CN114574590A - 软组织血管纤维瘤分子标志物及其检测试剂盒 - Google Patents

软组织血管纤维瘤分子标志物及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学检验技术领域，尤其是涉及软组织血管纤维瘤分子标志物及其检测试剂盒，所述分子标志物为PTCH1‑PLAG1融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的融合基因PTCH1‑PLAG1，是由位于染色体9q22上的PTCH1基因Exon 1末端与位于染色体8q12上的PLAG1基因Exon 3前端融合形成，属于translocation类型中的splice‑site融合位点。本发明基于一步法qRT‑PCR技术检测石蜡包埋组织中PTCH1‑PLAG1融合基因的试剂盒，可实现对石蜡组织中PTCH1‑PLAG1 mRNA的绝对定量检测，可操作性及重复性强，灵敏度和特异性较高。

Description

软组织血管纤维瘤分子标志物及其检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学检验技术领域，尤其是涉及软组织血管纤维瘤分子标志物及其检测试剂盒。
背景技术
软组织血管纤维瘤（Angiofibroma of Soft Tissue，AFST）是2012年由Mariño-Enríquez 和Fletcher首先报道并命名的一种具有独特临床病理和分子遗传学特征的良性纤维血管性肿瘤，并被作为一个新病种收录入2020版WHO骨和软组织肿瘤分类中。迄今国内外有关AFST的文献报道约100例，对其临床病理和分子遗传学特征尚缺少足够的认识。组织学上，AFST富含血管，基质经常黏液样变性，易误诊为其他富含血管和／或黏液样基质的软组织肿瘤，特别是血管性肿瘤和黏液样软组织肿瘤，后者如低级别黏液纤维肉瘤和黏液样脂肪肉瘤等。AFST没有特异的免疫组化标记，肿瘤细胞常表达Vimentin、ER和CD163，也不同程度的表达EMA、CD68、D2-40、Desmin、PR、α-SMA、CD34和STAT6等。
2012年Jin等证实AFST中存在t(5;8)(p15;q13)染色体易位及其融合基因AHRR-NCOA2/NCOA2-AHRR等。目前，文献已报道的AFST中存在的染色体易位及其融合基因见表1。其中最常见的是t(5;8)(p15;q13)及其融合基因AHRR-NCOA2 / NCOA2-AHRR，少数为t (7;8;14) (q11;q13;q31) 及其融合基因GTF2I-NCOA2 、t (4;5) (q24;q31)及其融合基因NCOA2-ETV4、ETV4-AHRR、P4HA2-TBCK等。运用RT-PCR、FISH或二代测序等手段对这些染色体易位或融合基因进行检测，有助于AFST的诊断、分型和鉴别诊断。
表1文献报道软组织血管纤维瘤存在的染色体易位及其融合基因
Figure 723104DEST_PATH_IMAGE001
近期，申请者运用转录组测序、RT-PCR和FISH技术，在1例人软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织中发现和验证了一个新的融合基因PTCH1-PLAG1，它是由位于染色体9q22上的PTCH1基因Exon 1末端与位于8q12上的PLAG1基因Exon 3前端融合形成，属于translocation类型中的splice-site融合位点。而目前国内外尚未见PTCH1-PLAG1融合基因在软组织血管纤维瘤或其它肿瘤的研究报道。
逆转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR)方法是肿瘤染色体易位融合基因的常用的检测方法之一，尤其是一步法qRT-PCR，其反应速度快，可降低实验污染的可能性，可操作性及重复性强，灵敏度和特异性均较高，是目前在各种肿瘤检测石蜡包埋组织中融合基因表达的首选技术手段之一。
本发明提供了一种用于软组织血管纤维瘤诊断与分型的新型融合基因PTCH1-PLAG1，以及基于一步法qRT-PCR技术检测软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织中融合基因PTCH1-PLAG1的试剂盒，以实现对石蜡组织中PTCH1-PLAG1 mRNA的绝对定量检测，从而有利于软组织血管纤维瘤的诊断与分子分型。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种软组织血管纤维瘤分子标志物，该分子标志物有利于软组织血管纤维瘤的诊断与分子分型；
本发明的第二目的在于提供一种检测人软组织血管纤维瘤的检测试剂盒，该检测试剂盒可实现对石蜡包埋组织中PTCH1-PLAG1 mRNA的绝对定量检测，灵敏度和特异性较高，可操作性及重复性强。
本发明提供的一种软组织血管纤维瘤分子标志物，所述分子标志物为PTCH1-PLAG1融合基因，所述PTCH1-PLAG1融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
作为本技术方案优选地，所述PTCH1-PLAG1融合基因由位于染色体9q22上的PTCH1基因Exon 1末端与位于染色体8q12上的PLAG1基因Exon 3前端融合而成。
作为本技术方案优选地，PTCH1-PLAG1融合基因的融合位点为PTCH1-chr9和PLAG1-chr8。
本发明针对上述PTCH1-PLAG1融合基因还提供了一种检测人软组织血管纤维瘤的检测试剂盒，也理应属于本发明的保护范围。
作为本技术方案优选地，还包括上述PTCH1-PLAG1融合基因的引物组合物；
所述引物组合物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为5’-TGATGTGAAATCCAAGCC-3’，如SEQ ID No.2所示，所述反向引物的序列为5’-GAATCCAATCCTTCCCATT -3’ ，如SEQ ID No.3所示。
作为本技术方案优选地，还包括上述PTCH1-PLAG1融合基因的探针，所述探针的序列为FAM-5'-TTGGCCAA TCATAGCCGGCCGTCAA -3'-BHQ1，如SEQ ID No.4所示。
作为本技术方案优选地，还包括阳性定量参考品，所述阳性定量参考品为含有PTCH1-PLAG1融合基因接合位点片段的PESI-T质粒，且其浓度梯度为1×106 copies/ml、1×105 copies/ml、1×104 copies/ml、1×103 copies/ml和1×102 copies/ml。
作为本技术方案优选地，还包括阴性对照，所述阴性对照为融合基因PTCH1-PLAG1呈阴性的人上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织。
作为本技术方案优选地，还包括Probe One-step qRT-PCR Kit，并且Probe One-step qRT-PCR Kit包括：5X buffer、dNTP Mixture、Enzyme Mixed、Forward Primer、Reverse Primer和TaqMan®probe。
本发明的软组织血管纤维瘤分子标志物，具有以下技术效果：
本发明的融合基因PTCH1-PLAG1，是由位于染色体9q22上的PTCH1基因Exon 1末端与位于染色体8q12上的PLAG1基因Exon 3前端融合形成，属于translocation类型中的splice-site融合位点。
其中，PTCH1基因位于染色体8q12，PTCH是一种12跨膜蛋白，有2个细胞外结合域和1个细胞内结合域，具有结合HH配体和抑制Smo的两种功能。人类有两种PTCH同源基因PTCH1和PTCH2，其中PTCH1为HH信号通路的负反馈基因，可直接抑制HH信号传导通路；目前对PTCH2的作用机制仍不清楚。
PLAG1基因（pleomorphic adenoma gene 1，）是一个锌指转录因子基因，位于染色体8q12，包含5个外显子和4个内含子，其蛋白产物是由501个氨基酸组成的DNA结合锌指蛋白，属细胞周期相关蛋白家族。初步研究表明，PLAG1具有转录因子的活性，可表达在皮肤及软组织肌上皮瘤、脂肪母细胞瘤、多形性腺瘤、肝母细胞瘤、子宫肌瘤等，可能与这些肿瘤的发病有关。
PLAG1相关的融合基因主要见于二类实体肿瘤：（1）约50%~60%的脂肪母细胞瘤（lipoblastoma）中存在多种PLAG1相关融合基因，包括PLAG1-HAS2（8q24.13）、PLAG1-COL1A2（7q21.3）、PLAG1-RAD51B（14q24.1）、PLAG1-COL3A1（2q32.2）、PLAG1-RAB2A（8q12.1-2）、PLAG1-BOC（3q13.2）等；（2）约40%的多形性腺瘤（pleiomorphicadenoma）中存在t（3；8）（p21;q12）及其融合基因CTNNB1-PLAG1、t（5;8）（p13;q12）LIFR-PLAG1、PLAG1-TCEA1、PLAG1-CHCHD7、FGFR1-PLAG1、TCEA1-PLAG1等基因融合，且可常见 HMGA2 基因（12q14）扩增。
而本发明基于一步法qRT-PCR技术检测石蜡包埋组织中PTCH1-PLAG1融合基因的检测试剂盒，通过把PTCH1-PLAG1融合基因作为标志物，可实现对石蜡组织中PTCH1-PLAG1mRNA的绝对定量检测，可操作性及重复性强，灵敏度和特异性较高。不仅有利于软组织血管纤维瘤的诊断和分子分型，而且提高了对该少见软组织肿瘤的临床病理与分子特征的认识和理解。
此外，本发明的检测试剂盒中的引物组合物是对原有融合基因PTCH1-PLAG1软组织血管纤维瘤引物的补充，扩展了PTCH1-PLAG1软组织血管纤维瘤的类型，增加了RT-PCR方法诊断该肿瘤的检出率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的PTCH1-PLAG1融合基因形成示意图（A）与一步法RT-PCR检测软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织中PTCH1-PLAG1 mRNA表达（B）并测序证实（C）；
图2为一步法RT-PCR检测软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织中AHRR-NCOA2和NCOA2-AHRR融合基因4种转录体的表达；
图3为本发明提供的PTCH1-PLAG1标准品的标准曲线，本实验标准曲线斜率为-3.893，效率值为1.907；
图4为本发明提供的PTCH1-PLAG1标准品与软组织血管纤维瘤组织中PTCH1-PLAG1mRNA的一步法qRT-PCR扩增曲线；
图5为FISH检测软组织血管纤维瘤中PLAG1基因重排结果；
图6为FISH检测软组织血管纤维瘤中NCOA2基因重排结果；
图7为软组织血管纤维瘤RNA测序结果中PLAG1基因重排与融合位点分析图；
图8为软组织血管纤维瘤RNA测序结果中PTCH1基因重排与融合位点分析图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本发明提供了一种新型的软组织血管纤维瘤分子标志物及其定量检测试剂盒。其技术思路如下：申请人在运用RT-PCR和FISH技术对经典的人软组织血管纤维瘤进行常见的融合基因AHRR-NCOA2/NCOA2-AHRR和NCOA2基因重排进行检测无果后，通过高通量测序（RNA-sq）技术，在1例软组织血管纤维瘤中检测出一个新的融合基因：PTCH1-PLAG1，分析发现该融合基因由位于染色体9q22上的PTCH1基因Exon 1末端与位于8q12上的PLAG1基因Exon 3前端融合形成，属于translocation类型中的splice-site融合位点，其融合位点分别为PTCH1-chr9：98278751和PLAG1-chr8:57083748。
因该融合基因PTCH1-PLAG1为国内外首次发现，申请人进一步设计和优选PTCH1-PLAG1的扩增引物，运用一步法RT-PCR技术在此例软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织中成功扩增到一个101bp的阳性目的片段，通过对PCR产物Sanger测序并使用NCBI数据库进行比对，证实为融合基因PTCH1-PLAG1，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；同时，应用FISH技术也检测到PLAG1基因重排。最后，申请人提供了基于一步法qRT-PCR技术、可对石蜡包埋组织中PTCH1-PLAG1 mRNA绝对定量检测的试剂盒，可操作性及重复性强，灵敏度和特异性较高，有助于AFST的诊断与分子分型。具体分析及实验过程如下：
一、实验材料
1.软组织血管纤维瘤和对照病例组织样本
下述2例软组织血管纤维瘤（AFST）和1例对照病例上皮样血管内皮瘤（EHE）均为福尔马林固定、石蜡包埋组织，其临床病理信息见表2。
表2 软组织血管纤维瘤和对照病例临床病理信息表
Figure 990138DEST_PATH_IMAGE002
2.实验中各种PCR相关引物与探针序列
2.1PTCH1-PLAG1融合基因引物及探针设计
因本申请的PTCH1-PLAG1融合基因是由染色体9q22上的PTCH1基因Exon 1末端与8q12上的PLAG1基因Exon 3前端融合形成，其融合位点分别为PTCH1-chr9:98278751和PLAG1-chr8:57083748。因此，申请者在设计引物时，通过已知的PTCH1基因序列和PLAG1基因序列，设计了PTCH1-PLAG1融合基因的正向和反向引物，其序列见表3，该融合基因的扩增片段大小为101bp。同样，根据PTCH1-PLAG1融合基因序列，设计了该融合基因特异性探针，其序列见表3，用于qRT-PCR对PTCH1-PLAG1融合基因进行定量检测。
表3 实验所用PCR引物和探针序列表
Figure 518200DEST_PATH_IMAGE003
2.2常见融合基因AHRR-NCOA2/NCOA2-AHRR的引物序列
本申请还分别设计和合成了软组织血管纤维瘤中常见融合基因AHRR-NCOA2/NCOA2-AHRR的4对引物，其序列和扩增片段大小均见表3。
2.3 阳性定量参考品的制备
通过SEQ ID No.2和SEQ ID No.3正向引物和反向引物对从软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织中提取的总RNA进行扩增，得到101bp长度的含PTCH1-PLAG1融合基因位点的片段产物，将其导入PESI-T质粒，转入大肠杆菌进行大量培养，提取纯化质粒，测定质粒浓度，计算单位体积的拷贝数，按比例稀释，得到阳性定量质粒参考品系列：1×106 copies/ml、1×105 copies/ml、1×104 copies/ml、1×103 copies/ml和1×102 copies/ml。
3.FISH探针
表4 实验所用的FISH探针
Figure 187079DEST_PATH_IMAGE004
4.其它主要试剂
1）Trizol试剂（Invitrogen）
2）Proteinase K (PK) Solution（Promega）
3）QIAGEN One Step RT-PCR Kit（Qiagen）
4）RNeasy FFPE Kit (Qiagen)
5）TruSeq RNA Exome Kit (Illumina Inc)
6）NCOA2分离探针（安必平）
7）PLAG1分离探针（安必平）
8）胃蛋白酶工作液（安必平）
9）DAPI染色液（安必平）
10）50×EDTA（安必平）
11）2×SSC（安必平）
12）0.1% NP-40/2×SSC（安必平）
二、实验方法与步骤
1. 一步法RT-PCR和qRT-PCR
1.1石蜡包埋肿瘤组织RNA的抽提
新刀连续切取10μm蜡膜10张，置入1.5 ml消毒离心管中；加1.0 ml二甲苯55℃孵育10分钟；13000 rpm/4℃离心2分钟；重复1次；加100％酒精1.0ml室温孵育10分钟，13000rpm/4℃离心2分钟，弃上清；重复1次；加提前配置细胞裂解液250ul后13000 rpm/4℃离心10秒，混匀；加蛋白酶K（Protease K）（20mg/ml）50ul，55℃干式恒温器中过夜（12小时）。
干式恒温器中95℃ 5分钟灭活蛋白酶K，13000 rpm/4℃离心2分钟，弃沉淀，收集上清液至2ml离心管中；加1.0 ml Trizol液（Invitrogen）入离心管中，室温孵育5分钟；加氯仿200 ul后用vortex剧烈混匀15秒，室温孵育5分钟；然后13000 rpm/4℃离心10分钟；移水相至另一2.0 ml离心管中（约700 ul）按1:1体积（即700 ul）加异丙醇，吹打后室温10分钟，–25℃沉淀30分钟；13000 rpm/4℃10分钟，弃上清；加75%酒精1.0ml，上下颠倒离心管数次；离心13000 rpm/4℃ 5分钟，弃上清，干燥；加无酶水50ul溶解RNA (30-60分钟)，Nanodrop测RNA浓度及A260/A280和A260/A230比值并记录。
1.2一步法RT-PCR
样本RNA按照表5配制PCR扩增反应体系及下述反应条件进行PCR扩增，PCR反应条件如表6所示。
表5一步法RT-PCR扩增反应体系
Figure 180443DEST_PATH_IMAGE005
表6 PCR扩增反应条件
Figure 934772DEST_PATH_IMAGE006
1.3一步法qRT-PCR
1.3.1按表7配制qRT-PCR扩增反应体系，混匀，离心；
表7一步法qRT-PCR扩增反应体系
Figure 734101DEST_PATH_IMAGE007
1.3.2将加入反应体系的96孔板放入Light Cycler 480 PCR仪，按如下设置反应条件开始PCR扩增，具体条件如表8；
表8 PCR扩增反应条件
Figure 257486DEST_PATH_IMAGE008
1.3.3 LightCycler 480 PCR仪根据标准品溶液系列浓度1×106、1×105、1×104、l×103、1×102 copies/mL，绘制标准曲线，根据该标准曲线计算出组织样品中PTCH1-PLAG1融合基因的含量（copies/mL）。
2. 二代测序
2例软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织送索真公司分别进行转录组测序和肉瘤panel测序（BSR）。
3. 组织荧光原位杂交（FISH）
3.1制片与脱蜡
3.1.1制片
连续切取3μm白片5张，烤箱中60℃烘烤2小时。
3.1.2脱蜡
将玻片放入室温二甲苯中10分钟，三次；取出玻片，放入100%乙醇中3分钟，三次；取出玻片，室温去离子水中洗一遍。
3.2 切片预处理
将玻片放入1×EDTA工作液中，置于99℃水浴锅中25分钟，取出后冷却至室温，用去离子水冲洗一遍；将玻片放入室温2×SSC中浸泡3分钟，室温晾干；玻片样本区滴加预热（37℃水浴锅中，预热15分钟）的胃蛋白酶消化液200ul，放入杂交仪中37℃孵育7分钟；甩去玻片上多余液体，放入室温2×SSC中，3分钟；取出玻片，分别放入70%、90%、100%乙醇中各1分钟；取出玻片，室温晾干。
3.3变性杂交
从-20℃冰箱中取出NCOA2分离探针及PLAG1分离探针，震荡混匀，离心15s ；玻片样本区分别滴加NCOA2/ PLAG1分离探针10ul，迅速放置盖玻片，轻压使探针液均匀分布；然后用封片胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触部位；将玻片放入杂交仪（Thermo Fisher，美国）中，杂交仪湿度条湿润后插入杂交仪，盖好杂交仪上盖，设置程序：85℃变性5分钟，然后37℃避光杂交过夜16小时。
3.4洗涤和复染
先将2×SSC、0.1%NP-40/2×SSC放入37℃恒温水浴锅中，预热30分钟；关闭杂交仪电源，取出玻片后去除橡皮封胶，移去盖玻片；将玻片放入预热37℃的2×SSC中，10分钟；取出玻片再放入预热37℃的0.1%NP-40/2×SSC中5分钟；取出玻片按顺序分别放入室温70%，90%，100%乙醇中1分钟；取出玻片，暗处晾干；室温下，滴加10ul DAPI染色液于干燥的载玻片上，轻压盖玻片，避免产生气泡，暗处存放，荧光显微镜下观察。
3.5结果判读
3.5.1 PLAG1分离探针检测判读标准
随机计数100个肿瘤细胞核中双色信号。当红、绿两种信号的距离大于信号长度的两倍时，认为是PLAG1分离阳性细胞。
判读标准：若阳性细胞大于15%（15个细胞），则该病例为PLAG1分离阳性。
3.5.2 NCOA2分离探针检测判读标准
随机计数100个癌细胞核中的双色信号。当红、绿两种信号的距离大于信号长度的两倍时，认为是NCOA2分离阳性细胞。
判读标准：若阳性细胞大于15%（15个细胞），则为NCOA2分离阳性。
三、结果
1. 一步法RT-PCR和qRT-PCR检测融合基因的表达
1.1软组织血管纤维瘤中PTCH1-PLAG1等融合基因的表达
选取2例软组织血管纤维瘤（AFST）的石蜡包埋组织，以1例上皮样血管内皮瘤（EHE）为阴性对照，使用PTCH1-PLAG1引物组合物SEQ ID No.2和SEQ ID No.3进行一步法RT-PCR。
凝胶电泳显示，软组织血管纤维瘤（AFST）组织扩增出101bp的PTCH1-PLAG1目的条带，而阴性对照上皮样血管内皮瘤（ET）组织及和空白对照均为阴性（图1 B）。Sanger测序结果与NCBI数据库中的序列一致（图1 C）。
运用一步法RT-PCR技术检测软组织血管纤维瘤中常见融合基因AHRR-NCOA2 /NCOA2-AHRR四种转录体的结果显示（图2中由左至右依次为AHRR(exon9)-NCOA2(exon16)、AHRR(exon10)-NCOA2(exon14)、 NCOA2(exon15)-AHRR(exon10) 、NCOA2(exon13)-AHRR(exon11)转录体的结果），该2例病例及阴性对照中均未检测到AHRR-NCOA2 /NCOA2-AHRR四种转录体表达，该结果也与RNA-Seq高通量测序结果一致（图2）。
1.2qRT-PCR检测AFST中PTCH1-PLAG1 mRNA的表达
本实施例从软组织血管纤维瘤石蜡包埋组织中成功抽提RNA，以上皮样血管内皮瘤作为阴性对照，一步法qRT-PCR检测软组织血管纤维瘤样本中PTCH1-PLAG1 mRNA的表达，本实验标准曲线斜率为-3.893，效率值为1.907（图3）。与标准曲线对比后，PTCH1-PLAG1mRNA的定量结果见表9和图4。
表9 AFST组织中PTCH1-PLAG1 mRNA定量检测结果
Figure 687331DEST_PATH_IMAGE009
2. 二代测序结果
本实施例中2例软组织血管纤维瘤的转录组测序结果分析，未发现目前文献已报道的常见融合基因AHRR-NCOA2 /NCOA2-AHRR四种转录体的存在。
但是，在2例软组织血管纤维瘤的转录组测序结果中发现一个新的融合基因PTCH1-PLAG1，融合位点具体为：PTCH1--chr9:98278751；PLAG1--chr8:57083748，PTCH1基因的末端与PLAG1基因的前端融合，属于translocation类型中的splice-site融合位点。
PLAG1基因exon3断点（chr8: 57083748）碱基序列，能够与PTCH1基因exon1序列匹配（图7）；PTCH1基因exon1断点（chr9: 98278751）碱基序列，能够与PLAG1基因exon3序列匹配（图8）。PTCH1基因Exon1末端与PLAG1基因Exon3前端融合，属于translocation类型中的splice-site融合位点。
通过已知的PTCH1基因的序列和PLAG1基因的序列，以及RNA-Seq预测的断裂结合位点，申请者进一步拼接出了融合基因PTCH1-PLAG1的序列如SEQ ID No.1。
3. FISH检测结果
3.1软组织血管纤维瘤中PLAG1基因重排检测结果
使用PLAG1双色分离探针对AFST样本进行PLAG1基因重排检测，FISH结果显示：计数100个肿瘤细胞，阳性细胞18个，PLAG1基因重排阳性（图5）。该结果与之前融合基因PTCH1-PLAG1的RT-PCR检测结果一致。
3.2软组织血管纤维瘤中NCOA2基因重排检测结果
使用NCOA2双色分离探针对AFST样本进行NCOA2基因重排检测，FISH结果显示，计数100个细胞，阳性细胞0个，NCOA2基因重排阴性（图6）。该结果与之前融合基因AHRR-NCOA2/NCOA2-AHRR的RT-PCR检测结果一致。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京朝阳医院
<120> 软组织血管纤维瘤分子标志物及其检测试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 538
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaaagcctc cggcggccca gcgcgccggg gtttttacac tttccgttcc ttttgtaaag 60
acggaggagg aggagaagaa gaagaagaaa acggaggaga agaaaaagac gacaggggag 120
acaaagagac ccgcagcgac aaggcaaggg ggagacgagg gaagactggg agaagacgga 180
ggagcggagg acgaggaaag gggggccagg gaaaaaaaag gaattgatgt gaaatccaag 240
cccagcgtcc gcgccatcgg cacccgcgct ccgagcaggg gttgacggcc ggctatgatt 300
ggccaaaatg ggaaggattg gattccactc tcttccacga agagtcaatg ggactggcta 360
agatcaaagt ctgaggcttt ttccatcagt aatcagtccc tttttgcttt cttttacgac 420
cacatgaaac ttgagaagca catggctact cattctcctg agaaaaccca caagtgtaat 480
tattgtgaga aaatgtttca ccggaaagat catctgaaga atcacctcca tacacacg 538
<210> 2
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgatgtgaaa tccaagcc 18
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaatccaatc cttcccatt 19
<210> 4
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttggccaatc atagccggcc gtcaa 25

Claims (9)

1.一种软组织血管纤维瘤分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为PTCH1-PLAG1融合基因，所述PTCH1-PLAG1融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的软组织血管纤维瘤分子标志物，其特征在于，所述PTCH1-PLAG1融合基因由位于染色体9q22上的PTCH1基因Exon 1末端与位于染色体8q12上的PLAG1基因Exon 3前端融合而成。
3.根据权利要求1所述的软组织血管纤维瘤分子标志物，其特征在于，PTCH1-PLAG1融合基因的融合位点为PTCH1-chr9和PLAG1-chr8。
4.一种检测人软组织血管纤维瘤的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述PTCH1-PLAG1融合基因的试剂。
5.根据权利要求4所述的检测人软组织血管纤维瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括权利要求1所述PTCH1-PLAG1融合基因的引物组合物。
6.根据权利要求5所述的检测人软组织血管纤维瘤的检测试剂盒，其特征在于，所述引物组合物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No.3所示。
7.根据权利要求4所述的检测人软组织血管纤维瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括权利要求1所述PTCH1-PLAG1融合基因的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.4所示。
8.根据权利要求4所述的检测人软组织血管纤维瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性定量参考品，所述阳性定量参考品为含有PTCH1-PLAG1融合基因接合位点片段的PESI-T质粒。
9.根据权利要求4所述的检测人软组织血管纤维瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照，所述阴性对照为融合基因PTCH1-PLAG1呈阴性的人上皮样血管内皮瘤石蜡包埋组织。
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