CN114502202A - 用于通过使用基于肽核酸的试剂来治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本公开内容尤其提供了经改善的PNA试剂，包含其的组合物，和用于通过使用此类试剂和/或组合物来治疗疾病例如癌症的方法。还提供了用于在细胞中降低基因表达的方法。

Description

用于通过使用基于肽核酸的试剂来治疗癌症的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年7月24日提交的美国临时专利申请系列号62/878,301(该申请通过提及而以其整体合并入本文)的权益。

公开内容的领域

本公开内容尤其提供了经改善的PNA试剂，包含其的组合物，和用于通过使用此类试剂和/或组合物来治疗疾病例如癌症的方法。

公开内容的背景

医疗保健行业不断地需要提供用于治疗与癌症作斗争的患者的新的且有效的疗法。不同于传统化学治疗方法的新型组合物的发现有助于医师为肿瘤患者开具疗程所采用的方法。特别的努力致力于用于通过使用分子生物学方法而非化学方法来治疗癌症的组合物和方法。

PNA试剂是在研究和开发用于治疗疾病例如癌症的新药物中有前途的工具。美国专利号10,113,169描述了PNA-递送肽缀合物的增加的效力，这通过在两个末端都附加阳离子亲脂性部分来实现。通过加强递送和稳定针对染色体靶标的结合，这的确创造了更强有力的转录阻抑。但是，该缀合物的增加的去污剂样特性冒着非特异性细胞毒性的风险，因为这些两亲性肽具有在细胞膜上团聚的倾向。因此，仍然存在需要以平衡转录阻抑效力与由所述递送肽的必需的去污剂样特性所引起的对于细胞的非特异性毒性。

公开内容的概述

先前已显示，通过向PNA-递送肽缀合物的末端添加疏水性的和阳离子的部分改善了关于PNA的递送和针对染色体DNA靶标的靶标结合特性。这些末端修饰给予所述PNA缀合物以经改善的递送和靶标稳定化。在这个当口，认为Lys(棕榈酰基)-(d)Lys-(d)Lys-的这些末端添加也同样能够影响递送，而无需递送肽。据推测，最好可以删除能够对于PNA序列与其基因靶标结合造成空间干扰的任何非必需结构。对于这样的修饰(即删除疏水性阳离子的在末端处经修饰的PNA缀合物的递送肽部分)的评价在AspC1细胞系内证明了显著地更好的KRAS G12D的阻抑(参见实施例1)。

在相似的按剂量给药条件下，在末端处经修饰的PNA-递送肽缀合物能够在AsPC1细胞系内将KRAS G12D的转录阻抑至正常基线的50％，但是没有检测到增殖的可检测的阻抑。相比之下，对于相同的疗法但没有递送肽(NLS)，在AsPC1细胞系内将KRAS G12D转录阻抑至正常基线的20％，并且具有增殖的浓度依赖性阻抑，其中注意到增殖的完全阻抑。此外，通过聚乙二醇间隔子将每个单独的末端的Lys(棕榈酰基)-(d)Lys-(d)Lys-与PNA寡聚体区段分隔开进一步地将功效改善两倍。

从这些实验中证明，仅用末端的Lys(棕榈酰基)-(d)Lys-(d)Lys-进行修饰的PNA寡聚体序列在体外和可能地在体内阻抑基因转录方面比类似地经末端修饰的PNA寡聚体-递送肽(NLS)缀合物更有效。这可能是由于相似的和/或足够的递送特征以及PNA寡聚体未附着至具有相似尺寸的现在非必需的空间阻碍性的递送肽。去除非必需的分子结构将会使PNA寡聚体摆脱潜在的对于结合的妨碍。将PNA寡聚体与递送组分分隔开的前提是在PNA-DNA相互作用内将会存在较少对于氢键π-堆叠构型的干扰。

因此，本公开内容的一个实施方案为PNA试剂，其包含：PNA部分；和至少一个附着至所述PNA部分的至少一个末端的修饰部分，其中所述至少一个修饰部分由赖氨酸残基组成，并且所述赖氨酸残基中的至少一个包含棕榈酰基侧链部分。

本公开内容的另一个实施方案为药用组合物，其包含在本文中所公开的PNA试剂和在药学上可接受的承载体。

本公开内容的另一个实施方案为用于在受试者中治疗疾病、病症或状况或者降低疾病、病症或状况的风险的方法，其包括：向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的PNA试剂或者有效量的在本文中所公开的药用组合物。

本公开内容的另外一个实施方案为用于在细胞中降低基因表达的方法，其包括：使所述细胞与有效量的至少一种在本文中所公开的PNA试剂相接触。

附图简述

本专利或申请文件包含至少一个以彩色制作的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本将会在请求和支付必要的费用后由专利局提供。

下面的附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步证明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合在本文中所呈现的特定实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。

图1A显示了附加有短的疏水性聚合物(蓝色)的PNA寡聚体的图；该短的疏水性聚合物仍然在熔球中。

图1B显示了附加有更长的疏水性聚合物(蓝色)的PNA寡聚体的图；该更长的疏水性聚合物能够突破熔球的限制。

图2提供了在研究中所使用的不同PNA缀合物(包括157A、228B、204C和228A)的构造。

图3-6显示了响应于各种与KRAS G12D互补的PNA寡聚体(图3–204C；图4–228B；图5–157A；图6–228A)的浓度依赖性的等位基因特异性细胞增殖。相关于所附加的疏水性聚合物的尺寸，特性发生变化。所有实验以一式三份进行。

图7-10显示了响应于各种与KRAS G12D互补的PNA寡聚体(图7–204C；图8–228B；图9–157A；图10–228A)的在性质上相似的浓度依赖性细胞增殖。通过去除内源性KRAS基因并且用人KRAS G12D[NCI RPZ26198]、HRAS野生型[NCI RPZ200024]或KRAS野生型[NCIRPZ26216]代替，创建了一系列的细胞系。以这种方式，更好地控制在细胞系之间的所插入的人基因的比较，因为在所述细胞系之间没有其他差异。相关于所附加的疏水性聚合物的尺寸，特性发生变化。所有实验以一式三份进行。

图11显示了暴露于PNA缀合物157A或204C的AsPC1(KRAS G12D-依赖性细胞系)和BxPC3(表达KRAS WT的细胞系)的实时PCR的结果。ND是未处理的细胞系的经标准化的结果。204C完全阻抑KRAS G12D基因的转录，而不影响KRAS WT，其相差仅一个碱基对。157A仅部分地阻抑KRAS G12D，并且也通过不影响KRAS WT基因而显示了特异性。

公开内容的详述

在本公开内容中，进行了研究以评价被给予PNA寡聚体的对于实现转录阻抑和使非特异性毒性最小化来说足够的去污剂样/两亲性特性(更多细节，参见实施例1)。这种毒性通过不依赖于靶标KRAS G12D基因的具有相似来源的细胞的细胞生存力的阻抑而最好地得到举例说明。虽然比两端都附加有阳离子亲脂性肽的KRAS G12D-互补寡聚体Lys(C16)-Lys-Lys-[PNA]-Lys-Lys-Lys(C16)的效力低(图5和9)，但是仅在一个末端进行附加的相同的PNA寡聚体Lys(C16)-Lys-Lys-[PNA](图3和7)除了通过PCR研究所显示的具有相似特异性的经改善的转录阻抑外，还提供了显著地更低的非特异性毒性(图11)。所述经改善的转录阻抑可能通过更少的空间特征而得到促进，因此改善了被给予后一种设计(附加单个末端)的其结合动力学相。

此外，已确定，单个邻接的Lys(C16)-Lys-Lys脂肪族链对于这些特性来说是足够的。用单个Lys(C8)-Lys-Lys(图6和10中的228A)邻接脂肪族链部分的替换是不足够的，因为在正常治疗浓度下无论什么都未注意到阻抑。而且，在两个末端处都附加Lys(C8)-Lys-Lys(图4和8中的228B)也不足以实现递送，因为也未注意到功效。这强烈地暗示，单个连续C16脂肪族部分不能作为添加区段被替代(图4和8中的228B对比图3和7中的204C)。

另外，Lys(C16)-Lys-Lys-[PNA]-Lys-Lys相比于Lys(C16)-Lys-Lys-[PNA]-Lys-Lys-Lys(C16)而言没有提供增加的功效，却增添了显著地增加的非特异性毒性。

这些发现与所述PNA缀合物的统计学链模型相一致。所附加的组分的特性将会要求最小长度以延伸到通过疏水力而收缩的整个结构之外(图1A和1B)。多重放置的更短长度将不会等价地给予单个更长脂肪族链的区域化学特征。

因此，本公开内容的一个实施方案为PNA试剂，其包含：PNA部分；和至少一个附着至所述PNA部分的至少一个末端的修饰部分，其中所述至少一个修饰部分由赖氨酸残基组成，并且所述赖氨酸残基中的至少一个包含棕榈酰基侧链部分。

在一些实施方案中，所述至少一个修饰部分具有Lys(棕榈酰基)-Lys-Lys-的结构。在一些实施方案中，所述PNA试剂具有Lys(棕榈酰基)-Lys-Lys-[PNA]-Lys-Lys-Lys(棕榈酰基)的结构。在一些实施方案中，所述PNA试剂具有Lys(棕榈酰基)-Lys-Lys-[PNA]或[PNA]-Lys-Lys-Lys(棕榈酰基)的结构。

在一些实施方案中，所述PNA试剂在所述PNA部分和所述至少一个修饰部分之间包含至少一个聚乙二醇(PEG)间隔子。

在一些实施方案中，所述PNA试剂具有有着最小的形成发夹环的倾向的序列。在一些实施方案中，所述PNA试剂具有包含少于60％嘌呤的序列。

在一些实施方案中，所述PNA部分具有靶向基因的序列。在一些实施方案中，所述PNA部分具有靶向具有75％或更大互补性的基因的13-20核苷酸序列的序列。在一些实施方案中，所述PNA部分具有靶向具有完全互补性的基因的13-20核苷酸序列的序列。在一些实施方案中，所述PNA部分具有靶向其长度为至少14、15、16、17或18个核苷酸的核酸的序列，和/或所述互补性为至少大约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施方案中，所述基因为癌基因。在一些实施方案中，所述癌基因包括突变型序列元件，并且所述PNA试剂具有靶向包含所述突变型序列元件或由所述突变型序列元件组成的位点的序列。

声索项12的PNA试剂，其中所述PNA试剂靶向包含下述区域或由下述区域组成的位点：(i)BRAF癌基因的区域，其包含相应于在BRAF蛋白中的V600E突变的突变；或(ii)Gnaq基因的区域，其包含相应于在Gnaq蛋白中的Q209L突变的突变；或(iii)KRAS癌基因的区域，其包含相应于在KRAS蛋白中的G12D突变的突变。

在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含这样的区域或由这样的区域组成的位点，所述区域包含癌基因的易位接点。在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含MYB-NFIB易位的区域或由MYB-NFIB易位的区域组成的位点，所述区域包含MYB和NFIB基因的接点或其片段。在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含FUS-CHOP易位的区域或由FUS-CHOP易位的区域组成的位点，所述区域包含FUS和CHOP基因的接点的或其片段。在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含EWS-FLI1易位的区域或由EWS-FLI1易位的区域组成的位点，所述区域包含EWS和FLI1基因的接点或其片段。在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含BCR-ABL易位的区域或由BCR-ABL易位的区域组成的位点，所述区域包含BCR和ABL基因的接点或其片段。在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含SYT-SSX易位的区域或由SYT-SSX易位的区域组成的位点，所述区域包含SYT和SSX基因的接点或其片段。在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含下述区域或由下述区域组成的位点：(i)MYB-NFIB易位的区域，其包含MYB和NFIB基因的接点或其片段；或(ii)FUS-CHOP易位的区域，其包含FUS和CHOP基因的接点或其片段。在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含两个基因区域的并置/接点的易位位点，或者包含一个点突变或多个点突变的基因区域。

在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向包含这样的区域或由这样的区域组成的位点，所述区域包含基因的扩增。在一些实施方案中，PNA试剂靶向包含AKT2、CDK4、MDM2、MYCN、CCNE、CCND1、KRAS、HRAS、EGFR、ERBB2、ERBB1、FGF、FGFR1、FGFR2、MYC、MYB和MET的基因扩增。

在一些实施方案中，所述PNA试剂具有靶向基因中的位点的序列，该PNA试剂的特征在于，当将包含表达所述基因的细胞的系统暴露于所述PNA试剂时，当所述PNA试剂存在时所述基因的表达被降低在正常活性的20％至90％阻抑的范围内的量，相比于当它不存在时但在其他方面相当的条件而言。在一些实施方案中，所述PNA试剂具有靶向基因中的位点的序列，该PNA试剂的特征在于，当将包含表达所述基因的细胞的系统暴露于所述PNA试剂时，当所述PNA试剂存在时所述基因的表达被降低在20％至90％的范围内的量，相比于当它不存在时但其他方面相当的条件而言。在一些实施方案中，蛋白质产物降低至小于50％表达。在一些实施方案中，所述细胞为人细胞。在一些实施方案中，所述系统为或包含动物。在一些实施方案中，所述系统为或包含灵长类。在一些实施方案中，所述系统为或包含人。在一些实施方案中，所述系统为或包含小鼠。在一些实施方案中，所述系统为或包含基因修饰小鼠。在一些实施方案中，所述系统为或包含BRAF小鼠。在一些实施方案中，所述系统为或包含处于培养物中的细胞。

在一些实施方案中，所述系统包括体外系统。在一些实施方案中，所述系统包括体内系统。在一些实施方案中，所述系统为或包含细胞。

在一些实施方案中，所述细胞包括癌细胞。在一些实施方案中，所述系统包含处于细胞培养物中的细胞。在一些实施方案中，所述处于细胞培养物中的细胞包括BRAF野生型细胞。在一些实施方案中，BRAF野生型细胞包括C918细胞。在一些实施方案中，所述处于细胞培养物中的细胞包括BRAF V600E黑素瘤细胞。在一些实施方案中，BRAF V600E黑素瘤细胞选自OCM1A眼色素层黑素瘤细胞和/或SK-MEL 7皮肤黑素瘤细胞。

在一些实施方案中，所述系统为或包含组织。在一些实施方案中，所述系统为或包含生物。在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性相应于所述生物的存活。在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性的显著降低包括所述生物的存活的大于50％增加。在一些实施方案中，所述生物包括小鼠。在一些实施方案中，所述小鼠包括BRAF小鼠。

本公开内容的另一个实施方案为药用组合物，其包含在本文中所公开的PNA试剂和在药学上可接受的承载体。

在一些实施方案中，所述药用组合物被配制成用于直接施用到靶组织中。在一些实施方案中，所述药用组合物被配制成用于口服施用。在一些实施方案中，所述药用组合物被配制成用于胃肠外施用。在一些实施方案中，所述药用组合物被配制成用于真皮内施用。在一些实施方案中，所述药用组合物被配制成用于透皮施用。在一些实施方案中，所述药用组合物被配制成用于通过吸入施用。在一些实施方案中，所述药用组合物为或包含液体。在一些实施方案中，所述药用组合物为或包含固体。

本公开内容的另一个实施方案为用于在受试者中治疗疾病、病症或状况或者降低疾病、病症或状况的风险的方法，其包括：向所述受试者施用有效量的在本文中所公开的PNA试剂或者有效量的在本文中所公开的药用组合物。

在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况为癌症。癌症的非限制性例子包括黑素瘤、眼黑素瘤、肉瘤、胰腺癌、胃肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、结肠直肠癌和甲状腺癌。

本公开内容的另外一个实施方案为用于在细胞中降低基因表达的方法，其包括使所述细胞与有效量的至少一种在本文中所公开的PNA试剂相接触。

在一些实施方案中，在细胞中降低靶基因表达的方法包括：使其中表达所述靶标的细胞与至少一种在本文中所公开的PNA试剂相接触；测定当所述PNA试剂存在时在所述细胞中所述靶标的水平或活性，相比于在当所述PNA试剂不存在时但其他方面相当的条件下所观察到的靶标参考水平或活性而言；并且将所述至少一种PNA试剂归类为靶标抑制剂，如果当所述PNA试剂存在时所述靶标的水平或活性显著地降低，相比于所提供的靶标参考水平或活性而言。在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性包括靶标mRNA水平。在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性包括靶标蛋白质水平。在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性相应于细胞生存力。在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性的显著降低相应于肿瘤细胞生存力的大于90％下降。

在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性的显著降低包括靶标活性的大于30％降低。在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性的显著降低包括靶标水平的大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％降低。在一些实施方案中，所述靶标的水平或活性的显著降低包括大于两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、四十倍、五十倍、六十倍、七十倍、八十倍、九十倍、一百倍、二百倍、三百倍、四百倍、五百倍、六百倍、七百倍、八百倍、九百倍、一千倍、两千倍、三千倍、四千倍、五千倍、六千倍、七千倍、八千倍、九千倍、一万倍或更多。在一些实施方案中，所述参考水平为历史参考。在一些实施方案中，所述历史参考被记录在有形的和/或计算机可读的媒介中。

本发明的另外的特征和优点将会从附图、定义、详细描述和权利要求书中成为是明显的。

定义

试剂：如在本文中所使用的，术语“试剂”可以是指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子、金属或其组合。如从上下文中将会是清楚的，在一些实施方案中，试剂可以为或包含细胞或生物，或者其级分、提取物或组分。在一些实施方案中，试剂为或包含天然产物，因为它被发现于和/或获得自自然界。在一些实施方案中，试剂为或包含一种或多种人造的实体，因为它是通过人的手的活动来设计、改造和/或产生的，和/或未被发现于自然界中。在一些实施方案中，试剂可以以分离的或纯的形式进行使用；在一些实施方案中，试剂可以以粗制的形式进行使用。在一些实施方案中，潜在的试剂作为集合物或文库来提供，例如其可以进行筛选以鉴定或表征在它们之内的活性试剂。可以按照本发明进行使用的试剂的一些特别的实施方案包括小分子、抗体、抗体片段、适配体、siRNA、shRNA、DNA/RNA杂合物、反义寡核苷酸、核酶、肽、肽模拟物、肽核酸、小分子等。在一些实施方案中，试剂为或包含聚合物。在一些实施方案中，试剂不是聚合物和/或实质上没有任何聚合物。在一些实施方案中，试剂包含至少一个聚合物部分。在一些实施方案中，试剂缺乏或实质上没有任何聚合物部分。

亲和力：如在本领域中已知的，“亲和力”是特定配体(例如，HA多肽)结合其伙伴(例如，HA受体)的紧密度的量度。亲和力可以以不同的方法来进行测量。在一些实施方案中，亲和力通过定量测定法(例如，聚糖结合测定法)来进行测量。在一些实施方案中，可以将结合伙伴(例如，HA受体、聚糖等)浓度固定为超过配体(例如，HA多肽)浓度，以便模拟生理条件(例如，病毒HA结合至细胞表面聚糖)。备选地或另外地，在一些实施方案中，结合伙伴(例如，HA受体、聚糖等)浓度和/或配体(例如，HA多肽)浓度可以变动。在一些此类实施方案中，可以将亲和力(例如，结合亲和力)在相当的条件(例如，浓度)下与参考(例如，介导人的感染的野生型HA)进行比较。

氨基酸：如在本文中所使用的，术语“氨基酸”以其最广泛的含义是指可以被掺入到多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H₂N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸为天然出现的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸为合成的氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸为d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸为l-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然出现的肽中发现的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸之外的其他任何氨基酸，无论它是合成制备的还是获得自天然来源。如在本文中所使用的，“合成的氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代物。氨基酸(包括在肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可以通过下述方式来进行修饰：甲基化，酰胺化，乙酰化，保护基团，和/或用可以改变肽的循环半寿期而不会不利地影响其活性的其他化学基团进行取代。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一个或多个翻译后修饰，例如与一个或多个化学实体(例如，甲基基团、乙酸基团、乙酰基团、磷酸基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)相联合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以是指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从其中使用了该术语的上下文中将会明显的是，它是指游离氨基酸还是肽的残基。

动物：如在本文中所使用的，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指任一性别的和处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在一些实施方案中，所述非人动物为哺乳动物(例如，啮齿类、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，所述动物易于被HCV感染。在一些实施方案中，动物可以为转基因动物、基因改造动物和/或克隆。

抗体试剂：如在本文中所使用的，术语“抗体试剂”是指与特定抗原特异性地结合的试剂。在一些实施方案中，该术语涵盖具有足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽。合适的抗体试剂包括但不限于人抗体、灵长类动物源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、经缀合的抗体(即，与其他蛋白质、放射性标记物、细胞毒素相缀合或融合的抗体)、小型模块化免疫药物(Small Modular ImmunoPharmaceuticals)(“SMIPs^TM”)、单链抗体、骆驼类动物抗体和抗体片段。如在本文中所使用的，术语“抗体试剂”也包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体(例如，IgNAR或其片段))、从至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出所希望的生物学活性。在一些实施方案中，该术语涵盖订合肽(stapled peptide)。在一些实施方案中，该术语涵盖一种或多种抗体样结合肽模拟物。在一些实施方案中，该术语涵盖一种或多种抗体样结合支架蛋白。在一些实施方案中，该术语涵盖monobody或adnectin。在一些实施方案中，抗体试剂为或包含这样的多肽，其氨基酸序列包括一个或多个被本领域技术人员公认为互补性决定区(CDR)的结构元件；在一些实施方案中，抗体试剂为或包含这样的多肽，其氨基酸序列包括至少一个与在参考抗体中发现的那一个实质上相同的CDR(例如，至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR实质上相同，因为它相比于参考CDR而言在序列上相同或者包含1-5个氨基酸置换。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR实质上相同，因为它与参考CDR显示出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR实质上相同，因为它与参考CDR显示出至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR实质上相同，因为相比于参考CDR而言在所包括的CDR内的至少一个氨基酸被缺失、添加或置换，但是所包括的CDR具有与参考CDR在其他方面相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR实质上相同，因为相比于参考CDR而言在所包括的CDR内的1-5个氨基酸被缺失、添加或置换，但是所包括的CDR具有与参考CDR在其他方面相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR实质上相同，因为相比于参考CDR而言在所包括的CDR内的至少一个氨基酸被置换，但是所包括的CDR具有与参考CDR在其他方面相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的CDR与参考CDR实质上相同，因为相比于参考CDR而言在所包括的CDR内的1-5个氨基酸被缺失、添加或置换，但是所包括的CDR具有与参考CDR在其他方面相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体试剂为或包含这样的多肽，其氨基酸序列包括被本领域技术人员公认为免疫球蛋白可变结构域的结构元件。在一些实施方案中，抗体试剂为具有与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源的结合结构域的多肽蛋白质。

拮抗剂：如在本文中所使用的，术语“拮抗剂”是指这样的试剂：i)其抑制、减小或降低另一种试剂(其例如使核酸失活)的效应；和/或ii)抑制、减小、降低或延迟一种或多种生物学事件，例如一种或多种核酸的表达或者一个或多个生物学途径的刺激。拮抗剂可以为或包括任何化学类别的试剂，包括例如小分子、多肽、核酸、碳水化合物、脂质、金属和/或任何其他显示出相关抑制活性的实体。拮抗剂可以是直接的(在这种情况下，它直接对于受体施加其影响)或者间接的(在这种情况下，它通过除了与受体结合之外的其他方式来施加其影响；例如，改变受体的表达或翻译，改变由受体直接激活的信号转导途径，改变受体的激动剂的表达、翻译或活性)。

抗体多肽：如在本文中所使用的，术语“抗体多肽”或“抗体”或者“其抗原结合片段”(它们可互换使用)是指能够与表位相结合的多肽。在一些实施方案中，抗体多肽为全长抗体，和在一些实施方案中，小于全长但是包括至少一个结合位点(其包含至少一个，和优选地至少两个具有抗体“可变区”的结构的序列)。在一些实施方案中，术语“抗体多肽”涵盖任何具有与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源的结合结构域的蛋白质。在一些实施方案中，“抗体多肽”涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域显示出至少99％同一性的结合结构域的多肽。在一些实施方案中，“抗体多肽”为任何具有与免疫球蛋白结合结构域(例如参考免疫球蛋白结合结构域)显示出至少70％、80％、85％、90％或95％同一性的结合结构域的蛋白质。所包括的“抗体多肽”可以具有与在天然来源中发现的抗体的氨基酸序列相同的氨基酸序列。根据本发明的抗体多肽可以通过任何可用的手段来制备，包括例如从天然来源或抗体文库中分离，在宿主系统中或用宿主系统重组产生，化学合成，等等，或者其组合。抗体多肽可以是单克隆的或多克隆的。抗体多肽可以是任何免疫球蛋白类别(包括下列人类别中的任一种：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)的成员。在一些实施方案中，抗体可以是IgG免疫球蛋白类别的成员。如在本文中所使用的，术语“抗体多肽”或“抗体的特征性部分”可互换使用，并且是指具有与目的表位相结合的能力的抗体的任何衍生物。在一些实施方案中，所述“抗体多肽”为抗体片段，其至少保持了全长抗体的特异性结合能力的很大一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv、双链抗体和Fd片段。备选地或另外地，抗体片段可以包含多条链，它们连接在一起，例如通过二硫键。在一些实施方案中，抗体多肽可以为人抗体。在一些实施方案中，所述抗体多肽可以是人源化的。人源化抗体多肽可以为包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或抗体多肽(例如，Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其他抗原结合子序列)。一般而言，人源化抗体为这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补性决定区(CDR)的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供者抗体)(例如，小鼠、大鼠或兔子)的CDR的残基替代。

抗原：“抗原”为抗体所与之相结合的分子或实体。在一些实施方案中，抗原为或包含多肽或其部分。在一些实施方案中，抗原为被抗体所识别的感染因子的部分。在一些实施方案中，抗原为：(i)引发免疫应答的试剂；和/或(ii)当暴露于或施用给生物时被T细胞受体(例如，当由MHC分子呈递时)或抗体(例如，由B细胞所产生的)所结合的试剂。在一些实施方案中，抗原在生物中引发体液应答(例如，包括抗原特异性抗体的产生)；备选地或另外地，在一些实施方案中，抗原在生物中引发细胞应答(例如，涉及其受体与该抗原特异性地相互作用的T-细胞)。本领域技术人员将会意识到，特定的抗原在靶生物(例如，小鼠、兔子、灵长类、人)的一个或几个成员中，但不是在靶生物物种的所有成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原在靶生物物种的至少大约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原与抗体和/或T细胞受体相结合，并且可以或可以不在生物中诱导特定的生理学应答。在一些实施方案中，例如，抗原可以在体外与抗体和/或T细胞受体相结合，无论这样的相互作用是否在体内出现。一般而言，抗原可以为或包括任何化学实体，例如小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、除了生物聚合物之外(例如，除了核酸或氨基酸聚合物之外)的其他聚合物，等等。在一些实施方案中，抗原位或包含多肽。在一些实施方案中，抗原为或包含聚糖。本领域技术人员将会意识到，一般而言，抗原可以以分离的或纯的形式提供，或者备选地，可以以粗制的形式提供(例如，与其他材料一起，例如在提取物例如细胞提取物或者其他包含抗原的来源的相对粗制的制备物中)。在一些实施方案中，根据本发明所使用的抗原以粗制的形式提供。在一些实施方案中，抗原为或包含重组抗原。

大致：如在本文中所使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大致”或“大约”是指与所陈述的参考值相似的值。在一些实施方案中，术语“大致”或“大约”是指这样的值的范围，其在任一方向上(大于或小于)落在所陈述的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小之内，除非另有说明或者从上下文中可以明显看出(除了这样的数目将会超过可能值的100％时)。

在生物学上有活性的：如在本文中所使用的，短语“在生物学上有活性的”是指在生物系统(例如，细胞培养物、生物等)中具有活性的任何物质的特征。例如，当施用给生物时对于那种生物具有生物学效应的物质被认为是在生物学上有活性的。在一些实施方案中，当蛋白质或多肽是在生物学上有活性的时，共享所述蛋白质或多肽的至少一种生物学活性的那种蛋白质或多肽的一部分典型地被称作“在生物学上有活性的”部分。

特征性部分：如在本文中所使用的，术语物质的“特征性部分”以其最广泛的含义为相关于该整个物质而言共享一些程度的序列或结构同一性的部分。在一些实施方案中，特征性部分与完整物质共享至少一个功能特征。例如，蛋白质或多肽的“特征性部分”为这样的部分，其包含一个连续的氨基酸链段，或者连续的氨基酸链段的集合，这些氨基酸一起对于蛋白质或多肽来说是特征性的。在一些实施方案中，每个这样的连续链段通常包含至少2、5、10、15、20、50或更多个氨基酸。通常，物质(例如，蛋白质、抗体等)的特征性部分是这样的部分，其除了上面所指定的序列和/或结构同一性外，还与相关的完整物质共享至少一个功能特征；表位结合特异性是一个例子。在一些实施方案中，特征性部分可以是在生物学上有活性的。

联合疗法：如在本文中所使用的，术语“联合疗法”是指这样的那些情形，其中两种或更多种不同的用于治疗疾病的药学试剂以重叠的制度进行施用，从而受试者同时暴露于至少两种试剂。在一些实施方案中，所述不同的试剂同时进行施用。在一些实施方案中，一种试剂的施用与至少一种其他试剂的施用重叠。在一些实施方案中，所述不同的试剂顺次进行施用，从而所述试剂在受试者内具有同时的生物学活性。

检测实体：如在本文中所使用的，术语“检测实体”是指促进它所连接至的试剂(例如，抗体)的检测的任何元素、分子、官能团、化合物，其片段或部分。检测实体的例子包括但不限于：各种配体、放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁸F、¹⁹F、³²P、³⁵S、¹³⁵I、¹²⁵I、¹²³I、⁶⁴Cu、¹⁸⁷Re、¹¹¹In、⁹⁰Y、^99mTc、¹⁷⁷Lu、⁸⁹Zr等)、荧光染料(关于具体的示例性荧光染料，参见下面)、化学发光试剂(例如，吖啶酯、经稳定化的二氧杂环丁烷(dioxetane)等)、生物发光试剂、在光谱上可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(例如，量子点)、金属纳米颗粒(例如，金、银、铜、铂等)、纳米簇、顺磁性金属离子、酶(关于酶的具体例子，参见下面)、比色法标记物(例如，染料、胶体金等)、生物素、洋地黄毒苷、半抗原和蛋白质(对于其，抗血清或单克隆抗体是可得的)。

诊断信息：如在本文中所使用的，诊断信息或用于在诊断中使用的信息为任何在下述方面有用的信息：确定患者是否具有疾病或状况；和/或将疾病或状况归类入表型类别或者任何相关于疾病或状况的预后或者可能对于疾病或状况的治疗(一般性的治疗或者任何特定的治疗)的应答方面具有意义的类别。类似地，诊断是指提供任何类型的诊断信息，包括但不限于，受试者是否可能具有疾病或状况(例如癌症)，在受试者中所表现的疾病或状况的状态、分期或特征，与肿瘤的性质或分类相关的信息，与预后相关的信息，和/或在选择合适的治疗中有用的信息。治疗的选择可以包括特定的治疗性(例如，化学治疗性)试剂或其他治疗样式例如外科手术、辐射等的选择，关于不给还是给予治疗的选择，关于按剂量给药制度(例如，特定治疗性试剂或者治疗性试剂的组合的一个或多个剂量的频次或水平)的选择，等等。

剂型：如在本文中所使用的，术语“剂型”和“单位剂型”是指待向受试者施用的治疗性组合物的在物理上离散的单元。每个单元包含预先确定的量的活性材料(例如，治疗性试剂)。在一些实施方案中，所述预先确定的量为这样的量，其已经与当在按剂量给药制度中作为一个剂量进行施用时所希望的治疗效应相关连。本领域技术人员意识到，向特定受试者施用的治疗性组合物或试剂的总量由一个或多个主治医师来决定，并且可以涉及多种剂型的施用。

按剂量给药制度：如在本文中使用该术语那样，“按剂量给药制度”(或“治疗制度”)为独个地向受试者施用的一组单位剂量(典型地，多于一个)，其典型地由时间段分隔开。在一些实施方案中，给定的治疗性试剂具有所建议的按剂量给药制度，其可以涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，按剂量给药制度包含多个剂量，其每一个以相同长度的时间段与另一个相分隔开；在一些实施方案中，按剂量给药制度包含多个剂量和至少两个不同的分隔开独个剂量的时间段。在一些实施方案中，按剂量给药制度与或已经与所希望的治疗结果相关连，当在一群患者中施用时。

表达：如在本文中所使用的，核酸序列的“表达”是指下列事件中的一种或多种：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’末端形成)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

功能性(的)：如在本文中所使用的，“功能性”生物分子为以这样的形式的生物分子，它以所述形式展示出它所以之为特征的特性和/或活性。生物分子可以具有两种功能(即，双功能的)或许多功能(即，多功能的)。

基因：如在本文中所使用的，术语“基因”具有其在本领域中所理解的含义。在一些实施方案中，术语“基因”可以包括基因调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。在一些实施方案中，该术语是指不编码蛋白质而是编码功能性RNA分子例如tRNA、RNAi-诱导试剂等的核酸。备选地或另外地，在一些实施方案中，如在本申请中所使用的，术语“基因”是指编码蛋白质的核酸的部分。该术语是否涵盖其他序列(例如，非编码序列、调控序列等)对于本领域技术人员来说从上下文将会是清楚的。

基因产物或表达产物：如在本文中所使用的，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或者由从基因转录的RNA所编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。

同源性：如在本文中所使用的，术语“同源性”是指两个聚合物分子之间(例如多肽分子之间)的总相关性。在一些实施方案中，聚合物分子例如抗体被认为是相互“同源的”，如果它们的序列为至少80％、85％、90％、95％或99％同一的。在一些实施方案中，聚合物分子被认为是相互“同源的”，如果它们的序列为至少80％、85％、90％、95％或99％相似的。

赖氨酸或赖氨酸残基：如在本文中所使用的，术语“赖氨酸”或“赖氨酸残基”是指碱性氨基酸残基及其衍生物。此类衍生物包括具有侧链修饰的那些赖氨酸残基。赖氨酸衍生物包括e-棕榈酰基赖氨酸或Lys(棕榈酰基)-(dLys)2。

标志物：如在本文中所使用的，“标志物”是指其存在或水平是特定肿瘤或其转移性疾病的特征的试剂。例如，在一些实施方案中，该术语是指对于特定肿瘤、肿瘤亚类、肿瘤阶段等来说特征性的基因表达产物。备选地或另外地，在一些实施方案中，特定标志物的存在或水平与特定信号传导途径(例如，其可以对于特定类别的肿瘤来说是特征性的)的活性(或活性水平)相关。在一些实施方案中，标志物的存在或不存在的统计学显著性可以依赖于特定标志物而变化。在一些实施方案中，标志物的检测是高度特异性的，因为它反映了所述肿瘤属于特定亚类的高可能性。这样的特异性可能以灵敏度为代价(即，阴性结果可能出现，即使所述肿瘤为将会被预期表达所述标志物的肿瘤)。相反地，具有高程度灵敏度的标志物可能比具有较低灵敏度的那些标志物较不特异。根据本发明，有用的标志物不需要以100％准确性区别特定亚类的肿瘤。

突变体(型)：如在本文中所使用的，术语“突变体(型)”是指相比于其天然出现的对应物而言在核酸(或任选地，基因)序列中的任何改变。突变体(型)也可以是指基因产物(例如，蛋白质)、具有经突变的基因的细胞或生物。具有突变的核酸序列也可以被称为突变型序列元件。

非启动子区：如在本文中所使用的，术语“非启动子区”是指基因的这样的那些部分，其不是转录起始位点。与启动子区不同，非启动子区倾向于被封锁并且较不易被其他元件接近。

癌基因：如在本文中所使用的，术语“癌基因”是指其产物与在生物中引起癌症、发育异常、增生等相关联的那些基因。本公开内容的癌基因可以包括但不限于：ABL1、ABL2、ALK、AKT1、AKT2、ATF1、BCL11A、BCL2、BLC3、BCL6、BCR、BRAF、CARD11、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CDX2、CTNNB1、DDB2、DDIT3、DDX6、DEK、EGFR、ELK4、ERBB2、ETV4、ETV6、EVI1、EWSR1、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FUS、GOLGA5、HMGA1、HMGA2、HRAS、IRF4、IDH1、IDH2、JUN、KIT、KRAS、LCK、LMO2、MAF、MAFB、MAML2、MDM2、MET、MITF、MLL、MPL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NCOA4、NFKB2、NRAS、NTRK1、NUP214、PAX8、PDGFB、PIK3CA、PIM1、PLAG1、PPARG、PTPN11、RAF1、REL、RET、ROS1、SMO、SS18、TCL1A、TET2、TFG、TLX1、TPR和USP6。

患者：如在本文中所使用的，术语“患者”或“受试者”是指任何这样的生物，向其施用或可能施用所提供的组合物，例如为了实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类和/或人)。在一些实施方案中，患者为人。在一些实施方案中，患者正罹患或易患一种或多种病症或状况。在一些实施方案中，患者展现出病症或状况的一个或多个症状。在一些实施方案中，患者已被诊断为具有一种或多种病症或状况。在一些实施方案中，所述病症或状况为或包括癌症，或者一种或多种肿瘤的存在。在一些实施方案中，这样的癌症或肿瘤为或包括前列腺的癌症或在前列腺中的肿瘤。在一些实施方案中，所述病症或状况为转移性癌症。在一些实施方案中，所述病症或状况为黑素瘤。

肽：术语“肽”是指通过肽键或经修饰的肽键相互连接的两个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，“肽”是指具有少于大约100个氨基酸、少于大约50个氨基酸、少于20个氨基酸或少于10个氨基酸的长度的多肽。

肽核酸：术语“肽核酸”是指与DNA或RNA相似但是分别缺乏脱氧核糖和核糖主链的合成聚合物。肽核酸具有由通过肽键进行连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成的主链。嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基桥和羰基基团与主链相连接。

在药学上可接受的：如在本文中所使用的，术语“在药学上可接受的”是指这样的物质，其在合理的医学判断范围内适合于与人类和动物的组织相接触地进行使用，而无过度的毒性、刺激、变应性应答或其他问题或并发症，这与合理的益处/风险比相称。

药用组合物：如在本文中所使用的，术语“药用组合物”是指与一种或多种在药学上可接受的承载体一起配制的活性试剂。在一些实施方案中，活性试剂以适合于在治疗制度中的施用的单位剂量数量存在，其显示出在当施用给相关群体时取得预先确定的治疗效应的在统计学上显著的概率。在一些实施方案中，药用组合物可以特别地被配制成用于以固体或液体形式进行施用，包括适合于下列的那些：口服施用，例如灌服剂(drenches)(水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂，例如以颊、舌下和全身吸收为目标的那些，大丸剂，粉剂，颗粒剂，用于施加至舌的糊剂；胃肠外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液，或持续释放制剂；局部应用，例如作为霜剂、软膏剂或者施加至皮肤、肺或口腔的受控释放的贴剂或喷雾剂；以阴道内方式或以直肠内方式，例如作为阴道栓剂、霜剂或泡沫剂；以舌下方式；以眼方式；以透皮方式；或以鼻方式，肺的，和至其他粘膜表面。

多肽：如在本文中所使用的，“多肽”通常而言为一串通过肽键相互附着的至少两个氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以包含至少3-5个氨基酸，其每一个通过至少一个肽键相互附着。本领域技术人员将会意识到，多肽有时任选地包含“非天然”氨基酸或其他实体(其虽然如此但能够整合到多肽链中)。

预后和预测信息：如在本文中所使用的，术语“预后信息”和“预测信息”可互换使用，以指任何可以用于指明在治疗不存在或存在下疾病或状况过程的任何方面的信息。这样的信息可以包括但不限于患者的平均预期寿命，患者将会存活给定量的时间(例如，6个月、1年、5年等)的可能性，患者将会被治愈疾病的可能性，患者的疾病将会对特定疗法作出应答的可能性(其中应答可以以各种各样的方式中的任一种来定义)。预后和预测信息被包括在宽泛类别的诊断信息之内。

启动子：如在本文中所使用的，术语“启动子”是指这样的DNA的区域，其充当关于特定基因的转录的起始位点。启动子序列经常是开放的/或解开的，并且等待与其他元件的结合。

蛋白质：如在本文中所使用的，术语“蛋白质”是指多肽(即，一串通过肽键相互连接的至少3-5个氨基酸)。蛋白质可以包括除了氨基酸之外的其他部分(例如，可以为糖蛋白、蛋白聚糖等)，和/或可以在其他方面进行了加工或修饰。在一些实施方案中，“蛋白质”可以为由细胞产生的和/或在细胞中有活性的完整多肽(具有或不具有信号序列)；在一些实施方案中，“蛋白质”为或包含特征性部分，例如由细胞产生的和/或在细胞中有活性的多肽。在一些实施方案中，蛋白质包括多于一条多肽链。例如，多肽链可以通过一个或多个二硫键相连接或者通过其他方式相联合。在一些实施方案中，如在本文中所描述的，蛋白质或多肽可以包含L-氨基酸、D-氨基酸或两者，和/或可以包含本领域中已知的各种各样的氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包括例如，末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质或多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成的氨基酸和/或其组合。在一些实施方案中，蛋白质为或包含抗体、抗体多肽、抗体片段、其在生物学上有活性的部分和/或其特征性部分。

应答：如在本文中所使用的，对于治疗的应答可以是指由于治疗而出现的或与治疗相关的在受试者状况方面的任何有益改变。这样的改变可以包括该状况的稳定化(例如，阻止在该治疗不存在下将会发生的恶化)，该状况的症状的改善，和/或在关于治愈该状况的前景方面的改进，等等。它可以是指受试者的应答或肿瘤的应答。肿瘤或受试者应答可以按照广泛多样的标准来测量，包括临床标准和客观标准。用于评估应答的技术包括但不限于：临床检查、正电子发射断层成象术、胸部X-射线CT扫描、MRI、超声、内窥镜检查术、腹腔镜检查术、在从受试者获得的样品中肿瘤标志物的存在或水平、细胞学和/或组织学。这些技术中的许多试图测定肿瘤的大小或者测定总的肿瘤负荷。用于评估对于治疗的应答的方法和指南在Therasse等人,“New guidelines to evaluate the response to treatmentin solid tumors”,European Organization for Research and Treatment of Cancer,National Cancer Institute of the United States,National Cancer Institute ofCanada,J.Natl.Cancer Inst.,2000,92(3):205-216中进行了讨论。确切的应答标准可以以任何合适的方式进行选择，条件是当比较肿瘤和/或患者的组时，基于相同或相当的用于确定应答率的标准来评估待比较的组。本领域技术人员将能够选择合适的标准。

样品：如在本文中所使用的，从受试者获得的样品可以包括但不限于下列项目中的任一种或全部：细胞、组织的一部分、血液、血清、腹水、尿、唾液、和其他体液、分泌物或排泄物等。术语“样品”也包括任何通过加工这样的样品而衍生出的材料。衍生的样品可以包括从样品中提取的或者通过使样品经历诸如扩增或mRNA的逆转录等的技术而获得的核苷酸分子或多肽。

特异性结合：如在本文中所使用的，术语“特异性结合”或“特异于”或“对...来说特异性的”是指在靶标实体(例如，靶蛋白质或多肽)与结合试剂(例如，抗体，例如所提供的抗体)之间的相互作用(典型地，非共价的)。如本领域技术人员将会理解的，如果在备选的相互作用存在下它得到偏爱，那么这样的相互作用被认为是“特异性的”。在一些实施方案中，相互作用典型地依赖于靶分子的特定的结构特征(例如，由结合分子所识别的抗原决定簇或表位)的存在。例如，如果抗体特异于表位A，那么在包含游离的未标记的A和针对其的抗体两者的反应中包含表位A的多肽的存在或者游离的未标记的A的存在将会减少与所述抗体相结合的未标记的A的数量。应当理解的是，特异性不需要是绝对的。例如，本领域中众所周知的是，除了存在于靶分子中的那些之外，许多抗体也与其他表位交叉反应。此类交叉反应性可以是可接受的，这取决于所述抗体待用于的应用。本领域技术人员将能够选择具有对于在任何给定的应用(例如，用于靶分子的检测，用于治疗目的，等等)中适当地执行任务来说足够的特异性程度的抗体。特异性可以在额外的因素(例如，结合分子对于靶分子的亲和力相比于结合分子对于其他靶标(例如，竞争者)的亲和力)的情景下进行评价。如果结合分子展示出高的对于希望它去检测的靶分子的亲和力和低的对于非靶分子的亲和力，那么该抗体将可能是可接受的用于免疫诊断目的的试剂。一旦在一种或多种情景下建立了结合分子的特异性，就可以在其他(优选地，相似的)情景下采用它，而不必重新评价其特异性。

癌症的阶段：如在本文中所使用的，术语“癌症的阶段”是指癌症的进展水平的定性或定量评估。用于确定癌症的阶段的标准包括但不限于肿瘤的大小和转移的程度(例如，局部的或远距离的)。

实质上：如在本文中所使用的，术语“实质上”是指展示出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物学领域的技术人员将会理解，生物学和化学现象很少(如果曾经)达到完成和/或进行至完全或取得或避免绝对结果。因此，术语“实质上”在本文中用于捕捉在许多生物学和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。

罹患：正“罹患”疾病、病症或状况(癌症)的个体已被诊断为具有和/或展示出该疾病、病症或状况的一个或多个症状。在一些实施方案中，正罹患癌症的个体为具有相对于不具有癌症的个体而言增加的肿瘤相关联的或肿瘤内的癌症相关的标志物的个体。

症状得到减轻：根据本发明，当特定疾病、病症或状况的一个或多个症状在大小程度(例如，强度、严重度等)和/或频次方面减小，那么“症状得到减轻”。为了清楚起见，特定症状的开始的延迟被认为是一种减少了那种症状的频次的形式。许多具有较小肿瘤的癌症患者没有症状。并不打算的是，将本发明仅限制于其中症状被消除的情况。本发明特别地考虑了治疗，从而一个或多个症状得到减轻(并且受试者的状况由此得到“改善”)，虽然未完全消除。

治疗性试剂：如在本文中所使用的，短语“治疗性试剂”是指任何当施用给受试者时具有治疗效应和/或引发希望的生物学和/或药理学效应的试剂。

治疗有效量：如在本文中所使用的，术语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理的益处/风险比将治疗效应赋予所治疗的受试者的治疗性蛋白质的量。所述治疗效应可以是客观的(即，通过一些测试或标志物可测量的)或主观的(即，受试者提供效果的指示或感觉到效果)。特别地，“治疗有效量”是指治疗性蛋白质或组合物的这样的量，其对于治疗、改善或防止所希望的疾病或状况或者展示出可检测的治疗或预防效应(例如，通过改善与该疾病相关联的症状，阻止或延迟该疾病的开始，和/或还有减少该疾病的症状的严重度或频次)来说是有效的。治疗有效量通常以可以包含多个单位剂量的按剂量给药制度来进行施用。对于任何特定的治疗性蛋白质，治疗有效量(和/或在有效的按剂量给药制度内的合适的单位剂量)可以变化，例如取决于施用途径、与其他药学试剂的组合。此外，关于任何特定患者的具体的治疗有效量(和/或单位剂量)可以取决于各种各样的因素，包括正进行治疗的病症和该病症的严重度；所采用的特定药学试剂的活性；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；所采用的特定融合蛋白的施用时间、施用途径和/或排泄或代谢速率；治疗的持续时间；和类似因素，其是医学领域中众所周知的。

治疗：如在本文中所使用的，术语“治疗”是指物质的任何施用，其部分地或完全地减轻、改善、缓解、抑制、延迟特定疾病、病症和/或状况(例如，癌症)的一个或多个症状、特征和/或原因的开始，减小其严重度，和/或降低其发生率。这样的治疗可以涉及不展示出有关疾病、病症和/或状况的征候的受试者，和/或涉及仅展示出所述疾病、病症和/或状况的早期征候的受试者。备选地或另外地，这样的治疗可以涉及展示出有关疾病、病症和/或状况的一个或多个已建立的征候的受试者。在一些实施方案中，治疗可以涉及已被诊断为罹患有关疾病、病症和/或状况的受试者。在一些实施方案中，治疗可以涉及已知具有一个或多个在统计学上与增加的有关疾病、病症和/或状况发展风险相关连的易感性因素的受试者。

术语“PNA”和“PNA部分”在本文中可互换使用。术语“PNA试剂”和“PNA衍生物”在本文中可互换使用。

肽核酸(PNA)试剂结构

肽核酸是与DNA和RNA具有相似性的合成聚合物。PNA具有通过肽键相连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元的主链。PNA在本文中也被称为PNA部分。这不同于DNA和RNA的主链，其分别由脱氧核糖和核糖糖骨架组成。进一步地，嘧啶和嘌呤碱基通过羰基基团和亚甲基桥与PNA主链相连接。PNA主链不包含带电荷的磷酸基团。因此，由于缺乏静电推斥，PNA序列与DNA(或RNA)链之间的结合比两条DNA(或RNA)链之间的结合更强。由于更高的结合强度，长于20-25个碱基的PNA寡聚体通常不是必要的。增加PNA链的长度可能降低对于靶DNA(或RNA)序列的特异性。PNA/DNA错配具有比DNA/DNA错配更大的不稳定性；当与互补序列相结合时，PNA展示出比DNA更大的特异性。缺乏带电荷的磷酸基团也对PNA的疏水性质做出了贡献，其不经一些修饰就无法跨过细胞膜。这些修饰可以包括但不限于：共价偶联细胞穿透肽和/或添加阳离子的/疏水性的肽。PNA在宽的pH范围内也是稳定的并且能抵抗酶降解，因为它们不被蛋白酶或核酸酶所识别。

在一些实施方案中，PNA试剂与靶序列是互补的。在一些实施方案中，它们是由目的基因表达的mRNA序列的精确拷贝。在一些实施方案中，这也是所述基因的有义链序列。在一些实施方案中，可以与任何目的基因互补地来产生PNA试剂。

在一些实施方案中，在本文中所公开的PNA试剂具有下列结构之一：

AcNH-Lys(棕榈酰基)-dLys-dLys-[PNA]-dLys-dLys-Lys(棕榈酰基)-CONH₂(无递送肽)，

AcNH-Lys(棕榈酰基)-dLys-dLys-[PNA]-CONH₂(无递送肽)，和

AcNH-[PNA]-dLys-dLys-Lys(棕榈酰基)-CONH₂(无递送肽)。

基因靶向

在一些实施方案中，以阳离子方式带电荷的末端改善了PNA靶向具有特定核酸序列的基因的能力。使以阳离子方式带电荷的赖氨酸-衍生的末端针对阴离子DNA进行稳定化通过末端成核作用而提供了在动力学上更快的结合，按照Zimm-Bragg统计学模型。这使得PNA以经改善的方式靶向非启动子序列成为可能，这是尤其出人意料的，鉴于启动子序列通常是开放的/解开的并且等待结合，而基因的非启动子区则较不易接近。将PNA针对其DNA靶标进行稳定化只是因为缺乏推斥性的阴离子磷酸-磷酸推斥力(焓优势)。PNA-肽的阳离子末端通过使PNA-肽的在构型上更游离的末端针对靶标进行稳定化而改善了结合的熵组分。

在一些实施方案中，PNA-肽缀合物的PNA具有标准设计-长度范围通常为13-18个碱基。对于小于13个碱基的长度，结合由于降低的结合焓而在热力学上变得非常较为不利。对于大于18个碱基的长度，其并不提供更多的热力学优势，因为焓结合能的增益被适当地布置这样的长链的动力学劣势(更多的分子内底物可以与结合状态竞争)所抵消。

在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向特定的基因或基因序列。PNA试剂可以被设计成靶向具有已知的经突变的序列的基因以及基因易位位点。在一些实施方案中，所述PNA试剂靶向癌基因。在一些实施方案中，所述PNA试剂可以靶向突变型癌基因。在一些实施方案中，可以被靶向的野生型和突变型癌基因选自包括下列各项的组：ABL1、ABL2、AKT1、AKT2、ALK、ATF1、BCL11A、BCL2、BLC3、BCL6、BCR、BRAF、CARD11、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CDX2、CTNNB1、DDB2、DDIT3、DDX6、DEK、EGFR、ELK4、ERBB2、ETV4、ETV6、EVI1、EWSR1、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FUS、GOLGA5、HMGA1、HMGA2、HRAS、IDH1、IDH2、IRF4、JUN、KIT、KRAS、LCK、LMO2、MAF、MAFB、MAML2、MDM2、MET、MITF、MLL、MPL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NCOA4、NFKB2、NRAS、NTRK1、NUP214、PAX8、PDGFB、PIK3CA、PIM1、PLAG1、PPARG、PTPN11、RAF1、REL、RET、ROS1、SMO、SS18、TCL1A、TET2、TFG、TLX1、TPR和USP6。在一些实施方案中，被靶向的癌基因包括BRAF、Gnaq和KRAS。在一些实施方案中，PNA试剂可以靶向基因异常的位点。在一些实施方案中，PNA试剂可以靶向易位位点。在一些实施方案中，易位位点可以包括MYB-NFIB易位的接点。在一些实施方案中，易位位点可以包括FUS-CHOP易位的接点。在一些实施方案中，易位位点可以包括BCR-ABL易位的接点。在一些实施方案中，易位位点可以包括SYT-SSX易位的接点。可以靶向任何基因序列；所呈现的PNA-肽试剂旨在用于针对包含单点突变(和/或其组合)的癌基因、基因易位点、基因扩增或者驱动肿瘤的过表达的野生型基因进行靶向。

用于测试PNA试剂的系统

可以在癌细胞系以及表达基因异常的细胞系中测试PNA试剂。在一些实施方案中，在癌细胞系中测试PNA试剂。在一些实施方案中，在黑素瘤细胞系中测试PNA试剂。在一些实施方案中，在眼色素层和皮肤黑素瘤以及尤因肉瘤细胞系中测试PNA试剂。可以在表达与除了癌症之外的其他疾病相关联的基因异常的细胞系中测试PNA试剂。可以在具有失常的基因表达的神经元和/或肌细胞系中测试PNA试剂。在一些实施方案中，在包含突变型基因序列的啮齿类模型中测试PNA试剂。在一些实施方案中，可以在任何细胞系中测试PNA试剂。本领域技术人员采用各种各样的细胞系用于测试PNA肽。

PNA试剂的应用

通过PNA试剂的靶向和结合将会具有作为研究工具、医学诊断剂和药学治疗的用途。在一些实施方案中，PNA试剂可以用于靶向和结合特定的基因序列。在一些实施方案中，PNA试剂可以用于阻抑基因序列的表达。靶向特定基因的PNA试剂可以在了解那些基因的功能中充当有价值的研究工具。阻抑特定基因产物的表达将会帮助阐明和发现那些产物在不同的生物学途径中的作用。

在一些实施方案中，将PNA试剂用于靶向和阻抑BRAF基因的表达。在一些实施方案中，将PNA试剂用于靶向和阻抑突变型BRAF基因的表达。在一些实施方案中，将PNA试剂用于靶向和阻抑突变型Gnaq基因的表达。在一些实施方案中，将PNA试剂用于靶向和阻抑突变型KRAS基因的表达。在一些实施方案中，PNA试剂可以用于治疗与基因序列相关联的疾病。在一些实施方案中，将PNA试剂用于治疗与经突变的BRAF基因相关联的疾病。在一些实施方案中，将PNA试剂用于治疗与经突变的Gnaq基因相关联的疾病。在一些实施方案中，将PNA试剂用于治疗与经突变的KRAS基因相关联的疾病。在一些实施方案中，将PNA试剂用于治疗癌症。

在一些实施方案中，将PNA试剂用于在动物中治疗癌症。在一些实施方案中，将PNA试剂用于在哺乳动物中治疗癌症。在一些实施方案中，将PNA试剂用于在灵长类中治疗癌症。在一些实施方案中，将PNA试剂用于在人中治疗癌症。

PNA试剂可以靶向和结合至经突变的基因序列并且阻抑突变型癌基因的表达，由此阻抑和/或治疗癌症。在一些实施方案中，将PNA试剂用于治疗归因于经突变的BRAF基因的癌症。在一些实施方案中，将PNA试剂用于治疗归因于经突变的Gnaq基因的癌症。在一些实施方案中，将PNA试剂用于治疗归因于易位的癌症。PNA试剂可以靶向和结合至基因易位的接点并且阻抑经突变的基因序列的表达，由此预防和/或治疗与易位相关联的癌症。MYB-NFIB易位和FUS-CHOP易位的接点可以被本公开内容的PNA试剂所靶向和阻抑。BCR-ABL易位和SYT-SSX易位的接点可以被本公开内容的PNA试剂所靶向和阻抑。PNA试剂可以靶向和结合至基因扩增的接点并且阻抑经突变的基因序列的表达，由此预防和/或治疗与扩增相关联的癌症。包含基因AKT2、CDK4、MDM2、MYCN、CCNE、CCND1、KRAS、HRAS、EGFR、ERBB2、ERBB1、FGF、FGFR1、FGFR2、MYC、MYB和MET的基因扩增可以被本公开内容的PNA试剂所靶向和阻抑。

PNA试剂可以用于治疗在不与癌症相关联的疾病中的基因异常。可以通过使PNA试剂靶向表达有害基因产物的经突变的基因来治疗由经突变的基因产物所引起的疾病或状况。可以通过使用靶向的PNA试剂来治疗遗传或先天性病症。PNA试剂可以用于阻抑正常基因例如支持肥胖症、代谢综合征或相关的血管病的那些。PNA试剂可以用于靶向引起感染的真菌基因、病毒基因或细菌基因。

药用组合物

本发明还提供了组合物，其包含一种或多种所提供的抗体、其片段或特征性部分。在一些实施方案中，本发明提供了至少一种PNA-缀合物和至少一种在药学上可接受的赋形剂。此类药用组合物可以任选地包含另外的在治疗上或在生物学上有活性的物质，和/或与另外的在治疗上或在生物学上有活性的物质相组合地进行施用。在一些实施方案中，所提供的药用组合物在医学或者制备药物中是有用的。在一些实施方案中，所提供的药用组合物在治疗或预防癌症和其神经变性病症中作为预防性试剂(例如，疫苗)是有用的。在一些实施方案中，所提供的药用组合物在治疗性应用中是有用的，例如在罹患癌症的个体中；例如，作为能够特异性地使阻断失常的细胞信号传导的细胞毒性试剂或化合物进行靶向的递送载料。在一些实施方案中，所述药用组合物同时在诊断性应用和治疗性应用中是有用的。在一些实施方案中，将药用组合物配制成用于向人施用。在一些实施方案中，所述药用组合物包含与在本文中所定义的治疗性试剂或其他治疗剂相组合或相缀合的抗体。

例如，药用组合物可以以无菌可注射形式(例如，适合于皮下注射或静脉内输注的形式)来提供。在一些实施方案中，药用组合物以适合于注射的液体剂型来提供。在一些实施方案中，药用组合物作为在注射前用水性稀释剂(例如，水、缓冲液、盐溶液等)进行重构的粉末(例如，经冻干的和/或经灭菌的)(任选地，在真空中)来提供。在一些实施方案中，在水、氯化钠溶液、乙酸钠溶液、苄醇溶液、磷酸盐缓冲盐水等中稀释和/或重构药用组合物。在一些实施方案中，应当将粉末与水性稀释剂轻轻地相混合(例如，不摇动)。

在一些实施方案中，所提供的药用组合物包含一种或多种在药学上可接受的赋形剂(例如，防腐剂、惰性稀释剂、分散试剂、表面活性试剂和/或乳化剂、缓冲试剂等)。在一些实施方案中，药用组合物包含一种或多种防腐剂。在一些实施方案中，药用组合物不包含防腐剂。

在一些实施方案中，药用组合物以可以冷藏和/或冷冻的形式来提供。在一些实施方案中，药用组合物以不能冷藏和/或冷冻的形式来提供。在一些实施方案中，经重构的溶液和/或液体剂型可以在重构后储存一定的时间段(例如，2小时、12小时、24小时、2天、5天、7天、10天、2周、一个月、两个月或更长)。在一些实施方案中，将抗体组合物储存长于所规定的时间导致抗体降解。

液体剂型和/或经重构的溶液可以在施用前包含颗粒物质和/或变色。在一些实施方案中，如果变色或混浊和/或如果颗粒物质在过滤后保留，那么不应当使用溶液。

在本文中所描述的药用组合物可以通过在药理学领域中已知的或今后开发出的任何方法来制备。在一些实施方案中，此类制备方法包括下述步骤：将活性成分与一种或多种赋形剂和/或一种或多种其他附属成分相联合，然后，如果需要和/或希望，使产品成形和/或将其包装入所希望的单剂量或多剂量单位中。

根据本发明的药用组合物可以批量地、作为单单位剂量和/或作为多个单单位剂量来制备、包装和/或销售。如在本文中所使用的，“单位剂量”是包含预先决定的量的活性成分(例如，肽核酸试剂)的药用组合物的离散的量。活性成分的量通常等于将会施用给受试者的剂量和/或此类剂量的一个方便的级分，例如此类剂量的一半或三分之一。

在根据本发明的药用组合物中的活性成分、在药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量可以变化，这取决于所治疗的受试者的身份、体量和/或状况，和/或取决于待施用所述组合物所经由的途径。例如，所述组合物可以包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。

另外，本发明的药用组合物可以包含在药学上可接受的赋形剂，其(如在本文中所使用的)可以为或包含溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载料、分散或悬浮助剂、表面活性试剂、等渗试剂、增稠或乳化试剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，按照适合于所希望的特定剂型。Remington的The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)公开了在配制药用组合物中所使用的各种赋形剂以及用于其制备的已知技术。除非任何常规的赋形剂介质与物质或其衍生物不相容(例如通过产生任何不希望的生物学效应或者与所述药用组合物的任何其他组分以有害方式相互作用)，其使用被考虑是在本发明的范围之内。

缀合物概况

在本文中所描述的的多功能试剂包含多个实体，每个具有至少一种功能。所考虑的多功能试剂的某些实施方案包含靶向性实体和至少一个下列实体：检测实体、治疗性实体和诊断性实体。在一些实施方案中，本发明的多功能试剂包含靶向性实体、治疗性实体和检测实体。在一些实施方案中，试剂的实体可以相互缀合。各种实体相缀合以形成多功能试剂并不限于特定的缀合方式。例如，两个实体可以直接地相互共价缀合。备选地，两个实体可以间接地相互缀合，例如经由连接体实体。在一些实施方案中，多功能试剂可以在该试剂内包括不同类型的缀合，从而该试剂的一些实体经由直接缀合相缀合，而该试剂的其他实体经由一个或多个连接体间接地相缀合。在一些实施方案中，本发明的多功能试剂包含单一类型的连接体实体。在一些实施方案中，本发明的多功能试剂包含多于一种类型的连接体实体。在一些实施方案中，多功能试剂包括单一类型的连接体实体，但是其具有变化的长度。

在一些实施方案中，在多功能试剂中所包含的实体之间或之中存在共价联合。如本领域技术人员将会意识到的，所述部分可以直接地或间接地(例如，通过连接体，如下面所描述的)相互附着。

在一些实施方案中，当多功能试剂的一个实体(例如，靶向性实体)与第二个实体直接地相互共价连接时，这样的直接共价缀合可以是通过联接(例如，连接体或连接性实体)，例如酰胺、酯、碳-碳、二硫化物、氨基甲酸酯、醚、硫醚、脲、硫脲、异硫脲、胺或碳酸酯联接。共价缀合可以通过利用在所述多功能试剂的第一实体和/或第二实体上存在的官能团来实现。备选地，可以将非关键氨基酸替代为将会引入用于偶联目的的有用基团(例如氨基、羧基或硫氢基)的另一种氨基酸。备选地，可以将另外的氨基酸添加至所述多功能试剂的实体中的至少一个，以引入用于偶联目的的有用基团(例如氨基、羧基或硫氢基)。可以用于将部分附着在一起的合适的官能团包括但不限于胺、酸酐、羟基基团、羧基基团、硫醇等。活化试剂例如碳二亚胺可以用于形成直接联接。广泛多样的活化试剂是本领域中已知的，并且适合于将一个实体缀合至第二个实体。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的多功能试剂的实体经由连接体基团间接地相互共价连接。这样的连接体基团也称为连接体或连接体实体。这可以通过使用任何数目的本领域中众所周知的稳定的双官能试剂来完成，包括同官能和异官能试剂(关于此类试剂的例子，参见例如Pierce Catalog and Handbook)。双官能连接体的使用不同于活化试剂的使用，因为前者导致连接性部分存在于所得的缀合物(试剂)中，而后者导致在参与该反应的两个部分之间的直接偶联。双官能连接体的作用可以为允许在两个不一样地为惰性的部分之间的反应。备选地或另外地，可以如此选择成为反应产物的一部分的双官能连接体，从而它将一些程度的构象柔韧性赋予所述试剂(例如，所述双官能连接体包含含有几个原子的直的烷基链，例如所述直的烷基链包含2至10个碳原子)。备选地或另外地，可以如此选择所述双官能连接体，从而在所提供的抗体和治疗性试剂之间所形成的联接是可切割的，例如可水解的(关于此类连接体的例子，参见例如美国专利号5,773,001、5,739,116和5,877,296，其各自通过提及而以其整体合并入本文)。例如，当在所述缀合物水解后观察到某些实体(例如，靶向性实体和/或治疗性受体)的更高的活性时，可以使用此类连接体。示例性的可以将实体从多功能试剂上切割下来所采用的机制包括在溶酶体的酸性pH中的水解(腙、缩醛和顺乌头酸样酰胺)，通过溶酶体酶(组织蛋白酶和其他溶酶体酶)的肽切割，和二硫化物的还原。另一个将此类实体从多功能试剂上切割下来所采用的机制包括在细胞外或在细胞内在生理pH下的水解。当用于将一个实体与另一个实体相偶联的交联剂为生物可降解的/生物可侵蚀的组分(例如，葡聚糖等)时，这种机制适用。

例如，可以用所引入的提供所希望的释放特性的羰基基团来制备包含腙的多功能试剂。也可以用连接体来制备多功能试剂，所述连接体包含在一个末端处具有二硫化物基团和在另一个末端处具有肼衍生物的烷基链。包含除了腙之外的其他官能团的连接体也具有在溶酶体的酸性环境中被切割的潜力。例如，可以从硫醇反应性连接体制备多功能试剂，所述硫醇反应性连接体包含在细胞内可切割的除了腙之外的其他基团，例如酯、酰胺和缩醛/缩酮。

pH敏感性连接体类别的另一个例子为顺乌头酸类，其具有与酰胺基团并置的羧酸基团。所述羧酸加速在酸性溶酶体中的酰胺水解。也可以使用这样的连接体，其用几种其他类型的结构来取得相似类型的水解速率加速。

对于治疗性试剂的缀合物的另一种潜在释放方法为通过溶酶体酶的肽的酶促水解。在一个实施方案中，将所提供的抗体经由酰胺键附着至对氨基苄醇，然后在所述苄醇和所述治疗性试剂之间制成氨基甲酸酯或碳酸酯。所述肽的切割导致所述氨基苄基氨基甲酸酯或碳酸酯的瓦解和所述治疗性试剂的释放。在另一个例子中，可以通过连接体(而不是氨基甲酸酯)的瓦解来切割酚。在另一个变化形式中，使用二硫化物还原来起始对巯基苄基氨基甲酸酯或碳酸酯的瓦解。

可以用作在本文中所提供的多功能试剂的连接性实体的有用的连接体包括但不限于：聚乙二醇、乙二醇的共聚物、聚丙二醇、丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸、葡聚糖n-乙烯吡咯烷酮、聚n-乙烯吡咯烷酮、丙二醇同聚物、氧化丙烯聚合物、氧化乙烯聚合物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、线性或支化的糖基化链、聚缩醛、长链脂肪酸、长链疏水性脂肪族基团。

本发明的一些实施方案使用包括至少一个非共价地联合的实体的多功能试剂。非共价相互作用的例子包括但不限于：疏水相互作用、静电相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用和氢键键合。无论结合、相互作用或偶联的性质为何，在一些实施方案中，第一实体和第二实体之间的联合是选择性的、特异性的和足够强的，从而在运输/递送至和入靶标之前或期间，在所述试剂中所包含的所述第二实体不与所述第一实体解离。因此，在多功能试剂的多个实体之中的联合可以通过使用本领域技术人员已知的任何化学的、生物化学的、酶的或基因的偶联来实现。

治疗性缀合物

如在本文中所描述的，PNA试剂可以构成为具有与癌症或神经变性病症相关的治疗效用的多功能试剂的一部分。在本公开内容的情景下的治疗效用的例子包括但不限于：与靶向(例如，结合特定的基因序列)相关联的效用，与治疗效应(例如，细胞毒性和/细胞生长抑制效应、抗增殖效应、抗血管生成效应、减轻症状等)相关联的效用，和与诊断、检测或标记相关联的效用，等等。

靶向性实体为可以被包含在这样的试剂中的分子结构，所述试剂通过与目的靶标特异性地相互作用而影响或控制作用位点或者对于目的靶标具有亲和力。作为例子，靶标可以为存在于细胞表面(例如，某些细胞类型、组织等)上的分子或分子复合物。在本发明的一些实施方案中，所述靶标为肿瘤相关联的或肿瘤内的基因，并且所述靶向性实体为PNA试剂。对于试剂例如治疗性试剂使用靶向性部分是本领域中已知的。在本申请的情景下，原发性或转移性癌细胞以及其他细胞类型为靶标。即，在分子水平上，靶标为存在(例如，优先地表达)于细胞上的分子或细胞成分，从而在接触后它可以特异性地或优先地与PNA试剂相结合。本发明的PNA试剂发挥对于其靶标(例如，癌细胞的癌基因)的特异性，并且能够定位至细胞核并且与其靶标相结合。在一些实施方案中，PNA试剂靶向性实体定位至癌细胞并且保持其联合一段时间。在一些实施方案中，PNA试剂靶标为编码肿瘤内和/或整合膜蛋白的核酸序列。

在一些实施方案中，所述PNA试剂为多功能试剂，其包含与一个或多个治疗性试剂相缀合的基因靶向性实体(其基本上由PNA试剂组成)。下面提供了可以在癌症或其他病症的诊断或评估，癌症或其他病症的治疗，以及用于癌症或其他病症的药物的制备中使用的有用的PNA试剂的缀合物的非限制性实施方案。

适合于在本发明的实践中使用的核酸抗癌试剂包括这样的那些试剂，其靶向与肿瘤发生和细胞生长或细胞转化相关联的基因(例如，原癌基因，其编码刺激细胞分裂的蛋白质)、血管生成/抗血管生成基因、肿瘤阻抑基因(其编码阻抑细胞分裂的蛋白质)、编码与肿瘤生长和/或肿瘤迁移相关联的蛋白质的基因和自杀基因(其诱导凋亡或其他形式的细胞死亡)，尤其是在快速分裂的细胞中最活跃的自杀基因。

与肿瘤发生和/或细胞转化相关联的基因的例子包括：MLL融合基因、BCR-ABL、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、Bc1-2、AML1-ETO、AML1-MTG8、Ras、Fos、PDGF、RET、APC、NF-1、Rb、p53、MDM2等；过表达的基因，例如多药抗性基因；细胞周期蛋白；β-联蛋白；端粒酶基因；c-myc、n-myc、Bc1-2、Erb-B1和Erb-B2；和经突变的基因，例如Ras、Mos、Raf和Met。肿瘤阻抑基因的例子包括但不限于：p53、p21、RB1、WT1、NF1、VHL、APC、DAP激酶、p16、ARF、神经纤维瘤蛋白和PTEN。可以被在抗癌疗法中有用的核酸试剂所靶向的基因的例子包括：编码与肿瘤迁移相关联的蛋白质(例如，整联蛋白、选择蛋白和金属蛋白酶)的基因；编码促进新血管形成的蛋白质(例如，血管内皮生长因子(VEGF)或VEGFr)的抗血管生成基因；编码抑制新血管形成的蛋白质(例如，内皮抑制素、制管张素和VEGF-R2)的抗血管生成基因；和编码诸如白介素、干扰素、成纤维细胞生长因子(α-FGF和β-FGF)、胰岛素样生长因子(例如，IGF-1和IGF-2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(例如，TGF-α和TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、干细胞因子及其受体c-Kit(SCF/c-Kit)配体、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、hyalurin/CD44等的蛋白质的基因。

PNA试剂可以具有各种各样的用途中的任一种，包括例如用作抗癌试剂或其他治疗性试剂、探针、引物等。核酸试剂可以具有酶促活性(例如，核酶活性)、基因表达抑制活性(例如，作为反义或siRNA试剂等)和/或其他活性。核酸试剂可以是本身有活性的，或者可以是递送活性核酸试剂的载体(例如，通过所递送的核酸的复制和/或转录)。对于本说明书的目的，如果它们编码或者递送在治疗上有活性的试剂，即使它们本身不具有治疗活性，此类载体核酸也被认为是“治疗性试剂”。

在一些实施方案中，PNA试剂的缀合物包含作为核酶的核酸治疗性试剂。如在本文中所使用的，术语“核酶”是指能够以靶标特异性方式切割其他RNA或DNA分子的催化性RNA分子。核酶可以用于下调目的基因的任何不希望的产物的表达。可以在本发明的实践中使用的核酶的例子包括但不限于特异于癌基因mRNA或DNA的那些。

在一些实施方案中，在PNA试剂的缀合物内的实体或部分包含在光动力学疗法(PDT)中使用的光敏剂。在PDT中，向患者局部或全身施用光敏剂，随后用在待治疗的组织或器官中的光敏剂吸收的光进行照射。通过光敏剂的光吸收生成对于细胞有害的反应性种类(例如，自由基)。为了最大功效，光敏剂典型地以适合于施用的形式，并且也以可以容易地经受在靶位点处的细胞内化的形式，通常具有超过正常组织的一定程度的选择性。

与光敏剂相关联的PNA试剂的缀合物可以用作在PDT中的新的递送系统。除了减少光敏剂聚集之外，根据本发明的光敏剂的递送还展示出其他优点，例如增加的对于靶组织/器官的特异性和光敏剂的细胞内化。

适合于在本发明中使用的光敏剂包括各种各样的在PDT中有用的具有光敏化特性的合成或天然出现的分子中的任一种。在一些实施方案中，所述光敏剂的吸收光谱在可见光范围中，典型地350nm至1200nm，优选地400nm至900nm，例如600nm至900nm。根据本发明的可以与毒素相偶联的合适的光敏剂包括但不限于：卟啉和卟啉衍生物(例如，二氢卟酚、菌绿素、异菌绿素、酞菁和萘酞菁(naphthalocyanine))、金属卟啉、金属酞菁、白芷根素、chalcogenapyrrillium染料、叶绿素、香豆素、黄素以及相关化合物例如咯嗪和核黄素、富勒烯、脱镁叶绿甲酸酯、焦脱镁叶绿甲酸酯、花菁(例如，部花青540)、褐藻素、sapphyrin、texaphyrin、红紫素、porphycene、吩噻嗪鎓、亚甲蓝衍生物、萘二甲酰亚胺、尼罗蓝衍生物、醌、苝醌(例如，金丝桃素、竹红菌素(hypocrellin)和尾孢菌素)、补骨脂素、醌、类视黄醇、罗丹明、噻吩、verdin、呫吨染料(例如，伊红、藻红、玫瑰红)、卟啉的二聚体和寡聚体形式以及前体药物例如5-氨基乙酰丙酸(R.W.Redmond和J.N.Gamlin,Photochem.Photobiol.,1999,70:391-475)。

适合于在本发明中使用的示例性光敏剂包括在美国专利号5,171,741、5,171,749、5,173,504、5,308,608、5,405,957、5,512,675、5,726,304、5,831,088、5,929,105和5,880,145(其各自的内容通过提及而以其整体合并入本文)中所描述的那些。

在一些实施方案中，PNA试剂的缀合物包含辐射敏化剂。如在本文中所使用的，术语“辐射敏化剂”是指使得肿瘤细胞对于放射疗法更敏感的分子、化合物或试剂。向接受放射疗法的患者施用辐射敏化剂通常导致放射疗法的效果增强。将辐射敏化剂与靶向性实体(例如，能够靶向肿瘤内基因序列的PNA试剂)相偶联的优点是，所述辐射敏化剂仅在靶细胞上起作用。为了易于使用，辐射敏化剂还应当能够找到靶细胞，即使全身施用它。但是，目前可得的辐射敏化剂典型地对于肿瘤不是选择性的，并且它们在哺乳动物身体中通过扩散进行分布。本发明的PNA试剂缀合物可以用作新的用于辐射敏化剂的递送系统。

本领域中已知各种各样的辐射敏化剂。适合于在本发明中使用的辐射敏化剂包括但不限于：紫杉醇

卡铂、顺铂和奥沙利铂(Amorino等人,Radiat.Oncol.Investig.,1999,7:343-352；Choy,Oncology,1999,13:22-38；Safran等人,Cancer Invest.,2001,19:1-7；Dionet等人,Anticancer Res.,2002,22:721-725；Cividalli等人,Radiat.Oncol.Biol.Phys.,2002,52:1092-1098)；吉西他滨

(Choy,Oncology,2000,14:7-14；Mornex和Girard,Annals of Oncology,2006,17:1743-1747)；依他硝唑

(Inanami等人,Int.J.Radiat.Biol.,2002,78:267-274)；米索硝唑(Tamulevicius等人,Br.J.Radiology,1981,54:318-324；Palcic等人,Radiat.Res.,1984,100:340-347)；替拉扎明(Masunaga等人,Br.J.Radiol.,2006,79:991-998；Rischin等人,J.Clin.Oncol.,2001,19:535-542；Shulman等人,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,1999,44:349-353)；和核酸碱基衍生物，例如卤代嘌呤或嘧啶，例如5-氟脱氧尿苷(Buchholz等人,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,1995,32:1053-1058)。

在一些实施方案中，PNA试剂的缀合物包含放射性同位素。合适的放射性同位素的例子包括任何当定位在肿瘤位点处时导致细胞破坏的α-、β-或γ-放射体(S.E.Order,“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody in Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies for CancerDetection and Therapy,R.W.Baldwin等人(编者),Academic Press,1985)。此类放射性同位素的例子包括但不限于：碘-131(¹³¹I)、碘-125(¹²⁵I)、铋-212(²¹²Bi)、铋-213(²¹³Bi)、砹-211(²¹¹At)、铼-186(¹⁸⁶Re)、铼-188(¹⁸⁸Re)、磷-32(³²P)、钇-90(⁹⁰Y)、钐-153(¹⁵³Sm)和镥-177(¹⁷⁷Lu)。

在一些实施方案中，可以在定向酶前体药物疗法中使用PNA试剂的缀合物。在定向酶前体药物疗法方法中，向受试者施用定向/靶向的酶和前体药物，其中所述靶向的酶特异性地定位至受试者身体的一部分，在那里它将所述前体药物转变为有活性的药物。可以在一个步骤(通过所述靶向的酶)或在多于一个步骤中将所述前体药物转变为有活性的药物。例如，可以通过所述靶向的酶将所述前体药物转变为有活性的药物的前体。然后，可以通过例如下述方式将所述前体转变为有活性的药物：通过一种或多种另外的靶向的酶、一种或多种施用给受试者的非靶向的酶、一种或多种天然存在于受试者中或在受试者中的靶位点处的酶(例如，蛋白酶、磷酸酶、激酶或聚合酶)的催化活性；通过施用给受试者的试剂；和/或通过不是酶促催化的化学过程(例如，氧化、水解、异构化、差向异构化等)。

本发明的一些实施方案使用PNA试剂导向的酶前体药物疗法，其中将PNA试剂与酶相连接并且注射到受试者中，这导致所述酶与肿瘤相关联的或转移性的基因的选择性结合。随后，向所述受试者施用前体药物。通过仅在癌细胞内或附近的酶将所述前体药物转变为其活性形式。选择性通过所述PNA试剂的特异性和通过延迟前体药物施用直至在癌症和正常组织酶水平之间存在大的差异来实现。也可以用编码前体药物活化酶的基因来靶向癌细胞。该方法已被称为病毒导向的酶前体药物疗法(VDEPT)或更通常地GDEPT(基因导向的酶前体药物疗法)，并且已在实验室系统中显示出良好的结果。定向酶前体药物疗法的其他版本包括PDEPT(聚合物导向的酶前体药物疗法)、LEAPT(凝集素导向的酶活化前体药物疗法)和CDEPT(梭菌导向的酶前体药物疗法)。

适合于在本发明中使用的酶/前体药物/活性药物组合的非限制性例子例如描述在Bagshawe等人,Current Opinions in Immunology,1999,11:579-583；Wilman,“Prodrugs in Cancer Therapy”,Biochemical Society Transactions,14:375-382,615th Meeting,Belfast,1986；Stella等人,“Prodrugs:A Chemical Approach ToTargeted Drug Delivery”,在“Directed Drug Delivery”中,Borchardt等人(编者),pp.247-267(Humana Press,1985)。酶/前体药物/活性抗癌药物组合的非限制性例子例如描述在Rooseboom等人,Pharmacol.Reviews,2004,56:53-102中。

前体药物活化酶的例子包括但不限于：硝基还原酶、细胞色素P450、嘌呤核苷磷酸化酶、胸苷激酶、碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、羧肽酶、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶和甲硫氨酸γ-裂合酶。

可以通过用前体药物活化酶活化前体药物而在体内形成的抗癌药物的例子包括但不限于：5-(氮丙啶-1-基)-4-羟基-氨基-2-硝基-苯甲酰胺、异磷酰胺芥、磷酰胺芥、2-氟腺嘌呤、6-甲基嘌呤、更昔洛韦-三磷酸核苷酸、依托泊苷、丝裂霉素C、p-[N,N-双(2-氯乙基)氨基]苯酚(POM)、多柔比星、噁唑烷酮、9-氨基喜树碱、芥子气、氨甲蝶呤、苯甲酸芥、阿霉素、道诺霉素、洋红霉素、博来霉素、埃斯波霉素、美法仑、岩沙海葵毒素、4-去乙酰长春碱-3-羧酸酰肼、苯二胺芥、4'-羧基邻苯二甲酸合(1,2-环己烷二胺)铂、紫杉酚、5-氟尿嘧啶、甲基硒醇和carbonothionic difluoride。

在一些实施方案中，治疗性(例如，抗癌)试剂包含一个或多个PNA试剂和抗血管生成试剂的缀合物。适合于在本发明中使用的抗血管生成试剂包括任何这样的分子、化合物或因子，其阻断、抑制、减慢或降低血管生成的过程，或者新血管通过从先前存在的血管发展而形成所经由的过程。这样的分子、化合物或因子可以通过下述方式来阻断血管生成，即阻断、抑制、减慢或降低在血管生成中所牵涉的步骤中的任一个，包括(但不限于)下述步骤：(1)源起性血管的膜的溶解，(2)内皮细胞的迁移和增殖，和(3)通过迁移性细胞形成新的脉管系统。

抗血管生成试剂的例子包括但不限于：贝伐珠单抗

塞来考昔

内皮抑制素、沙利度胺、EMD121974(西仑吉肽)、TNP-470、角鲨胺、风车子抑碱A4、干扰素-α、抗-VEGF抗体、SU5416、SU6668、PTK787/2K 22584、Marimistal、AG3340、COL-3、新伐司他和BMS-275291。

施用

根据本发明的PNA试剂和本发明的药用组合物可以按照任何合适的途径和制度来进行施用。在一些实施方案中，途径或制度为已与积极的治疗益处相关连的那个。

在一些实施方案中，所施用的准确量可能因受试者而变化，这取决于一个或多个因素，如在医学领域中众所周知的。此类因素可以包括例如下列中的一个或多个：受试者的物种、年龄、总体状况；待施用的特定组合物，其施用方式，其活性方式；疾病的严重度；所采用的特定PNA试剂的活性；所施用的特定药用组合物；在施用后组合物的半寿期；受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；所采用的特定化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的特定化合物相组合地或同时地进行使用的药物；等等。可以将药用组合物配制成易于施用和剂量均匀的剂量单位形式。但是，将会理解的是，本发明的组合物的总的每日用法将会由主治医师在合理的医学判断范围之内来决定。

本发明的组合物可以通过任何途径来进行施用，如本领域技术人员将会意识到的。在一些实施方案中，本发明的组合物通过下述方式来进行施用：通过口服(PO)、静脉内(IV)、肌内(IM)、动脉内、髓内、鞘内、皮下(SQ)、心室内、透皮、真皮间(interdermal)、真皮内、直肠(PR)、阴道、腹膜内(IP)、胃内(IG)、局部(例如，通过粉剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻内、颊、肠、玻璃体、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为口喷雾剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂；和/或通过门静脉导管。

在一些实施方案中，根据本发明的PNA试剂和/或其药用组合物可以以静脉内方式(例如，通过静脉内输注)来进行施用。在一些实施方案中，根据本发明的PNA试剂和/或其药用组合物可以通过肌内注射来进行施用。在一些实施方案中，根据本发明的PNA试剂和/或其药用组合物可以通过肿瘤内注射来进行施用。在一些实施方案中，根据本发明的PNA试剂和/或其药用组合物可以通过皮下注射来进行施用。在一些实施方案中，根据本发明的PNA试剂和/或其药用组合物可以经由门静脉导管来进行施用。但是，本发明涵盖通过任何合适的途径来递送根据本发明的PNA试剂和/或其药用组合物，考虑到在药物递送科学中的可能进步。

在一些实施方案中，根据本发明的PNA试剂和/或其药用组合物可以以足以递送大约0.001mg/kg至大约100mg/kg，大约0.01mg/kg至大约50mg/kg，大约0.1mg/kg至大约40mg/kg，大约0.5mg/kg至大约30mg/kg，大约0.01mg/kg至大约10mg/kg，大约0.1mg/kg至大约10mg/kg，或大约1mg/kg至大约25mg/kg受试者体重/天的剂量水平来进行施用，以获得所希望的治疗效应。所希望的剂量可以以下述方式进行递送：每天多于三次，每天三次，每天二次，每天一次，每隔一天一次，每隔两天一次，每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每两个月一次，每六个月一次，或每十二个月一次。在一些实施方案中，所希望的剂量可以通过使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来进行递送。

预防性应用

在一些实施方案中，根据本发明的PNA试剂可以用于预防性应用。在一些实施方案中，预防性应用涉及这样的系统和方法，所述系统和方法用于在易患癌症或其他病症和/或展示出癌症或其他病症的症状的个体中预防癌症或其他病症和/或任何其他基因相关联的状况，抑制癌症或其他病症和/或任何其他基因相关联的状况的进展，和/或延迟癌症或其他病症和/或任何其他基因相关联的状况的开始。

联合疗法

将会意识到的是，可以在联合疗法中采用根据本发明的PNA试剂和其在治疗上有活性的缀合物和/或其药用组合物，以有助于诊断和/或治疗。“联合”并不意欲暗示，所述试剂必须同时施用和/或配制成用于一起递送，虽然这些递送方法在本发明的范围之内。可以将组合物与一种或多种其他所希望的治疗剂或医学程序同时地、在其之前或在其之后进行施用。将会意识到的是，可以将联合使用的在治疗上有活性的试剂在单个组合物中一起进行施用，或者在不同的组合物中分开地进行施用。通常，每种试剂将会按照对于那种试剂所确定的剂量和/或时间表来进行施用。

待以联合制度进行采用的特定的疗法(例如，治疗剂或程序)组合将会考虑所希望的治疗剂和/或程序与待取得的所希望的治疗效应的相容性。还将会意识到的是，可以在联合疗法(例如，联合化学治疗疗法)中采用在本文中所公开的PNA试剂的药用组合物，即可以将所述药用组合物与一种或多种其他所希望的治疗剂和/或化学治疗程序同时地、在其之前或在其之后进行使用。

可以将PNA试剂或其在药学上可接受的组合物与化学治疗试剂相联合地进行施用以靶向原发性或转移性癌症。在一些实施方案中，活性成分为化学治疗性试剂，例如但不限于阿霉素、地塞米松、长春新碱、环磷酰胺、氟尿嘧啶、托泊替康、紫杉酚、干扰素、铂衍生物、紫杉烷(例如，紫杉醇)、长春花生物碱(例如，长春花碱)、蒽环类(例如，多柔比星)、表鬼臼毒素(例如，依托泊苷)、顺铂、氨甲蝶呤、放线菌素D、放线菌素D、多拉司他汀10、秋水仙素、吐根碱、三甲曲沙、氯苯氨啶、环孢菌素、柔红霉素、表鬼臼毒噻吩糖苷、两性霉素、烷基化试剂(例如，苯丁酸氮芥)、5-氟尿嘧啶、喜树碱、顺铂、甲硝唑、伊马替尼、Gleevec^TM、舒尼替尼和

以及其组合。

在一些实施方案中，将PNA试剂、其缀合物或其在药学上可接受的组合物与从下列各项中的任何一种或多种中选择的抗增殖试剂或化学治疗性试剂相联合地进行施用：阿巴瑞克、阿地白介素、阿地白介素、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、BCG Live、贝伐珠单抗、阿瓦斯丁、氟尿嘧啶、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡鲁睾酮、卡倍他滨、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、塞来考昔、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、更生霉素、达贝泊汀α、柔红霉素、地尼白介素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星(中性)、盐酸多柔比星、丙酸屈他雄酮、表柔比星、阿法依泊汀、厄洛替尼、雌莫司汀、磷酸依托泊苷、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗、醋酸戈舍瑞林、醋酸组氨瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素α-2a、干扰素α-2b、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、醋酸亮丙立德、左旋咪唑、洛莫司汀、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、6-MP、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、奈拉滨、诺莫单抗、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕利夫明、帕米膦酸盐、培加酶、培门冬酶、培非司亭、培美曲塞二钠、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、卟吩姆钠、丙卡巴肼、奎纳克林、拉布立酶、利妥昔单抗、沙格司亭、索拉非尼、链佐星、马来酸舒尼替尼、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、VM-26、睾内酯、硫鸟嘌呤、6-TG、塞替派、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、ATRA、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、唑来膦酸盐或唑来膦酸。

待以联合制度进行采用的特定的疗法组合通常将会考虑所希望的治疗剂和/或程序与待取得的所希望的治疗效应的相容性。还将会意识到的是，所采用的疗法和/或化学治疗剂可以对于相同的病症取得所希望的效应(例如，可以将本发明的抗原与另一种化学治疗性或神经学药物同时地进行施用)，或者它们可以取得不同的效应。将会意识到的是，所采用的疗法可以对于相同目的取得所希望的效应(例如，可以将对于治疗癌症或其他病症、预防癌症或其他病症和/或延迟癌症或其他病症的开始来说有用的PNA试剂与另一种对于治疗癌症或病症、预防癌症或病症和/或延迟癌症或病症的开始来说有用的试剂同时地进行施用)，或者它们可以取得不同的效应(例如，任何副作用的控制)。本发明涵盖与可以改善其生物利用率、降低和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其在身体内的分布的试剂相联合地递送药用组合物。

在一些实施方案中，联合使用的试剂将会以不超过它们独个使用时所处的水平的水平来进行使用。在一些实施方案中，联合使用的水平将会低于独个使用的那些。

在一些实施方案中，联合疗法可以涉及施用多种针对单个基因的PNA试剂。在一些实施方案中，联合疗法可以包含多种识别不同基因序列的PNA试剂。

试剂盒

本发明提供了各种各样的用于方便地和/或有效地施行根据本发明的方法的试剂盒。试剂盒典型地包含一种或多种PNA试剂。

在一些实施方案中，用于根据本发明进行使用的试剂盒可以包含一个或多个参考样品；说明书(例如，关于加工样品，关于实施测试，关于解释结果，关于施用PNA试剂，关于储存PNA试剂，等等)；缓冲液；和/或对于实施测试来说必需的其他试剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包含PNA试剂套组。试剂盒的其他组分可以包括细胞、细胞培养基、组织和/或组织培养基。

在一些实施方案中，试剂盒包括许多单位剂量的包含PNA试剂的药用组合物。可以提供记忆辅助，例如以数字、字母和/或其他标记的形式和/或用日历插页，其指明了在治疗规划表中其中可以施用剂量的日子/时间。可以包括安慰剂剂量和/或钙膳食补充物(以与所述药用组合物的剂量相似或不同的形式)，以提供其中每天服用剂量的试剂盒。

试剂盒可以包含一个或多个器皿或容器，从而独个组分或试剂中的某些可以分开收纳。试剂盒可以包含用于以相对封闭的方式封装独个容器以用于商业销售的工具，例如塑料盒，其中可以封装说明书、包装材料例如聚苯乙烯泡沫塑料等。

在一些实施方案中，在罹患和/或易患癌症或其他病症的受试者的治疗、诊断和/或预防中使用试剂盒。在一些实施方案中，此类试剂盒包含：(i)至少一种PNA试剂；(ii)注射器、针头、敷料器等，其用于向受试者施用所述至少一种PNA试剂；和(iii)使用说明书。

本发明的这些方面和其他方面将会在考虑下面的实施例后得到进一步充分理解，这些实施例意欲举例说明本发明的某些具体的实施方案，而并不意欲限制通过权利要求书所定义的其范围。

提供下面的实施例以进一步举例说明本公开内容的某些方面。这些实施例仅是举例说明性的，并且并不意欲以任何方式限制本公开内容的范围。

实施例

实施例1

使用经改进的肽核酸(PNA)来抑制KRAS表达

鉴于由一致的物理化学特征(例如，细胞膜渗透性)构成的分子链(例如，疏水性聚合物)，存在对于将特征赋予所附加的自由旋转的无规卷曲链(例如，PNA寡聚体)来说必需的最小长度。该最小必需长度取决于它所附加至的无规卷曲链的运动特征，最重要地，其长度，即构成它的单体的数目。

据信，无规卷曲聚合物的在熵上更有利的构型是相对紧凑的卷曲，这与延伸状态相对，其将会要求聚合物的所有组分的相似的键旋转。这可以通过理想链模型来显示，其中时间平均末端至末端距离与N^1/2(N＝#单体)成正比，所述N^1/2也与其回转半径成正比。同理，所附加的链(例如，疏水性的)将会遵从相同的特性。此外，关于未结合的PNA寡聚体，由于其疏水性，卷曲状态也是优选的。鉴于该旋绕构型，所附加的片段/部分容易被埋在该“熔球”构型之内(图1A)而不是暴露在其表面上(图1B)，以允许其特征发挥功能。所同等的不是所附加的化学特征的量，而是它向它被附加在其之内的熔球的外部的可接近性。要求最小长度以突破不断重新组织的无规卷曲的表面足够有效的时间。

为了评价该假设，合成了与KRAS G12D癌基因序列互补的PNA寡聚体，其中向末端附加一个或两个C8烷基链或一个或两个C16烷基链(图2)。迄今为止，还未针对该癌基因(其驱动几乎80％的胃肠癌)开发出抑制剂。关于评价，将这些PNA缀合物施加至人细胞系，AsPC1(依赖于KRAS G12D的细胞系)、MiaPaca2(表达KRAS G12C的细胞系)、BxPC3(表达野生型的细胞系)和Panc1(表达G12D和野生型但不依赖于前者的细胞系)。野生型和G12C与G12D的差异仅在于在其18-聚体靶区域内的单个核碱基，从而挑战其特异性的极限。

显示出对于G12-依赖性细胞系增殖的等位基因特异性阻抑和对于其他细胞几乎无任何阻抑的最好结果是用C16-PNA，204C取得的(图3)。按照上述假设，使用C8-PNA-C8，228B(其包含与C16-PNA相等的量的潜在疏水性)未显示出针对在AsPC1内的其互补靶标以及在其他细胞系内的其他靶标的功效(图4)。在极端情况下，暴露于C16-PNA-C16，157A以特异性降低为代价显示出更强有力的增殖应答阻抑(图5)，而C8-PNA，228A依然对于任何细胞系没有有效的增殖阻抑(图6)。

为了进一步确认，将这些PNA施加至一系列通过去除内源性KRAS基因并且用人KRAS G12D[NCI RPZ26198]、HRAS野生型[NCI RPZ200024]或KRAS野生型[NCI RPZ26216]代替而创建的细胞系。以这种方式，更好地控制在细胞系之间的所插入的人基因的比较，因为所述细胞系之间没有其他差异。结果(图7-10)在质上与在上面的先前段落中所描述的上述源自人的细胞系的那些相匹配。

此外，关于157A相对于204C而言的效力增加而特异性降低，可以推测的是，该效力可能归因于由于其增加的亲脂特性(双重C16对单末端C16)而更好地递送到脂质双层细胞膜中。如通过靶标KRAS G12D转录的PCR测定法所显示的，204C完全阻抑转录，而157A仅部分地阻抑转录至正常的25％(图11)。如所预期的，两者都未影响在BxPC3中KRAS WT的转录(图11)，因而相信明显的非特异性毒性极可能是由于不必要地增加的亲脂特性。最重要地，具有过度的亲脂链可能增加膜递送，但是也可能在空间上干扰PNA寡聚体接近基因靶标。

参考文献

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Wu J,Meng Q,Ren H,Wang H,Wu J,Wang Q.Recent advances in peptidenucleic acid for cancer bionanotechnology.Acta Pharmacologica Sinica.2017年6月,38(6):798.

等价物和范围

本领域技术人员将会认识到或者能够通过仅使用常规实验来确定在本文中所描述的本发明的特定实施方案的许多等价物。本发明的范围并不意欲局限于上面的描述。同样地，本领域技术人员将会容易地意识到，前述那些仅代表本发明的某些优选的实施方案。可以对上面所描述的程序和组合物进行各种改变和修改，而不背离本发明的精神和范围，其在下面的权利要求书中阐述。

在权利要求书中，冠词例如“a”、“an”和“the”可以意指一个(种)或多于一个(种)，除非相反地指出或者从上下文中可以明显看出。因此，例如，提及“抗体”包括多个(种)此类抗体，和提及“细胞”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种细胞，等等。在一个组的一个或多个成员之间包括“或(或者)”的声索或描述被认为是令人满意的，如果一个、多于一个或所有该组成员存在于给定的产品或过程中，在给定的产品或过程中被采用，或者与给定的产品或过程相关，除非相反地指出或者从上下文中可以明显看出。本发明包括这样的实施方案，其中恰好该组的一个成员存在于给定的产品或过程中，在给定的产品或过程中被采用，或者与给定的产品或过程相关。本发明包括这样的实施方案，其中多于一个或所有该组成员存在于给定的产品或过程中，在给定的产品或过程中被采用，或者与给定的产品或过程相关。此外，应当理解的是，本发明涵盖所有这样的变化、组合和排列，其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、分句、描述性术语等引入到另一个权利要求中。例如，可以修改任何从属于另一个权利要求的权利要求，以包括在从属于相同基础权利要求的任何其他权利要求中所找到的一个或多个限制。此外，当权利要求记述到组合物时，应当理解的是，包括为了在本文中所公开的任一个目的而使用所述组合物的方法，并且包括按照在本文中所公开的制备方法或本领域中已知的其他方法中的任一种来制备所述组合物的方法，除非另有说明或者除非本领域技术人员将会明显看出会出现矛盾或不一致。

当将要素作为列表来呈现(例如，以马库什组格式)时，应当理解的是，也公开了所述要素的每个亚组，并且可以从所述组中去除任何要素。应当理解的是，通常，当本发明或本发明的方面被提及为包含特定的要素、特征等时，某些本发明的实施方案或本发明的方面由或基本上由此类要素、特征等组成。为了简单起见，在本文中已用这些言语特别地阐述了那些实施方案。需要注意的是，术语“包含(包括)”意欲是开放的，并且允许包括另外的要素或步骤。

当给出范围时，包括端点。此外，应当理解的是，除非另有说明或者从上下文和本领域技术人员的理解中可以明显看出，被表示为范围的值可以采取在本发明的不同实施方案中的所陈述的范围内的任何具体的值或子范围，至所述范围的下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。

另外，应当理解的是，可以从任何一个或多个权利要求中明确地排除落在现有技术内的本发明的任何具体的实施方案。由于认为此类实施方案是本领域技术人员已知的，因而可以排除它们，即使在本文中未明确提出所述排除。可以出于任何原因从任何一个或多个权利要求中排除本发明的组合物的任何具体的实施方案，无论是否与现有技术的存在相关。

上面和贯穿该文本所讨论的出版物仅仅因其在本申请的申请日之前公开而提供。在本文中的任何内容均不应被解释为承认，发明人无权凭借在先公开而将此类公开提前。

Claims (20)

1.PNA试剂，其包含：

PNA部分；和

至少一个附着至所述PNA部分的至少一个末端的修饰部分，其中所述至少一个修饰部分由赖氨酸残基组成，并且所述赖氨酸残基中的至少一个包含棕榈酰基侧链部分。

2.权利要求1的PNA试剂，其中所述至少一个修饰部分具有Lys(棕榈酰基)-Lys-Lys-的结构。

3.权利要求1的PNA试剂，其具有Lys(棕榈酰基)-Lys-Lys-[PNA]-Lys-Lys-Lys(棕榈酰基)的结构。

4.权利要求1的PNA试剂，其具有Lys(棕榈酰基)-Lys-Lys-[PNA]或[PNA]-Lys-Lys-Lys(棕榈酰基)的结构。

5.权利要求1的PNA试剂，其进一步在所述PNA部分和所述至少一个修饰部分之间包含至少一个聚乙二醇(PEG)间隔子。

6.权利要求1的PNA试剂，其中所述PNA试剂具有有着最小的形成发夹环的倾向的序列。

7.权利要求1的PNA试剂，其中所述PNA试剂具有包含少于60％嘌呤的序列。

8.权利要求1的PNA试剂，其中所述PNA部分具有靶向基因的序列。

9.权利要求1的PNA试剂，其中所述PNA部分具有靶向具有75％或更大互补性的基因的13-20核苷酸序列的序列。

10.权利要求1的PNA试剂，其中所述PNA部分具有靶向具有完全互补性的基因的13-20核苷酸序列的序列。

11.权利要求10的PNA试剂，其中所述基因为癌基因。

12.权利要求11的PNA试剂，其中所述癌基因包括突变型序列元件，并且所述PNA试剂具有靶向包含所述突变型序列元件或由所述突变型序列元件组成的位点的序列。

13.权利要求12的PNA试剂，其中所述PNA试剂靶向包含下述区域或由下述区域组成的位点：

(i)BRAF癌基因的区域，其包含相应于在BRAF蛋白中的V600E突变的突变；或

(ii)Gnaq基因的区域，其包含相应于在Gnaq蛋白中的Q209L突变的突变；或

(iii)KRAS癌基因的区域，其包含相应于在KRAS蛋白中的G12D突变的突变。

14.权利要求11的PNA试剂，其中所述PNA试剂靶向包含这样的区域或由这样的区域组成的位点，所述区域包含癌基因的易位接点。

15.权利要求14的PNA试剂，其中所述PNA试剂靶向包含下述区域或由下述区域组成的位点：

(i)MYB-NFIB易位的区域，其包含MYB和NFIB基因的接点或其片段；或

(ii)FUS-CHOP易位的区域，其包含FUS和CHOP基因的接点或其片段。

16.药用组合物，其包含根据权利要求1-15中任一项的PNA试剂和在药学上可接受的承载体。

17.用于在受试者中治疗疾病、病症或状况或者降低疾病、病症或状况的风险的方法，其包括：向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-15中任一项的PNA试剂或者有效量的权利要求16的药用组合物。

18.权利要求17的方法，其中所述疾病、病症或状况为癌症。

19.权利要求18的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、眼黑素瘤、肉瘤、胰腺癌、胃肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、结肠直肠癌和甲状腺癌。

20.用于在细胞中降低基因表达的方法，其包括：使所述细胞与有效量的至少一种根据权利要求1-15中任一项的PNA试剂相接触。

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