CN114518402B - 一种电化学传感器、制备方法及其在甲氨蝶呤浓度检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及电化学传感器技术领域，具体涉及一种电化学传感器、制备方法及其在甲氨蝶呤浓度检测中的应用。在多壁碳纳米管/乙炔黑电极表层滴加十八烷基三甲基氯化铵后干燥得到多壁碳纳米管‑乙炔黑‑STAC电极，即为所述电化学传感器。本发明电化学传感器可以实现唾液中0.05‑8μM范围内MTX的检测。并且所述电化学传感器制备方法简单，所需仪器比较便宜，操作简单方便。
Description
技术领域
本发明涉及电化学传感器技术领域，具体涉及一种电化学传感器、制备方法及其在甲氨蝶呤浓度检测中的应用。
背景技术
甲氨蝶呤，为抗叶酸类抗肿瘤药，为橙黄色结晶性粉末，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。主要适用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎、头颈部肿瘤、骨肿瘤、白血病脑膜脊髓浸润、肺癌、生殖系统肿瘤、肝癌、顽固性普通牛皮癣、系统性红斑狼疮、皮肌炎等自身免疫病。甲氨蝶呤血药浓度与不良反应和疗效之间存在密切关系且个体差异大、治疗窗窄、毒性大。为安全有效地实施甲氨蝶呤给药，监测甲氨蝶呤用药后的血药浓度尤为必要。
现在临床检测用的比较多的方法有液相色谱方法和液相色谱-质谱方法，但这由于液相色谱仪、液相色谱-质谱联用仪的价格比较昂贵(几十万-几百万)，导致甲氨蝶呤的检测成本极高；另外还有在用的发光和均相酶免疫的方法，但存在免疫交叉反应的影响，测定结果不能保证。
发明内容
基于上述内容，本发明提供一种电化学传感器、制备方法及其在甲氨蝶呤浓度检测中的应用。
本发明的技术方案之一，一种电化学传感器，结构为多壁碳纳米管/乙炔黑电极表层吸附十八烷基三甲基氯化铵。
本发明的技术方案之二，上述电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)乙炔黑和多壁碳纳米管研磨均匀后填充电极得到多壁碳纳米管/乙炔黑电极；
(2)多壁碳纳米管/乙炔黑电极表面经打磨至光滑后滴加十八烷基三甲基氯化铵溶液；
(3)静置、干燥得到多壁碳纳米管-乙炔黑-STAC电极，即为所述电化学传感器。
进一步地，所述步骤(1)中乙炔黑和多壁碳纳米管的质量比为(1～5):(5～1)，研磨过程中添加石蜡油，研磨时间10-30min。石蜡油有一定的粘性，赋予这两种混合材料一定的粘度，从而方便后续电极的填充。
进一步地，所述步骤(2)使用光面称量纸对多壁碳纳米管/乙炔黑电极表面进行打磨；所述十八烷基三甲基氯化铵溶液的浓度为0.1-0.7mM，滴加量为1-10μL。
进一步地，所述步骤(3)静置1-7min，甩干后室温干燥。
本发明的技术方案之三，上述电化学传感器在甲氨蝶呤浓度检测中的应用。
进一步地，所述所述的电化学传感器在唾液中甲氨蝶呤浓度检测中的应用。
本发明的技术方案之四，一种甲氨蝶呤浓度检测方法，包括以下步骤：
将上述电化学传感器浸入甲氨蝶呤待测液中吸附甲氨蝶呤至饱和后经CV方法检测电流值，根据电流值得出甲氨蝶呤的浓度。
吸附一定时间达到饱和吸附后，再增加时间吸附量也不会有明显的增加，对吸附饱和的电化学传感器进行CV方法检测电流值，此时的检测吸附到电极表面的信号强度就可以代表溶液中甲氨蝶呤的浓度。通过预先绘制标准曲线的方法可以计算得出待测液中甲氨蝶呤的浓度。
进一步地，所述甲氨蝶呤待测液中甲氨蝶呤浓度为0.05-8μM；所述吸附时间为1-9min。
进一步地，吸附过程中进行搅拌，可以加速吸附速率，缩短达到吸附平衡的时间，搅拌速度在450rmp时，MTX在电极上的吸附量能够最快达到饱和。因此，450rmp被认为是最佳搅拌速度。
进一步地，吸附过程中调整甲氨蝶呤待测液的pH值为7。
本发明原理：
多壁碳纳米管-乙炔黑-STAC电极对甲氨蝶呤存在物理吸附和电化学催化，其中电化学催化的原理：
多壁碳纳米管和乙炔黑的作用是吸附和催化，STAC的作用是吸附，因此各个物质的用量和浓度对最终结果均存在影响，本发明限定条件为优化的最佳条件，检测效果最好。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明电化学传感器可以实现唾液中0.05-8μM范围内MTX的检测。并且所述电化学传感器制备方法简单，所需仪器比较便宜，操作简单方便。
附图说明
图1为实施例1步骤(1)中乙炔黑和多壁碳纳米管质量比对制备的电化学传感器对6μM MTX氧化峰电流的影响结果图；
图2为实施例1步骤(2)中STAC浓度对制备的电化学传感器对6μM MTX氧化峰电流的影响结果图；
图3为实施例1步骤(3)中转速对制备的电化学传感器对6μM MTX氧化峰电流的影响结果图；
图4为实施例1步骤(4)中吸附液pH值对制备的电化学传感器对6μM MTX氧化峰电流的影响结果图；
图5为效果验证例1中不同浓度的甲氨蝶呤母液的标准曲线图；
图6为效果验证例2步骤(4)中不同类型电极材料对6μM MTX的CV电流响应图；
图7为效果验证例2步骤(6)中不同类型电极材料对6μM MTX的CV电流响应图；
图8为效果验证例2步骤(7)中不同表面活性剂电极材料对6μM MTX的CV电流响应图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1电化学传感器的最优条件的筛选
采用单因素实验确定制备电化学传感器的最优条件，具体包括以下步骤：
(1)乙炔黑和多壁碳纳米管的质量比例(乙炔黑和多壁碳纳米管的总量为300mg)为单一变量，制备电化学传感器并用于甲氨蝶呤吸附，具体过程和参数如下：
将50-250mg乙炔黑(AB)与250-50mg多壁碳纳米管(MWCNTs)放入石英研钵中(乙炔黑和多壁碳纳米管的质量比分别为1:5，2:1，1:1，1:2，5:1)，加入60μL石蜡油研磨30分钟，充分研磨均匀后，以研磨均匀的多壁碳纳米管/乙炔黑粉末填充电极制备出多壁碳纳米管/乙炔黑电极，以光面称量纸打磨所填充电极的表面，使得电极表面光滑。将浓度为0.5mM的十八烷基三甲基氯化铵(STAC)取5μL滴加在打磨好的电极表面，静置5min后，甩干表面液体，室温干燥电极表面得到MWCNTs/AB/STAC电极。
MWCNTs/AB/STAC电极置于PBS缓冲液(10mL，0.1M，pH 7.0)中，在转速450rpm下吸附7min。对吸附饱和甲氨蝶呤的电化学传感器经CV方法进行电流值检测(参数：扫描速度为80mV s-1，电位范围为0.3V～1.2V)，结果见图1。图1结果显示，当乙炔黑与多壁纳米碳管质量比为2:1(总质量为300mg)时，甲氨蝶呤在所制备电极上电流响应值最高，因此乙炔黑-多壁碳纳米管质量比例2:1为最佳参数条件。
(2)以十八烷基三甲基氯化铵浓度为单一变量，制备电化学传感器并用于甲氨蝶呤吸附，具体过程和参数如下：
将200mg乙炔黑(AB)与100mg多壁碳纳米管(MWCNTs)放入石英研钵中，加入60μL石蜡油研磨30分钟，充分研磨均匀后，以研磨均匀的多壁碳纳米管/乙炔黑粉末填充电极制备出多壁碳纳米管/乙炔黑电极，以光面称量纸打磨所填充电极的表面，使得电极表面光滑。分别将浓度为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM的十八烷基三甲基氯化铵(STAC)取5μL滴加在打磨好的电极表面，静置5min后，甩干表面液体，室温干燥电极表面得到MWCNTs/AB/STAC电极。将MWCNTs/AB/STAC电极置于PBS缓冲液(10mL，0.1M，pH 7.0)中，在转速450rpm下吸附7min。对吸附饱和甲氨蝶呤的电化学传感器经CV方法进行电流值检测(参数：扫描速度为80mV s-1，电位范围为0.3V～1.2V)，结果见图2。图2结果显示，结果显示，当STAC的浓度从0.1逐渐增加到0.5mM时，MTX在电极上的电流响应值逐渐增大，这是因为随着STAC浓度的增加电极表面分布的STAC增多，因此对MTX的吸附量增多，氧化电流值变大；然而继续增加STAC的浓度，MTX电流值反而呈现下降的趋势，这是因为当STAC浓度超过一定值时，电极表面的STAC过多，影响了MTX与催化电极之间的电子传递，导致氧化峰电流的减小，因此选择STAC的最适滴加浓度为0.5mM。
(3)以搅拌转速为单一变量，制备电化学传感器并用于甲氨蝶呤吸附，具体过程和参数如下：
将200mg乙炔黑(AB)与100mg多壁碳纳米管(MWCNTs)放入石英研钵中，加入60μL石蜡油研磨30分钟，充分研磨均匀后，以研磨均匀的多壁碳纳米管/乙炔黑粉末填充电极制备出多壁碳纳米管/乙炔黑电极，以光面称量纸打磨所填充电极的表面，使得电极表面光滑。将浓度为0.5mM的十八烷基三甲基氯化铵(STAC)取5μL滴加在打磨好的电极表面，静置5min后，甩干表面液体，室温干燥电极表面得到MWCNTs/AB/STAC电极。将MWCNTs/AB/STAC电极置于PBS缓冲液(10mL，0.1M，pH 7.0)中，在转速300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm下吸附7min。对吸附饱和甲氨蝶呤的电化学传感器经CV方法进行电流值检测(参数：扫描速度为80mV s-1，电位范围为0.3V～1.2V)；结果见图3。图3结果显示，结果表明，随着磁棒搅拌速度从300rmp提高到450rmp，MTX的氧化峰电流值逐渐增大，在450rmp后电流值趋于稳定。这是由于在450rmp时，MTX在电极上的吸附量能够最快达到饱和。因此，450rmp被认为是最佳搅拌速度。
(4)以吸附液pH值为单一变量，制备电化学传感器并用于甲氨蝶呤吸附，具体过程和参数如下：
将200mg乙炔黑(AB)与100mg多壁碳纳米管(MWCNTs)放入石英研钵中，加入60μL石蜡油研磨30分钟，充分研磨均匀后，以研磨均匀的多壁碳纳米管/乙炔黑粉末填充电极制备出多壁碳纳米管/乙炔黑电极，以光面称量纸打磨所填充电极的表面，使得电极表面光滑。将浓度为0.5mM的十八烷基三甲基氯化铵(STAC)取5μL滴加在打磨好的电极表面，静置5min后，甩干表面液体，室温干燥电极表面得到MWCNTs/AB/STAC电极。将MWCNTs/AB/STAC电极置于PBS缓冲液(10mL，0.1M，pH分别为5、6、7、8、9)中，在转速450rpm下吸附7min。对吸附饱和甲氨蝶呤的电化学传感器经CV方法进行电流值检测(参数：扫描速度为80mV s-1，电位范围为0.3V～1.2V)；结果见图4。图4结果显示，结果表明，当缓冲液pH从5.0增加到7.0时，电流响应值增加，继续增加pH到9.0，电流响应值明显下降。可以看出，在pH为7.0时，传感器的吸附和催化效果最好，因此，pH为7的时候甲氨蝶呤在电极上响应信号最好。
以上验证结果表明，最优参数条件及过程为：将200mg乙炔黑(AB)与100mg多壁碳纳米管(MWCNTs)放入石英研钵中，加入60μL石蜡油研磨30分钟，充分研磨均匀后，以研磨均匀的多壁碳纳米管/乙炔黑粉末填充电极制备出多壁碳纳米管/乙炔黑电极，以光面称量纸打磨所填充电极的表面，使得电极表面光滑。将浓度为0.5mM的十八烷基三甲基氯化铵(STAC)取5μL滴加在打磨好的电极表面，静置5min后，甩干表面液体，室温干燥电极表面得到MWCNTs/AB/STAC电极。将MWCNTs/AB/STAC电极置于PBS缓冲液(10mL，0.1M，pH 7.0)中，在转速450rpm下吸附7min。对吸附饱和甲氨蝶呤的电化学传感器经CV方法进行电流值检测(参数：扫描速度为80mV s-1，电位范围为0.3V～1.2V)。
效果验证1
在10毫升浓度为0.1M(或者pH值为7.0)的PBS缓冲液中加入甲氨蝶呤(MTX)母液，使得MTX浓度为0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8μmol/L，将实施例1确定的最优参数条件下制备的MWCNTs/AB/STAC电极浸入含有MTX的PBS缓冲液中，450rpm转速条件下吸附7min后经CV方法(条件参数：扫描速度为80mV s-1，电位范围为0.3V～1.2V)检测电流值。根据所体现出来的电流值绘制标准曲线，见图5。
取某唾液样本，配制含甲氨蝶呤浓度为0.1μM，1μM，5μM的唾液样本各三份，使用实施例1确定的最优参数条件下所制备的MWCNTs/AB/STAC-1电极测试其电流值，对照标准曲线计算其MTX浓度结果如表1显示，MTX回收率在93.7-104.6％范围内，RSD为0.47％-7.36％，说明所制备的传感器在MTX血清和唾液样本的检测中显示出较好的稳定性和准确性。因此，本实施例制备的电化学传感器能够准确的检测唾液样本中甲氨蝶呤浓度。
表1
结果显示，本申请制备的MWCNTs/AB/STAC电极可实现在唾液样本中0.05-8μM范围内MTX的检测，在灵敏度和准确度方面结果均是令人满意的。
对于上述血清样本，使用同样的MWCNTs/AB/STAC电极进行重复检测(处理掉表层，重新打磨后重新滴加STAC)，电流响应的相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)为8.90％。将同一根电极在一天内重复测定6次仍保持良好的性能，峰电流值的RSD为6.80％。结果表明，该方法对MTX的测定具有良好的稳定性和重复性。
效果验证例2
(1)制备AB-PE电极：将300mg乙炔黑和90μL石蜡油加入研钵中，充分研磨30分钟，将得到的粉末填充入碳糊电极中可得AB-PE电极；
(2)制备MWCNTs电极：将300mg多壁碳纳米管和90μL石蜡油加入研钵中，充分研磨30分钟，将得到的粉末填充入碳糊电极中可得MWCNTs-PE电极；
(3)制备AB/MWCNTs-PE电极：将乙炔黑和多壁碳纳米管2:1比例和90uL石蜡油加入研钵中，充分研磨30分钟，将得到的粉末填充入碳糊电极中可得AB/MWCNTs-PE电极；
(4)将步骤(1)-(3)制备的电极材料对6μM的MTX(磷酸缓冲溶液pH值为7)进行吸附后(450rpm，吸附7min)进行CV检测(条件参数同实施例1)，探究不同类型电极材料对6μMMTX氧化峰电流的影响。结果见图6。图6中，a为AB-PE电极对6μM MTX的CV响应图，b为MWCNTs-PE电极对6μM MTX的CV响应图，c为AB/MWCNTs-PE电极对6μM MTX的CV响应图。图6结果说明乙炔黑与多壁纳米碳管组合后，相比碳管来说减低了电极反应的基线，与乙炔黑相比增加了电流响应值。
(5)制备AB/MWCNTs/STAC-PE电极；AB+MWCNTs电极的制备同(3)，在所得电极表面滴加0.5mM的STAC 5μL，室温静置5min后甩干电极表面多余的STAC干燥即可得AB/MWCNTs/STAC-PE电极；
(6)将步骤(3)和步骤(5)制备的电极材料对6μM的MTX(磷酸缓冲溶液pH值为7)进行吸附后(450rpm，吸附7min)进行CV检测(条件参数同实施例1)，探究不同类型电极材料对6μM MTX氧化峰电流的影响。结果见图7。图7中a表示AB/MWCNT/STAC-PE电极对6μM MTX的CV响应图，b表示AB/MWCNT-PE电极对6μM MTX的CV响应图；图7结果说明，在AB+MWCNTs电极表面修饰STAC能够很大程度上增加甲氨蝶呤在电极上的电流响应。
(7)将步骤(5)中的STAC分别更换为CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、STAB(十八烷基三甲基溴化铵)、DB(双十八烷基二甲基溴化铵)、DDAC(二甲基二十八烷基氯化铵)、1-DC(十二烷基氯化吡啶)、SDS(十二烷基磺酸钠)、3-(N-DM)P(3-磺丙基十六烷基二甲甜菜碱)、PA(全氟辛酸)制备不同表面活性剂成分的电极材料，并用于对6μM的MTX(磷酸缓冲溶液pH值为7)进行吸附后(450rpm，吸附7min)进行CV检测(条件参数同实施例1)，探究不同表面活性剂电极材料对6μM MTX氧化峰电流的影响。结果见图8，图8中a为AB/MWCNT/STAC-PE电极对6μM MTX的CV响应图，b为将STAC更换为CTAB的电极材料对6μM MTX的CV响应图，c为将STAC更换为STAB的电极材料对6μM MTX的CV响应图，d为将STAC更换为DB的电极材料对6μMMTX的CV响应图，e为将STAC更换为DDAC的电极材料对6μM MTX的CV响应图，f为将STAC更换为1-DC的电极材料对6μM MTX的CV响应图，g为将STAC更换为SDS的电极材料对6μM MTX的CV响应图，h为将STAC更换为3-(N-DM)P的电极材料对6μM MTX的CV响应图，i为将STAC更换为PA的电极材料对6μM MTX的CV响应图；图8显示，若把STAC换成其他表面活性剂，效果会变差。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种电化学传感器，其特征在于，结构为多壁碳纳米管/乙炔黑电极表层吸附十八烷基三甲基氯化铵；
所述电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)乙炔黑和多壁碳纳米管研磨均匀后填充电极得到多壁碳纳米管/乙炔黑电极；
(2)多壁碳纳米管/乙炔黑电极表面经打磨至光滑后滴加十八烷基三甲基氯化铵溶液；
(3)静置、干燥得到多壁碳纳米管-乙炔黑-十八烷基三甲基氯化铵电极，即为所述电化学传感器；
所述步骤(1)中乙炔黑和多壁碳纳米管的质量比为2:1。
2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述步骤(1)研磨过程中添加石蜡油，研磨时间10-30min。
3.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述步骤(2)使用光面称量纸对多壁碳纳米管/乙炔黑电极表面进行打磨；所述十八烷基三甲基氯化铵溶液的浓度为0.1-0.7mM，溶液滴加量为1-10μL。
4.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述步骤(3)静置1-7min，甩干后室温干燥。
5.一种根据权利要求1所述的电化学传感器在甲氨蝶呤浓度检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的电化学传感器在唾液中甲氨蝶呤浓度检测中的应用。
7.一种甲氨蝶呤浓度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的电化学传感器浸入甲氨蝶呤待测液中吸附甲氨蝶呤至平衡后经CV方法检测电流值，根据电流值得出甲氨蝶呤的浓度。
8.根据权利要求7所述的甲氨蝶呤浓度检测方法，其特征在于，所述甲氨蝶呤待测液中甲氨蝶呤浓度为0.05-8μM；所述吸附时间为1-9min。
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