CN114522170A - 靶向adora2a受体的拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途 - Google Patents

靶向adora2a受体的拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途 Download PDF

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CN114522170A CN202210214888.3A CN202210214888A CN114522170A CN 114522170 A CN114522170 A CN 114522170A CN 202210214888 A CN202210214888 A CN 202210214888A CN 114522170 A CN114522170 A CN 114522170A
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Abstract

本发明提供了靶向ADORA2A受体的拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤药物中的用途。进一步的，所述的靶向ADORA2A受体的拮抗剂的结构式为：
Figure DDA0003532557360000011
本发明还提供了ADORA2A作为靶点在筛选治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途。本发明发现拮抗剂SCH58261可特异性的抑制神经内分泌表型的LNCaP/AR+shRB1/TP53、LASCPC1细胞的增殖能力；而对前列腺腺癌表型细胞系VCaP、LNCaP/AR的细胞生长增殖没有影响。另外加上肿瘤模型与现有的应用相比，拮抗剂SCH58261在神经内分泌肿瘤的治疗作用更加特异，为临床上分子靶向化合物治疗提供新的思路与进展。

Description

靶向ADORA2A受体的拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤的药 物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种ADORA2A拮抗剂，具体来说是靶向ADORA2A受体的拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途。
背景技术
神经内分泌肿瘤是近10年才明确界定的一类恶性肿瘤，指光镜下不易区分，组织来源不易确切诊断，形态以小圆细胞为主的一类恶性肿瘤。神经内分泌肿瘤是极为恶性的一类肿瘤。在肺癌中神经内分泌肺癌约占所有肺癌的15％，具有异常高的增殖率、显著的早期转移倾向和预后不良的特征(Small cell lung cancer.Nat Rev Dis Primers 7，4(2021))。在前列腺癌症中的神经内分泌前列腺癌也是极致命的疾病，患者的生存期一般不超过一年。这类疾病对人类的生存健康构成了极大的威胁。
目前临床对此类疾病也没有较好的治疗手段，主要还是以外科手术为主，辅助放疗和铂类联合化疗及免疫治疗的结合等杀死原位肿瘤细胞及潜在的转移病灶。放化疗作用机制是借助细胞毒化合物以及放射线来抑制肿瘤细胞增殖从而达到杀死肿瘤细胞的目的。放、化疗手法由于其作用机制，对细胞增殖时期的正常细胞也有杀伤作用，因此毒副作用较大。相较于放化疗的低特异性，分子靶向化合物的诞生则为高效精准的靶向治疗肿瘤带来新生机。并且分子靶向化合物能够特异性作用于肿瘤细胞中异常激活的信号通路或生物学进程，与传统放、化疗相比更高效、副作用更小。那么寻找一种特异性靶向神经内分泌癌症的靶点和有效的靶向抑制药物显得十分重要。
ADORA2A(也称为A2AR)是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联受体(GPCR)超家族的一个成员。它是七次跨膜蛋白，使用腺苷作为首选的内源性激动剂，并优先与G蛋白的G(s)和G(olf)家族相互作用，以增加细胞内cAMP水平，激活细胞内信号转导途径，对外界的信号做出反应。目前的研究中ADORA2A在心脏节律和循环、脑和肾血流、免疫功能、疼痛调节和睡眠等生物功能中发挥着重要作用。另外也与炎症性疾病和神经退行性疾病等病理生理条件相关，ADORA2A可以抑制免疫细胞，从而保护组织免受炎症。ADORA2A也在大脑中表达，在调节谷氨酸和多巴胺释放方面发挥重要作用，是治疗失眠、疼痛、抑郁和帕金森病等疾病的潜在治疗靶点。拮抗剂SCH58261是强效、选择性、竞争性的ADORA2A受体的拮抗剂。在以往的研究报道中该拮抗剂的功能主要是靶向免疫细胞起到免疫调节的作用，也可以抑制肿瘤相关成纤维细胞CAF的生长。其作用的研究领域还比较窄。经过探索研究在本发明中发现该拮抗剂具有更好的针对神经内分泌肿瘤的治疗效果。
拮抗剂SCH58261的化学结构：
Figure BDA0003532557340000021
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了ADORA2A拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途，所述的这种用途要解决现有技术对于治疗神经内分泌肿瘤的效果不佳的技术问题。
本发明提供了靶向ADORA2A受体的拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途。
进一步的，所述的靶向ADORA2A受体的拮抗剂的结构式为：
Figure BDA0003532557340000022
本发明还提供了ADORA2A作为靶点在筛选治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途。
本发明发现靶向ADORA2A受体的拮抗剂SCH58261在治疗神经内分泌肿瘤中的新作用。我们发现拮抗剂SCH58261可特异性的抑制神经内分泌表型的LNCaP/AR+shRB1/TP53、LASCPC1细胞的增殖能力；而对前列腺腺癌表型细胞系VCaP、LNCaP/AR的细胞生长增殖没有影响。并且将SCH58261对应靶标基因ADORA2A在LNCaP/AR+shRB1/TP53、LASCPC1这两种细胞进行干扰后，细胞的增殖速率与对照scramble相比减弱，与使用拮抗剂效果一致。
我们进一步发现使用拮抗剂SCH58261后神经内分泌细胞LASCPC1细胞周期中G2增殖期比例减少。并在本发明中发现并证明拮抗剂SCH58261可特异的抑制神经内分泌细胞系TC1、rb1Δ/Δp53Δ/Δ类器官在小鼠体内的生长。与现有的应用相比，拮抗剂SCH58261在神经内分泌肿瘤的治疗作用更加特异，为临床分子靶向化合物治疗提供新的思路与进展。
附图说明
图1显示通过CellTiter-Glo细胞增殖检测方法来检测拮抗剂SCH58261处理下，LNCaP/AR与LNCaP/AR+shRB1/TP53细胞系的细胞增殖情况结果图；
图2显示通过CellTiter-Glo细胞增殖检测方法来检测拮抗剂SCH58261不同浓度处理下，VCaP与LASCPC1细胞增殖的情况结果图；
图3显示通过CellTiter-Glo细胞增殖检测方法来检测拮抗剂SCH58261不同浓度处理下及不同时间点中A549与NCI1688细胞增殖的情况结果图；
图4显示通过CCK8细胞增殖检测方法，检测干扰ADORA2A后，在拮抗剂SCH58261处理下LNCaP/AR+shRB1/TP53+shADORA2A细胞与scramble细胞的增殖情况对比结果；
图5显示通过CellTiter-Glo细胞增殖检测方法，检测干扰ADORA2A后，在拮抗剂SCH58261处理下LASCPC1+shADORA2A细胞与scramble细胞的增殖情况对比结果；
图6显示通过流式细胞术检测在不同浓度拮抗剂SCH58261处理下神经内分泌肿瘤细胞系LASCPC1细胞周期变化结果图；
图7通过RT-PCR检测MyC-CaP与TC1两种细胞系终mRNA表达水平；
图8显示在拮抗剂SCH58261治疗下，检测小鼠细胞系MyC-CaP在小鼠皮下植瘤后，体内成瘤能力结果图；
图9显示在拮抗剂SCH58261治疗下，检测小鼠细胞系TC1在小鼠皮下植瘤后，体内成瘤能力结果图；
图10显示在拮抗剂SCH58261治疗下，检测rb1Δ/Δp53Δ/Δ类器官小鼠前列腺原位植瘤，体内原位成瘤能力结果图；
以上各图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
具体实施方法
下面结合实施例具体说明本发明。本发明的实验材料有如下所示购买的，也有按照教科书的教导制备的，均为现有技术，在此不再赘述。
实验材料：
拮抗剂SCH58261(购自MCE，货号HY-19533)，人前列腺癌细胞系LNCaP构建而来的LNCaP/AR和LNCaP/AR+shRb1/TP53，和人前列腺细胞系VCaP、LASCPC1，肺癌细胞系A549、NCI1688；小鼠前列腺癌细胞系MyC-CaP、TC1及神经内分泌肿瘤Pbsn-Cre4；Rbfl/fl；Trp53fl /fl小鼠来源的前列腺癌上皮类器官rb1Δ/Δp53Δ/Δ类器官。
其中A549、NCI-H1688、LNCaP均来自ATCC。实验中使用的C57BL/6、FVB和BALB/c-六周大的雄性小鼠均来自上海斯莱克实验动物有限责任公司。本发明中使用的基因小鼠Pbsn-Cre4；Rbfl/fl；Trp53fl/fl由Jackson实验室(https://www.jax.org/)基因小鼠杂交而来。所有小鼠实验均按照仁济医院实验动物使用与护理委员会批准的规程进行。
CellTiter-
Figure BDA0003532557340000041
3D发光法细胞活力检测试剂盒(购自promega，货号G9682)，CCK8细胞增殖检测试剂((同仁，cck8-kit，CK08)，细胞/组织总RNA提取试剂盒(购自Vazyme，货号RC101-01)。Matrigel Matrix(购自CORNING，货号356234)。DAPI(购自ThermoFisher，货号D21490)，HITES培养基包括RPMI-1640Medium、0.005mg/ml Insulin(购自MCE，HY-P0035)、0.01mg/ml Transferrin(购自sigma,T8158)、终浓度30nM Sodium selenite(购自sigma,S5261)、终浓度10nM Hydrocortisone(购自sigma,H0888)、终浓度10nMβ-estradiol(购自sigma,E8875)、终浓度2mM L-glutamine(Gibco,25030-081)、体积百分比5％FBS(购自Gibco)。
实施例1
细胞增殖实验
实验步骤：
选择前列腺腺癌细胞系VCaP与前列腺小细胞癌细胞系LASCPC1作对照，以及将前列腺癌细胞系LNCaP/AR与LNCaP/AR干扰RB1、TP53后表现为神经内分泌癌表型的细胞LNCaP/AR-shRB1/TP53作对照，检测拮抗剂SCH58261及其标靶基因ADORA2A对细胞增殖的影响。
1、细胞系的建立方法：
包装AR过表达载体慢病毒(载体购自addgene,编号85128)，感染LNCaP细胞，经过筛选获得LNCaP/AR细胞。在该细胞基础上，设计干扰靶向RB1、TP53的shRNA，构建载体，将载体包装慢病毒感染LNCaP/AR细胞构建LNCaP/AR-shRB1/TP53；设计干扰靶向ADORA2A的shRNA，包装慢病毒感染LNCaP/AR-shRB1/TP53、LASCPC1细胞构建shADORA2A细胞；以及包装scramble载体慢病毒感染对应细胞系获得scramble细胞系。
shRNA干扰序列如下：
Figure BDA0003532557340000051
载体构建过程如下：首先对购买的慢病毒表达载体lenti MS2-P65-HSF1-Hygro(载体购自addgene,编号61426)进行改造，使用BsiWI和BsrGI进行双酶切，切除载体中间片段，使载体自连形成所用的目的骨架。完成载体改造之后，设计分别靶向RB1、TP53的shRNA序列，将设计好的两段靶向shRNA序列，加上NheI酶切位点及U6启动子序列，合成shRB1-TP53双shRNA序列。然后使用NheI对改造的载体及合成的双shRNA片段进行单酶切，之后对获得的酶切产物去磷酸化，产物纯化后，利用T4连接酶，将shRB1-TP53序列构建到改装载体上，获得靶向RB1和TP53目的载体。
合成NheI-humanU6-shRB1-SPACER-humanU6-shTP53-SPACER-NheI双shRNA序列如下：(首尾阴影为酶切位点，中间阴影为靶向shRNA序列)GCTAGCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGTAAGATCTCCAAAGAAATTCAAGAGATTTCTTTGGAGATCTTACATTTTTTTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTCGCTTCACGAGATTCCAGCAGGTCGAGGGACCTAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTTTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTCGCTTCACGAGATTCCAGCAGGTCGAGGGACCTAGCTAGC(SEQ ID NO.5所示)
同样靶向ADORA2A序列(sh-ADORA2A#1，sh-ADORA2A#2)，分别构建到改造后的慢病毒表达载体lenti CRISPRV2-puro(购自addgene,编号98290)上，获得靶向ADORA2A的目的载体。其中所使用载体为lenti CRISPRV2-puro通过XbaI和BamHI进行双酶切，去掉Cas9序列，使用T4连接酶与XbaI和BamHI双酶切后的linker DNA构建成新的载体。linker DNA序列如下：linker-F(CTAGGCCACCATGGGCC)(SEQ ID NO.6所示)；linker-R(CTAGGCCACCATGGGCC)(SEQ ID NO.7所示),退火后形成双链DNA。以上序列均由上海生工生物技术公司合成。
慢病毒的生产：准备10cm培养皿的低代数HEK293T，转染前将培养基换成无血清培养基。然后在EP管内加入500μL无血清的DMEM培养基，将目的载体与病毒包装辅助质粒psPAX2，pMD2.G(购自Addgene，编号12260，12259)按照DNA质量3:2:1的量混合均匀，之后加入3倍总DNA量的PEI(1μg/μL)，涡旋振荡混匀。在室温孵育15min，将DNA/PEI混合物加入HEK293T，6-8小时更换成含有体积百分比浓度为10％FBS的DMEM完全培养基，转染48小时后收集细胞上清液，用0.45μM滤器(Millipore)过滤除掉细胞碎片，直接将上清液冻于-80以备使用，或者4度22000rpm高速离心2小时，弃上清，用50μLPBS溶解病毒沉淀，浓缩病毒液用于后续细胞感染。
(2)目的细胞系获得：LNCaP细胞培养于RPMI 1640(Gibco)完全培养基中(添加体积百分比浓度为1％Penicillin/streptomycin(Gibco 15140-122)，体积百分比浓度为10％FBS(Gibco))。待LNCaP细胞贴壁率达到60-80％时，按照体积比1：4将新鲜培养液与步骤2中得到的过表达病毒AR上清，以及终浓度8μg/ml polybrene(millipore，TR-1003-G)混合摇匀加入培养皿内。病毒感染16h换成正常培养基，感染48小时后，加入含5μg/mlBlasticidin抗生素(购自InvivoGen，ant-bl-1)的完全培养基培养细胞对目的细胞进行筛选，经验证获得LNCaP/AR细胞。在LNCaP/AR细胞中干扰RB1和TP53与上述方法一致，将LNCaP/AR细胞分别感染Scramble和shRB1-TP53载体病毒，抗生素筛选时加入含100μg/mlHygromycin(购自InvivoGen，ant-hg-1)的1640完全培养基，对得到细胞进行验证，获得LNCaP/AR+shRb1/TP53细胞及对应的LNCaP/AR细胞。在LNCaP/AR-shRB1/TP5细胞中干扰ADORA2A与上述方法一致，抗生素筛选时加入含5μg/ml Puromycin(购自InvivoGen，ant-pr-1)的1640完全培养基，经验证获得LNCaP/AR+shRb1/TP53+shADORA2A与对应细胞。
(3)由于LASCPC1是悬浮细胞，取5×10^6个LASCPC1细胞消化成单细胞悬液，将30μL干扰shADORA2A病毒浓缩液及scramble病毒浓缩液与2mlHITEIS培养基混合，并按终浓度8μg/ml加入辅助转染试剂polybrene(millipore，TR-1003-G)，重悬LSCPC1细胞，种植于六孔板内。3000rpm，26℃离心2h。离心结束将细胞收集于离心管，加入10mlPBS，300g 5min离心，弃上清。加入新鲜培养基重新种于六孔板内，48h后加入含1μg/ml puromycin的HITES对感染细胞进行筛选。
2、拮抗剂SCH58261处理下，体外细胞增殖实验检测：
(1)LNCaP/AR及LNCaP/AR-shRB1/TP5细胞系检测方法。取LNCaP/AR及对应的干扰细胞系LNCaP/AR-shRB1/TP5细胞系消化成单细胞悬液，按3000个细胞/孔的密度接种取96孔板，每种细胞系每种处理平行做6个孔。待到细胞贴壁后，将弃去原来培养基，对每种细胞分别换成阴性对照组(添加溶剂DMSO)培养基，阳性对照组(添加20μM SCH8261)培养基，每隔一天换液100μL。培养至第四天时，弃去培养基，每孔加入100μL PBS，再加入
Figure BDA0003532557340000081
3D，室温孵育15min，将裂解液转移至化学发光检测特殊的96孔板(Fluidx，66-42049-L)中进行化学发光的检测。具体检测方法参考Promega公司CellTiter-
Figure BDA0003532557340000082
3D发光法细胞活力检测试剂盒操作说明。检测仪器：Promega公司
Figure BDA0003532557340000083
DiscoverSystem，软件程序为仪器自带的CellTiter-Glo luciferase assay system检测体系。
(2)VCaP及LASCPC1细胞系检测方法。VCaP检测方法同上述(1)中方案。对于LASCPC1悬浮细胞，将按3000个细胞/孔的密度接种取96孔板，直接使用对照组(添加溶剂DMSO)培养基与实验组(添加20μM SCH8261)培养基重悬细胞，每隔一天补加50μL培养基，在第四天准备检测时，将细胞收集至EP管内，1200rpm离心去上清，细胞沉淀用100μLPBS重悬，加入100μLCellTiter-
Figure BDA0003532557340000085
3D，室温孵育15min，将裂解液转移至化学发光检测特殊的96孔板(Fluidx，66-42049-L)中进行化学发光的检测。
(3)A549及NCI1688细胞系检测方法。将A549及NCI1688细胞消化单细胞悬液，根据细胞生长速度按2000和5000个细胞/孔的密度接种取96孔板，使用对照组(添加溶剂DMSO)培养基与实验组(添加10/20μM SCH8261)培养基两种细胞细胞，每种细胞系每种处理平行做6个孔，每隔一天弃去原来培养基换液100μL。细胞过夜贴壁后，定义为0天，检测培养第0、2、5、7天细胞增殖情况，弃去培养基，加入100ΜlPBS及等量的CellTiter-
Figure BDA0003532557340000084
3D，室温孵育15min，将裂解液转移至化学发光检测特殊的96孔板(Fluidx，66-42049-L)中进行化学发光的检测。取第0天每组细胞荧光值的平均值，计算不同时间点的检测荧光值与其比值，得到每组细胞的相对增殖率。
(3)分析结果。用CellTiter-Glo试剂盒检测到的荧光值代表每组中细胞的活力，由于荧光值与细胞数目和活力是成正比的，所以能够线性直观的反映细胞数量。
结果在图1和图2中看出，对比对照组与实验组结果发现拮抗剂SCH58261对前列腺腺癌细胞系LNCaP/AR与VCaP的生长没有影响；但可以抑制神经内分泌表型的LNCaP/AR-shRB1/TP5与LASCPC1前列腺癌细胞的生长速率；在图3中，对照组与实验组结果对比发现拮抗剂SCH58261对肺腺癌细胞系A549细胞在不同时间点的生长都没有影响，而神经内分泌肺癌细胞系NCI1688细胞生长在培养至第5天时，实验细胞生长开始受到抑制，培养至第7天与对照组相比细胞生长抑制更加明显。以上说明拮抗剂SCH58261对神经内分泌癌细胞系的增殖抑制具有特异性与普遍性。
3、干扰ADORA2A细胞系体外细胞增殖实验检测：
(1)LNCaP/AR-shRB1/TP5及对应ADORA2A干扰细胞系检测。取LNCaP/AR-shRB1/TP5及对应的干扰细胞系shADORA2A1#、shADORA2A2#细胞系消化成单细胞悬液，按3000个细胞/孔的密度接种取96孔板，每种细胞系每种处理平行做6个孔，每隔一天换液100μL。待细胞贴壁后，开始使用CCK8检测细胞吸光度。细胞过夜贴壁后，定义为0天，之后对2、4、6天进行检测。检测时将CCK8试剂与1640培养基按1：10进行稀释，弃去孔内培养基，没孔内加入100μLCCK8稀释液，在37℃孵育1.5小时，然后在酶标仪(BioTek)上检测490nm处的吸光度，吸光度与细胞数目和活力是成正比的，能够线性直观反映细胞数目大小。
结果如图4，与加入SCH58261结果一致，干扰其靶标ADORA2A可以减缓LNCaP/AR-shRB1/TP5的增殖速率。
(2))LASCPC1及对应ADORA2A干扰细胞系检测。同上取LASCPC1及对应的干扰细胞系shADORA2A 1#、shADORA2A 2#细胞系消化成单细胞悬液，按5000个细胞/孔的密度接种取96孔板，每种细胞系每种处理平行做6个孔，每隔一天补液50μL。细胞铺板一天后定义为第1天，开始用CellTiter-
Figure BDA0003532557340000091
3D检测，另选取3、5天进行检测。同上，检测是将细胞收集至EP管内，离心弃上清，加入100μL PBS与等体积的CellTiter-
Figure BDA0003532557340000092
3D，室温孵育15min，将裂解液转移至化学发光检测特殊的96孔板(Fluidx，66-42049-L)中进行化学发光的检测。取第一天每组细胞荧光值的平均值，计算不同时间点的检测荧光值与其比值，得到每组细胞的相对增殖率。
结果如图5，与加入SCH58261结果一致，干扰其靶标可以减缓LASCPC1的增殖速率。
4、细胞周期检测实验
取LASCPC1细胞系，消化为单细胞悬液，取2×105细胞量，接种于24孔板内，设置对照组(添加溶剂DMSO)培养与实验组(添加10μM、20μMSCH8261)培养，每组3个平行复孔，用对应的培养基各500μL重悬细胞，每隔一天补加100μL培养基。在培养第四天时，1200rpm离心5min收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。250μLPBS重悬，边轻轻涡旋，边缓慢滴加750μL预冷的无水乙醇，至终浓度(体积百分比浓度)75％，4℃静置过夜(18-24h)，-20℃固定4h以上，准备流式检测。将固定好的细胞用预冷PBS洗两次，2000rpm，5min去除PBS后加入200μL PBS，轻轻弹击离心管底，以适当分散细胞，避免细胞成团。每管内加入1μg/ml的DAPI染料，避光4度染色30min，再加入200μL PBS，充分混匀细胞，用200目滤网过滤后，上流失细胞仪进行细胞周期检测。流式结果用FlowJo分析。
结果如图6所示，与对照组相比在拮抗剂SCH58261处理下，实验组的处于增殖期G2期细胞占比较低，说明实验组细胞增殖缓慢。
5、体内成瘤实验
(1)Real-time PCR
利用Vazyme的细胞/组织总RNA提取试剂盒，抽提细胞MyC-CaP及TC1中的中RNA。运用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)试剂盒反转录RNA合成cDNA，进一步通过SYBR Green实时定量RT-PCR技术(Takara RR420A)，检测SCH58261靶标ADORA2A，和神经内分泌肿瘤细胞标志物SYP、NSE，以及前列腺腺癌标志基因AR，在两种细胞系上mRNA水平的差异。用ΔΔct方法以内参ACTIN的表达水平标准化检测基因的表达水平。用MyC-CaP作为对照，量化检测基因的表达水平，结果如图7所示。证明TC1表现为神经内分泌癌症表型。
(2)拮抗剂SCH58261处理下，皮下植瘤实验
准备MyC-CaP及TC1单细胞悬液，重悬于不含血清的RPMI 1640基础培养基中；将Matrigel在4℃解冻。将50μL基本培养基含有1×10^6个细胞的悬浮液与等体积的Matrigel混合均匀，将混合物置于冰上。将MyC-CaP与TC1的Matrigel混合物分别注射6周大的FVB和BALB/c-nu小鼠皮下，注射量为100μL/只。待肿瘤长至肉眼可见大小时，将皮下植瘤小鼠随机分为两组，对照组腹腔注射(87％生理盐水、10％HS-15助溶剂、3％DMSO混合物)，实验组腹腔注射(87％生理盐水、10％HS-15助溶剂及3％溶解于DMSO的拮抗剂SCH58261混合物)。根据小鼠状况，每隔三天，按小鼠体重6mg/kg进行腹腔给药，至小鼠处死前。另外使用游标卡尺，测量肿瘤大小。计算的方法是V＝a2×b(其中V是体积，a是最短边的长度，b是最长边的长度)。
结果如图8和9所示，可以看出SCH58261不影响MyC-CaP细胞在体内的生长，而特异性的抑制神经内分泌癌细胞TC1在体内的生长。
(3)拮抗剂SCH58261处理下，小鼠原位植瘤实验
小鼠来源的前列腺癌组织建立rb1Δ/Δp53Δ/Δ类器官的步骤如下：
首先前列腺肿瘤分离：
1)将小鼠使用二氧化碳窒息法处死，用70％酒精浸泡5min，并放在灭菌后的擦手纸上，擦手纸固定于泡沫板上，胶布固定；
2)用镊子捏住小鼠阴茎上方皮肤，用剪刀在皮肤层做一竖切口，再将竖切口由皮肤中线延长至小鼠颈部，暴露胸腔和腹腔；
3)拿出另一套无菌器械，使用剪刀和直镊，小心地在直肠上方0.75cm处切开腹肌层，找到膀胱，然后将膀胱上拉，露出下面的尿道，垂直下剪使其靠在前列腺背侧剪断尿道，然后向上牵拉，剪断与睾丸相连的组织，将余下的组织置于装有无菌PBS的10cm培养皿中；
4)在体式镜下用显微镊依次去除精囊腺、膀胱、尿道及脂肪，得到前列腺组织。
其次前列腺的消化及类器官的建立：
1)用剪刀将前列腺组织剪碎至直径约2毫米的小块，并在RPMI培养基中消化，该培养基包含0.2mg/mL胶原酶I，0.2mg/mL胶原酶IV，0.01mg/mL Dnase I，0.1mg/mL Dispase和2％FBS；
2)在振荡器中37℃以120rpm消化1.5h。用2倍体积含10％FBS的DMEM中和消化后的组织，使其通过40μm细胞筛以获得单细胞悬液；
3)350g离心5min，弃上清；
4)用(体积百分比浓度)2％FBS重悬细胞，以CD16/32抗体封闭30min；
5)用CD326(EpCam)孵育30-60min，整个染色过程在冰上进行；
6)将anti-biotin microbeads以20μL每107个细胞的剂量添加到细胞悬液并在4℃摇床上孵育15-30min；
7)将MS column或LS column放入磁力架，柱子的选择视细胞量决定：MS column适合分选107个标记后的细胞(总细胞数2×108)；LS column适合分选10–10个标记后的细胞(总细胞数107–2×108)；
8)以500μL或1mL DPBS润洗柱子，保持溶液在4-7℃，将细胞悬液转移至柱子，开始分选。待细胞悬液即将流尽时，以500μL或1mL含体积百分比0.5％FBS的DPBS冲洗柱子2次以提高纯度。最后以1mL或5mL含体积百分比0.5％FBS的DPBS通过推动活塞洗脱吸附在磁珠上的EpCam+上皮细胞；
10)350g离心5min，弃上清，细胞计数后，以2000-10000个细胞/孔的标准将上皮细胞铺在超低吸附96孔板中，放入细胞培养箱，进行organoid的培养，足够细胞时进行实验。
取rb1Δ/Δp53Δ/Δ类器官，加入预冷的PBS将细胞洗两遍，去除培养基中的Matrigel，每次4℃350g离心5min，弃上清；0.25％Trypsin-EDTA消化类器官为单细胞悬液，10％FBS的DMEM中和，以350g离心5min，弃上清；用冷的无血清培养基重悬，将悬液与等体积的Matrigel混合均匀，将混合物置于冰上。之后麻醉六周大的C57BL/6小鼠，剃毛备皮待用。于右髋关节水平与中线交界的一半稍靠下处切约1cm长的横向切口，用剪刀依次剪开皮肤层与腹肌层，定位腹腔中的精囊，并将附着在精囊上的前列腺前叶暴露出来。左手固定精囊腺，右手用胰岛素针将25-50μL的类器官悬浮液缓慢注入前列腺前叶，可观察到有小泡形成。用弯头镊将前列腺和精囊小心复位至腹腔，然后用尼龙手术缝合线依次缝合腹肌层，安尔碘消毒，再缝合皮肤层，安尔碘消毒。整个手术过程在加热垫上进行操作，直到小鼠完全从麻醉中恢复。原位注射一周后，同上(2)中将小鼠随机分为对照组与实验组，每隔三天，按小鼠体重6mg/kg进行腹腔给药SCH58261，至原位移植21天将小鼠处死，取出原位肿瘤进行称重比较。
结果如图10所示，与对照组相比靶向ADORA2A的拮抗剂SCH58261，可抑制rb1Δ/Δp53Δ/Δ类器官在小鼠体内原位的生长。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院
<120> 靶向ADORA2A的受体的拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaagatct ccaaagaaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactccagtg gtaatctac 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctcatgct gggtgtctat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgcatcccg ctccggtaca a 21
<210> 5
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctagcgagg gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt 60
agagagataa ttggaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga 120
cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac 180
tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg 240
aaaggacgaa acaccgtgta agatctccaa agaaattcaa gagatttctt tggagatctt 300
acattttttt cgaggtcgac ggtatcgata agctcgcttc acgagattcc agcaggtcga 360
gggacctaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 420
ttagagagat aattggaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 480
gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 540
actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 600
ggaaaggacg aaacaccgac tccagtggta atctacttca agagagtaga ttaccactgg 660
agtctttttt tcgaggtcga cggtatcgat aagctcgctt cacgagattc cagcaggtcg 720
agggacctag ctagc 735
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctaggccacc atgggcc 17
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctaggccacc atgggcc 17

Claims (3)

1.靶向ADORA2A受体的拮抗剂在制备治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的靶向ADORA2A受体的拮抗剂的结构式为：
Figure FDA0003532557330000011
3.ADORA2A作为靶点在筛选治疗神经内分泌肿瘤的药物中的用途。
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. KALHAN等: "Adenosine A2A and A2B receptor expression in neuroendocrine tumours: potential targets for therapy", 《PURINERGIC SIGNALLING》, vol. 8, no. 2, pages 265, XP035054529, DOI: 10.1007/s11302-011-9280-5 *

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