CN114540390B - 基于全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子半定量检测方法 - Google Patents

基于全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子半定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子半定量检测方法，属于环境生物技术领域。该方法操作便利、耗时短、成本低、可视性好、易于定量。利用SRRz裂解基因作为报告元件，响应迅速，菌液在接触重金属2h内光密度明显下降。利用SRRz裂解基因作为报告元件，导致微生物菌体裂解，所得结果与Cd(II)离子浓度相关性较高，检测结果可实现裸眼判断，也可通过可见光分光光度计检测。利用X‑gal对释放到细胞外的β‑半乳糖苷酶进行检测，操作简便。该方法安全性好、无需添加试剂、不受色素干扰、耗时短成本低，具有特异性，易于实现高通量筛查，便于推广；可为重金属污染的日常检测和高通量筛查提供技术支持。

Description

基于全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子半定量检 测方法
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，特别涉及一种基于全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子(二价镉离子)半定量检测方法。
背景技术
随着人们环保意识的不断增强，对水体污染也越来越重视，尤其是重金属元素对水体的污染。它们不能被生物降解，相反却有在生物体内有积累的倾向，造成慢性中毒。因此，对其进行测定对于人类健康和环境保护都具有重要意义。重金属离子的检测主要有两个发展方向。一种是基于仪器的分析化学方法，如气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)、原子吸收光谱(AAS)，X射线荧光光谱法(XRF)等，然而基于仪器的分析需要非常昂贵的设备、训练有素的操作员和耗时的样品制备，几乎不可能实时应用这些方法进行现场分析，并且无法反映重金属的生物利用度。另一种方法涉及生物或理化传感器。基于化学的金属传感器使用螯合配体作为传感设备，通过测量光谱变化(例如荧光)来检测金属螯合物的结合，然而由于配体结构不可溶，其应用范围有限。而生物传感器使用生物识别元件(如抗体、抗原、核酸、酶等)提供定量分析信息，被称为检测环境和城市污染的有力工具之一。
生物传感器中有三个基本成分：生物识别元件、报告元件和信号处理系统。在目标化合物存在的情况下，识别元件刺激启动子，进而引发报告基因的转录翻译并产生可量化的信号。虽然从细菌(lux)和萤火虫(luc)产生的荧光酶基因在生物传感器的研究中已被开发，但需要ATP和底物的存在，才能实现生物发光。来自水母的绿色荧光蛋白(GFP)在不添加任何外源基质的情况下产生荧光，但由于荧光蛋白表达响应时间长和背景信号较高，需要用紫外分光光度计判断浓度，仪器昂贵、操作繁琐，其实用性在细菌生物传感器中受到了阻碍。
本发明所述基于微生物全细胞生物传感器的检测方法，能够解决传统常规检测方法存在的前处理周期长、成本高昂、无法快速现场检测、对操作人员专业度要求高等缺陷的问题，以低廉的人力设备成本等达到现场快速准确检测重金属离子的要求。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器。
本发明的另一目的在于提供上述检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的构建方法。
本发明的另一目的在于提供上述检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的应用。
本发明的再一目的在于提供一种基于全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子半定量检测方法。该方法操作便利、耗时短、成本低、可视性好、易于定量。
在原核生物中，当环境中存在重金属时，重金属识别蛋白(重金属感应转录因子)感知它们的存在并驱动重金属抗性基因的表达，如金属敏感转录因子ArsR/SmtB家族的CadA(Cd)。报告基因是在转录因子(激活因子和/或抑制因子)的控制下从调控DNA区域(启动子和操纵子)表达的。一个报告基因被融合到镉转运体基因的启动子上，该启动子由CadA转录激活因子调控。当镉离子进入细胞时，报告基因的启动子被激活，报告基因表达。
大肠杆菌λ噬菌体的SRRz裂解基因簇是导致大肠杆菌裂解是大噬菌体裂解基因的典型代表，由穿孔素基因S、噬菌体溶菌酶(转糖苷酶)基因R和基因Rz三个基因组成，其中R基因的产物是一种可溶于水的转糖基酶(transglycosylase)，可分解细胞壁的肽聚糖。Rz基因的产物可能是一种肽链内切酶(endopeptidase)，它可以切割肽聚糖的寡糖之间和或者肽聚糖与细胞壁外膜之间的交联。R和Rz基因产物的功能是降解细胞壁，而S基因产物的作用是改变细胞质膜的通透性，在细胞质膜上形成多孔的结构，以使R和Rz基因产生的酶可以穿过细胞质膜，到达细胞壁，从而作用于细胞壁，使细胞壁破碎，释放胞内物质。
大肠杆菌的lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，其能催化5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactoside，X-gal)水解，产物显蓝色，反应很容易被目视观察和检测。
本发明以镉离子特异性识别基因CadA操纵子为识别元件，以λ噬菌体裂解基因SRRz作为报告基因，以大肠杆菌Escherichia coli BL21作为底盘细胞，构建检测重金属镉离子的全细胞生物传感器，确立检测方法。由样品中的Cd(II)离子诱导大肠杆菌裂解，通过测定菌体密度(OD600)检测待测样品的重金属离子。在全细胞生物传感器构建成功的基础上，通过测量大肠杆菌内源表达的β-半乳糖苷酶结果裂解释放到胞外的酶活，使不同浓度Cd(II)之间的检测结果差异更加明显。最终形成简单、成本低廉的重金属检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，该全细胞生物传感器是将重金属离子诱导的基因表达系统转化大肠杆菌中构建得到的；
所述的重金属离子诱导的基因表达系统中自5′到3′端依次连接大肠杆菌终止子、含有双向启动子的重金属离子响应元件、噬菌体裂解基因、大肠杆菌终止子；
所述的含有双向启动子的重金属离子响应元件可为任意含有双向启动子序列的重金属离子响应元件；优选为含有双向启动子序列的镉(Cd2+)响应蛋白(SEQ ID No.1)。
所述的噬菌体裂解基因，可为任意一种噬菌体裂解基因，优选为λ噬菌体的裂解基因SRRz，具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
所述的大肠杆菌终止子可为任意一种大肠杆菌终止子，优选为强终止子TrrnB，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述的重金属离子诱导的基因表达系统所用的出发载体可为任意一种大肠杆菌载体，优选pSB1C3，pBluescript，pUC18，pUC19，pET系列等克隆表达载体。更优选为以pSB1C3为出发载体，构建的大肠杆菌裂解载体为pSB1C3-MCd。
所述的大肠杆菌优选为E.coli BL21。
一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的构建方法，具体包括如下步骤：以pSB1C3为出发载体：
(1)合成特异性识别Cd(II)的CadA操纵子DNA序列，包括Cd(II)响应蛋白和双向启动子序列，见SEQ ID No.1，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、响应蛋白反向互补编码基因、双向启动子、SpeI、NotI和PstI；
(2)合成λ噬菌体裂解基因SRRz，其序列见SEQ ID No.2，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、SRRz裂解基因、SpeI、NotI和PstI；
(3)合成强终止子TrrnB，其序列见SEQ ID No.3，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、TrrnB终止子、SpeI、NotI和PstI；
(4)将特异性识别Cd(II)的CadA操纵子DNA序列SEQ ID No.1用XbaI和PstI进行双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQ ID No.3用EcoRI和SpeI进行双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI进行双酶切，三者经连接酶连接成环形成pSB1C3-TrrnB-CadA，其中TrrnB-CadA的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；
(5)将含有SRRz裂解基因的序列SEQ ID No.2用EcoRI和SpeI进行双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQ ID No.3用XbaI和PstI进行双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI进行双酶切，三者经连接酶连接成环形成pSB1C3-SRRz-TrrnB，其中SRRz-TrrnB的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；
(6)质粒pSB1C3-TrrnB-CadA采用SpeI和PstI进行双酶切，质粒pSB1C3-SRRz-TrrnB采用XbaI和PstI进行双酶切，目的片段纯化后连接获得镉离子响应载体，命名为pSB1C3-MCd；
(7)将步骤(6)所得的载体转入到E.coli BL21感受态细胞，获得重金属检测用的重组大肠杆菌，即全细胞生物传感器。
所述的检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器在快速检测水溶性样品中重金属离子中的应用。
所述的全细胞生物传感器可在15～40℃、pH4～9条件下于1～3h完成样品中重金属的专一性检测。
所述的重金属离子优选为镉(Cd2+)。
所述的全细胞生物传感器可在15～40℃、pH4～9条件下于1～3h完成对样品中0～10-5mol/L无机二价镉离子的专一性检测。
通过分光光度计或酶标仪定量测定或肉眼观察菌液光密度，即可对待测水样中的重金属离子(无机二价镉离子)含量进行定量或定性检查。
一种基于全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子半定量检测方法，包括如下步骤：将全细胞生物传感器(重组大肠杆菌)与重金属离子孵育，大肠杆菌细胞裂解并释放β-半乳糖苷酶；表现为大肠杆菌菌液光密度显著下降，既可通过分光光度计或酶标仪定量检测，也可肉眼观察可见，实现对待测样品是否含有重金属离子的定量或定性检测。光密度检测方案见如下方案一：
方案一：用分光光度计或酶标仪测定标准重金属样品细胞裂解液光密度并计算细胞死亡率，绘制细胞死亡率标准曲线；测定待测样品细胞裂解液光密度并计算细胞死亡率，通过标准曲线对其中重金属离子浓度进行半定量分析，计算出离子浓度。
通过检测释放到生物传感器细胞外的β-半乳糖苷酶酶活，即可对待测样品所含的重金属离子(无机二价镉离子)含量进行定量检测。酶活检测方案见如下方案二：
方案二：将裂解液与底物X-gal孵育，对反应体系拍照转变为灰度照片，把白色与黑色之间按对数关系分成若干级，范围从0到255，白色为255，黑色为0；建立重金属离子浓度与显色灰度值之间的关系，绘制显色标准曲线；对待测样品中重金属离子浓度进行半定量分析，计算出离子浓度。
具体包括如下步骤：
方案一：细胞死亡率法检测重金属离子
(A)制备大肠杆菌检测液；
(B)将大肠杆菌检测液与不同浓度梯度的重金属离子标准样品混合，同时以添加同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作对照；样品均在35～37℃，200～220rpm条件下继续培养1～2h；用分光光度计或酶标仪测定细胞液光密度并计算细胞死亡率，建立细胞死亡率与重金属离子浓度的关系，绘制细胞死亡率标准曲线；
(C)将待测样品与大肠杆菌检测液混合，在35～37℃，200～220rpm条件下继续培1～2h；用分光光度计或酶标仪测定细胞液光密度并计算细胞死亡率；根据步骤(B)的标准曲线，计算得出待测样品中重金属离子的浓度。
方案二：显色法半定量检测重金属离子
(a)制备大肠杆菌检测液；
(b)在Z buffer中加入X-gal溶液至终浓度为1g/L，混匀后加入到96孔板中，备用；
(c)将大肠杆菌检测液与不同浓度梯度的重金属离子标准样品混合，同时以添加同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作对照；样品均在35～37℃，200～220rpm条件下继续培养1～2h；取培养液上清液加入到含有显色底物的小孔中，35～37℃孵育30～35min；对反应体系拍照转变为灰度照片，把白色与黑色之间按对数关系分成若干级，范围从0到255，白色为255，黑色为0；建立重金属离子浓度与显色灰度值之间的关系，绘制显色标准曲线；
(d)将待测样品与大肠杆菌检测液混合，在35～37℃，200～220rpm条件下继续培养1～2h；取培养液上清液加入到含有显色底物的小孔中，35～37℃孵育30～35min；对显色样品拍照转变为灰度照片，获得显色灰度值；根据步骤(c)的显色标准曲线，计算得出待测样品中重金属离子的浓度。
优选的，方案一，步骤(B)中所述的细胞死亡率计算公式如下：
细胞死亡率＝(OD600(溶剂)-OD600(重金属))/OD600(溶剂)
其中，OD600(溶剂)和OD600(重金属)分别为添加待测重金属溶剂和重金属溶液时菌液某一时刻在600nm波长的光密度。
优选的，方案一，步骤(B)中所述的标准曲线如下：
Y＝89.75/(1+10^((-6.06-logx)*353240))，R2＝0.9931(0<X≤10-5mol/L)
其中，X表示重金属离子浓度(mol/L)，Y表示细胞死亡率(％)，R2为拟合曲线的相关系数。
优选的，方案二，步骤(b)中所述的Z buffer：以50mL计，在50mL 1×PBS缓冲溶液中添加0.12g MgSO4和45μLβ-巯基乙醇。
优选的，方案二，步骤(c)中所述的显色标准曲线如下：
Y＝-1011X2–4*106X+194.6，R2＝0.9740(0<X≤10-5mol/L)
其中，X表示重金属离子浓度(mol/L)，Y表示显色灰度值，R2为拟合曲线的相关系数。
所述的大肠杆菌检测液的制备方法，包括如下步骤：
(Ⅰ)将重组大肠杆菌接种到LB固体培养基培养，使其复苏活化；
(Ⅱ)挑取单菌落接入到LB液体培养基震荡培养过夜；
(Ⅲ)以1：50～100体积比转接到新鲜的LB液体培养基中并加入IPTG，培养至菌液OD600约为0.5～0.7，得到大肠杆菌检测液。
优选的，步骤(Ⅰ)中所述的培养的条件为35～37℃条件下培养14～15h。
优选的，步骤(Ⅱ)中所述的震荡培养过夜的条件为在35～37℃、200～220rpm条件下培养12～16h。
优选的，步骤(Ⅲ)中所述的培养的条件为在35～37℃，200～220rpm条件下培养。
优选的，所述的菌液OD600为0.6。
优选的，所述的IPTG的浓度为0.01mmol/L。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)操作对象为大肠杆菌，无致病风险，操作简单易行。
(2)利用SRRz裂解基因作为报告元件，响应迅速，菌液在接触重金属2h内光密度明显下降。
(3)利用SRRz裂解基因作为报告元件，导致微生物菌体裂解，所得结果与Cd(II)离子浓度相关性较高，检测结果可实现裸眼判断，也可通过常见的可见光分光光度计检测。
(4)利用X-gal对释放到细胞外的β-半乳糖苷酶进行检测，操作简便。应用无需使用到昂贵的仪器，大大减小了检测的成本，实现水样快速检测，并且使现场检测成为可能。
(5)本发明的全细胞生物传感器与待测样品接触，SRRz基因响应导致细胞2h内快速裂解，检测菌液OD600或细胞裂解液中β-半乳糖苷酶酶活即可判断样品是否含有重金属离子。检测结果可以通过两种方式显示：一种是用分光光度计甚至肉眼检测到的细胞光密度改变；另一种是通过细胞裂解释放的β-半乳糖苷酶催化显色反应。
(6)该方法安全性好、无需添加试剂、不受色素干扰、耗时短成本低，具有特异性，易于实现高通量筛查，便于推广；可为重金属污染的日常检测和高通量筛查提供技术支持。
附图说明
图1是Cd(II)离子响应载体的构建示意图。
图2是不同Cd(II)浓度下全细胞生物传感器菌液的浑浊程度。
图3是添加Cd(II)样品后孵育2h时的细胞死亡率与Cd(II)浓度间的拟合曲线。
图4是细胞裂解上清液催化X-gal显色结果。
图5是细胞裂解释放的酶催化显色与Cd(II)浓度的关系曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1重金属离子响应重组菌的获得
以pSB1C3为出发载体(iGEM，http://parts.igem.org/Part:pSB1C3)，构建重金属响应载体。重金属响应载体构建示意图如图1所示。具体构建方法如下：
1、合成特异性识别Cd(II)的CadA操纵子DNA序列，包括Cd(II)响应蛋白和双向启动子(SEQ ID No.1)，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、响应蛋白反向互补编码基因、双向启动子、SpeI、NotI和PstI。
2、合成裂解基因SRRz，其序列见SEQ ID No.2，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、SRRz裂解基因、SpeI、NotI和PstI。
3、合成终止子TrrnB，其序列见SEQ ID No.3，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、TrrnB终止子、SpeI、NotI和PstI。
4、将特异性识别Cd(II)的CadA操纵子DNA序列SEQ ID No.1用XbaI和PstI双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQ ID No.3用EcoRI和SpeI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在T4连接酶作用下环化形成pSB1C3-TrrnB-CadA，其中TrrnB-CadA的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的。
5、将含有SRRz裂解基因的序列SEQ ID No.2用EcoRI和SpeI双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQ ID No.3用XbaI和PstI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在T4连接酶作用下环化形成pSB1C3-SRRz-TrrnB，其中SRRz-TrrnB的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的。
6、质粒pSB1C3-TrrnB-CadA采用SpeI和PstI双酶切，质粒pSB1C3-SRRz-TrrnB采用XbaI和PstI双酶切，目的片段纯化后连接获得Cd(II)响应载体，命名为pSB1C3-MCd。
7、将步骤6所得的载体按常规方法转入到E.coli BL21感受态细胞，获得重金属检测用的重组大肠杆菌，即全细胞生物传感器，记为E.coli BL21-MCd。
实施例2菌体裂解效率快速检测样品重金属离子浓度
1、重组大肠杆菌的复苏活化
将重组大肠杆菌从-80℃冰箱中划线于LB平板培养基中，在37℃条件下恢复培养15h。从平板上挑取Cd(II)检测基因生物传感器E.coli BL21-MCd的单菌落，然后将其接种到含有终浓度为25μg/L的氯霉素的5mL液体LB培养基中，37℃，220rpm，过夜培养15h以上。
2、大肠杆菌检测液制备
将复苏活化的菌液按照1：50(体积比)转接至新鲜LB液体培养基，加入IPTG诱导剂，使其终浓度为0.01mmol/L。摇床培养(37℃，220rpm)至OD600吸光值约为0.6，得到大肠杆菌检测液。
3、与受试样品接触
将锥形瓶内的大肠杆菌检测液转移到96微孔板内，加入198μL大肠杆菌检测液和2μL的不同浓度Cd(II)重金属离子溶液，设置重金属离子终浓度为浓度梯度，每组设置3个孔作为重复。其中一组加入2μL的重金属样品纯溶剂作为空白对照。
4、绘制计量效应标准曲线
将96微孔板放置摇床中培养(37℃，220rpm)2h，用酶标仪测定OD600，计算细胞死亡率并拟合计量效应标准曲线。
实验结果表明，当测试菌与含有不同重金属离子浓度的样品接触时，测试菌发生菌体裂解，菌液光密度下降，裂解程度即细胞死亡率与离子浓度有相关，如图2所示。
其中，细胞死亡率计算公式如下：
细胞死亡率＝(OD600(溶剂)-OD600(重金属))/OD600(溶剂)
其中，OD600(溶剂)和OD600(重金属)分别为添加待测重金属溶剂和重金属溶液时菌液某一时刻在600nm波长的光密度。
根据检测图，相应重金属离子的检测标准曲线(即细胞死亡率标准曲线)如图3所示。
Y＝89.75/(1+10^((-6.06-logx)*353240))，R2＝0.9931(0<X≤10-5mol/L)
其中，X表示重金属离子浓度(mol/L)，Y表示细胞死亡率(％)，R2为拟合曲线的相关系数。
5、样品检测
按实施例2步骤1～3将测试菌活化、培养并与待测试样品接触，摇床培养(37℃，220rpm)2h。用酶标仪测定OD600，计算细胞死亡率，根据上述步骤4的计量效应标准曲线，计算得出待测试样品中对应的重金属离子浓度。
实施例3结合显色法的重金属离子半定量快速检测
1、显色体系制备
在Z buffer中加入40mg/mL的X-gal溶液至终浓度为1mg/mL，混匀后加入到96孔板中，备用。
2、显色标准曲线绘制
按实施例2步骤1～3将测试菌活化、培养并与待测试样品接触。
将96孔板中的菌液转移到离心管中，在8000g条件下离心3min，取上清液。按表1配制β-半乳糖苷酶催化显色检测体系。
表1显色检测体系配制
试剂 体积(μL)
X-gal(40mg/mL) 6
菌液上清液 30
Z buffer 204
其中，Z buffer配制方法：在50mL 1×PBS缓冲溶液中添加0.12g MgSO4和45μLβ-巯基乙醇。X-gal溶液配置方法：1mL N,N-二甲基甲酰胺中添加0.04g X-gal。
摇床培养2h后取菌液上清液加入到含有显色底物X-gal的小孔中，37℃孵育30min。不同金属离子浓度，底物经酶催化会呈现不同深浅的蓝色(图4)。
利用相机对凝胶拍照转变为灰度照片，把白色与黑色之间按对数关系分成若干级，范围从0到255，白色为255，黑色为0。建立金属离子浓度与显色灰度值之间的关系(图5)，绘制显色标准曲线；拟合曲线相关系数达到R2＝0.9740。
根据图5，显色标准曲线如下：
Y＝-1011X2–4*106X+194.6，R2＝0.9740(0<X≤10-5mol/L)
其中，X表示重金属离子浓度(mol/L)，Y表示显色灰度值，R2为拟合曲线的相关系数。
3、重金属离子样品检测
按实施例2步骤1～3将测试菌活化、培养并与待测试样品接触。摇床培养2h后，取30μL菌液上清液加入到含有显色底物的小孔中，37℃孵育30min。扫描小孔拍照，根据显色标准曲线，计算得出待测试样品中对应的重金属离子浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 基于全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子半定量检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CadA操纵子DNA序列
<220>
<222> (1)..(22)
<223> 对应的酶切位点依次为EcoRI、NotI、XbaI
<220>
<222> (23)..(466)
<223> Cd(II)响应蛋白编码基因的反向互补序列
<220>
<222> (467)..(549)
<223> 双向启动子序列
<220>
<222> (550)..(570)
<223> 对应的酶切位点依次为SpeI、NotI和PstI
<400> 1
gaattcgcgg ccgcttctag agttagtggc cgtggctacg gccaacgtgg ctgtgttcgg 60
tatccggaac agaaaccgca ccgttggttt ccagctgttg caggatcgcg cattcgctac 120
cctgcgcgtt gcaacgacga cgcagttcaa ccagctgttc ctggagcgca accagaccat 180
cgatacgcgc ctgaacgtgt tcgatgtgtt cgtcgatgag cgcgttaaca gaaccgcacg 240
catcgtccgg agagtcgcgc agacgcagca ggctacggat ctcgtccagg gtcatatcca 300
gggtacgaca gttacggatg aaggtcagac gttcaacgtg cgcctgggtg tacagacggt 360
agttaccttc gctacgcgcc ggttccggca gcaggttttc acgttcgtag taacggatgg 420
tttcaaccgc gcaatcggtc gctttcgcca gttcaccgat tttcatcacg aaatctccag 480
caagtggctt gaccctatag tggctacagg gtgttcactt ggcaacaggc tcaatttaag 540
gatgacccct actagtagcg gccgctgcag 570
<210> 2
<211> 1592
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<222> (1)..(22)
<223> 对应的酶切位点依次为EcoRI、NotI、XbaI
<220>
<222> (1572)..(1592)
<223> 对应的酶切位点依次为SpeI、NotI和PstI
<400> 2
gaattcgcgg ccgcttctag aggccactgt ctgtcctgaa ttcattagta atagttacgc 60
tgcggccttt tacacatgac cttcgtgaaa gcgggtggca ggaggtcgcg ctaacaacct 120
cctgccgttt tgcccgtgca tatcggtcac gaacaaatct gattactaaa cacagtagcc 180
tggatttgtt ctatcagtaa tcgaccttat tcctaattaa atagagcaaa tccccttatt 240
gggggtaaga catgaagatg ccagaaaaac atgacctgtt ggccgccatt ctcgcggcaa 300
aggaacaagg catcggggca atccttgcgt ttgcaatggc gtaccttcgc ggcagatata 360
atggcggtgc gtttacaaaa acagtaatcg acgcaacgat gtgcgccatt atcgcctggt 420
tcattcgtga ccttctcgac ttcgccggac taagtagcaa tctcgcttat ataacgagcg 480
tgtttatcgg ctacatcggt actgactcga ttggttcgct tatcaaacgc ttcgctgcta 540
aaaaagccgg agtagaagat ggtagaaatc aataatcaac gtaaggcgtt cctcgatatg 600
ctggcgtggt cggagggaac tgataacgga cgtcagaaaa ccagaaatca tggttatgac 660
gtcattgtag gcggagagct atttactgat tactccgatc accctcgcaa acttgtcacg 720
ctaaacccaa aactcaaatc aacaggcgcc ggacgctacc agcttctttc ccgttggtgg 780
gatgcctacc gcaagcagct tggcctgaaa gacttctctc cgaaaagtca ggacgctgtg 840
gcattgcagc agattaagga gcgtggcgct ttacctatga ttgatcgtgg tgatatccgt 900
caggcaatcg accgttgcag caatatctgg gcttcactgc cgggcgctgg ttatggtcag 960
ttcgagcata aggctgacag cctgattgca aaattcaaag aagcgggcgg aacggtcaga 1020
gagattgatg tatgagcaga gtcaccgcga ttatctccgc tctggttatc tgcatcatcg 1080
tctgcctgtc atgggctgtt aatcattacc gtgataacgc cattacctac aaagcccagc 1140
gcgacaaaaa tgccagagaa ctgaagctgg cgaacgcggc aattactgac atgcagatgc 1200
gtcagcgtga tgttgctgcg ctcgatgcaa aatacacgaa ggagttagct gatgctaaag 1260
ctgaaaatga tgctctgcgt gatgatgttg ccgctggtcg tcgtcggttg cacatcaaag 1320
cagtctgtca gtcagtgcgt gaagccacca ccgcctccgg cgtggataat gcagcctccc 1380
cccgactggc agacaccgct gaacgggatt atttcaccct cagagagagg ctgatcacta 1440
tgcaaaaaca actggaagga acccagaagt atattaatga gcagtgcaga tagagttgcc 1500
catatcgatg ggcaactcat gcaattattg tgagcaatac acacgcgctt ccagcggagt 1560
ataaatgcct atactagtag cggccgctgc ag 1592
<210> 3
<211> 290
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<222> (1)..(22)
<223> 对应的酶切位点依次为EcoRI、NotI、XbaI
<220>
<222> (270)..(290)
<223> 对应的酶切位点依次为SpeI、NotI和PstI
<400> 3
gaattcgcgg ccgcttctag agaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 60
ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 120
gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 180
ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 240
tctacaaact cttcctgtcg tcatatctat actagtagcg gccgctgcag 290

Claims (9)

1.一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，其特征在于：所述全细胞生物传感器是将重金属离子诱导的基因表达系统转化大肠杆菌中构建得到的；
所述的重金属离子诱导的基因表达系统中自5′到3′端依次连接大肠杆菌终止子、含有双向启动子的重金属离子响应元件、噬菌体裂解基因、大肠杆菌终止子；
所述的含有双向启动子的重金属离子响应元件为含有双向启动子序列的镉响应蛋白，见SEQ ID No.1；
所述的噬菌体裂解基因为λ噬菌体的裂解基因SRRz，具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
所述的大肠杆菌终止子为终止子TrrnB，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述的重金属离子诱导的基因表达系统所用的出发载体为pSB1C3，pBluescript，pUC18，pUC19或pET系列；
所述的大肠杆菌为E.coli BL21。
2.一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的构建方法，其特征在于：具体包括如下步骤：以pSB1C3为出发载体：
（1）合成特异性识别Cd(II)的CadA操纵子DNA序列，包括Cd(II)响应蛋白和双向启动子序列，见SEQ ID No.1，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、响应蛋白反向互补编码基因、双向启动子、SpeI、NotI和PstI；
（2）合成λ噬菌体裂解基因SRRz，其序列见SEQ ID No.2，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、SRRz裂解基因、SpeI、NotI和PstI；
（3）合成终止子TrrnB，其序列见SEQ ID No.3，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、TrrnB终止子、SpeI、NotI和PstI；
（4）将特异性识别Cd(II)的CadA操纵子DNA序列SEQ ID No.1用XbaI和PstI进行双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQ ID No.3用EcoRI和SpeI进行双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI进行双酶切，三者经连接酶连接成环形成pSB1C3-TrrnB-CadA，其中TrrnB-CadA的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；
（5）将含有SRRz裂解基因的序列SEQ ID No.2用EcoRI和SpeI进行双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQ ID No.3用XbaI和PstI进行双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI进行双酶切，三者经连接酶连接成环形成pSB1C3-SRRz-TrrnB，其中SRRz-TrrnB的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；
（6）质粒pSB1C3-TrrnB-CadA采用SpeI和PstI进行双酶切，质粒pSB1C3-SRRz-TrrnB采用XbaI和PstI进行双酶切，目的片段纯化后连接获得镉离子响应载体，命名为pSB1C3-MCd；
（7）将步骤（6）所得的载体转入到E.coli BL21感受态细胞，获得重金属检测用的重组大肠杆菌，即全细胞生物传感器。
3.权利要求1所述的检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器在快速检测水溶性样品中重金属离子中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述的全细胞生物传感器在15～40℃、pH4～9条件下于1～3h完成样品中重金属的专一性检测。
5.一种基于权利要求1所述的全细胞生物传感器的水溶性样品中重金属离子半定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
方案一：将权利要求1所述的全细胞生物传感器与重金属离子孵育的裂解液，用分光光度计或酶标仪测定标准重金属样品细胞裂解液光密度并计算细胞死亡率，绘制细胞死亡率标准曲线；测定待测样品细胞裂解液光密度并计算细胞死亡率，通过标准曲线对其中重金属离子浓度进行半定量分析，计算出离子浓度；
方案二：将权利要求1所述的全细胞生物传感器与重金属离子孵育的裂解液与底物X-gal孵育，对反应体系拍照转变为灰度照片，把白色与黑色之间按对数关系分成若干级，范围从0到255，白色为255，黑色为0；建立重金属离子浓度与显色灰度值之间的关系，绘制显色标准曲线；对待测样品中重金属离子浓度进行半定量分析，计算出离子浓度。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
方案一：细胞死亡率法检测重金属离子
（A）制备大肠杆菌检测液，其中，所述大肠杆菌为权利要求1所述的全细胞生物传感器；
（B）将大肠杆菌检测液与不同浓度梯度的重金属离子标准样品混合，同时以添加同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作对照；样品均在35～37℃，200～220rpm条件下继续培养1～2h；用分光光度计或酶标仪测定细胞液光密度并计算细胞死亡率，建立细胞死亡率与重金属离子浓度的关系，绘制细胞死亡率标准曲线；
（C）将待测样品与大肠杆菌检测液混合，在35～37℃，200～220rpm条件下继续培1～2h；用分光光度计或酶标仪测定细胞液光密度并计算细胞死亡率；根据步骤（B）的标准曲线，计算得出待测样品中重金属离子的浓度；
方案二：显色法半定量检测重金属离子
（a）制备大肠杆菌检测液，其中，所述大肠杆菌为权利要求1所述的全细胞生物传感器；
（b）在Z buffer中加入X-gal溶液至终浓度为1g/L，混匀后加入到96孔板中，备用；
（c）将大肠杆菌检测液与不同浓度梯度的重金属离子标准样品混合，同时以添加同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作对照；样品均在35～37℃，200～220rpm条件下继续培养1～2h；取培养液上清液加入到含有显色底物的小孔中，35～37℃孵育30～35min；对反应体系拍照转变为灰度照片，把白色与黑色之间按对数关系分成若干级，范围从0到255，白色为255，黑色为0；建立重金属离子浓度与显色灰度值之间的关系，绘制显色标准曲线；
（d）将待测样品与大肠杆菌检测液混合，在35～37℃，200～220rpm条件下继续培养1～2h；取培养液上清液加入到含有显色底物的小孔中，35～37℃孵育30～35min；对显色样品拍照转变为灰度照片，获得显色灰度值；根据步骤（c）的显色标准曲线，计算得出待测样品中重金属离子的浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
方案一，步骤（B）中所述的标准曲线如下：
Y= 89.75/(1+10^((-6.06-logx)*353240))，R2=0.9931，0<X≤10-5 mol/L；
其中，X表示重金属离子浓度，单位是mol/L，Y表示细胞死亡率（%），R2为拟合曲线的相关系数；
方案二，步骤（c）中所述的显色标准曲线如下：
Y= -1011X2 – 4*106X + 194.6，R2 = 0.9740，0<X≤10-5mol/L；
其中，X表示重金属离子浓度，单位是mol/L，Y表示显色灰度值，R2为拟合曲线的相关系数。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述的大肠杆菌检测液的制备方法，包括如下步骤：
（Ⅰ）将权利要求1所述的全细胞生物传感器接种到LB固体培养基培养，使其复苏活化；
（Ⅱ）挑取单菌落接入到LB液体培养基震荡培养过夜；
（Ⅲ）以1：50～100体积比转接到新鲜的LB液体培养基中并加入IPTG，培养至菌液OD600为0.5～0.7，得到大肠杆菌检测液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
步骤（Ⅰ）中所述的培养的条件为35～37℃条件下培养14～15h；
步骤（Ⅱ）中所述的震荡培养过夜的条件为在35～37℃、200～220rpm条件下培养12～16h；
步骤（Ⅲ）中所述的培养的条件为在35～37℃，200～220rpm条件下培养。
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