促生长类抗菌药物的检测。
实验例6耐用性考察
在不同流动相pH(3.6、3.8、4.0)、不同柱温(25℃、30℃、35℃)、不同流速(0.42mL/min、0.45mL/min、0.48mL/min)条件下，分别对实施例1步骤(1)中制备的对照品溶液进行测定，统计分离度、纯度角度和纯度阈值，结果如表7所示。
表7色谱条件耐用性考察结果
由表7可以看出，在上述各色谱条件下，6种促生长类抗菌药物主成分峰与周围峰的分离度均大于1.5，且各主成分峰的纯度角度均小于纯度阈值，为单一物质峰，表明本发明方法具有良好的耐用性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (16)

1.一种促生长类抗菌药物的分离方法，其特征在于，所述促生长类抗菌药物包括土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽和黄霉素中的至少两种，所述方法采用超高效液相色谱，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
以乙腈-甲酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0～1min，流动相中乙腈的体积百分比为12％；1.01～8min，流动相中乙腈的体积百分比为25％→30％；8.01～11min，流动相中乙腈的体积百分比为30％；11.01～14min，流动相中乙腈的体积百分比为42％；14.01～20min，流动相中乙腈的体积百分比为44％；20.01～25min，流动相中乙腈的体积百分比为70％；25.01～30min，流动相中乙腈的体积百分比为12%；
利用二极管阵列检测器进行检测；色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述促生长类抗菌药物包括土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽和黄霉素。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还满足以下条件中的至少一项：
1）所述甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度为0.04～0.06mol/L；
2）所述甲酸铵水溶液的pH值为3.6～4.0；
3）流速为0.42ml/min～0.48ml/min；
4）柱温为25℃～35℃；
5）进样量为3～8μL。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，采用甲酸调节所述甲酸铵水溶液的pH值。
5.一种促生长类抗菌药物的检测方法，其特征在于，采用权利要求1至4中任一项所述的分离方法对供试品溶液和对照品溶液进行分离，利用二极管阵列检测器进行检测，其中，所述对照品溶液中含有至少两种促生长类抗菌药物对照品；
所述二极管阵列检测器的采集波长为200～400nm，提取波长为252～256nm；
所述检测方法还包括采用供试品制备所述供试品溶液的步骤：取所述供试品，加溶剂，提取，固液分离，取液体，得到所述供试品溶液；所述供试品选自阿苯达唑伊维菌素预混剂、地克珠利预混剂、莫能菌素预混剂、对乙酰氨基酚注射液、止痢散；
所述溶剂为乙腈与甲酸水溶液的混合溶液，所述甲酸水溶液中甲酸的体积百分含量为0.2～0.3%，所述乙腈与所述甲酸水溶液的体积比为（50～60）：（50～40）。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，相对于0.1g所述供试品，所述溶剂的加入量为8～12ml。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述提取为超声提取，提取时间为5～10分钟。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述固液分离为室温下0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用至少两种促生长类抗菌药物对照品制备所述对照品溶液的步骤：取至少两种促生长类抗菌药物对照品，加溶剂，溶解，得到所述对照品溶液。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液中，各促生长类抗菌药物对照品的浓度为0.04mg/mL～0.6mg/mL。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液中，土霉素对照品浓度为0.08mg/mL～0.12mg/mL，恩拉霉素对照品浓度为0.4mg/mL～0.6mg/mL，喹烯酮对照品浓度为0.04mg/mL～0.06mg/mL，维吉尼亚霉素对照品浓度为0.08mg/mL～0.12mg/mL，那西肽对照品浓度为0.04mg/mL～0.06mg/mL，黄霉素对照品浓度为0.4mg/mL～0.6mg/mL。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液中，土霉素对照品浓度为0.1mg/mL，恩拉霉素对照品浓度为0.5mg/mL，喹烯酮对照品浓度为0.05mg/mL，维吉尼亚霉素对照品浓度为0.1mg/mL，那西肽对照品浓度为0.05mg/mL，黄霉素对照品浓度为0.5mg/mL。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的检测方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器法检测得到供试品图谱和对照品图谱，基于所述供试品图谱和所述对照品图谱，对供试品中的促生长类抗菌药物进行检测，所述供试品图谱包括供试品色谱图和供试品光谱图，所述对照品图谱包括对照品色谱图和对照品光谱图；
所述基于所述供试品图谱和所述对照品图谱，对供试品中的促生长类抗菌药物进行检测，包括：
确定所述供试品色谱图中是否存在与所述对照品色谱图中的目标对照色谱峰保留时间一致的目标供试色谱峰，其中，所述目标对照色谱峰包括对照品色谱图中的至少两个促生长类抗菌药物对照色谱峰；
在确定存在所述目标供试色谱峰的情况下，确定所述目标供试色谱峰是否为单一物质峰；
在确定所述目标供试色谱峰为单一物质峰的情况下，在所述供试品光谱图中确定与所述目标供试色谱峰对应的目标供试光谱图，以及在所述对照品光谱图中确定所述目标对照色谱峰对应的目标对照光谱图；
将所述目标供试光谱图与所述目标对照光谱图进行比对，并根据比对结果确定所述目标供试光谱图与所述目标对照光谱图是否一致，在所述目标供试光谱图与所述目标对照光谱图一致的情况下，确定所述供试品中存在与所述目标对照色谱峰对应的促生长类抗菌药物。
14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，在确定所述供试品色谱图中不存在与所述对照品色谱图中的目标对照色谱峰保留时间一致的目标供试色谱峰的情况下，确定所述供试品中不存在与所述目标对照色谱峰对应的促生长类抗菌药物。
15.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述基于所述供试品图谱和所述对照品图谱，对供试品中的促生长类抗菌药物进行检测，还包括：
基于所述目标供试色谱峰的峰面积和所述目标对照色谱峰的峰面积，利用外标法计算所述供试品中促生长类抗菌药物的含量。
16.权利要求1至4中任一项所述的分离方法或者权利要求5～15中任一项所述的检测方法在兽药中非法添加促生长类抗菌药物检测中的用途。
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