CN114538616B - 一种低温条件下强化好氧反硝化菌脱氮性能和代谢活性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种低温条件下强化好氧反硝化菌脱氮性能和代谢活性的方法，涉及污水生物脱氮领域。本发明通过向2‑10℃温度下含有好氧反硝化菌的反应体系中投加电子穿梭体，进而有效提升好氧反硝化菌自身的脱氮能效，降低反应器出水氮素的含量，提高好氧反硝化菌的生长活性，促进生物膜的形成，强化群体感应系统。本发明旨在改善冬季低温条件下好氧反硝化菌存在的的代谢活性差、菌剂易流失，脱氮效能变差等问题，为好氧反硝化菌强化脱氮技术的应用落实提供一种新的策略。
Description
技术领域
本发明涉及污水生物脱氮领域，适用于好氧反硝化生物脱氮过程。
背景技术
过量的硝态氮排放至自然水体将会加剧水体富营养化并威胁人类身体健康。生物反硝化技术较物理、化学法更具经济效益和环境效益，因此成为了污水处理厂去除水体中硝酸盐的主流技术手段。传统反硝化菌一般为异养兼性厌氧菌，其与自养好氧型硝化菌的生态位存在明显差异，两类微生物通常在独立的构筑物中运行。好氧反硝化菌的发现及应用，使得硝化和反硝化过程得以在同时间、同空间进行。该应用在一定程度上解决了传统生物脱氮工艺中耐负荷冲击能力较差、基建和运营成本较高等问题。好氧反硝化技术在治理水体氮污染问题中有着重要研究价值和应用潜力。目前的研究多以生物强化技术为主，即通过向系统中投加好氧反硝化菌，以期强化脱氮性能。
然而，在我国北部地区，冬季水体温度普遍低于10℃，好氧反硝化菌的脱氮和代谢活性都受到严重抑制。低温条件下运行时(2-10℃)，好氧反硝化工艺存在菌种代谢活性差、菌剂流失、好氧反硝化菌难以成为优势菌群等问题，导致实际脱氮效果并不理想，限制了该技术的发展和应用。
发明内容
针对上述提到的好氧反硝菌在应用中存在的问题，本发明提供了一种低温条件下强化好氧反硝化菌自身脱氮性能和代谢活性的方法。本发明通过向低温好氧反硝化体系中投加电子穿梭体，进而提高好氧反硝化菌的反硝化速率和氮素去除率并促进菌株的生长活性和生物膜的形成，自动调控群体感应系统释放信号分子，为冬季低温条件下好氧反硝化菌的成功定植和反应器的稳定运行奠定基础，同时也为好氧反硝化菌强化脱氮技术的应用落实提供了实验依据和可行性方案。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)活化富集好氧反硝化菌，制备接种液：挑取单株好氧反硝化菌至LB培养基，随后放入振荡培养箱，连续培养至对数期，离心并收集菌体；用生理盐水固定菌体生物量作为试验的接种液；
(2)将接种液接种至盛有硝酸盐废水的体系中，并投加一种或混合两种电子穿梭体，在温度2-10℃，水中溶解氧含量为0.5-7mg/L的条件下运行好氧反硝化工艺。
上述步骤(1)技术方案中LB培养基组分为：10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母提取物，10.0g/L NaCl，pH值7.0-7.2。用其培养的条件通常为转速120-140rpm、温度25-30℃。
上述步骤(1)中所述的好氧反硝菌没有限制，一般的均可。
上述步骤(2)中所述的电子穿梭体包括：蒽醌(AQ，CAS:84-65-1)、2-羟基-1,4-萘醌(LAW,CAS:83-72-7)、黄腐酸(FA,CAS:479-66-3)、1,5-二氯蒽醌(1,5-AQDS，CAS:82-46-2)，通常投加剂量范围在0.01mM-0.15mM。混合投加时通常为FA与AQ、LAW、1,5-AQDS其中一种物质同时投加，其投加比范围通常为1-3。
作为优选，上述步骤(2)的接种液投加量通常为5-10％(V/V)。
作为优选，步骤(2)在对应的温度范围内，温度每降低4℃，电子穿梭体投加量通常增加0.01-0.05mM。
作为优选，步骤(2)中所述的温度为2-10℃。
作为优选，步骤(2)溶解氧含量通常控制在0.5-7mg/L，对应转速通常控制在110-160rpm。
定时取样检测出水水质，并定时测定好氧反硝化菌的细胞密度、生物膜的形成能力、EPS组分和含量、信号分子的种类和含量，以评估菌株的代谢活性。
作为优选，上述定时取样检测出水水质的常规指标，包括但不限于NO3 --N、NO2 --N、TN。
测定细胞密度的方法，包括但不限于测定样品的OD600值；采用结晶紫染色法定量测定对数生长末期好氧反硝化菌的生物膜形成能力，通过测定样品的OD570值，评估其生物膜量；采用热处理法对处于对数生长末期的好氧反硝化菌的EPS进行提取，EPS含量以胞外多糖(PS)和胞外蛋白质(PN)浓度之和进行表征，并计算PS/PN的比值，作为间接评估生物膜形成能力的指标；通过检测对数生长末期好氧反硝化菌分泌信号分子的种类和浓度，进而评估电子穿梭体对群体感应活性的影响。所检测的信号分子为N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子，包括但不限于：C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL；上述参数和性能均得到的优化。
本发明的有益效果：
(1)通过投加电子穿梭体，改善低温(2-10℃)条件下好氧反硝化菌的脱氮性能和代谢活性，好氧反硝化菌的脱氮性能显著提高，其氮素平均去除速率显著提升15％-70％，系统出水总氮去除率可提高10％-60％，并促进了好氧反硝化的生长繁殖，其最大比生长速率将提升3-10％，稳定期生物量将增长2-8％。同时，投加电子穿梭体可促进低温条件下好氧反硝菌生物膜的生成，其生物膜形成能力可提高0.4-0.8倍，显著刺激EPS的分泌，EPS中PN含量可提升30％-80％，并强化了细菌群体感应能力，尤其刺激了C6、C8-HSL信号分子的释放，可分别提升0.4-1、2-9倍，这间接促进细菌生物膜的形成并提高了其附着挂膜性能，间接改善了低温下好氧反硝化性能，降低出水中氮素浓度，为好氧反硝化菌的成功定植和系统高效稳定运行奠定良好的基础。
(2)黄腐酸作为腐殖酸主要成分，是一种广泛存在土壤、沉积物和水体中的天然有机质，其在调控好氧反硝化菌代谢和改善好氧反硝化性能的同时，实现了对该物质的资源化的利用。
(3)本发明具备操作简便、成本低廉、绿色环保的特点，具有较高的应用价值和潜能，其为冬季低温条件下强化好氧反硝化脱氮技术、推动污水处理工艺实现绿色低碳发展提供了新的思路。
附图说明
图1为试验1中2-4℃条件下菌株JQ1004的TN去除率变化图
图2为试验1中2-4℃条件下菌株JQ1004的OD600变化图
图3为试验1中2-4℃条件下菌株PHB18的OD570变化图
图4为试验2中2-4℃条件下菌株PHB18的TN去除率变化图
图5为试验2中2-4℃条件下菌株PHB18的OD600变化图
图6为试验2中8-10℃条件下菌株PHB18的OD570变化图
图7为试验3中8-10℃条件下菌株PHB18的TN去除率的变化图
图8为试验3中8-10℃条件下菌株PHB18的OD600变化图
图9为试验3中8-10℃条件下菌株PHB18的OD570变化图
图10为试验3中8-10℃条件下菌株PHB18的EPS的组分变化图
图11为试验3中8-10℃条件下菌株PHB18的信号分子的组分变化图
具体实施方式
以下结合具体实施案例对本发明进行说明，但本发明的实施并不限于此。
本发明的好氧反硝菌没有限制，一般的均可。本发明实施例采用的是一类在有氧(DO≥0.5mg/L)可降解水体中硝酸盐的细菌，包括但不限于不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004和硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)PHB18。前者保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.15414；PHB18为已知的，16S rDNA的Genbank登录号为OM691455.1。
下述案例均采用模拟硝酸盐废水进行人工配水。
其中，案例1和案例2中进水NO3--N浓度为50-53mg/L，进水COD浓度为700-750mg/L，水温控制在2-4℃。其配水水质特征：0.89g/L CH3COONa，0.36g/L KNO3，10.60g/LNa2HPO4·12H2O，5g/L KH2PO4，0.049g/L MgSO4，2mL微量元素，初始pH值在7.0-7.2。微量元素溶液组分：50.0g/L EDTA，3.9g/LZnSO4·7H2O，5.5g/L CaCl2，1.1g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，5.1g/L MnCl·4H2O，5.0g/L FeSO4·7H2O，1.6g/LCuSO4·5H2O，1.6g/L CoCl2·6H2O。
案例3中其进水NO3--N浓度：100-106mg/L，进水COD浓度：1400-1480mg/L，水温控制在8-10℃。配水水质特征：1.79g/L CH3COONa，0.72g/L KNO3，10.60g/L Na2HPO4·12H2O，5g/L KH2PO4，0.049g/LMgSO4，2mL微量元素，初始pH值在7.0-7.2。微量元素溶液组分：50.0g/L EDTA，3.9g/L ZnSO4·7H2O，5.5g/L CaCl2，1.1g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O，5.1g/LMnCl·4H2O，5.0g/L FeSO4·7H2O，1.6g/L CuSO4·5H2O，1.6g/L CoCl2·6H2O。
下述案例的实验均设置3组平行实验，其实验数据均取平均值。
实施例1
将300mL配水和0.02mM不同电子穿梭体(分别为：1,5-AQDS、FA、AQ、LAW)放入500mL锥形瓶内，设置不添加电子穿梭体的空白对照组，调节反应体系初始pH范围7.0-7.2。将5个锥形瓶采用透气封口膜密封，并放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌(121℃，15min)，冷却后备用。挑取长势良好的JQ1004单菌落至LB培养基，并将其放入振荡培养箱(30℃，140r/min)培养12h，随后离心收集菌体。用0.9％(W/W)生理盐水固定菌体OD600约为0.450A作为接种液。取10％(V/V)接种液分别接种于上述5个锥形瓶内，在温度2-4℃，摇床转速140rpm(控制体系溶解氧范围在2.0-7.5mg/L)的条件下，连续培养96h并间隔定时取样，测定菌液OD600值和总氮浓度，并计算总氮去除率。检测第84h时细菌生物膜形成能力(OD570)。
实验结果如图1、2、3所示，相比于未投加电子穿梭体的对照组，四种电子穿梭体均可加速菌株JQ1004氮素降解、提高脱氮去除效率并促进细菌生长活性，加快细菌生长繁殖，促进了生物膜的形成。采用0.02mM的1,5-AQDS的处理效果最佳，出水氮素浓度在72h时基本稳定，其平均总氮速率为0.17mg/(L·h)，总氮去除率为25.21％，最大比生长速率为0.11h-1，稳定期细菌生物量维持在309mg DCW/L，第84h时OD570值为0.235A，较对照组分别提高了55.37％、41.23％、5.36％、4.63％、49.33％。
实施例2
挑取菌株PHB18至LB培养基进行活化富集培养，将其接种液接种于含有0.02mM电子穿梭体(分别为：1,5-AQDS、FA、AQ、LAW)的锥形瓶内，连续培养96h并间隔定时取样，测定菌液OD600值和总氮浓度并计算总氮去除率。检测第84h时细菌生物膜形成能力(OD570)。其余操作步骤同实施案例1。
各电子穿梭体在2-4℃条件下对菌株PHB18脱氮过程的影响如图4所示，投加FA时细菌的脱氮效率达到最佳，其平均脱氮速率和总氮去除率为0.25mg/(L·h)和43.81％，出水总氮含量为29.02mg/L，相比于对照组出水总氮含量38.78mg/L，降低了33.65％；各电子穿梭体在2-4℃条件下对菌株PHB18生长过程的影响如图5所示，投加1,5-AQDS时促进细菌生长的效果最佳，其最大比生长速率为0.066h-1，稳定期细菌生物量维持在253mg DCW/L，较对照组分别提高了8.84％和12.17％。电子穿梭体对细菌生物膜的形成影响如图6所示，相比于对照组OD570值为0.109A，投加0.02mM FA使得该值增至0.159A，表明生物膜形成能力提高了0.46倍。四种电子穿梭体实验结果表明，2-4℃条件下，四种电子穿梭体均在不同程度上强化了菌株PHB18的脱氮能效并促进了细菌的生长繁殖，细菌生物膜的形成能力得到了显著提升。
实施例3
将300mL配水和不同浓度(分别为：0.02、0.05、0.10、0.15mM)的FA放入500mL锥形瓶内，设置不添加电子穿梭体的空白对照组，调节反应体系初始pH范围7.0-7.2。将5个锥形瓶采用透气封口膜密封，并放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌(121℃，15min)，冷却后备用。挑取长势良好的PHB18单菌落至LB培养基，并将其放入振荡培养箱(30℃，140r/min)培养12h，随后离心收集菌体。用0.9％(W/W)生理盐水固定菌体OD600约为0.450作为接种液。取5％(V/V)接种液分别接种于上述5个锥形瓶内，在温度8-10℃，摇床转速140rpm(控制体系溶解氧范围在2.0-7.5mg/L)的条件下，连续培养72h并间隔定时取样，测定菌液OD600值和总氮浓度，并计算总氮去除率。检测第48h时细菌生物膜形成能力(OD570)、EPS组分含量和AHLs信号分子浓度，并计算PN/PS比值。
8-10℃条件下，不同浓度的FA对菌株PHB18脱氮性能和生长量的影响如图7、8所示。低温条件下，菌株PHB18的氮代谢和生长代谢活性受到严重抑制。投加0.02-0.15mM浓度范围的FA均可提升菌株PHB18的降解硝酸盐性能同时提高细胞生物量的积累。其中，投加0.15mM时脱氮效果最好，其总氮去除率为44.85％，是对照组的1.41倍,稳定期生物量为295mg DCW/L，较对照组提高了5％。
FA对生物膜形成能力的影响如图7、8所示，其结果表明0.02-0.15mM浓度的FA使得菌株PHB18在低温条件下生物膜形成能力提高了0.45-0.71倍，即投加FA能够促进好氧反硝化菌生物膜的形成。EPS成分含量的变化表明，相比于PS含量相对稳定(约为20.4mg/mgDCW),FA的加入可以显著刺激菌株PHB18PN的分泌。0.02mM FA时PN含量达到最大值，是未投加电子穿梭体对照组的1.71倍，对应PN/PS比值也达到最大，是对照组的1.76倍。添加FA可以促进好氧反硝化菌分泌EPS，尤其是胞外蛋白质的含量显著提升，进而提升细菌生物膜的附着性能。
FA对菌株PHB18分泌AHLs类信号分子的影响如图9所示。FA刺激了细菌C6、C8-HSL的分泌，且两种信号浓度与EPS含量变化趋势类似。FA显著影响了C8-HSL浓度，投加0.02mM的FA时，细菌分泌C8-HSL达到最高值9.06nM，是对照组的7.20倍。
总的来说，投加FA可有效提高低温条件下好氧反硝菌PHB18氮素降解效率，降低出水氮素含量，同时提高菌株的代谢活性，其中包含促进细菌的生长繁殖、提高菌株生物膜的形成能力、强化菌株的群体感应系统。本发明方法强化了好氧反硝化菌在低温运行下的处理效能，为保障菌株成功定植和系统稳定运行奠定了良好的实践基础。
Claims (4)
1.一种低温条件下强化好氧反硝化菌脱氮性能和代谢活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化富集好氧反硝化菌，制备接种液：挑取单株好氧反硝化菌至LB培养基，随后放入振荡培养箱，连续培养至对数期，离心并收集菌体；用生理盐水固定菌体生物量作为试验的接种液；
(2)将接种液接种至盛有硝酸盐废水的体系中，并投加一种或混合两种电子穿梭体，在温度2-10℃，水中溶解氧含量为0.5-7mg/L的条件下运行好氧反硝化工艺；
脱氮性能和代谢活性测定：定时取样检测出水水质，并定时测定好氧反硝化菌的细胞密度、生物膜的形成能力、EPS组分和含量、信号分子的种类和含量，以评估菌株的代谢活性；
定时取样检测出水水质的常规指标，包括NO3 --N、NO2 --N、TN；
测定细胞密度的方法，包括测定样品的OD600值；采用结晶紫染色法定量测定对数生长末期好氧反硝化菌的生物膜形成能力，通过测定样品的OD570值，评估其生物膜量；采用热处理法对处于对数生长末期的好氧反硝化菌的EPS进行提取，EPS含量以胞外多糖(PS)和胞外蛋白质(PN)浓度之和进行表征，并计算PS/PN的比值，作为间接评估生物膜形成能力的指标；通过检测对数生长末期好氧反硝化菌分泌信号分子的种类和浓度，进而评估电子穿梭体对群体感应活性的影响；所检测的信号分子为N-酰基高丝氨酸内酯信号分子，包括：C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL；
所述电子穿梭体投加量为0.02-0.15mM，好氧反硝化菌的脱氮性能显著提高，其氮素平均去除速率显著提升15％-70％，系统出水总氮去除率提高10％-60％，并促进了好氧反硝化的生长繁殖，其最大比生长速率将提升3-10％，稳定期生物量将增长2-8％；同时，投加电子穿梭体促进低温条件下好氧反硝菌生物膜的生成，其生物膜形成能力提高0.4-0.8倍，显著刺激EPS的分泌，EPS中PN含量提升30％-80％，并强化了细菌群体感应能力，刺激了C6-HSL、C8-HSL信号分子的释放，分别提升0.4-1、2-9倍；
步骤(2)中所述的电子穿梭体包括：蒽醌AQ、2-羟基-1,4-萘醌LAW、黄腐酸FA、1,5-二氯蒽醌1,5-AQDS，混合投加时通常为FA与AQ、LAW、1,5-AQDS其中一种物质同时投加，其投加摩尔比为1：3。
2.按照权利要求1所述的一种低温条件下强化好氧反硝化菌脱氮性能和代谢活性的方法，其特征在于，步骤(1)技术方案中LB培养基组分为：10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母提取物，10.0g/L NaCl，pH值7.0-7.2；用其培养的条件通常为转速120-140rpm、温度25-30℃。
3.按照权利要求1所述的一种低温条件下强化好氧反硝化菌脱氮性能和代谢活性的方法，其特征在于，在对应的温度范围内，温度每降低4℃，电子穿梭体投加量通常增加0.01-0.05mM。
4.按照权利要求1所述的种低温条件下强化好氧反硝化菌脱氮性能和代谢活性的方法，其特征在于，步骤(2)的接种液投加量通常为5-10V/V％，硝酸盐废水中硝酸盐浓度通常为50-100mg/L，C/N＝10-14。
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| CN105236566A (zh) * | 2015-09-23 | 2016-01-13 | 同济大学 | 一种提高生物脱氮效果的方法 |
| CN110745966A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-02-04 | 南京大学 | 一种强化低温条件下生物膜脱氮的群体感应-好氧反硝化菌的二元系、构建方法及应用 |
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| "生物炭耦合异养硝化-好氧反硝化菌株ZO3处理低温低C/N废水的研究";姜洁;中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑(第2022年第02期期);B027-80 * |
| 姜洁."生物炭耦合异养硝化-好氧反硝化菌株ZO3处理低温低C/N废水的研究".中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑.2022,(第2022年第02期期),B027-80. * |
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