CN114525325A - 一种检测人hla-i/ii类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种检测人hla-i/ii类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN114525325A CN202210046741.8A CN202210046741A CN114525325A CN 114525325 A CN114525325 A CN 114525325A CN 202210046741 A CN202210046741 A CN 202210046741A CN 114525325 A CN114525325 A CN 114525325A
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Abstract

本发明属于基因测序领域，涉及一种检测人HLA‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，包含：用于cDNA合成的逆转录试剂；用于HLA‑I/II类基因捕获的HLA Target Mix1；用于HLA‑I/II类基因捕获的HLA Target Mix2；用于HLA‑I/II类基因捕获的PCR试剂；用于捕获后DNA文库构建的试剂。本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法：RNA逆转录合成cDNA及纯化；HLA靶向第一次富集及纯化；HLA靶向第一次富集及纯化所得产物的第二次富集及片段分选；捕获文库构建。本发明的试剂盒及使用方法，能够更加真实地评估细胞的免疫状态；方法简单有效，流程稳定。

Description

一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其 使用方法
技术领域
本发明属于基因测序领域，具体涉及一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法。
背景技术
测序法已经成为一种常规的实验技术，最近新一代测序技术的显著优势，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)、高通量测序技术、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ionsemiconductor sequencing）、DNA纳米球测序（DNA nanoball sequencing）等。
主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。1958年Dausset等发现，多次接受输血的患者、多产妇和用同种白细胞免疫的志愿者血清中，存在不同特异性的白细胞抗体，用这些抗体鉴定出许多不同特异性的白细胞抗原，称为人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）。通过家系和人群遗传分析发现，人类MHC位于第6号染色体上，称为HLA复合体。MHC可以分为经典MHC与非经典MHC两类，经典MHC包括MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、MHC Ⅲ基因，分别编码MHC Ⅰ分子、MHC Ⅱ分子、MHC Ⅲ分子。
MHC class Ⅰ（MHC Ⅰ）：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链（peptide）透过MHC提示在细胞外侧，可以供杀手CD8+ T细胞等辨识，以进行扑杀。Ⅰ类基因区包括HLA-A、B、C位点的等位基因，编码HLA-A抗原、B抗原和C抗原等经典的Ⅰ类抗原（分子）。
MHC class Ⅱ（MHC Ⅱ）：大多位于抗原提呈细胞（APC)上，如巨噬细胞等。这类提供则是细胞外部的情况，像是组织中有细菌侵入，则巨噬细胞进行吞食后，把细菌碎片利用MHC提示给辅助T细胞，启动免疫反应。Ⅱ类基因区十分复杂，主要包括HLA-DP、DQ、DR三个亚区和新近确定的DN、DO、DM等3个亚区。
MHC class Ⅲ (MHC Ⅲ) ：主要编码补体成分，肿瘤坏死因子（TNF），热休克蛋白70（HSP70)和21羟化酶基因（CYP21A和CYP21B)。Ⅲ类基因区内已定位的至少有36个基因，其中与免疫系统有关的基因有C4B、C4A、C2、Bf、肿瘤坏死因子（TNFA、TNFB）和热休克蛋白70(HSP70），分别编码C4、C2、B因子、TNF-α、TNF-β和HSP70分子。
针对MHC的研究，目前主要集中在针对bulk MHC的I类和II类两个方面。然而，查阅相关试剂盒，仅发现能够检测MHC的某一部分试剂盒，例如专利CN101892317B中描述的I类A基因的2-4外显子、B基因的2-4外显子和DRB1基因的2号外显子；专利CN105039332B描述的I类A、B、C三个基因的全长。结合大量文献研究，HLA的I类基因多态性显著，在1-7号外显子上都显示出基因的多态性；II类集中在DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1六个基因的2-4号外显子。目前，尚未发现有此类高范围bulk MHC转录本的试剂盒的出现。
发明内容
针对上述情况，本发明在转录组水平上，靶向HLA的I类主要集中在A、B、C三个基因的1-6号外显子，II类集中在DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1六个基因的1-4号外显子，开发出一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法。该试剂盒不仅能够高分辨率第全面检测人HLA的相关基因，并且能够精准区分细胞中HLA多态情况，具有十分重要的应用价值。
为实现以上目的，本发明具体方案如下：
一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，包括以下组分的试剂：
（a）用于cDNA合成的逆转录试剂；
（b）用于HLA-I/II类基因捕获的HLA Target Mix1；
（c）用于HLA-I/II类基因捕获的HLA Target Mix2；
（d）用于HLA-I/II类基因捕获的PCR试剂；
（e）用于捕获后DNA文库构建的试剂。
进一步的，所述逆转录试剂（a）包含逆转录酶、TSO引物、Poly d(T)引物、Buffer。
更进一步的，所述逆转录试剂（a）在逆转录的同时具有Template Switch的功能，能够在cDNA的5’端加上通用的序列。
本发明中，具有Template Switch功能的逆转录酶可选自TransScript® IVReverse Transcriptase、TransScript® II Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript® Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript® II Reverse Transcriptase、VazymeHiScript® III Reverse Transcriptase、Vazyme M-MLV(H-) Reverse Transcriptase、ABclonal® ABScript II Reverse Transcriptase、ABclonal® ABScript III ReverseTranscriptase、Yeasen Hifair® V Reverse Transcriptase、Invitrogen SuperScript® IV Reverse Trascriptase，但不限于以上几种酶，事实上，凡是具备Template Switch功能的逆转录酶，都可用于本试剂盒。
更进一步的，所述TSO引物由已知的Oligo和其3`端用于模板转换的1到多个碱基组成。
其中，所述已知的Oligo通常为本领域技术人员常用序列，如Illumina测序平台Read1序列：5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
3’端用于模板转换的1到多个碱基通常为3-5个脱氧核糖核酸形式的G或3-5个核糖核酸形式的G。
更进一步的，所述已知的Oligo和3`端用于模板转换的碱基之间，还可以添加任意长度的碱基序列，如UMI等。
更进一步的，所述Poly d(T)引物由Oligo d(T)10-29序列和其5’端一段已知序列组成。
其中，所述5`端一段已知序列通常为本领域技术人员常用序列，如Illumina测序平台Read2序列：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’。
进一步的，所述组成试剂（b）HLA Target Mix1由5’read 1引物、靶向HLA-I的A、B、C基因的7号外显子的引物、HLA-II的DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1基因4号外显子的引物组成；
更进一步的，所述HLA Target Mix1的HLA-I的A、B、C基因的上游引物HLA-ITarget Mix1-F为：5’-CAGACGCCGAGGATGGCC-3’；
所述HLA Target Mix1的HLA-I的A、B、C基因的下游引物HLA-I Target Mix1-R为：5’-CAGAGCCCTGGGCACTGT-3’；
所述HLA Target Mix1的HLA-II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因的上游引物HLA-II Target Mix1-F为：
DPA-1：5’-ATGCGCCCTGAAGACAGAATGT-3’；
DPB-1：5’-ATGATGGTTCTGCAGGTTTCTGC-3’；
DQA-1：5’-ATGATCCTAAACAAAGCTCTG-3’；
DQB-1：5’-GAARAAGKCTTTGCGGATCCC-3`；
DRA-1：5’-ATGGCCATAAGTGGAGTCCC-3’；
DRB-1：5’-GTGCTGAGCTCCCSACTGG-3’；
所述HLA Target Mix1的HLA-II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因的下游引物HLA-II Target Mix1-R为：
DPA-1：5’-TTATGATGAGGACGGTGCCC-3’；
DPB-1：5’-ATGAAGATGCCCACTCCACA-3’；
DQA-1：5’-CCTTCCAGGATGGGATTCACAAT-3’；
DQB-1：5’-GATGATAAGGCCCAGCCCAA-3’；
DRA-1：5’-GCTTTTGCGCAATCCCTTGAT-3’；
DRB-1：5’-TCCTGAAGTAGATGAACAGCCC-3’。
进一步的，所述组成试剂（c）HLA Target Mix2由5’read 1引物、靶向HLA-I的A、B、C基因的6或7号外显子的引物、靶向HLA-II的DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1基因4号外显子区域的引物组成；
所述HLA Target Mix2中HLA-II的靶向引物结合位点位于HLA Target Mix1中HLA-II的靶向引物的内侧。
更进一步的，所述HLA Target Mix2的HLA-I的A、B、C基因上游引物HLA-I TargetMix2-F为：5`-TGGCCCTGACCSAGACCTG-3`；
所述HLA Target Mix2的HLA-I的A、B、C基因下游引物HLA-I Target Mix2-R为：
A-2：5’-TCACACTTTACAAGCTGTGA-3’；
B-2：5’-TGCCAGAGGCTCTTGAAGTC-3’；
C-2：5’-TGCAGAAAGAGATGCCAGAGG-3’；
所述HLA Target Mix2的HLA-II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因上游引物为HLA-II Target Mix 2-F为：
DPA-1：5’-ATGCGCCCTGAAGACAGAATGT-3’；
DPB-1：5’-ATGATGGTTCTGCAGGTTTCTGC-3’；
DQA-1：5’-ATGATCCTAAACAAAGCTCTG-3’；
DQB-1：5’-GAARAAGKCTTTGCGGATCCC-3’；
DRA-1：5’-ATGGCCATAAGTGGAGTCCC-3’；
DRB-1：5’-GTGCTGAGCTCCCSACTGG-3’；
所述HLA Target Mix2的HLA-II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因下游引物HLA-II Target Mix2-R为：
DPA-2：5’-TTATGATGAGGACGGTGCCC-3’；
DPB-2：5’-CCACTCCACAGATGATGAGC-3’；
DQA-2：5’-TTCCAGGATGGGATTCACAATGG-3’；
DQB-2：5’-GATGATAAGGCCCAGCCCAA-3’；
DRA-2：5’-TAATGATGCCCACCAGACCCA-3’；
DRB-2：5’-TCCTGAAGTAGATGAACAGCCC-3’。
进一步的，所述组成试剂（d）为多重PCR专用试剂，选自Taq酶、dNTP、Buffer、盐离子中的任意一种或多种。
进一步的，所述捕获后DNA文库构建的试剂（e）的配置包含以下步骤：
（i）DNA的片段化反应；
（ii）片段化后DNA的末端修复、3`端加A；
（iii）末修及加A后DNA添加测序接头；
（iv）文库index PCR扩增。
一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒的使用方法，包含以下步骤：
（i) RNA逆转录合成cDNA及纯化；
（ii）HLA靶向第一次富集及纯化；
（iii）HLA靶向第一次富集及纯化所得产物的第二次富集及片段分选；
（iv）捕获文库构建。
进一步的，所述步骤(i)RNA逆转录合成cDNA及纯化，是将RNA、逆转录酶、TSO引物、Poly d(T)引物、Buffer等组分分别加入反应管，在PCR仪器上进行cDNA第一链合成，并使用磁珠、离心柱、分离柱等方法对cDNA产物进行纯化，去掉其中过量的Oligo及逆转录组分，即得到第一链cDNA产物。
进一步的，所述步骤(ii)HLA靶向第一次富集及纯化，是将10x Genomics平台获得的单细胞cDNA和第一次富集所需要的PCR组分分别加入反应管，在PCR仪器上按进行第一次靶向富集，并使用磁珠、离心柱、分离柱等方法对第一次靶向富集的产物进行纯化，去掉其中过量的oligo及PCR组分，即得到第一次靶向富集及纯化后的产物。
进一步的，所述步骤(iii)HLA靶向第一次富集及纯化所得产物的第二次富集及片段分选，是将第一次靶向富集及纯化后得到的产物作为第二次靶向富集的模板，与所需PCR组分分别加入反应管，在PCR仪器上进行第二次靶向富集，使用0.5X和0.8X 磁珠按照说明书上的方法或其他等效的分选方法对反应产物进行纯化，即得到第二次靶向富集及分选后的产物。
进一步的，所述步骤（iv）获得捕获文库的步骤为：使用打断酶在合适的条件下对步骤（iii）获得的第二次靶向富集及分选后的产物进行酶切打断、末端修复、3’端加A，之后用连接酶进行接头连接，再使用磁珠、离心柱、分离柱等方法对连接产物进行纯化，纯化后通过PCR将测序接头和sample index加在所得片段的两端，再用磁珠、离心柱、分离柱等方法对反应产物再次进行纯化，即得到测序文库。
一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法，应用于HLA-I/II类基因的捕获文库构建。
有益效果：
1.本发明检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法，使得测序文库更加有针对性，能够充分展现细胞的HLA多态性；
2.本发明基于cDNA的HLA-I/II类基因的表达水平的分型及定量，能够有效展示细胞的表达过程中的HLA组合状态，而非DNA水平细胞内含的HLA状态；转录过程中的HLA分型才能够真实反映细胞免疫状态；
3.本发明充分包含HLA-I/II的9个基因的基因分型，基因数量多而全面，能够更加真实地评估细胞的免疫状态；
4.本发明方法简单有效，流程稳定。
附图说明
图1 ：病人冻存的外周血PBMC样本提取的总RNA电泳图。
图2 ：HLA第二次靶向富集磁珠纯化后的峰形图。
图3： HLA二代测序文库库检峰形图。
图4 ：同一样品使用不同方法建库HLA-I/II类基因的表达分型检出结果统计图。
图5 ：同一样品使用不同方法建库HLA-I/II类基因的表达分型和表达量的分型表达量统计图。
图6 ：同一样本完整RNA和降解RNA富集建库后分型结果比较。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例1-5进一步阐明本发明人HLA基因检测、分型及表达量评估，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1 人类HLA总RNA的获得
使用QIAGEN® RNeasy Mini Kit得到样本中的总RNA，样本来源可以是人的新鲜血液，手术或穿刺获得的新鲜组织块，实验室培养的人源细胞系甚至是冻存的外周血PBMC等，得到的总RNA需用Agilent Tapestation Screen Tape and Reagents检测完整性，用Nanodrop检测浓度和纯度，某病人冻存的外周血PBMC样本提取的总RNA电泳图如图1所示，检测浓度为42ng/ul，纯度为OD260/280=2.0，此RNA质量较好，完整性很高。
实施例2 逆转录cDNA第一链的获得
使用TransScript® Uni Reverse Transcriptase （目录号：AU101）逆转录酶按照相应说明书的步骤进行逆转录，逆转录的同时通过Template Switch在cDNA的5’端加上通用的序列。
逆转录酶优选为具有Template Switch功能的逆转录酶，均可达到本发明所需要的效果，进一步优选为TransScript® IV Reverse Transcriptase、TransScript® IIReverse Transcriptase、Vazyme HiScript® Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript®II Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript® III Reverse Transcriptase、Vazyme M-MLV(H-) Reverse Transcriptase、ABclonal® ABScript II Reverse Transcriptase、ABclonal® ABScript III Reverse Transcriptase、Yeasen Hifair® V ReverseTranscriptase、Invitrogen SuperScript® IV Reverse Trascriptase。
实施例3 对于完整性较好的RNA样本，使用5’端通用上游引物和Target Mix中下游引物对HLA-I/II类基因进行靶向捕获及扩增
3.1 HLA-I/II 第一次靶向富集：
第一次靶向富集使用Hieff® Multiplex PCR Kit，按照说明书将第一次富集所需要的PCR组分、逆转录后的第一链cDNA、5’端通用上游引物和HLA-I/II Target Mix1中的下游引物组合分别加入反应管，在PCR仪器上按如下表1条件进行第一次靶向富集：
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
3.2 HLA-I/II第一次靶向富集后产物纯化：
使用0.8X Agencourt AMPure XP Beads磁珠按照说明书上的方法对反应产物进行纯化，去掉其中过量的oligo及PCR组分（如盐离子等），获得第二次靶向富集的模板。
3.3 HLA-I/II第二次靶向富集：
将纯化后的第一次富集产物分别加入反应管，使用Hieff® Multiplex PCR Kit，按照说明书在PCR仪器上按如下表2条件进行第二次靶向富集，第二次靶向富集上游引物仍然使用5’端通用上游引物，下游引物使用HLA-I/II Target Mix2中的下游引物组合：
表2
Figure 400367DEST_PATH_IMAGE002
3.4 HLA-I/II第二次靶向富集后产物双端纯化：
使用0.5X和0.8X Agencourt AMPure XP Beads磁珠按照说明书上的方法对反应产物进行纯化，筛选出所需长度的片段。
富集产物质检：富集产物使用Agilent Tapestation检测峰图，示意图如图2所示，并检测Qubit浓度。富集产物可在4℃保存72h，或在-20℃保存一周。
实施例4 对于完整性不好（降解）的RNA样本，使用Target Mix中的上下游引物组合对HLA-I/II类基因进行靶向捕获及扩增
4.1 HLA-I/II 第一次靶向富集：
第一次靶向富集使用Hieff® Multiplex PCR Kit，按照说明书将第一次富集所需要的PCR组分、逆转录后的第一链cDNA、HLA-I/II Target Mix1中的上下游引物组合分别加入反应管，在PCR仪器上按如下表3条件进行第一次靶向富集：
表3
Figure 691671DEST_PATH_IMAGE001
4.2 HLA-I/II第一次靶向富集后产物纯化：
使用0.8X Agencourt AMPure XP Beads磁珠按照说明书上的方法对反应产物进行纯化，去掉其中过量的oligo及PCR组分（如盐离子等），获得第二次靶向富集的模板。
4.3 HLA-I/II第二次靶向富集：
将纯化后的第一次富集产物分别加入反应管，使用Hieff® Multiplex PCR Kit，按照说明书在PCR仪器上按如下表4条件进行第二次靶向富集，第二次靶向富集使用HLA-I/II Target Mix2中的上下游引物组合：
表4
Figure 427546DEST_PATH_IMAGE002
4.4 HLA-I/II第二次靶向富集后产物双端纯化：
使用0.5X和0.8X Agencourt AMPure XP Beads磁珠按照说明书上的方法对反应产物进行纯化，筛选出所需长度的片段。
富集产物质检：富集产物使用Agilent Tapestation检测峰图，并检测Qubit浓度。富集产物可在4℃保存72h，或在-20℃保存一周。
实施例5 适用于Illumina platform的二代测序文库建立及质检
测序文库制备及纯化：
使用适用于Illumina二代测序平台的建库试剂盒，如VAHTS Universal Plus DNALibrary Prep Kit for Illumina V2、ABclonal FS DNA Lib Prep Kit for Illumina V2等其他等效试剂盒或建库模块组合，按照其说明书对靶向捕获得到的产物进行二代测序文库的构建。具体步骤包括：
5.1 使用打断酶在合适的条件下对富集DNA酶切打断、末端修复、3’端加A；
5.2 用合适浓度的Agencourt AMPure XP Beads进行纯化或片段长度筛选，磁珠浓度按照期待得到片段的大小根据说明书选择；
5.3 用连接酶进行接头连接；
5.4 使用合适浓度的 Agencourt AMPure XP Beads对连接产物进行纯化或片段长度筛选，磁珠浓度按照期待得到片段的大小根据说明书选择；
5.5 通过PCR将测序接头和sample index加在片段的两端，同时进行二代测序文库的扩增
5.6 使用合适浓度的Agencourt AMPure XP Beads对反应产物进行片段长度的分选，磁珠浓度按照期待得到片段的大小根据说明书选择，即得到测序文库。
得到二代测序文库后，需用qPCR进行定量，使用Qubit检测文库浓度，AgilentTapestation Screen Tape and Reagents检测产物片段大小（图3）。
实施例6 不同方法所得HLA结果对比分析
6.1 原始下机fastq数据预处理
原始下机fastq数据按照既往生信分析经验，采用fastqc、fastp、trimmatic、bowtie2等软件，对数据进行初始质控，去除低质量数据，去除接头，比对到参考基因组，并质控比对后数据质量。
6.2 HLA分型分析
利用HLA-VBseq等软件，构建单细胞matrix，并对HLA进行分型并统计分型检出情况。所得结果如图4，图中可见和10X Genimocs平台的GEX建库方法相比，本专利方法对同一样本的HLA分型具有更高的检出率。
6.3 不同方法所得HLA结果对比分析
不同方法所得HLA分型及表达量结果，采用端对端的方式一一对比分析。同一样本分别用10X Genimocs平台的GEX建库方法和本专利建库方法分别建库，对比结果见图5，图中可见本专利方法与10X方法构建的二代测序文库每个HLA分型所检出的Read Counts数量基本接近。使用另一样本分别用提取的完整性很高的RNA和降解的RNA按照说明书方法构建二代测序文库，其检出的HLA分型一致，每个HLA分型所对应的Read Counts数量也基本接近，如图6，说明本专利方法很好的解决了提取的RNA容易降解或者因样本本身质量问题（如长期冻存等）所导致的提取RNA质量不佳对HLA捕获建库产生的影响。
本发明是一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法，使得测序文库更加有针对性，能够充分展现细胞的HLA多态性；基于cDNA的HLA-I/II的转录组水平，能够有效展示细胞的表达过程中的HLA组合状态，而非DNA水平细胞内含的HLA状态；转录过程中的HLA分型才能够真实反映细胞免疫状态；充分包含HLA-I和HLA-II的9个基因的基因分型，基因数量多而全面，能够更加真实地评估细胞的免疫状态。
以上实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此为限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，包含以下组分的试剂：
（a）用于cDNA合成的逆转录试剂；
（b）用于HLA-I/II类基因捕获的HLA Target Mix1；
（c）用于HLA-I/II类基因捕获的HLA Target Mix2；
（d）用于HLA-I/II类基因捕获的PCR试剂；
（e）用于捕获后DNA文库构建的试剂。
2.根据权利要求1所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂（a）包含逆转录酶、TSO引物、Poly d(T)引物、Buffer。
3.根据权利要求2所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂（a）中的逆转录酶具有Template Switch的功能，能够在cDNA的5’端加上通用的序列；
所述具有Template Switch功能的逆转录酶可选自TransScript® IV ReverseTranscriptase、TransScript® II Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript®Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript® II Reverse Transcriptase、VazymeHiScript® III Reverse Transcriptase、Vazyme M-MLV(H-) Reverse Transcriptase、ABclonal® ABScript II Reverse Transcriptase、ABclonal® ABScript III ReverseTranscriptase、Yeasen Hifair® V Reverse Transcriptase、Invitrogen SuperScript® IV Reverse Trascriptase。
4.根据权利要求2所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述TSO引物由已知的Oligo和其3`端用于模板转换的1到多个碱基组成。
5.根据权利要求4所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述已知的Oligo和3`端用于模板转换的碱基之间，还可以添加任意长度的碱基序列。
6.根据权利要求2所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述Poly d(T)引物由Oligo d(T)10-29序列和其5’端一段已知序列组成。
7.根据权利要求1所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述组成试剂（b）HLA Target Mix1由5’read 1引物、靶向HLA-I的A、B、C基因的7号外显子的引物、HLA-II的DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1基因4号外显子的引物组成。
8.根据权利要求1所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述组成试剂（c）HLA Target Mix2由5’read 1引物、靶向HLA-I的A、B、C基因的6或7号外显子的引物、靶向HLA-II的DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1基因4号外显子区域的引物组成；
所述HLA Target Mix2中HLA-II的靶向引物结合位点位于HLA Target Mix1中HLA-II的靶向引物的内侧。
9.根据权利要求7所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述HLA Target Mix1的HLA-I的A、B、C基因的上游引物HLA-I Target Mix1-F为：5’-CAGACGCCGAGGATGGCC-3’；
所述HLA Target Mix1的HLA-I的A、B、C基因的下游引物HLA-I Target Mix1-R为：5’-CAGAGCCCTGGGCACTGT-3’；
所述HLA Target Mix1的HLA-II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因的上游引物HLA-IITarget Mix1-F为：
DPA-1：5’-ATGCGCCCTGAAGACAGAATGT-3’；
DPB-1：5’-ATGATGGTTCTGCAGGTTTCTGC-3’；
DQA-1：5’-ATGATCCTAAACAAAGCTCTG-3’；
DQB-1：5’-GAARAAGKCTTTGCGGATCCC-3`；
DRA-1：5’-ATGGCCATAAGTGGAGTCCC-3’；
DRB-1：5’-GTGCTGAGCTCCCSACTGG-3’；
所述HLA Target Mix1的HLA-II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因的下游引物HLA-IITarget Mix1-R为：
DPA-1：5’-TTATGATGAGGACGGTGCCC-3’；
DPB-1：5’-ATGAAGATGCCCACTCCACA-3’；
DQA-1：5’-CCTTCCAGGATGGGATTCACAAT-3’；
DQB-1：5’-GATGATAAGGCCCAGCCCAA-3’；
DRA-1：5’-GCTTTTGCGCAATCCCTTGAT-3’；
DRB-1：5’-TCCTGAAGTAGATGAACAGCCC-3’。
10.根据权利要求8所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述HLA Target Mix2的HLA-I的A、B、C基因上游引物HLA-I Target Mix2-F为：5`-TGGCCCTGACCSAGACCTG-3`；
所述HLA Target Mix2的HLA-I的A、B、C基因下游引物HLA-I Target Mix2-R为：
A-2：5’-TCACACTTTACAAGCTGTGA-3’；
B-2：5’-TGCCAGAGGCTCTTGAAGTC-3’；
C-2：5’-TGCAGAAAGAGATGCCAGAGG-3’；
所述HLA Target Mix2的HLA-II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因上游引物为HLA-IITarget Mix 2-F为：
DPA-1：5’-ATGCGCCCTGAAGACAGAATGT-3’；
DPB-1：5’-ATGATGGTTCTGCAGGTTTCTGC-3’；
DQA-1：5’-ATGATCCTAAACAAAGCTCTG-3’；
DQB-1：5’-GAARAAGKCTTTGCGGATCCC-3’；
DRA-1：5’-ATGGCCATAAGTGGAGTCCC-3’；
DRB-1：5’-GTGCTGAGCTCCCSACTGG-3’；
所述HLA Target Mix2的HLA-II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因下游引物HLA-IITarget Mix2-R为：
DPA-2：5’-TTATGATGAGGACGGTGCCC-3’；
DPB-2：5’-CCACTCCACAGATGATGAGC-3’；
DQA-2：5’-TTCCAGGATGGGATTCACAATGG-3’；
DQB-2：5’-GATGATAAGGCCCAGCCCAA-3’；
DRA-2：5’-TAATGATGCCCACCAGACCCA-3’；
DRB-2：5’-TCCTGAAGTAGATGAACAGCCC-3’。
11.根据权利要求1-10所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所有引物选自其目的基因引物结合位点上下200bp的范围内，即HLA-A,B,C和HLA-DPA,DPB,DQA,DQB,DRA,DRB靶向引物结合位点第一个核苷酸和最后一个核苷酸上下游200bp的范围。
12.根据权利要求1所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述组成试剂（d）为多重PCR专用试剂，选自Taq酶、dNTP、Buffer、盐离子中的任意一种或多种。
13.根据权利要求1所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述捕获后DNA文库构建的试剂（e）的配置包含以下步骤：
（i）DNA的片段化反应；
（ii）片段化后DNA的末端修复、3`端加A；
（iii）末修及加A后DNA添加测序接头；
（iv）文库index PCR扩增。
14.根据权利要求1-13任一项所述的一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒的使用方法，其特征在于，包含以下步骤：
RNA逆转录合成cDNA及纯化；
（ii）HLA靶向第一次富集及纯化；
（iii）HLA靶向第一次富集及纯化所得产物的第二次富集及片段分选；
（iv）捕获文库构建。
15.根据权利要求14所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(i)RNA逆转录合成cDNA及纯化，是将RNA、逆转录酶、TSO引物、Poly d(T)引物、Buffer等组分分别加入反应管，在PCR仪器上进行cDNA第一链合成，并使用磁珠、离心柱、分离柱等方法对cDNA产物进行纯化，去掉其中过量的Oligo及逆转录组分，即得到第一链cDNA产物。
16.根据权利要求14所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(ii)HLA靶向第一次富集及纯化，是将10x Genomics平台获得的单细胞cDNA和第一次富集所需要的PCR组分分别加入反应管，在PCR仪器上按进行第一次靶向富集，并使用磁珠、离心柱、分离柱等方法对第一次靶向富集的产物进行纯化，去掉其中过量的oligo及PCR组分，即得到第一次靶向富集及纯化后的产物。
17.根据权利要求14所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(iii)HLA靶向第一次富集及纯化所得产物的第二次富集及片段分选，是将第一次靶向富集及纯化后得到的产物作为第二次靶向富集的模板，与所需PCR组分分别加入反应管，在PCR仪器上进行第二次靶向富集，使用0.5X和0.8X 磁珠的方法或其他等效的分选方法对反应产物进行纯化，即得到第二次靶向富集及分选后的产物。
18.根据权利要求14所述的检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤（iv）获得捕获文库的步骤为：使用打断酶在合适的条件下对步骤（iii）获得的第二次靶向富集及分选的产物进行酶切打断、末端修复、3’端加A，之后用连接酶进行接头连接，再使用磁珠、离心柱、分离柱等方法对连接产物进行纯化，纯化后通过PCR将测序接头和sample index加在所得片段的两端，再用磁珠、离心柱、分离柱等方法对反应产物再次进行纯化，即得到测序文库。
19.根据权利要求1-18任一项所述的一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，应用于HLA-I/II类基因的捕获文库构建。
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