CN114540537B - 与海雀稗耐黑痣病性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

与海雀稗耐黑痣病性状相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物技术领域，公开了一种与海雀稗耐黑痣病性状相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其中，SEQ ID NO.1所示序列的第401bp处存在G/T突变。本发明通过172份海雀稗种质的重测序数据，结合12个月海雀稗田间黑痣病发病情况作为质量性状进行全基因组关联分析，定位筛选出与耐黑痣病相关的分子标记，该分子标记对海雀稗耐黑痣病的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，快速预测或鉴定其黑痣病的抗性，可有效筛选得到强耐黑痣病的海雀稗品种，加速海雀稗育种进程。

Description

与海雀稗耐黑痣病性状相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与海雀稗耐黑痣病性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
海雀稗(Paspalum vaginatum Sw.)又称海滨雀稗或夏威夷草，是被子植物门单子叶植物纲禾本科黍族雀稗属的多年生草本植物，主要分布于热带和亚热带的海滨地区，有长势发达的匍匐茎和根茎，叶片线形或狭披针形，其形成的草坪均一致密、色泽墨绿，是绿地草坪和运动场草坪的优良草种。2017年底，在以1m×1m地块活体种植并保存于海南大学儋州校区海雀稗种质资源圃的海雀稗发生了黑痣病大爆发，在叶片的上面和叶背出现小的圆形、卵形、或长形黑斑，其外有黄色晕圈。叶片衰老时，黑斑周围仍保持绿色，黑斑稍隆起，有光泽，大小约1.5～11mm×0.3～1.0mm，资源圃海雀稗样本中有将近80％发病，经鉴定该病害致病病原菌是黑痣菌属的一个小种。
黑痣病广泛分布于各地，可寄生在大多数草坪草种上，病株叶片上下表面出现小的、黑色、环形至卵圆形的痣状病斑。病斑周围有褪绿的晕圈，但随着病斑的增大，这些晕圈通常会消失。发病严重的草坪呈现黄绿斑驳或亮黄色景象。当叶片衰老时，病斑周围组织往往仍会保持绿色，其保绿时间比健康组织还要长，呈绿岛状。黑痣病病原菌是以假子座中的子囊壳越冬，春季形成子囊孢子释放，侵染新生叶片。筛选高抗黑痣病的海雀稗品种，可以减少草坪用药，提高草坪美观有重要的意义。
全基因组关联分析(Genome wide association study，GWAS)是以连锁不平衡(LD)为基础，对多个个体在全基因组范围的遗传变异(标记)多态性进行检测，获得基因型，进而将表型数据与基因型数据进行群体水平的统计分析。以SNP(single nucleotideploymorphism)单核苷酸多态性为分子遗传标记，进行全基因组水平上的相关性分析，成为研究复杂农艺性状遗传变异的一种新策略。与传统的连锁分析(linkage analysis)相比，GWAS具有分辨率高、变异位点丰富、时间快的特点。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种与海雀稗耐黑痣病性状相关的SNP分子标记，用于图位克隆和分子标记辅助选择，实现强耐黑痣病性状的海雀稗品种的有效筛选，加速海雀稗育种进程。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种与海雀稗耐黑痣病性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第401位碱基为SNP位点，所述SNP位点存在G/T突变，所述SNP位点位于海雀稗基因组第010号染色体第24998738位核苷酸，故将该分子标记命名为Pv.chr10:p24998738。
所述SNP分子标记具体通过以下步骤获得：
a)利用收集来自国内外存在遗传性差异的179份海雀稗构成关联群体；
b)采用CTAB方法提取关联群体的每份材料的叶片总DNA，然后用对群体的DNA进行重测序鉴定群体SNP基因型信息；
c)通过对SNP数据质量过滤筛选高质量群体SNP数据集；
d)连续1年监控179份海雀稗材料的黑痣病抗性表型数据；
f)结合基因型和黑痣病抗性表型数据，进行全基因组关联分析，鉴定耐黑痣病性状显著相关的QTL位点，得到上述与海雀稗耐黑痣病性状相关的SNP分子标记。
本发明第二方面提供了一种用于扩增所述SNP分子标记的引物。
优选地，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明第三方面提供了一种鉴定海雀稗黑痣病抗性的方法，包括以下步骤：
S1.提取待测海雀稗材料的基因组DNA；
S2.以S1提取得到的基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.1所示SNP分子标记的特异性引物进行PCR扩增后测序；或者直接以基因组DNA进行重测序，以确定待测海雀稗材料的基因型。
S3.对所述基因型进行分析，具体为：当待测海雀稗的SNP位点的碱基类型为GG时，该海雀稗为强耐黑痣病性品种；当待测海雀稗的SNP位点的碱基类型为GT时，该海雀稗为中等耐黑痣病性品种；当待测海雀稗的SNP位点的碱基类型为TT时，该海雀稗为不耐黑痣病性品种。即所述待测海雀稗材料耐黑痣病能力大小与其SNP位点碱基类型的关系为GG﹥GT﹥TT。
优选地，步骤S2所述扩增的反应体系为：共10μL，50ng/μL模板DNA 1μL，2×PCRMaster Mix 5μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，ddH2O余量。
本发明第四方面提供了一种用于海雀稗黑痣病抗性检测的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增所述SNP分子标记的引物。优选地，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明第五方面提供了所述SNP分子标记在海雀稗抗黑痣病分子标记辅助育种中的应用。
本发明的有益效果：
通过179份海雀稗种质的重测序数据，结合海雀稗黑痣病抗性的表型数据进行全基因组关联分析，首次定位得到了海雀稗中影响耐黑痣病性状的QTL位点，并开发了相应的SNP分子标记，研究发现其中位于第10号染色体的第24998738bp位置处的SNP分子标记Pv.chr10:p24998738对海雀稗耐黑痣病性状的贡献率高，在12个月海雀稗黑痣病累计发病性状的数据贡献率达到38.19％，即所述SNP分子标记对海雀稗耐黑痣病性状的调控起着关键作用。
基于该SNP分子标记设计引物，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，从而有效筛选得到耐黑痣病性状的海雀稗品种，检测方便快速，不受环境影响，育种效率高，加速了海雀稗育种进程，克服了传统育种方法测定特定实验，所需操作限制多，时间周期长，不确定因素多等缺陷，适于大规模推广应用。
附图说明
图1为实施例1中179种海雀稗在1年内黑痣病发病统计结果示意图；
图2为实施例2中海雀稗耐黑痣病性状SNP分子标记Pv.chr10:p24998738不同基因型对应的黑痣病在连续12个月中累计抗性性状表型的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1海雀稗黑痣病抗性性状的主效QTL位点定位
(1)海雀稗黑痣病耐性的表型测定
本实施例中所用海雀稗种质共179份海雀稗，分别来自海南(54份)、广西(23份)、广东(11份)、美国(69份)、及其他国家(22份)，具体种质名称和来源见表1。以1m×1m的地块成坪种植，活体保存于海雀稗种质资源圃，按照草坪养护标准定时灌溉、施肥、修剪、除杂草，在2018年1月到2018年12月，连续12个月每个月15号记录179份海雀稗黑痣病的发病情况，有黑痣病病症记录为1，没有则记录为0，12个月海雀稗黑痣病发病统计情况见图1。
表1海雀稗种质资源信息表
Figure BDA0003577834110000051
Figure BDA0003577834110000061
Figure BDA0003577834110000071
(2)海雀稗群体重测序
在种质资源圃取样，每个种质取约2g的嫩叶，用液氮速冻后送往迈维代谢公司进行测序，测序策略为Illumina PE150。对测序下机数据(raw data)进行质控，过滤标准如下：(1)过滤含有接头的序列；(2)过滤单端序列中N含量超过10％的一对序列；(3)过滤低质量(Q≤5)碱基数超过50％的一对序列。过滤接头序列、不准确序列、低质量序列后得到clean data，进行下一步序列比对。对SeaIsle2000参考基因组构建索引文件后，使用BWA软件将clean data比对到参考基因组；使用SAMtools软件将比对结果排序；使用PicardTools软件对文库制备过程中产生的重复标记进行处理；使用GATK软件分析群体变异信息。使用VCFtools软件对SNP进一步筛选过滤，命令为“vcftools--vcf[vcf_file]--max-missing 0.8--maf 0.05--mac 3--minQ 30--minDP 3--min-alleles 2--max-alleles2--recode--recode-INFO-all--out[out_prefix]”。
(3)全基因组关联分析
使用plink软件将vcf文件进行格式转换；使用EMMAX软件生成Balding-Nichols亲缘关系矩阵，命令为“emmax-kin-intel64-v-d 10-o[out_prefix][tped_prefix]”；进行关联分析的命令为“emmax-intel64-v-d 10-t[tped_prefix]-p[pheno_file]-k[kin_file]-o[out_prefix]”。关联分析结果得到海雀稗每个位点的P值，当P值小于0.05/4805768＝1.04E-09的SNP即为显著SNP，选择至少重复在六个月的耐黑痣病表型数据全基因组关联分析结果中且P值最小的SNP作为为峰值SNP，将峰值SNP在群体中的不同等位基因类型将材料进行分组，结合12个月黑痣病发病累计性状数据，进行方差分析，组间方差与总方差的比值的百分比，即为该峰值SNP的贡献率。
通过分析，将海雀稗耐黑痣病的主效QTL位点的区间限定在海雀稗的chr10染色体的第24998728位碱基至第25731892位碱基之间，对应的SNP为chr10_24998728(C/G)，chr10_25731892(T/C)，峰值SNP为chr10:p24998738(A/G)，该QTL对海雀稗整体发病次数指标的贡献率为38.19％(根据峰值SNP的不同等位基因类型将材料分组，进行单因素方差分析，组间方差除以总方差的百分比即为贡献率)。
实施例2海雀稗黑痣病抗性SNP分子标记开发
根据上述鉴定到的海雀稗黑痣病抗性QTL和峰值SNP开发SNP分子标记，提取该SNP前后各400bp序列作为SNP分子标记Pv.chr10:p24998738的特征序列(如SEQ ID NO.1所示，其中第401bp即为SNP位点，存在G/T突变)，对该SNP分子标记Pv.chr10:p24998738设计引物如下：
正向引物：5’-GTTCATGTGAGACCAATGC-3’如SEQ ID NO.2所示；
反向引物：5’-CCACTTCAACTCGGTATGT-3’如SEQ ID NO.3所示。
通过常规PCR扩增和测序检测，SNP分子标记的碱基分为三种类型，当Pv.chr10:p24998738碱基类型为GG时，海雀稗在12个月的平均发病月数为2.24个月，即为海雀稗抗性较强的品种；当碱基类型为GT时，海雀稗在12个月的平均发病月数为5.25个月，即为海雀稗抗性中等的品种；当碱基类型为TT时，海雀稗在12个月的平均发病月数为9.75个月，即为海雀稗抗性较弱的品种。
不同基因型对应的海雀稗12个月发病月数如图2所示。结果表明，SNP分子标记Pv.chr10:p24998738的不同基因型类型对应的海雀稗黑痣病抗性性状具有显著差异。因此，可通过鉴定该SNP分子标记的类型对待检测海雀稗黑痣病抗性的高低进行快速简单评估，以快速筛选得到高抗黑痣病的海雀稗材料。
除使用上述引物扩增序列外，还可将材料进行基因组重测序，按照实施例1中的方法对通过本发明公布的SNP分子标记Pv.chr10:p24998738进行SNP基因型分型，确定SNP的基因型类型，以快速预测材料黑痣病的抗性。
综上，本发明所述的SNP分子标记Pv.chr10:p24998738对海雀稗黑痣病累计发病月数的贡献率最高，重复在7个月的黑痣病发病性状中都显著关联，其对海雀稗黑痣病抗性高低具有关键调控作用，并且基于该SNP分子标记可预测或筛选鉴定海雀稗黑痣病的抗性，鉴定方法简单，选择效率高，选择目标明确，不受环境的影响，可用作图位克隆和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。
实施例3SNP分子标记在海雀稗黑痣病抗性性状鉴定的应用
对前期已知的黑痣病抗性较差的18HN-101、18HN-104、18HN-102三个材料提取幼嫩叶片DNA送测序公司进行基因组重测序，分别鉴定三个材料的SNP基因型，根据实施例1的方法鉴定三个材料在资源圃连续12个月的累计发病月数。
同时，对前期已知的黑痣病抗性中等的18HN-76、17HN-33、17HN-22三个材料提取幼嫩叶片DNA送测序公司进行基因组重测序，分别鉴定三个材料的SNP基因型，根据实施例1的方法鉴定三个材料在资源圃连续12个月的累计发病月数。
同时，对前期已知的黑痣病抗性较强的材料HH、HI101、TYB 2三个材料提取幼嫩叶片DNA送测序公司进行基因组重测序，分别鉴定两个材料的SNP基因型，并根据实施例1的方法鉴定三个材料在资源圃连续12个月的累计发病月数。
上述三组的检测结果如表2所示：
表2不同材料Pv.chr10:p24998738位点基因型及黑痣病抗性鉴定
Figure BDA0003577834110000101
Figure BDA0003577834110000111
结果表明：①对前期已知的黑痣病抗性较差的的材料18HN-101、18HN-104、18HN-102三个材料，在chr10染色体的24998738bp位置(即SEQ ID NO.1所示序列的第401bp处)的SNP基因型都为TT，累计发病月数别为12、12、12个月，与实施例2中SNP分子标记的TT基因型对应黑痣病累计发病状况基本一致；②对前期已知的黑痣病抗性中等的18HN-76、17HN-33、17HN-22三个材料，在chr10染色体的24998738bp位置(即SEQ ID NO.1所示序列的第401bp处)的SNP基因型都为GT，累计发病月数别为3、5、4个月，与实施例2中SNP分子标记的GT基因型对应黑痣病累计发病状况基本一致；③对前期已知的黑痣病抗性较强的材料HH、HI101、TYB 2三个材料在chr10染色体的24998738bp位置(即SEQ ID NO.1所示序列的第401bp处)的SNP基因型都为GG，累计发病月数别为0、1、0个月，与实施例2中SNP分子标记的GG基因型对应黑痣病累计发病状况基本一致。
综上，根据SNP分子标记Pv.chr10:p24998738的基因型类型可以在有效地鉴定不同海雀稗材料黑痣病抗性的高低。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003577834110000121
Figure BDA0003577834110000131
序列表
<110> 海南大学
<120> 与海雀稗耐黑痣病性状相关的SNP分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctatttgt agccaaaacc acttgaaaag ttttatacca actttgttca aaatttcaag 60
atctataatt ttctcaattg gagcctagca tgaaaatgat tgtagaccat agaaaaagtg 120
ggatttctaa agatttcaga ttttaactgt gtttgtatgc tgacagaaaa atccccaaat 180
cccctagcaa acctttgtgc atgtcaaagc cctagttacc aaagttgttc ctcatgagat 240
caaatacaag ttttttacaa aaagttccac ctaaaactca ataggattaa agttatactc 300
acattcatag tgtcattcat gcaaaatctg agtgcaacac ttagctattt ctatcaagct 360
tgttcatgtg agaccaatgc acaacaacat gagatgaaat gatgcttatg agatgtcatt 420
aatctaatga tgctcatgaa atgcatctga gatgcctagg gcatcacaac ccacccccct 480
taaagatatc tcgtcccgag atttttgatg tgatgtgggt ggttaagtcg actaaaggta 540
gtgctacgtg taggtattaa gtttagatct tgaaattgaa ctattgtaac ataccgagtt 600
gaagtggatg gtagaatact cctcctattc ccaagttgcc tcttctttgg agtgattact 660
ccattgaact ttataaaagt tgattgtttt tcggcgtatt gatctttgct tttggtcgag 720
gacttttata gggtgctctt cgtatgtgag atctggttca atctgaattt gggacatgtc 780
taccactttc tctggcactc t 801
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttcatgtga gaccaatgc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccacttcaac tcggtatgt 19

Claims (9)

1.一种与海雀稗耐黑痣病性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第401位碱基为SNP位点，所述SNP位点为G或T。
2.可识别权利要求1所述SNP分子标记的分子探针。
3.一种用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，且SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第401位碱基为SNP位点，所述SNP位点为G或T。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
5.一种鉴定海雀稗黑痣病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取待测海雀稗材料的基因组DNA；
S2.以S1提取得到的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述SNP分子标记的特异性引物进行PCR扩增后测序，或者直接以基因组DNA进行重测序，以获得包含SEQ ID NO.1所示序列的目标片段，并确定待测海雀稗材料在SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第401位的碱基类型为GG、GT或TT。
6.根据权利要求5所述鉴定海雀稗黑痣病抗性的方法，其特征在于，所述待测海雀稗材料耐黑痣病能力大小与其SNP位点碱基类型的关系为GG﹥GT﹥TT。
7.根据权利要求5所述鉴定海雀稗黑痣病抗性的方法，其特征在于，步骤S2所述扩增的反应体系为：共10μL，50ng/μL模板DNA 1μL，2×PCR Master Mix 5μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，ddH2O余量。
8.一种用于海雀稗黑痣病抗性检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述引物。
9.权利要求1所述SNP分子标记在海雀稗抗黑痣病分子标记辅助育种中的应用。
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