CN114573660A - 一种自组装短肽及其诱导局部麻醉药生物矿化制得的长效局部麻醉和镇痛药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自组装短肽及其诱导局部麻醉药生物矿化制得的长效局部麻醉和镇痛药物制剂，属于制药领域。本发明的短肽与局部麻醉药通过π‑π堆积作用结合，在碱性pH调节剂作为助剂的情况下诱导局部麻醉药发生生物矿化，形成均一的微米级别、可以注射的药物结晶。该药物结晶作为一种药物制剂，生物相容性好，能够有效延缓药物的释放速率，延长局部麻醉和镇痛效果，在制备具有长效局部麻醉和长效镇痛作用的药物中具有良好的应用前景。

Description

一种自组装短肽及其诱导局部麻醉药生物矿化制得的长效局 部麻醉和镇痛药物制剂
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种自组装短肽及其诱导局部麻醉药生物矿化制得的长效局部麻醉和镇痛药物制剂。
背景技术
局部麻醉药(简称局麻药)是一类离子通道阻断剂，能够通过阻断神经元细胞膜上的离子通道来抑制神经冲动的传递，从而达到麻醉和镇痛的效果。目前临床上使用的局部麻醉药几乎都是分子量300道尔顿左右的水溶性小分子药物，其扩散、吸收和清除速度快，在体内半衰期短，因此，单次注射局部麻醉药的麻醉镇痛效果一般只有几个小时，不能满足目前临床对长时间手术和术后镇痛的要求。
为了延长局部麻醉药物的持续时间，人们广泛研究了脂质-聚合物纳米颗粒、脂质体和水凝胶/微球复合物等载体材料来实现局部麻醉药物的缓释或控释。总的来说，这些研究大多集中在传统的包埋或嵌入式载药策略上，并没有解决局部麻醉药作为小分子水溶性药物的快速扩散问题，因此对局部麻醉药物镇痛持续时间的延长效果有限。
布比卡因脂质体
Figure BDA0003547894860000011
是目前已获批在临床上使用的长效局部麻醉药物，主要用于术后伤口浸润麻醉。与盐酸布比卡因溶液相比，
Figure BDA0003547894860000012
可显著降低疼痛视觉评分、减少阿片类药物用量、延长术后首次阿片类药物使用时间。但是由于脂质体的固有理化特点，布比卡因的包封率、载药总量有限，所以在较大的外周神经干阻滞中，其作用强度不高。另一个被批准的药物HTX-011，是采用聚原酸酯作为载体包载布比卡因和美洛昔康所得，目前已在美国和欧盟上市。由于局部麻醉的给药方式为神经周围注射给药，因此对材料的组织相容性、生物可降解性、局部刺激性具有很高的要求。但是HTX-011的合成工艺复杂，成本较高，同时其降解产物可能产生局部组织刺激性，限制了其应用。
因此，亟需开发出生物相容性好，合成工艺简单，且能够实现长效局部麻醉和镇痛的药物制剂。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种可诱导局部麻醉药生物矿化的自组装短肽，该自组装短肽与局部麻醉药通过π-π堆积作用结合，在碱性pH调节剂作为助剂的情况下形成微米级晶体，得到了具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物制剂。
本发明的第二个目的在于提供上述短肽在诱导局部麻醉药生物矿化中的用途。
本发明的第三个目的在于提供在碱性pH调节剂作为助剂的情况下，局部麻醉药与上述短肽联合使用在制备具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物中的用途。
本发明的第四个目的在于提供上述具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物制剂及其制备方法。
本发明提供了一种短肽，它的氨基酸序列包括：(A)nB(Q-X)mC(A)n；其中A为不带电荷的氨基酸，n选自1-3的整数；B、C各自独立的选自带正电荷或负电荷的氨基酸且B、C所带电荷相反；(Q-X)m表示Q与X交替排列，与B直接相连的为Q或X，Q和X的总数为m，m选自5-7的整数，Q为谷氨酰胺，X为苯丙氨酸或酪氨酸。
进一步地，所述不带电荷的氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸，带正电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸。
进一步地，所述不带电荷的氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺，带正电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸。
进一步地，它的N端和/或C端带有化学修饰；其中，N端化学修饰为乙酰化，C端化学修饰为酰胺化。
进一步地，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了上述的短肽在诱导局部麻醉药生物矿化中的用途。
进一步地，所述局部麻醉药为含芳香环的局部麻醉药。
进一步地，所述含芳香环的局部麻醉药选自利多卡因或其盐、罗哌卡因或其盐、布比卡因或其盐、左旋布比卡因或其盐、普鲁卡因或其盐、丁卡因或其盐、氯普鲁卡因或其盐、依替卡因或其盐、丙胺卡因或其盐、甲哌卡因或其盐中的一种或两种以上。
本发明还提供了局部麻醉药与上述的短肽联合使用在制备具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物中的用途，其中，所述的联合使用的助剂包含碱性pH调节剂。
进一步地，所述局部麻醉药为含芳香环的局部麻醉药；
所述碱性pH调节剂选自氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、碱性氨基酸中的一种或两种以上。
进一步地，所述含芳香环的局部麻醉药选自利多卡因或其盐、罗哌卡因或其盐、布比卡因或其盐、左旋布比卡因或其盐、普鲁卡因或其盐、丁卡因或其盐、氯普鲁卡因或其盐、依替卡因或其盐、丙胺卡因或其盐、甲哌卡因或其盐中的一种或两种以上。
本发明还提供了一种具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物，它是以上述的短肽、局部麻醉药和助剂为原料制备而成的，所述助剂包含碱性pH调节剂。
进一步地，所述局部麻醉药为含芳香环的局部麻醉药；
所述碱性pH调节剂选自氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、碱性氨基酸中的一种或两种以上。
进一步地，所述含芳香环的局部麻醉药选自利多卡因或其盐、罗哌卡因或其盐、布比卡因或其盐、左旋布比卡因或其盐、普鲁卡因或其盐、丁卡因或其盐、氯普鲁卡因或其盐、依替卡因或其盐、丙胺卡因或其盐、甲哌卡因或其盐中的一种或两种以上。
进一步地，所述局部麻醉药和短肽的摩尔比为(1～32)：1，优选为(10～16)：1。
进一步地，所述药物为均一微米级别的药物结晶。
“均一微米级别”指该药物结晶的粒径尺寸均为微米级别。
进一步地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将短肽、局部麻醉药在水性溶液中混合均匀，得混合体系；
(2)在混合体系中加入碱性pH调节剂，静置，分离出固体，即得。
进一步地，步骤(1)中，所述水性溶液为水或PBS缓冲液；
步骤(2)中，加入碱性pH调节剂后混合体系的pH值为6.0-10.0，优选为7.0-8.5。
本发明还提供了上述药物在制备具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物制剂中的用途。
进一步地，所述药物制剂为固体制剂或液体制剂。
进一步地，所述液体制剂为注射制剂。
与现有技术相比，本发明提供短肽具有以下优势：
(a)本发明的自组装短肽是一类人工合成的、完全由天然L-型氨基酸组成的材料，制备工艺简单，在品质和纯度上可控，具有良好的生物相容性和可降解性。
(b)本发明的自组装短肽是以能够提供疏水作用和苯环间π-π堆积作用的氨基酸作为主要骨架，辅以带有相反电荷、能够提供静电相互作用的氨基酸，能够在水溶液中自组装形成稳定的纳米长纤维或纳米球，且在纤维或纳米球表面带有大量苯环结构，可以与带苯环结构的局部麻醉药物分子通过π-π堆积作用结合，然后在改变pH条件下诱导局部麻醉药发生生物矿化形成均一的微米级别、可以注射的药物结晶。
(c)本发明的自组装短肽同时还是局部麻醉药的药物载体，与现有载体材料相比，其装载局部麻醉药的能力有明显提升。
与现有技术相比，本发明以上述短肽、局部麻醉药和碱性pH调节剂为原料制得的药物制剂具有以下优势：
(i)该药物制剂是一种均一微米级别的药物晶体，具有明显的体外缓释效果，能够有效地延缓局部麻醉药物的释放速率。
(ii)该药物制剂可以直接注射使用，能够明显延长痛觉阻滞时间，表现出明显延长的麻醉和镇痛效果，既可以用于术前、术中或术后疼痛的治疗，也能够满足手术时的长时间局部麻醉需求。
(iii)该药物制剂具有良好的生物相容性和安全性，施用后在实验动物身上不会引起明显的组织及全身毒性反应。
(iv)该药物制剂的制备工艺简单，是一种极具开发前景的药物缓释体系。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为Q6F3，Q4Y5，Q5Y4，Q4F5，Q3F2Y4，Q5F2Y2短肽自组装形成纳米结构的透射电镜结果图。
图2为Q6F3，RH，RH/Q6F3的荧光光谱图。
图3为Q6F3结合罗哌卡因的透射电镜图。
图4为Q4Y5，BH，BH/Q4Y5的荧光光谱图。
图5为Q4Y5结合布比卡因的透射电镜图。
图6为Q5F2Y2，LH，LH/Q5F2Y2的荧光光谱图。
图7为Q5F2Y2结合利多卡因的透射电镜图。
图8为在不同Q6F3浓度下，Q6F3诱导Ropi生成晶体的比例。
图9为Ropi-Q6F3晶体的扫描电镜图。
图10为Bupi-Q4Y5晶体的扫描电镜图。
图11为Lido-Q5F2Y2晶体的扫描电镜图。
图12为Ropi-Q4F5晶体的扫描电镜图。
图13为Ropi-Q6F3晶体的体外药物缓释曲线。
图14为Bupi-Q4Y5晶体的体外药物缓释曲线。
图15为Lido-Q5F2Y2晶体的体外药物缓释曲线。
图16为Ropi-Q6F3药物制剂在大鼠皮下浸润模型中对感觉神经阻滞的效果。
图17为Ropi-Q6F3药物制剂注射后对大鼠的皮下组织损伤的HE染色结果。
图18为Bupi-Q4Y5药物制剂在大鼠皮下浸润模型中对感觉神经阻滞的效果。
图19为Bupi-Q4Y5药物制剂注射后对大鼠的皮下组织损伤的HE染色结果。
图20为Lido-Q5Y4药物制剂在大鼠皮下浸润模型中对感觉神经阻滞的效果。
图21为Lido-Q5Y4药物制剂注射后对大鼠的皮下组织损伤的HE染色结果。
图22为Ropi-Q4F5药物制剂在大鼠坐骨神经阻滞模型中对感觉神经阻滞的效果。
图23为Bupi-Q3F2Y4药物制剂在大鼠坐骨神经阻滞模型中对感觉神经阻滞的效果。
图24为Lido-Q5F2Y2药物制剂在大鼠坐骨神经阻滞模型中对感觉神经阻滞的效果。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
其中，盐酸利多卡因、盐酸罗哌卡因和盐酸布比卡因购买于Sigma-Aldrich公司。利多卡因简写为Lido，罗哌卡因简写为Ropi，布比卡因简写为Bupi。
实施例1：合成本发明的短肽
采用常规多肽固相合成法合成，分别合成以下短肽：Q6F3、Q4Y5、Q5Y4、Q4F5、Q3F2Y4、Q5F2Y2。所得短肽纯度均大于95％。
(1)SEQ ID NO.1：
Ac-Gln-Gln-Lys-Phe-Gln-Phe-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln-NH2，缩写为Q6F3。
(2)SEQ ID NO.2：
Ac-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Gln-Tyr-Gln-Tyr-Glu-Gln-Tyr-NH2，缩写为Q4Y5。
(3)SEQ ID NO.3：
Ac-Gln-Tyr-Glu-Gln-Tyr-Gln-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Gln-NH2，缩写为Q5Y4。
(4)SEQ ID NO.4：
Ac-Gln-Phe-Glu-Phe-Gln-Phe-Gln-Phe-Arg-Phe-Gln-NH2，缩写为Q4F5。
(5)SEQ ID NO.5：
Ac-Tyr-Lys-Phe-Gln-Tyr-Gln-Tyr-Gln-Phe-Glu-Tyr-NH2，缩写为Q3F2Y4。
(6)SEQ ID NO.6：
Ac-Gln-Asp-Tyr-Gln-Phe-Gln-Phe-Gln-Tyr-Lys-Gln-NH2，缩写为Q5F2Y2。
实施例2：制备本发明的Ropi-Q6F3药物制剂
(1)Q6F3母液配置：将Q6F3溶解于水中配制成2mM的Q6F3母液，超声5min(超声功率100W)。
(2)罗哌卡因母液配置：将盐酸罗哌卡因粉末溶解于水中配制20mM的罗哌卡因母液。
(3)将5mL Q6F3母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将5mL的罗哌卡因母液用移液器逐滴加入Q6F3母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到Ropi-Q6F3混合物。
(4)取Ropi-Q6F3混合物，用1M NaOH调pH至7.0，静置1h出现可见的结晶沉淀，再于12000rpm下离心5min，分离上清和沉淀，所得沉淀即Ropi-Q6F3药物制剂。
实施例3：制备本发明的Bupi-Q4Y5药物制剂
(1)Q4Y5母液配置：将Q4Y5溶解于水中配制成3mM的Q4Y5母液，超声5min(超声功率100W)。
(2)布比卡因母液配置：将盐酸布比卡因粉末溶解于水中配制30mM的布比卡因母液。
(3)将5mL Q4Y5母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将5mL的布比卡因母液用移液器逐滴加入Q4Y5母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到Bupi-Q4Y5混合物。
(4)取Bupi-Q4Y5混合物，用1M NaOH调pH至7.4，静置1h出现可见的结晶沉淀，再于12000rpm下离心5min，分离上清和沉淀，所得沉淀即Bupi-Q4Y5药物制剂。
实施例4：制备本发明的Lido-Q5Y4药物制剂
(1)Q5Y4母液配置：将Q5Y4溶解于水中配制成5mM的Q5Y4母液，超声5min(超声功率100W)。
(2)利多卡因母液配置：将盐酸利多卡因粉末溶解于水中配制80mM的利多卡因母液。
(3)将5mLQ5Y4母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将5mL的利多卡因母液用移液器逐滴加入Q5Y4母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到Lido-Q5Y4混合物。
(4)取Lido-Q5Y4混合物，用1M NaOH调pH至7.0，静置1h出现可见的结晶沉淀，再于12000rpm下离心5min，分离上清和沉淀，所得沉淀即Lido-Q5Y4药物制剂。
实施例5：制备本发明的Ropi-Q4F5药物制剂
参照实施例2的方法，区别仅在于将Q6F3替换为Q4F5，制得Ropi-Q4F5药物制剂。
实施例6：制备本发明的Bupi-Q3F2Y4药物制剂
参照实施例3的方法，区别仅在于将Q4Y5替换为Q3F2Y4，制得Bupi-Q3F2Y4药物制剂。
实施例7：制备本发明的Lido-Q5F2Y2药物制剂
参照实施例4的方法，区别仅在于将Q5Y4替换为Q5F2Y2，制得Lido-Q5F2Y2药物制剂。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1：短肽自组装纳米结构的制备和观察
1、实验方法
(1)取Q6F3溶解于水中配制成2mM的溶液。
(2)取Q4Y5溶解于水中配制成2mM的溶液。
(3)取Q5Y4溶解于水中配制成2mM的溶液。
(4)取Q4F5溶解于水中配制成2mM的溶液。
(5)取Q3F2Y4溶解于水中配制成2mM的溶液。
(6)取Q5F2Y2溶解于水中配制成2mM的溶液。
将上述短肽溶液分别取10μL置于400目铜网，沉淀样品2-5min，然后用滤纸片吸干短肽溶液；再用10μL染色液(2％磷钨酸)染色2min。最终用滤纸吸干染色液并晾干。采用透射电镜观察铜网并成像。
2、实验结果
结果如图1所示，可以看出上述短肽自组装后分别形成了纳米纤维或纳米球。
上述结果说明本发明设计的短肽均能自组装形成纳米纤维或纳米球。
实验例2：短肽纳米纤维和局部麻醉药物的相互作用研究
(一)Q6F3短肽纳米纤维和罗哌卡因相互作用
Q6F3母液配置：将Q6F3溶解于水中，超声处理5min(超声功率100W)，配制成2mM的Q6F3母液。
罗哌卡因母液配置：将盐酸罗哌卡因(简称RH)粉末溶解于水中配制成20mM的罗哌卡因母液。
将5mL Q6F3母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将5mL的罗哌卡因母液用移液器逐滴加入Q6F3母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到RH/Q6F3混合物。
采用Horiba scientific公司的Fluorolog荧光光谱仪在450nm激发光下分别测定Q6F3、RH、RH/Q6F3的460-600nm的荧光光谱。结果如图2所示，可以看出RH的最大吸收波峰在530nm，但混合Q6F3后的RH/Q6F3的最大吸收波峰蓝移到了482nm。参照文献(J.Mol.Biol.1991,218,837-846.)，说明RH和Q6F3之间发生了π-π相互作用，即RH分子上的苯环和Q6F3上苯丙氨酸的苯环之间形成了π-π堆叠，使短肽纤维和罗哌卡因通过π-π相互作用而结合。
另外通过高分辨率透射电子显微镜观察形态特征。将5mL Q6F3母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将罗哌卡因母液用移液器逐滴加入Q6F3母液中，控制Ropi与Q6F3摩尔比为10:1，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到受试样品溶液。将10μL受试样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干；再加入10μL染色溶液(2％的磷钨酸)染色3min；最终用滤纸吸干染色溶液并晾干。采用透射电镜成像。结果如图3所示，可以看出Q6F3纳米纤维结合罗哌卡因后倾向于聚集成束，成为后续结晶的基础。
上述实验结果表明：Q6F3和罗哌卡因能够通过π-π相互作用而结合。
(二)Q4Y5短肽纳米纤维和布比卡因相互作用
Q4Y5母液配置：将Q4Y5溶解于水中，超声处理5min(超声功率100W)，配制成3mM的Q4Y5母液。
布比卡因母液配置：将盐酸布比卡因(简称BH)粉末溶解于水中配制成30mM的布比卡因母液。
将5mL Q4Y5母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将5mL的布比卡因母液用移液器逐滴加入Q4Y5母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到BH/Q4Y5混合物。
采用Horiba scientific公司的Fluorolog荧光光谱仪在450nm激发光下分别测定Q4Y5、BH、BH/Q4Y5的460-600nm的荧光光谱。结果如图4所示，可以看出BH的最大吸收波峰在530nm，但混合Q4Y5后的BH/Q4Y5的最大吸收波峰蓝移到了482nm。参照文献(J.Mol.Biol.1991,218,837-846.)，说明BH和Q4Y5之间发生了π-π相互作用，即BH分子上的苯环和Q4Y5上苯丙氨酸的苯环之间形成π-π堆叠，使短肽纤维和布比卡因通过π-π相互作用而结合。
另外通过高分辨率透射电子显微镜观察形态特征。将5mL Q4Y5母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将布比卡因母液用移液器逐滴加入Q4Y5母液中，控制Bupi与Q4Y5摩尔比为10:1，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到受试样品溶液。将10μL受试样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干；再加入10μL染色溶液(2％的磷钨酸)染色3min；最终用滤纸吸干染色溶液并晾干。采用透射电镜成像。结果如图5所示，可以看出Q4Y5纳米纤维结合布比卡因后倾向于聚集成束，成为后续结晶的基础。
上述实验结果表明：Q4Y5和布比卡因能够通过π-π相互作用而结合。
(三)Q5F2Y2短肽纳米球和利多卡因相互作用
Q5F2Y2母液配置：将Q5F2Y2溶解于水中，超声处理5min(超声功率100W)，配制成4mM的Q5F2Y2母液。
利多卡因母液配置：将盐酸利多卡因(简称LH)粉末溶解于水中配制成40mM的利多卡因母液。
将5mL Q5F2Y2母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将5mL的利多卡因母液用移液器逐滴加入Q5F2Y2母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到LH/Q5F2Y2混合物。
采用Horiba scientific公司的Fluorolog荧光光谱仪在450nm激发光下分别测定Q5F2Y2、LH、LH/Q5F2Y2的460-600nm的荧光光谱。结果如图6所示，可以看出LH的最大吸收波峰在530nm，但混合Q5F2Y2后的LH/Q5F2Y2的最大吸收波峰蓝移到了482nm。参照文献(J.Mol.Biol.1991,218,837-846.)，说明LH和Q5F2Y2之间发生了π-π相互作用，即LH分子上的苯环和Q5F2Y2上苯丙氨酸的苯环之间形成π-π堆叠，使短肽和利多卡因通过π-π相互作用而结合。
另外通过高分辨率透射电子显微镜观察形态特征。将5mL Q5F2Y2母液于室温下磁力搅拌(2000rpm/min)，将5mL的利多卡因母液用移液器逐滴加入Q5F2Y2母液中，控制Lido与Q5F2Y2摩尔比为10:1，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min(超声功率100W)，得到受试样品溶液。将10μL受试样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干；再加入10μL染色溶液(2％的磷钨酸)染色3min；最终用滤纸吸干染色溶液并晾干。采用透射电镜成像。结果如图7所示，可以看出利多卡因附着、聚集于Q5F2Y2纳米球上形成晶核，成为后续结晶的基础。
上述实验结果表明：Q5F2Y2和利多卡因能够通过π-π相互作用而结合。
以上的实验结果表明，本发明的短肽能够和局部麻醉药通过π-π相互作用而结合。
实验例3：短肽诱导局部麻醉药物发生生物矿化形成结晶
(一)Q6F3短肽诱导罗哌卡因发生生物矿化而结晶
1、实验方法
在盐酸罗哌卡因溶液中分别加入等体积的不同浓度的Q6F3，使罗哌卡因终浓度为10mM并且Q6F3终浓度分别为0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,16mM，用1MNaOH调pH至6.8，静置2h以上至出现可见的结晶沉淀，再于12000rpm离心5min，分离上清和沉淀，将所得沉淀命名为Ropi-Q6F3晶体。
用HPLC法测定上清中游离药物罗哌卡因的含量，计算Ropi-Q6F3晶体中的罗哌卡因含量，比较不同Q6F3/Ropi比例下晶体中的罗哌卡因占罗哌卡因总量的比例。
HPLC色谱条件：采用Agilent 1200高效液相色谱仪和Agilent Extend C18column柱(4.6×150mm,5μm)，流动相A(10mM碳酸氢铵)，流动相B(乙腈)，流速1mL/min，柱温30度，采用比例为42.5：57.5的等度洗脱，检测214nm峰。罗哌卡因在2.2min时出峰。
将上述Q6F3/Ropi比例为1：10时获得的沉淀取少量置于载玻片，自然干燥后用Cressington sputter coater 108喷金仪进行喷金处理，并用EVO 10型扫描电子显微镜进行扫描电镜(SEM)观察结晶形态。
2、实验结果
从图8可以看出，随着Q6F3的加入量提高，罗哌卡因的结晶比例也随之增加，证明Q6F3短肽具有诱导罗哌卡因结晶的能力。
从图9可以看出，Q6F3能够诱导罗哌卡因发生生物矿化，形成颗粒状纳米晶体。
(二)Q4Y5短肽诱导布比卡因发生生物矿化而结晶
1、实验方法
Q4Y5母液配置：将Q4Y5溶解于水中配制成4mM的Q4Y5母液，超声5min。
布比卡因母液配置：将盐酸布比卡因溶解于水中配制20mM的布比卡因母液。
将Q4Y5母液与布比卡因母液按体积比1:1混合(此时Bupi/Q4Y5的摩尔比为5：1)，然后用1M NaOH调pH至7.0，静置2h以上至出现可见的结晶沉淀，再于12000rpm离心5min，分离上清和沉淀，将所得沉淀命名为Bupi-Q4Y5晶体。
然后参照上述方法，用扫描电镜观察Bupi-Q4Y5晶体的形态。
2、实验结果
从图10可以看出，Q4Y5能够诱导Bupi发生生物矿化，形成针状微米晶体。
(三)Q5F2Y2短肽诱导利多卡因发生生物矿化而结晶
Q5F2Y2母液配置：将Q5F2Y2溶解于水中配制成4mM的Q5F2Y2母液，超声5min。
布比卡因母液配置：将盐酸布比卡因溶解于水中配制40mM的利多卡因母液。
将Q5F2Y2母液与利多卡因母液按体积比10:1混合(此时Lido/Q5F2Y2的摩尔比为10：1)，然后用1M NaOH调pH至8.0，静置2h以上至出现可见的结晶沉淀，再于12000rpm离心5min，分离上清和沉淀，将所得沉淀命名为Lido-Q5F2Y2晶体。
然后参照上述方法，用扫描电镜观察Lido-Q5F2Y2晶体的形态。
从图11可以看出，Q5F2Y2能够诱导Lido发生生物矿化，形成针状微米晶体。
(四)Q4F5短肽诱导罗哌卡因发生生物矿化而结晶
Q4F5母液配置：将Q4F5溶解于水中配制成4mM的Q4F5母液，超声5min。
罗哌卡因母液配置：将盐酸罗哌卡因溶解于水中配制2mM的罗哌卡因母液。
将Q4F5母液与罗哌卡因母液按体积比2:1混合(此时Ropi/Q4F5的摩尔比为1：4)，然后用1MNaOH调pH至7.4，静置2h以上至出现可见的结晶沉淀，再于12000rpm离心5min，分离上清和沉淀，将所得沉淀命名为Ropi-Q4F5晶体。
然后参照上述方法，用扫描电镜观察Ropi-Q4F5晶体的形态。
从图12可以看出，Q4F5能够诱导Ropi发生生物矿化，形成颗粒状纳米晶体。
实验例2-实验例3的结果说明，本发明的短肽能够通过π-π相互作用与局麻药结合，并诱导局麻药发生生物矿化形成结晶。
实验例4：本发明晶体的体外释放测试
(一)Ropi-Q6F3晶体中药物的体外释放
1、实验方法
将实验例3中获得的Ropi-Q6F3晶体加入PBS溶液(pH为7.4)中，使所得体系中罗哌卡因的含量为0.75％(7.5mg/mL)，作为实验样。
另取盐酸罗哌卡因粉末加入PBS溶液中，使所得游离罗哌卡因体系中罗哌卡因的含量为0.75％(7.5mg/mL)，作为对照样。
将上述两种样品各1mL加入Float-A-Lyzer G2即用型透析管(100KD分子量，2mL)中，在PBS溶液(pH为7.4，37℃)中进行体外释放检测，于不同时间点取上清测定其中的罗哌卡因含量。含量测定方法按照实验例3中的HPLC法。
2、实验结果
结果如图13所示，可以看出与游离的罗哌卡因相比，Ropi-Q6F3晶体有明显的体外缓释效果。
(二)Bupi-Q4Y5晶体中药物的体外释放
1、实验方法
将实验例3中获得的Bupi-Q4Y5晶体加入PBS溶液(pH为7.4)中，使所得体系中布比卡因的含量为0.75％(7.5mg/mL)，作为实验样。
另取盐酸布比卡因粉末加入PBS溶液中，使所得游离布比卡因体系中布比卡因的含量为0.75％(7.5mg/mL)，作为对照样。
将上述两种样品各1mL加入Float-A-Lyzer G2即用型透析管(100KD分子量，2mL)中，在PBS溶液(pH为7.4，37℃)中进行体外释放检测，于不同时间点取上清测定其中的布比卡因含量。含量测定方法按照实验例3中的HPLC法。
2、实验结果
结果如图14所示，可以看出与游离的布比卡因相比，Bupi-Q4Y5晶体有明显的体外缓释效果。
(三)Lido-Q5F2Y2晶体中药物的体外释放
1、实验方法
将实验例3中获得的Lido-Q5F2Y2晶体加入PBS溶液(pH为7.4)中，使所得体系中利多卡因的含量为2％(20mg/mL)，作为实验样。
另取盐酸利多卡因粉末加入PBS溶液中，使所得游离利多卡因体系中利多卡因的含量为2％(20mg/mL)，作为对照样。
将上述两种样品各1mL加入Float-A-Lyzer G2即用型透析管(100KD分子量，2mL)中，在PBS溶液(pH为7.4，37℃)中进行体外释放检测，于不同时间点取上清测定其中的利多卡因含量。含量测定方法按照实验例3中的HPLC法。
2、实验结果
结果如图15所示，可以看出与游离的利多卡因相比，Lido-Q5F2Y2晶体有明显的体外缓释效果。
上述实验结果表明，与游离的局部麻醉药物相比，以本发明短肽诱导局部麻醉药物发生生物矿化结晶后得到的晶体具有明显更优的体外缓释效果。为了进一步评价本发明局麻药-短肽药物制剂的体内镇痛效果和安全性，进行了以下实验。
实验例5：Ropi-Q6F3药物制剂的镇痛效果和安全性
1、实验方法
将SD大鼠(体重180-220g，6-8周大)分成2组，每组6只，一组皮下注射0.5mL实施例2中制得的Ropi-Q6F3药物制剂的PBS溶液(含0.75％罗哌卡因)，另一组注射0.5mL游离罗哌卡因的PBS溶液(用PBS溶解盐酸罗哌卡因，含0.75％罗哌卡因)。注射后在隆起的皮丘划圈，并于注射后不同时间在圈内不同位置用30G的针头戳六次，以大鼠有反应的次数比上六次的百分比作为感觉神经阻滞的分数记录。并且在14天对药物制剂组注射部位皮下组织进行HE染色并进行评分，考察Ropi-Q6F3药物制剂对组织是否造成损伤。
2、实验结果
表1.病理评分表
炎症反应级别 0 1 2 3 4
大鼠数量(只) 4 2 0 0 0
说明：0级代表无炎症；1级代表轻微炎症、轻度充血和水肿；2级代表轻度炎症、关节面糜烂、充血水肿及少量中性粒细胞；3级代表中度炎症、中性粒细胞和巨噬细胞、滑膜细胞增生；4级代表严重炎症、中性粒细胞和巨噬细胞、滑膜细胞增生和纤维蛋白渗出。
根据图16可以看出，在大鼠皮下浸润模型中，相比于游离罗哌卡因仅能持续8h的作用时间，Ropi-Q6F3药物制剂的作用持续时间为48h，能够明显延长痛觉阻滞时间。
根据图17的代表性组织HE染色结果图和表1(病理评分表)可以看出，Ropi-Q6F3药物制剂对大鼠的皮下组织没有明显的损伤。
(二)Bupi-Q4Y5药物载体制剂的镇痛效果和安全性
1、实验方法
将SD大鼠(体重180-220g，6-8周大)分成2组，每组6只，一组皮下注射0.5mL实施例3中制得的Bupi-Q4Y5药物制剂的PBS溶液(含0.75％布比卡因)，另一组注射0.5mL游离布比卡因的PBS溶液(用PBS溶解盐酸布比卡因，含0.75％布比卡因)。注射后在隆起的皮丘划圈，并于注射后不同时间在圈内不同位置用30G的针头戳六次，以大鼠有反应的次数比上六次的百分比作为感觉神经阻滞的分数记录。并且在14天对药物制剂组注射部位皮下组织进行HE染色并进行评分，考察Bupi-Q4Y5药物制剂对组织是否造成损伤。
2、实验结果
表2.病理评分表
炎症反应级别 0 1 2 3 4
大鼠数量(只) 5 1 0 0 0
说明：0级代表无炎症；1级代表轻微炎症、轻度充血和水肿；2级代表轻度炎症、关节面糜烂、充血水肿及少量中性粒细胞；3级代表中度炎症、中性粒细胞和巨噬细胞、滑膜细胞增生；4级代表严重炎症、中性粒细胞和巨噬细胞、滑膜细胞增生和纤维蛋白渗出。
根据图18可以看出，相比于游离布比卡因仅能持续8h的作用时间，Bupi-Q4Y5制剂的作用持续时间为32h，能够明显延长痛觉阻滞时间。
根据图19的代表性组织HE染色结果图和表2(病理评分表)可以看出，Bupi-Q4Y5药物制剂对大鼠的皮下组织没有明显的损伤。
(三)Lido-Q5Y4药物制剂的镇痛效果和安全性
1、实验方法
将SD大鼠(体重180-220g，6-8周大)分成2组，每组6只，一组皮下注射0.5mL实施例4中制得的Lido-Q5Y4药物制剂的PBS溶液(含2％利多卡因)，另一组注射0.5mL游离利多卡因的PBS溶液(用PBS溶解盐酸利多卡因，含2％利多卡因)。注射后在隆起的皮丘划圈，并于注射后不同时间在圈内不同位置用30G的针头戳六次，以大鼠有反应的次数比上六次的百分比作为感觉神经阻滞的分数记录。并且在14天对药物制剂组注射部位皮下组织进行HE染色并进行评分，考察Lido-Q5Y4药物制剂对组织是否造成损伤。
2、实验结果
表3.病理评分表
炎症反应级别 0 1 2 3 4
大鼠数量(只) 6 0 0 0 0
说明：0级代表无炎症；1级代表轻微炎症、轻度充血和水肿；2级代表轻度炎症、关节面糜烂、充血水肿及少量中性粒细胞；3级代表中度炎症、中性粒细胞和巨噬细胞、滑膜细胞增生；4级代表严重炎症、中性粒细胞和巨噬细胞、滑膜细胞增生和纤维蛋白渗出。
根据图20可以看出，相比于游离利多卡因仅能持续4h的作用时间，Lido-Q5Y4药物制剂的作用持续时间为16h，能够明显延长痛觉阻滞时间。
根据图21的代表性组织HE染色结果图和表3(病理评分表)可以看出，Lido-Q5Y4药物制剂对大鼠的皮下组织没有明显的损伤。
(四)Ropi-Q4F5药物载体制剂的镇痛效果
1、实验方法
基础痛阈的测定：将SD大鼠(体重230-250g)实验室条件下饲养一周测定基础痛阈。将大鼠的1只后爪置于55℃热板痛觉测试仪上，记录大鼠受试后爪从放置热板即刻至回缩的时间(Paw withdrawal latency)。每只后爪测定3次，间隔5min，取3次测定结果的平均值作为基础痛阈。基础痛阈长于6s的大鼠排除本研究。
动物分组及给药：基础痛阈值合格的大鼠随机分成2组，每组6只，一组部位注射0.2mL实施例5中制得的Ropi-Q4F5药物制剂的PBS溶液(含0.75％罗哌卡因)，另一组注射0.2mL游离罗哌卡因的PBS溶液(用PBS溶解盐酸罗哌卡因，含0.75％罗哌卡因)。给药方法：异氟烷麻醉大鼠后，在右大转子和坐骨结节之间连线的靠近大转子的外1/3处，用27号针朝前内侧方向针尾抬高45°进针，直至针尖抵达坐骨后给药。
热痛阈的测定：分别于给药后不同时间测定给药侧后爪的热痛阈，大于6s的记录为6s。热痛阈的测定方法同基础痛阈的测定。
2、实验结果
根据图22可以看出，相比于游离罗哌卡因仅能持续6h的作用时间，Ropi-Q4F5制剂的作用持续时间为48h，能够明显延长痛觉阻滞时间。
(五)Bupi-Q3F2Y4药物载体制剂的镇痛效果
1、实验方法
基础痛阈的测定：将SD大鼠(体重230-250g)实验室条件下饲养一周测定基础痛阈。将大鼠的1只后爪置于55℃热板痛觉测试仪上，记录大鼠受试后爪从放置热板即刻至回缩的时间(Paw withdrawal latency)。每只后爪测定3次，间隔5min，取3次测定结果的平均值作为基础痛阈。基础痛阈长于6s的大鼠排除本研究。
动物分组及给药：基础痛阈值合格的大鼠随机分成2组，每组6只，一组部位注射0.2mL实施例6中制得的Bupi-Q3F2Y4药物制剂的PBS溶液(含0.75％布比卡因)，另一组注射0.2mL游离布比卡因的PBS溶液(用PBS溶解盐酸布比卡因，含0.75％布比卡因)。给药方法：异氟烷麻醉大鼠后，在右大转子和坐骨结节之间连线的靠近大转子的外1/3处，用27号针朝前内侧方向针尾抬高45°进针，直至针尖抵达坐骨后给药。
热痛阈的测定：分别于给药后不同时间测定给药侧后爪的热痛阈，大于6s的记录为6s。热痛阈的测定方法同基础痛阈的测定。
2、实验结果
根据图23可以看出，相比于游离布比卡因仅能持续6h的作用时间，Bupi-Q3F2Y4制剂的作用持续时间为48h，能够明显延长痛觉阻滞时间。
(六)Lido-Q5F2Y2药物载体制剂的镇痛效果
1、实验方法
基础痛阈的测定：将SD大鼠(体重230-250g)实验室条件下饲养一周测定基础痛阈。将大鼠的1只后爪置于55℃热板痛觉测试仪上，记录大鼠受试后爪从放置热板即刻至回缩的时间(Paw withdrawal latency)。每只后爪测定3次，间隔5min，取3次测定结果的平均值作为基础痛阈。基础痛阈长于6s的大鼠排除本研究。
动物分组及给药：基础痛阈值合格的大鼠随机分成2组，每组6只，一组部位注射0.2mL实施例7中制得的Lido-Q5F2Y2药物制剂的PBS溶液(含2％利多卡因)，另一组注射0.2mL游离利多卡因的PBS溶液(用PBS溶解盐酸利多卡因，含2％利多卡因)。给药方法：异氟烷麻醉大鼠后，在右大转子和坐骨结节之间连线的靠近大转子的外1/3处，用27号针朝前内侧方向针尾抬高45°进针，直至针尖抵达坐骨后给药。
热痛阈的测定：分别于给药后不同时间测定给药侧后爪的热痛阈，大于6s的记录为6s。热痛阈的测定方法同基础痛阈的测定。
2、实验结果
根据图24可以看出，相比于游离利多卡因仅能持续4h的作用时间，Lido-Q5F2Y2制剂的作用持续时间为24h，能够明显延长痛觉阻滞时间。
以上实验结果说明，与游离局麻药相比，本发明制得的局麻药-短肽药物制剂能够有效缓释局部麻醉药，明显延长痛觉阻滞时间，起到长效局部麻醉和镇痛的效果。
综上，本发明提供了一种自组装短肽及其诱导局部麻醉药生物矿化制得的长效局部麻醉和镇痛药物制剂。本发明的短肽与局部麻醉药通过π-π堆积作用结合，在碱性pH调节剂作为助剂的情况下诱导局部麻醉药发生生物矿化，形成均一的微米级别、可以注射的药物结晶。该药物结晶作为一种药物制剂，生物相容性好，能够有效延缓药物的释放速率，延长局部麻醉和镇痛效果，在制备具有长效局部麻醉和长效镇痛作用的药物中具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种自组装短肽及其诱导局部麻醉药生物矿化制得的长效局部麻醉和镇痛药
物制剂
<130> GYKH1533-2022P0114777CC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ac-Gln Gln Lys Phe Gln Phe Gln Phe Glu Gln Gln-NH2
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ac-Tyr Gln Lys Tyr Gln Tyr Gln Tyr Glu Gln Tyr-NH2
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ac-Gln Tyr Glu Gln Tyr Gln Tyr Gln Lys Tyr Gln-NH2
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ac-Gln Phe Glu Phe Gln Phe Gln Phe Arg Phe Gln-NH2
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ac-Tyr Lys Phe Gln Tyr Gln Tyr Gln Phe Glu Tyr-NH2
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ac-Gln Asp Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Tyr Lys Gln-NH2
1 5 10

Claims (21)

1.一种短肽，其特征在于：它的氨基酸序列包括：(A)nB(Q-X)mC(A)n；其中A为不带电荷的氨基酸，n选自1-3的整数；B、C各自独立的选自带正电荷或负电荷的氨基酸且B、C所带电荷相反；(Q-X)m表示Q与X交替排列，与B直接相连的为Q或X，Q和X的总数为m，m选自5-7的整数，Q为谷氨酰胺，X为苯丙氨酸或酪氨酸。
2.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于：所述不带电荷的氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸，带正电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的短肽，其特征在于：所述不带电荷的氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺，带正电荷的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸。
4.根据权利要求1-3任一项所述的短肽，其特征在于：它的N端和/或C端带有化学修饰；其中，N端化学修饰为乙酰化，C端化学修饰为酰胺化。
5.根据权利要求4所述的短肽，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
6.权利要求1-5任一项所述的短肽在诱导局部麻醉药生物矿化中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述局部麻醉药为含芳香环的局部麻醉药。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述含芳香环的局部麻醉药选自利多卡因或其盐、罗哌卡因或其盐、布比卡因或其盐、左旋布比卡因或其盐、普鲁卡因或其盐、丁卡因或其盐、氯普鲁卡因或其盐、依替卡因或其盐、丙胺卡因或其盐、甲哌卡因或其盐中的一种或两种以上。
9.局部麻醉药与权利要求1-5任一项所述的短肽联合使用在制备具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物中的用途，其中，所述的联合使用的助剂包含碱性pH调节剂。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述局部麻醉药为含芳香环的局部麻醉药；
所述碱性pH调节剂选自氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、碱性氨基酸中的一种或两种以上。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述含芳香环的局部麻醉药选自利多卡因或其盐、罗哌卡因或其盐、布比卡因或其盐、左旋布比卡因或其盐、普鲁卡因或其盐、丁卡因或其盐、氯普鲁卡因或其盐、依替卡因或其盐、丙胺卡因或其盐、甲哌卡因或其盐中的一种或两种以上。
12.一种具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物，其特征在于：它是以权利要求1-5任一项所述的短肽、局部麻醉药和助剂为原料制备而成的，所述助剂包含碱性pH调节剂。
13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于：所述局部麻醉药为含芳香环的局部麻醉药；
所述碱性pH调节剂选自氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、碱性氨基酸中的一种或两种以上。
14.根据权利要求13所述的药物，其特征在于：所述含芳香环的局部麻醉药选自利多卡因或其盐、罗哌卡因或其盐、布比卡因或其盐、左旋布比卡因或其盐、普鲁卡因或其盐、丁卡因或其盐、氯普鲁卡因或其盐、依替卡因或其盐、丙胺卡因或其盐、甲哌卡因或其盐中的一种或两种以上。
15.根据权利要求12-14任一项所述的药物，其特征在于：所述局部麻醉药和短肽的摩尔比为(1～32)：1，优选为(10～16)：1。
16.根据权利要求12-15任一项所述的药物，其特征在于：所述药物为均一微米级别的药物结晶。
17.权利要求12-16任一项所述药物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)将短肽、局部麻醉药在水性溶液中混合均匀，得混合体系；
(2)在混合体系中加入碱性pH调节剂，静置，分离出固体，即得。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述水性溶液为水或PBS缓冲液；
步骤(2)中，加入碱性pH调节剂后混合体系的pH值为6.0-10.0，优选为7.0-8.5。
19.权利要求12-16任一项所述药物在制备具有长效局部麻醉或/和长效镇痛作用的药物制剂中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于：所述药物制剂为固体制剂或液体制剂。
21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于：所述液体制剂为注射制剂。
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