CN114514010A - 成牙本质细胞增殖·分化促进剂 - Google Patents
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Abstract
使成牙本质细胞增殖·分化促进剂含有4‑(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。
Description
技术领域
本发明涉及成牙本质细胞(odontoblast)增殖·分化促进剂。
背景技术
已知在龋齿(蛀牙)的牙科治疗中,去除龋齿部分后,利用牙科用粘合剂将牙冠、嵌体、复合树脂等修复材料与牙齿粘合。将这样的牙科用粘合剂例如在对齿质(牙本质)进行脱钙后涂布,渗透经脱钙的部分来形成混合层。由此,牙科用粘合剂得以提高修复材料与齿质之间的粘合性。
然而,存在龋齿感染部位到达齿质深处的情况、去除龋齿时触及牙髓、感染部位周围发生意外露髓的情况,就上述的牙科用粘合剂而言,有齿质强度下降、对牙髓的神经造成不良影响的风险。因此,就在牙科用粘合剂中添加具有齿质再矿化能力的牙科材料进行了各种研究。
例如,提出了下述牙科材料,其含有:具有聚合性基团和酸性基团的单体的酸性基团被钙中和的单体钙盐;及/或作为具有聚合性基团和酸性基团的单体的聚合物、酸性基团被钙中和的聚合物钙盐(例如,参见专利文献1)。
这样的牙科材料的再矿化能力可如下进行确认:向Hepes水溶液中添加氯化钙、磷酸二氢钾、氯化钾及叠氮化钠配制成钙化溶剂,向钙化溶剂中添加上述牙科材料后,测定钙化溶剂中生成的钙的析出量。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2006-347943号公报
发明内容
发明所要解决的课题
然而,当龋齿到达牙髓附近或牙髓的情况下,需要去除感染了龋齿病原菌的牙髓周边的牙本质至牙髓的一部分。近年来,由于去除全部牙髓(拔髓)会导致齿质、特别是牙本质变得脆弱,因此,希望在牙髓中去除感染部分,并且保留未感染部分。
在这种情况下,去除牙髓的感染部分后,会在牙髓腔内产生空间,从而露出牙髓的未感染部分。因此,研究了将盖髓剂填充到牙髓腔内的空间、覆盖牙髓从而将牙髓以存活的状态保留。
例如,提出了使用氢氧化钙类药剂作为盖髓剂、利用氢氧化钙刺激成牙本质细胞、促进牙本质桥(dentine bridge)于进行了接触的牙髓部分生成的间接盖髓法。这种间接盖髓法会使部分生活牙髓向牙本质分化,因此可能使牙髓自身的容积减少、牙髓萎缩。
另外,如上所述,专利文献1中记载的牙科材料通常被添加至牙科用粘合剂中,而非添加至盖髓剂中。
本发明提供能够实现成牙本质细胞的增殖及/或干细胞向成牙本质细胞分化的成牙本质细胞增殖·分化促进剂。
用于解决课题的手段
本发明[1]包含成牙本质细胞增殖·分化促进剂,其含有4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。
本发明[2]包含如上述[1]所述的成牙本质细胞增殖·分化促进剂,其还含有可吸收生物材料,所述可吸收生物材料溶解、分散或吸附上述4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。
本发明[3]包含如上述[1]或[2]所述的成牙本质细胞增殖·分化促进剂,其还含有抗炎剂。
发明效果
本发明的成牙本质细胞增殖·分化促进剂含有4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐,因此可以促进成牙本质细胞的增殖及/或干细胞向成牙本质细胞的分化。因此,在牙科治疗中,通过使去除牙髓感染部分时露出的牙髓与成牙本质细胞增殖·分化促进剂接触,可以期待使成牙本质细胞在牙髓腔内的空间增殖。这种情况下,增殖的成牙本质细胞生成牙本质,因此可抑制牙髓腔的容积减少,进而抑制牙髓的萎缩。
附图说明
[图1]图1A示出龋齿未到达牙髓的牙齿的构成简图。图1B示出龋齿已到达牙髓的牙齿的构成简图。图1C示出继图1B之后将牙髓的感染部分去除、露出牙髓的牙齿的构成简图。图1D示出继图1C之后使用以往的盖髓剂覆盖于露出牙髓的状态的牙齿的构成简图。
[图2]图2A示出继图1C之后、使用成牙本质细胞增殖·分化促进剂覆盖于露出牙髓的状态的牙齿的构成简图。图2B示出继图2A之后、成牙本质细胞发生增殖、分化、牙髓腔被填充的状态的牙齿的构成简图。
[图3]图3为示出利用实施例1~5的成牙本质细胞增殖·分化促进剂进行了增殖的大鼠成牙本质细胞样细胞株的CCK-8分析的结果的图表。
[图4]图4为示出利用实施例4、6~10的成牙本质细胞增殖·分化促进剂进行了增殖的大鼠成牙本质细胞样细胞株的CCK-8分析的结果的图表。
[图5]图5A为使用了实施例4、6及7的成牙本质细胞增殖·分化促进剂的、成牙本质细胞增殖试验的实时PCR分析结果,所示为rDSPP的mRNA的表达量。图5B为与图5A相同的成牙本质细胞增殖试验的实时PCR分析结果,所示为rDMP-1的mRNA的表达量。图5C为与图5A相同的成牙本质细胞增殖试验的实时PCR分析结果,所示为rOCN的mRNA的表达量。图5D为与图5A相同的成牙本质细胞增殖试验的实时PCR分析结果,所示为rOPN的表达量。
[图6]图6为示出与实施例9、11~17的成牙本质细胞增殖·分化促进剂进行了接触的人牙髓干细胞的CCK-8分析的结果的图表。
[图7]图7A为使用了实施例12及比较例1~3的成牙本质细胞增殖·分化促进剂的、人牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化试验的实时PCR分析结果,所示为BSP的mRNA的表达量。图7B为与图7A相同的人牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化试验的实时PCR分析结果,所示为rOPN的mRNA的表达量。图7C为与图7A相同的人牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化试验的实时PCR分析结果,所示为rOCN的mRNA的表达量。图7D为与图7A相同的人牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化试验的实时PCR分析结果,所示为rDSPP的mRNA的表达量。图7E为与图7A相同的人牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化试验的实时PCR分析结果,所示为rDMP-1的mRNA的表达量。
[图8]图8为示出使用了实施例12的成牙本质细胞增殖·分化促进剂的碱性磷酸酶测定(静置时间14天、21天及28天)的结果的图表。
[图9]图9A为示出使用了实施例12及比较例1~4的成牙本质细胞增殖·分化促进剂的、茜素红染色测定(静置时间30天)的结果的图表。图9B为示出与图9A相同的茜素红染色测定(静置时间32天)的结果的图表。
[图10]图10A为使用了实施例12的成牙本质细胞增殖·分化促进剂的、间充质干细胞向成牙本质细胞的分化试验的实时PCR分析结果,所示为BSP的mRNA的表达量。图10B为与图10A相同的间充质干细胞向成牙本质细胞的分化试验的实时PCR分析结果,所示为rDMP-1的mRNA的表达量。
具体实施方式
本发明的成牙本质细胞增殖·分化促进剂含有4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐作为必需成分。
(1)4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐
4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐由下述通式(1)表示。
[化学式1]
(通式(1)中,R表示H或CH3。)
通式(1)中,R表示氢原子或甲基,优选为甲基。
即,成牙本质细胞增殖·分化促进剂含有4-丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐及/或4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐(以下为C-MET),优选含有C-MET。
将成牙本质细胞增殖·分化促进剂的固态成分设为100质量%时,4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的含量比例为例如0.01质量%以上,优选为0.03质量%以上,为例如100质量%以下,优选为95质量%以下。
4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的含量比例若为上述下限以上,可以可靠地促进成牙本质细胞的增殖及/或干细胞向成牙本质细胞的分化。4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的含量比例若为上述上限以下,可以确保促进成牙本质细胞的增殖及/或干细胞向成牙本质细胞的分化的效果,同时减少4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的使用量。
(2)生物可吸收材料
对于成牙本质细胞增殖·分化促进剂而言,作为任选成分,优选还含有生物可吸收材料。
若成牙本质细胞增殖·分化促进剂含有生物可吸收材料,则使成牙本质细胞增殖·分化促进剂与牙髓接触时,可以保证有足够的空间用于成牙本质细胞增殖及/或干细胞向成牙本质细胞的分化(参见图2A)。
生物可吸收材料溶解、分散或吸附4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。
生物可吸收材料为生物体所能吸收的材料,可举出例如胶原蛋白(例如,I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、去端肽胶原蛋白(atelocollagen)等)、蛋白质(例如,明胶、血纤维蛋白等)、多糖类(例如,氧化纤维素、壳多糖·脱乙酰壳多糖、透明质酸等)、合成高分子(例如,聚乙醇酸共聚物、聚乳酸共聚物等)、磷酸系/碳酸系无机材料(例如,羟基磷灰石、磷酸三钙、碳酸钙等)等。生物可吸收材料可以单独使用或组合使用2种以上。
生物可吸收材料中,可优选举出胶原蛋白。
常温(25℃)时的生物可吸收材料的状态没有特别的限制,可以为液体,也可以为固体。生物可吸收材料在常温时为液体的情况下,生物可吸收材料溶解或分散4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。生物可吸收材料在常温时为固体的情况下,生物可吸收材料吸附4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。
相对于4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸1质量份而言,生物可吸收材料的含量比例为例如2质量份以上,优选为5质量份以上,为例如100质量份以下,优选为80质量份以下。
(3)抗炎剂
另外,对于成牙本质细胞增殖·分化促进剂而言,作为任选成分,优选还含有抗炎剂。
若抗炎剂含有生物可吸收材料,则成牙本质细胞增殖·分化促进剂与牙髓接触时,在可以抑制牙髓的炎症的同时,也能可靠地达到促进成牙本质细胞的增殖及/或干细胞向成牙本质细胞的分化的目的(参见图2A)。
抗炎剂只要是可用于牙科材料中的已知的抗炎剂,则没有特别限制,可举出例如甾体类抗炎剂(例如,地塞米松、泼尼松龙、倍氯米松等)、倍他米松、氟替卡松、氢化可的松等。抗炎剂可以单独使用或组合使用2种以上。
抗炎剂中,优选为甾体类抗炎剂,更优选为地塞米松。
相对于4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸1质量份而言,抗炎剂的含量比例为例如1×10-7质量份以上,优选为1×10-6质量份以上,为例如1×10-2质量份以下,优选为1×10-3质量份以下。
(4)其他添加剂
此外,对于成牙本质细胞增殖·分化促进剂而言,作为任选成分,可以含有适当比例的其他添加剂。作为其他添加剂,可举出例如赋形剂、防腐剂、缓冲剂、着色剂、芳香剂、增稠剂等。
(5)成牙本质细胞增殖·分化促进剂的剂型
上述成牙本质细胞增殖·分化促进剂例如适合作为盖髓剂使用。对于成牙本质细胞增殖·分化促进剂而言,在龋齿到达牙髓的情况下,以与由于牙科治疗而露出的牙髓接触的方式进行使用(参见图2A)。成牙本质细胞增殖·分化促进剂的剂型没有特别限制,可举出例如粉剂、液体制剂、片状制剂等。
(5-1)粉剂
成牙本质细胞增殖·分化促进剂为粉剂的情况下,4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐优选具有粒子形状。
4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的平均一次粒径为例如1μm以上,优选为5μm以上,为例如100μm以下,优选为50μm以下。
使用作为粉剂的成牙本质细胞增殖·分化促进剂时,例如,将成牙本质细胞增殖·分化促进剂暂时性地保持于棉球,使该棉球与牙髓接触、或在牙髓附近擦拭等,使成牙本质细胞增殖·分化促进剂附着于牙髓(参见图2A)。
(5-2)液体制剂
成牙本质细胞增殖·分化促进剂为液体制剂的情况下,成牙本质细胞增殖·分化促进剂优选含有溶剂。
溶剂可以溶解或分散4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。
作为溶剂,可举出例如强极性溶剂(例如,水、乙醇等)、中极性溶剂(例如,丙酮等)、弱极性溶剂(例如,油等)等。溶剂可以单独使用或组合使用2种以上。
溶剂中,可优选举出水、乙醇、丙酮。
作为液体制剂的成牙本质细胞增殖·分化促进剂中,4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的浓度为例如1μg/mL以上,优选为10μg/mL以上,更优选为150μg/mL以上,进一步优选为300μg/mL以上,为例如5000μg/mL以下,优选为3000μg/mL以下,更优选为2000μg/mL以下,特别优选为1200μg/mL以下。
4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的浓度若为上述下限以上,可以更可靠地促进成牙本质细胞的增殖及/或干细胞向成牙本质细胞的分化。4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的浓度若为上述上限以下,可以充分确保促进成牙本质细胞的增殖及/或干细胞向成牙本质细胞的分化的效果,同时减少4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的使用量。
使用作为液体制剂的成牙本质细胞增殖·分化促进剂时,例如,涂布、喷雾或滴加至牙髓(参见图2A)。
(5-3)片状制剂
成牙本质细胞增殖·分化促进剂为片状制剂的情况下,4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐优选吸附于由生物可吸收材料形成的片材(例如,胶原蛋白片等)。
这种情况下,4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐优选具有粒子形状。对于4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的平均一次粒径的范围而言,例如,与上述的范围相同。
使用作为片状制剂的成牙本质细胞增殖·分化促进剂时,例如,以4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐与牙髓接触的方式粘贴于牙齿(参见图2A)。
(5)作用效果
龋齿未到达牙髓1的情况下,在牙科治疗中,如图1A所示,牙釉质3及原生牙本质2的龋齿部分被去除,例如,形成窝洞9。然后,将窝洞9的内表面脱钙后,将已知的牙科用粘合剂7涂布于窝洞9的内表面,使用牙科用粘合剂7将修复材料8(例如,嵌体、复合树脂等)与牙齿粘合。即,对于牙科用粘合剂7而言,在龋齿未到达牙髓1的情况下,以与牙釉质3及原生牙本质2的表面接触、而不与牙髓1接触的方式使用。
另一方面,如图1B所示,龋齿10到达牙髓1的情况下,在牙科治疗中,牙釉质3及原生牙本质2的龋齿部分与感染了龋齿病原菌的牙髓1的感染部分1A一同被去除,保留牙髓的未感染部分1B。这种情况下,如图1C所示,由于感染部分1A的去除,在原生牙本质2所具有的牙髓腔2A内产生了空间S,未感染部分1B的一部分介由形成于牙釉质3的窝洞3A、形成于原生牙本质2的窝洞2B及空间S而露出。
如图1D所示,使以往的盖髓剂4(例如,氢氧化钙类的药剂)接触露出的未感染部分1B后,未感染部分1B所含的成牙本质细胞被刺激,仅在面对牙髓腔2A内的空间S的未感染部分1B的表面生成第三牙本质6。因此,牙髓腔2A的容积减少,牙髓1有可能萎缩。
另一方面,如图2A所示,使含有4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的成牙本质细胞增殖·分化促进剂5接触露出的未感染部分1B后,如图2B所示,可以促进未感染部分1B所含的成牙本质细胞的增殖及/或干细胞向成牙本质细胞的分化,可以期待,不仅限于面对牙髓腔2A内的空间S的未感染部分1B的表面,成牙本质细胞7还以填充空间S的方式增殖。并且,增殖的成牙本质细胞在牙髓腔2A的外侧(例如,原生牙本质2的窝洞2B内)生成第三牙本质6,因此可以抑制牙髓腔2A的容积减少,进而可以抑制牙髓1的萎缩。
[实施例]
以下,基于实施例进一步具体地说明本发明,但本发明不限定于此。以下的记载中使用的混合比例(含量比例)、物性值、参数等的具体数值可用上述的“具体实施方式”中记载的、相应的混合比例(含量比例)、物性值、参数等记载的上限值(被定义为“以下”、“小于”的数值)或下限值(被定义为“以上”、“超过”的数值)替代。
<实施例1~实施例10>
<<4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐的制备>>
向具备搅拌装置、冷却管、温度计及滴液漏斗的玻璃反应装置内加入乙醇64g和4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸(以下为4-MET。)3.19g(0.01mol),一边用冰水将反应装置内温度冷却至约10℃,一边搅拌,使4-MET溶解于乙醇。
另外,用蒸馏水400g溶解氢氧化钙0.74g(0.01mol),制备氢氧化钙水溶液。然后,使用滴液漏斗将氢氧化钙水溶液经约30分钟滴入4-MET的乙醇溶液。此时维持反应装置内温度不变。
自4-MET乙醇溶液的滴入结束起30分钟,使反应装置内温度上升至室温(25℃),持续搅拌反应液,使4-MET与氢氧化钙的反应产物熟化。将得到的反应液在减压蒸馏装置内浓缩,过滤析出的反应产物。将残余物用乙醇洗涤及干燥,得到约3.3g白色固体粉末。
得到的固体粉末通过NMR分析及元素分析确认是4-MET的钙盐(C-MET)。C-MET中,酸碱克当量比(钙盐基克当量/酸克当量)为1.0[克当量/克当量]。
将C-MET用球磨机粗粉碎,进一步用玛瑙研钵制成充分均匀的微粉末。用扫描电子显微镜观察部分C-MET粉末,结果,C-MET粉末的最大一次粒径为约30μm,C-MET粉末的最小一次平均粒径为约0.1μm。将C-MET粉末用环氧乙烷气体灭菌后分包保存。
<<成牙本质细胞增殖·分化促进剂的制备>>
随后,在各实施例中,按照下述C-MET的浓度,将C-MET粉末用超纯水(dH2O)溶解或分散,制备作为液体制剂的成牙本质细胞增殖·分化促进剂。需要说明的是,实施例17中,不使用超纯水溶解或分散C-MET,而是将粉末状体的C-MET制成作为粉剂的成牙本质细胞增殖·分化促进剂。
实施例1:10μg/mL(1.0质量%)
实施例2:20μg/mL(2.0质量%)
实施例3:50μg/mL(4.8质量%)
实施例4:100μg/mL(9.1质量%)
实施例5:200μg/mL(16.7质量%)
实施例6:300μg/mL(23.1质量%)
实施例7:500μg/mL(33.3质量%)
实施例8:1000μg/mL(50.0质量%)
实施例9:1500μg/mL(60.0质量%)
实施例10:2000μg/mL(66.7质量%)
实施例11:30.9μg/mL(3.0质量%)
实施例12:52.6μg/mL(5.0质量%)
实施例13:111.1μg/mL(10.0质量%)
实施例14:250g/mL(20.0质量%)
实施例15:666.7μg/mL(40.0质量%)
实施例16:4000μg/mL(80.0质量%)
实施例17:100.0质量%。
<评价>
<<成牙本质细胞增殖试验>>
准备添加5质量%牛胎血清(FBS)的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)。然后,在DMEM中培养作为大鼠成牙本质细胞样细胞株之一的MDPC-23细胞(大鼠齿乳头来源细胞)。随后,以微孔板(96孔)的各孔中分配1000个MDPC-23细胞的方式,向各孔中注入了0.1mL培养有MDPC-23细胞的DMEM。
随后,将实施例1~10的成牙本质细胞增殖·分化促进剂及超纯水(对照)分别加入对应的孔内。随后,在常温(25℃)下静置5天后,通过活细胞数测定试剂盒(CCK-8:CellCounting Kit-8)评价MDPC-23细胞的增殖。
CCK-8分析中,使用微孔板检测仪(测定波长:450nm)。另外,CCK-8分析重复实施6次。
实施例1~5及对照的CCK-8分析结果如图3所示,实施例4、6~10及对照的CCK-8分析结果如图4所示。
如图3及图4所示,确认到与对照相比,利用各实施例的成牙本质细胞增殖·分化促进剂显著促进了MDPC-23细胞的增殖。
另外,如图4所示,确认到直至成牙本质细胞增殖·分化促进剂中的C-MET的浓度为500μg/mL(实施例7)为止,随着C-MET浓度的增加,MDPC-23细胞的增殖·分化促进效果逐渐提高,C-MET的浓度大于500μg/mL时,确认不到MDPC-23细胞的增殖·分化促进效果以更大程度提高。
<<关于牙本质形成的相关基因的表达试验>>
准备添加5质量%牛胎血清(FBS)的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)。然后,在DMEM中培养MDPC-23细胞(大鼠齿乳头来源细胞)。随后,以微孔板(12孔)的各孔中分配104个MDPC-23细胞的方式,向各孔中注入了2mL培养有MDPC-23细胞的DMEM。
随后,将实施例4、6及7的成牙本质细胞增殖·分化促进剂和超纯水(对照)分别加入对应的孔内。随后,在常温(25℃)下静置5天后,向各孔添加10mmol/L的β-甘油磷酸(β-GP)水溶液0.02mL、50μg/mL的抗坏血酸0.02mL、100nmol/L的地塞米松水溶液(甾体类抗炎剂)0.002mL。
随后,进一步静置2天后,实施了实时PCR。需要说明的是,使用β-肌动蛋白作为内参。另外,实时PCR重复实施3次。
RNA-牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein)(rDSPP)的信使RNA(mRNA)的表达量如图5A所示。RNA-牙本质基质蛋白(rDMP-1)的mRNA的表达量如图5B所示。RNA-骨钙素(rOCN)的mRNA的表达量如图5C所示。RNA-骨桥蛋白(rOPN)的mRNA的表达量如图5D所示。
如图5A及图5B所示,确认到生成牙本质特有的蛋白质(rDSPP及rDMP-1)的基因增加,并且,如图5C及图5D所示,生成硬组织(钙化)所需的表达骨基质蛋白质(骨钙素及骨桥蛋白)的基因增加。因此,可以期待增殖的MDPC-23细胞形成牙本质
<<细胞存活率测定>>
准备添加5质量%牛胎血清(FBS)、50单位/mL青霉素、及50μg/mL链霉素的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)。然后,在DMEM中培养人牙髓干细胞(hDPSC)。随后,向培养hDPSC的DMEM中添加10mmol/L的β-甘油磷酸(β-GP)0.02mL和50μg/mL的抗坏血酸0.02mL。
随后,以微孔板(96孔)的各孔中分配1,000~3,000个hDPSC的方式,向各孔中注入了0.1mL培养有hDPSC的DMEM。
随后,将实施例9、11~17的成牙本质细胞增殖·分化促进剂及超纯水(对照)分别加入对应的孔内。随后,在常温(25℃)下静置4天后,通过活细胞数测定试剂盒(CCK-8:CellCounting Kit-8)评价细胞存活率。
CCK-8分析中,使用微孔板检测仪(测定波长:450nm)。另外,CCK-8分析重复实施6次。其结果如图6所示。
如图6所示,添加各实施例的成牙本质细胞增殖·分化促进剂,均与对照同样地确认到细胞充分存活。
<<人牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化试验>>
与上述细胞存活率测定同样地准备培养hDPSC的DMEM。
另外,将粉末状的下述试样分别用超纯水(dH2O)溶解或分散后,用DMEM稀释,配制实施例12及比较例1~4的成牙本质细胞增殖·分化促进剂。各成牙本质细胞增殖·分化促进剂中的试样浓度为5质量%。
试样:
4-MET的钙盐:C-MET(实施例12)、
4-甲基丙烯酰氧基乙基偏苯三酸:4-MET(比较例1)、
氢氧化钙:CH(比较例2)、
矿物三氧化物凝聚体(mineral trioxide aggregate):MTA(比较例3)、
氯化钙:CaCl2(比较例4)。
随后,将实施例12及比较例1~4的成牙本质细胞增殖·分化促进剂和超纯水(对照)分别直接溶解于培养hDPSC的DMEM中。
随后,静置24天后,针对溶解了实施例12及比较例1~4的成牙本质细胞增殖·分化促进剂和超纯水(对照)的DMEM,实施实时PCR。需要说明的是,使用β-肌动蛋白作为内参。
RNA-骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein)(BSP)的mRNA的表达量如图7A所示。RNA-骨桥蛋白(rOPN)的mRNA的表达量如图7B所示。RNA-骨钙素(rOCN)的mRNA的表达量如图7C所示。RNA-牙本质涎磷蛋白(rDSPP)的mRNA的表达量如图7D所示。RNA-牙本质基质蛋白(rDMP-1)的mRNA的表达量如图7E所示。
如图7A~图7E所示,确认到使C-MET与hDPSC接触后,成牙本质细胞特有的基因(BSP、rOPN、rOCB、rDSPP及rDMP-1)增加。另一方面,使4-MET、CH及MTA分别与hDPSC接触,确认不到成牙本质细胞特有的基因增加,由此确认了C-MET促进自hDPSC向成牙本质细胞的分化。
另外,关于溶解了实施例12的成牙本质细胞增殖·分化促进剂和超纯水(对照)的DMEM,通过碱性磷酸酶(ALPase)测定来评价静置了14天、21天及28天的钙化状态。其结果如图8所示。
进一步,关于溶解了实施例12及比较例1~4的成牙本质细胞增殖·分化促进剂和超纯水(对照)的DMEM,通过茜素红染色测定来评价静置了30天及32天的钙化状态。其结果如图9A及图9B所示。此外,钙化状态的评价将显著性水平设为1%、使用单因素方差分析和事后Tukey HSD检验实施。
如图8、图9A及图9B所示,使C-MET与hDPSC接触后,确认到钙化得到促进。另外,使CH、MTA及CaCl2与hDPSC接触的情况下,也确认到钙化。然而,使CH及MTA与hDPSC接触的情况下,如图7A~图7E所示,未观察到促进了hDPSC向成牙本质细胞的分化,因此认为细胞上发生了钙离子与磷酸结合,磷酸钙沉淀。
<<间充质干细胞向成牙本质细胞的分化试验>>
将hDPSC变更为间充质干细胞(MSC),此外与上述细胞存活率测定同样地操作,准备培养MSC的DMEM。
随后,将实施例12的成牙本质细胞增殖·分化促进剂和超纯水(对照)分别直接溶解在培养MSC的DMEM中。随后,静置10天、17天及24天时,实施了实时PCR。需要说明的是,使用β-肌动蛋白作为内参。
RNA-骨唾液酸蛋白(BSP)的mRNA的表达量如图8A所示。RNA-牙本质基质蛋白(rDMP-1)的mRNA的表达量如图8B所示。
如图8A及图8B所示,使C-MET与MSC接触后,确认到成牙本质细胞特有的基因增加。由此确认了C-MET促进自MSC向成牙本质细胞的分化。
需要说明的是,上述发明作为本发明的示例实施方式而提供,其只不过为示例,不作限定性解释。本领域技术人员所能理解的本发明的变形例也包含于所附的权利要求范围之内。
产业上的可利用性
本发明的成牙本质细胞增殖·分化促进剂适合作为例如盖髓剂使用。
附图标记说明
1 牙髓
2 原生牙本质
3 牙釉质
5 成牙本质细胞增殖·分化促进剂
6 第三牙本质。
Claims (3)
1.成牙本质细胞增殖·分化促进剂,其特征在于,含有4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。
2.如权利要求1所述的成牙本质细胞增殖·分化促进剂,其还含有生物可吸收材料,所述生物可吸收材料溶解、分散或吸附所述4-(甲基)丙烯酰氧基乙基偏苯三酸的钙盐。
3.如权利要求1所述的成牙本质细胞增殖·分化促进剂,其还含有抗炎剂。
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