CN114487169B - 一种手性氨基酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种手性氨基酸的检测方法，包括以下的步骤：（1）衍生：将标准的氨基酸样品与待测的氨基酸样品分别进行衍生，衍生的条件如下：在‑20℃~40℃条件下，将亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂、碱、有机溶剂、水和氨基酸混合反应，反应时间为0.1~100小时，得到衍生化的氨基酸；（2）检测：将步骤（1）的标准的衍生化的氨基酸样品与待测的衍生化的氨基酸样品通过同一光学检测器检测并在同等参数条件下检测，得到的谱图进行比对和定性定量分析；优点在于操作简便，无需对衍生化后的样品进行萃取分离，可利用多种检测器进行检测氨基酸手性异构体的含量，灵敏度高，同时可以对酸性氨基酸以及对含二级胺的脯氨酸的氨基酸手性异构体进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸的检测技术领域，尤其是一种手性氨基酸的检测方法。
背景技术
氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，同时也直接参与许多生命活动。在构成人体蛋白质的20种基本氨基酸中，除了甘氨酸外都具有手性，因此这些氨基酸都存在着L型和D型两种手性同分异构体。生命体中D型氨基酸的含量水平和各种生命现象息息相关，可以反映诸如疾病的发生和进程、细菌的感染和繁殖等等。例如，血液中D-丝氨酸，D-脯氨酸和D-天冬酰胺的水平与肾功能密切相关，而D-天冬氨酸和D-脯氨酸的水平与糖尿病密切相关（Scientific Reports, 2016：26137）。现代食品以及营养学上对于氨基酸手性异构体的分析也具有很大的意义。例如，牛奶中D-丙氨酸（D-Ala）的浓度升高可以揭示微生物对牛奶的污染（Acta Universitatis Cibiniensis Series E Food Technology, 2008,12:3-18），葡萄酒和醋中的D-脯氨酸含量，则可被用于鉴定产品的发酵年份（Methods Enzymol，1984，106:98-115）。
现有成熟的氨基酸检测方法，包括茚三酮染色以及氨基酸分析仪等，都不涉及氨基酸手性异构体的测定（GB/T5009.124-2003，GB/T18246-2000）。氨基酸手性异构体的分离检测常用的方法有化学拆分法和物理拆分法。化学拆分法工艺较为常熟，多用于工业生产，但是产品的拆分率、产物光学纯度都不高，污染和能耗也较大，不适用于样品的精确检测分析。物理拆分法包括膜拆分、毛细管电泳拆分、色谱拆分等。其中膜拆分受制于膜的稳定性和使用寿命，不适用于高通量快速检测分析；毛细管电泳拆分尽管分辨率高，但是一次只能拆分一种或少数几种氨基酸的手性异构体，不适用于复杂实际样品的分析检测；色谱拆分法适用范围较广、灵敏度较高，能实现复杂样品中的氨基酸手性异构体检测分析。但是色谱拆分氨基酸手性异构体需要采用昂贵的手性色谱柱。并且由于大部分氨基酸在紫外光区没有吸收和特征荧光，因此在常用的色谱紫外检测器中的效果并不好。
为了解决以上问题，通常对待检测的含手性氨基酸样品进行（色谱）柱前衍生，以提高对手性氨基酸的检测灵敏度和色谱分离度。已报道的氨基酸手性衍生试剂可以分为羧基衍生试剂和胺基衍生试剂，这些衍生化试剂自身具有手性，在与待测的氨基酸样品通过化学反应结合后，使待测的氨基酸对映异构体引入额外的手性中心，成为非对映异构体，从而可以在非手性色谱柱中实现分离。
然而现有技术的衍生化方法需对衍生化后的样品进行萃取分离，衍生化过程繁琐，检测方法灵敏度不高且需要特定的检测器进行测试，对复杂体系中低水平含量的手性氨基酸难以进行检测，同时目前大部分衍生化标记试剂需要使用氨基酸的氨基发生醛胺缩合反应来结合标记基团，因此对酸性氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸）或者氨基为二级胺的氨基酸（如脯氨酸）不适用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种手性氨基酸的检测方法，操作简便，无需对衍生化后的样品进行萃取分离，可利用多种检测器进行检测氨基酸手性异构体的含量，灵敏度高，同时对复杂体系中低水平含量的手性氨基酸能够进行检测，也可以对酸性氨基酸以及对含二级胺的脯氨酸的氨基酸手性异构体进行检测。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种手性氨基酸的检测方法，包括以下的步骤：
（1）衍生：将标准的氨基酸样品与待测的氨基酸样品分别进行衍生化，分别得到所述的衍生化的标准的氨基酸样品与所述的衍生化的待测的氨基酸样品；所述的衍生化的条件如下：在-20℃~40℃条件下，将亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂、碱、有机溶剂、水和氨基酸混合反应，反应时间为0.1~100小时，得到衍生化的氨基酸；
其中，所述的亚膦酸酯衍生化试剂的化合物结构如下所示：
其中，R1为芳基基团；R2为含有手性的烷氧取代基。
（2）检测：将所述的步骤（1）的所述的衍生化的标准的氨基酸样品与所述的衍生化的待测的氨基酸样品通过同一光学检测器并在同等参数条件下检测，得到的谱图进行比对和定性定量分析。
所述的芳基基团选自苯基、苯氧基、噻吩基或呋喃基中的一种。
所述的含有手性的烷氧取代基选自L-薄荷醇基、D-薄荷醇基、(R)-(+)-1-苯基-1-丙醇基或(S)-(-)-1-苯基-1-丙醇基中的一种。
所述的亚膦酸酯衍生化试剂:所述的卤代试剂:所述的碱:所述的氨基酸的摩尔质量比为（10-50）：（100-300）：（10-200）：1；所述的有机溶剂的体积、所述的水的体积与所述的氨基酸的摩尔质量比为（100-400）mL：（50-200）mL：1 mmol。
所述的碱与所述的氨基酸的摩尔质量比为（10-20）：1。
所述的卤代试剂为四氯化碳、四溴化碳、六氯乙烷、次氯酸钠、次氯酸或次溴酸钠。
所述的碱为三乙胺、三异丙胺、苯胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸铯。
所述的有机溶剂选自乙醇、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中的一种或多种。
所述的光学检测器为高效液相色谱-质谱联用仪或核磁共振波谱仪。
本发明的优点在于：
1.本发明的亚膦酸酯衍生化试剂中含有芳基基团和手性中心，对氨基酸进行衍生化反应，衍生化后的氨基酸分子可在紫外检测器中出现信号；同时亚膦酸酯衍生化试剂中还含有手性中心，为氨基酸手性异构体分子引入第二个手性中心，使一对对映异构体变为非对映异构体，从而在不需要特殊手性色谱柱的情况下，使用廉价、常用的非手性色谱柱即可进行分离分析，大大拓宽了检测方法中所采用的检测器的选择范围，且亚膦酸酯衍生化试剂的所需合成原料都为市场价格低廉的药品，合成步骤简单。
2.本发明公开的一种手性氨基酸的检测方法操作简便，无需对衍生化后的样品进行萃取分离，尤其适用于对含有氨基的手性代谢产物如氨基酸、小肽或多肽等样品进行衍生化标记，并采用液相色谱-质谱联用或核磁共振-磷谱技术进行定性定量分析。
3.本发明利用亚膦酸酯衍生化试剂对氨基酸进行衍生化反应，由于衍生化后的磷酰化氨基酸在质谱正离子模式中具有高响应的效应，可显著提高样品的质谱响应信号，有助于痕量代谢物的检测，本发明可检测氨基酸的最低浓度达到1 nM，因此可以实现对复杂体系中低水平含量的手性氨基酸的检测；同时本发明的检测方法可以标记并检测各种酸性氨基酸和脯氨酸，适用性广、标记效率高。
附图说明
图1为本发明中实施例2~实施例10的衍生化的氨基酸手性异构体的核磁共振磷谱谱图；
图2为本发明中实施例11的衍生化的D,L天冬氨酸提取离子流图；
图3为本发明中实施例11的衍生化的D,L天冬氨酸质谱图；
图4为本发明中实施例11的衍生化的D,L天冬氨酸紫外吸收图；
图5为本发明中实施例12的衍生化的D,L苏氨酸提取离子流图；
图6为本发明中实施例12的衍生化的D,L苏氨酸质谱图；
图7为本发明中实施例12的衍生化的D,L苏氨酸紫外吸收图；
图8为本发明中实施例13的衍生化的D,L亮氨酸提取离子流图；
图9为本发明中实施例13的衍生化的D,L亮氨酸质谱图；
图10为本发明中实施例13的衍生化的D,L亮氨酸紫外吸收图；
图11为本发明中实施例14的混合样品的高效液相色谱-质谱谱图（质谱总离子流模式和提取离子流模式）；
图12为本发明中实施例15的衍生化的D/L-精氨酸异构体的核磁谱图；
图13为本发明中实施例15的实际检测的D/L比值与理论D/L比值的线性关系图；
图14为本发明中实施例16的衍生化的D/L-缬氨酸异构体的高效液相色谱谱图；
图15为本发明中实施例16的实际检测的D/L比值与理论D/L比值的线性关系图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明提供的一种手性氨基酸的检测方法，包括以下的步骤：（1）衍生：将标准的氨基酸样品与待测的氨基酸样品分别进行衍生化，分别得到衍生化的标准的氨基酸样品与衍生化的待测的氨基酸样品；衍生化的条件如下：在-20℃~40℃条件下，将亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂、碱、有机溶剂、水和氨基酸混合反应，反应时间为0.1~100小时，得到衍生化的氨基酸；
其中，所述的亚膦酸酯衍生化试剂的化合物结构如下所示：
其中，R1为芳基基团；R2为含有手性的烷氧取代基。
（2）检测：将步骤（1）的衍生化的标准的氨基酸样品与衍生化的待测的氨基酸样品通过同一光学检测器并在同等参数条件下检测，得到的谱图进行比对和定性定量分析。
本发明中，对于衍生化的条件中亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂、碱、有机溶剂、水和氨基酸的加入顺序没有特殊的限制，如在一些实施例中，可以先将氨基酸溶于水中，再加入亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂、碱和有机溶剂；在另一些实施例中，也可以先将氨基酸、水和有机溶剂先混合，再加入亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂和碱，只要保证氨基酸充分溶解即可。
本发明中，亚膦酸酯衍生化试剂:卤代试剂:碱:氨基酸的摩尔质量比为（10-50）：（100-300）：（10-200）：1；有机溶剂的体积、水的体积与氨基酸的摩尔质量比为（100-400）mL：（50-200）mL：1 mmol；优选地，碱与氨基酸的摩尔质量比为（10-20）：1。
本发明中，除非另有说明，否则所有商业试剂、溶剂和溶液均无需进一步纯化即可使用。
仪器型号与检测参数
超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析采用Thermo Scientific Dionexultimate300 UHLPC型号液相色谱仪Thermo Scientific TM Q Executive Plus TM质谱仪。核磁共振分析（NMR）采用Bruke ascend 500MHz核磁共振仪。色谱柱Agilent 5 HC-C18（2）（250*4.6 mm）；质谱电喷雾温度300℃，喷雾电压3.5 kV，毛细管温度360 ℃，RF值35%，分辨率7000，分子量范围200-900。正离子模式。流速为0.30mL/min，柱温40℃，进样体积2uL。A相为乙腈，B相为10 mmol乙酸铵溶液；色谱梯度：0-5 min，5% A，5-6 min，35% A，6-60min，35-55 % A，60-66 min 85-100% A，67-77 min，5% A。
高效液相色谱（HPLC）采用安捷伦液相色谱仪1260II-DAD，色谱柱Agilent 5 HC-C18（2）（250*4.6 mm）流速为1mL/min，柱温40℃，进样体积10uL。A相为乙腈，B相为30 mmol乙酸铵溶液；色谱梯度：0-23 min，38-40% A，24-30 min，100% A。
实施例1：亚膦酸酯衍生化试剂的制备
亚膦酸酯衍生化试剂的制备按照参考文献（Advanced synthesis & catalysis.2014,356,781-794）进行合成。
步骤1.1：在500 mL的三颈瓶中，于氮气氛下，加入200 mL无水乙醚和100 mmol苯基二氯化磷，冷却至−78℃，充分搅拌下，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加由100 mmol三乙胺、100 mmol L-薄荷醇和100 mL无水乙醚组成的混合液；滴加完成后，保持−78℃搅拌30 min，然后让其自然升至室温，并继续搅拌3 h，得到乳白色反应液。
步骤1.2：将上述乳白色反应液冷却至−78℃，充分搅拌下缓慢加入1.8 mL去离子水；滴加完成后让其自然升至室温，并继续搅拌过夜；于氮气氛围下将反应液快速过滤，减压除去有机溶剂，得到白色粗产物；粗产物溶解于正己烷和乙酸乙酯混合溶剂中，在−78℃下重结晶24小时，得到无色透明的亚膦酸酯衍生化标记试剂，核磁共振检测其光学纯度>99%。
结果表征：
1H NMR (CDCl3，500 MHz)：δ 8.13，7.03 (d, JP-H =553.30Hz, 1H. ), 7.76-7.16(m, 5H),4.25-4.16 (m, 1H.), 2.16-2.08 (m, 2H), 1.98-1.91 (m, 1H), 1.67-1.57(m, 2H), 1.44-1.34 (m, 2H), 1.24-1.34 (m, 3H), 1.03-0.92 (m, 1 H), 0.90-0.87(d, J= 7.20Hz, 3H), 0.84-0.81 (d, J= 6.70Hz, 3H), 0.80-0.77 (d, J= 6.75Hz,3H).
13C NMR (CDCl3，125 MHz)：132.91 (d, JP-C = 2.71Hz), 130.97 (d, JP-C =135.38Hz), 130.62(d, JP-C = 11.89Hz), 128.68 (d, JP-C = 13.93Hz), 78.98 (d, JP-C = 7.28Hz), 48.72 (d, JP-C = 6.33Hz), 43.52, 33.93, 31.65, 25.80, 22.94, 21.86,20.99, 15.76.
31P NMR (CDCl3，376 MHz)：24.68.
实施例2：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-丝氨酸混合样品
步骤2.1：制备溶液A：1 mmol的D丝氨酸与2 mmol的L丝氨酸混合于7.5 mM的碳酸氢钠水溶液中，其中D型浓度为5 mM，L型浓度为10 mM。
制备溶液B：取1.6 mmol的实施例1合成的亚膦酸酯和16 mmol四氯化碳混合，再以乙腈稀释至总体积为20 mL，放置于-18℃保存。
步骤2.2：在4 mL样品瓶中，加入100 uL的 D，L丝氨基酸混合的溶液A，加入3 μL三乙胺、400 μL 乙腈；放置冰浴中，冷却10分钟待用。
步骤2.3：冰浴下缓慢将47 uL的溶液B滴加入上述步骤2.2的混合溶液中，滴加完成后，0℃下反应30小时。
步骤2.4：在步骤2.3的反应液中加入60 uL氘代乙腈，经核磁共振仪检测分析。
实施例3：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-蛋氨酸混合样品
其余的部分同实施例二，不同之处在于：仅将步骤2.1和2.2中的“D，L-丝氨酸”，改为“D，L-蛋氨酸”。
实施例4：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-苯丙氨酸混合样品
其余的部分同实施例二，不同之处在于：仅将步骤2.1和2.2中的“D，L-丝氨酸”，改为“D，L-苯丙氨酸”。
实施例5：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-精氨酸混合样品
其余的部分同实施例二，不同之处在于：仅将步骤2.1和2.2中的“D，L-丝氨酸”，改为“D，L-精氨酸”。
实施例6：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-天冬酸混合样品
其余的部分同实施例二，不同之处在于：仅将步骤2.1和2.2中的“D，L-丝氨酸”，改为“D，L-天冬氨酸”，以及“标准亚膦酸酯标记试剂47 uL”改为“标准亚膦酸酯标记试剂94uL”。
实施例7：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-亮氨酸混合样品
其余的部分同实施例二，不同之处在于：仅将步骤2.1和2.2中的“D，L-丝氨酸”，改为“D，L-亮氨酸”。
实施例8：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-脯氨酸混合样品
其余的部分同实施例二，不同之处在于：仅将步骤2.1和2.2中的“D，L-丝氨酸”，改为“D，L-脯氨酸”。
实施例9：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-苏氨酸混合样品
其余的部分同实施例二，不同之处在于：仅将步骤2.1和2.2中的“D，L-丝氨酸”，改为“D，L-苏氨酸”。
实施例10：亚膦酸酯衍生化标记并检测D/L-缬氨酸混合样品
其余的部分同实施例二，不同之处在于：仅将步骤2.1和2.2中的“D，L-丝氨酸”，改为“D，L-缬氨酸”。
结果分析：实施例2至实施例10的实验结果分别列于图1中，如图1所示，在核磁共振磷谱中，衍生后的L型相较于D型在较低场，且各类衍生后的D，L氨基酸比例值均处在理论比值（1：2）附近。
实施例11：超高效液相色谱-质谱联用定性分析D/L-天冬氨酸异构体
其余的部分同实施例6，不同之处在于：仅将步骤3改为“反应结束后将反应液置在冰浴中，缓慢滴加1% 甲酸，后稀释配置成待测溶液，经超高效液相色谱-质谱联用仪检测衍生化的D/L-天冬氨酸。”
结果分析：实施例11的实验结果分别列于图2，3，4中，结果表明衍生后D型天冬氨酸先于L型被洗脱出来，提取离子流图积分比值D:L为1:1.90（理论比值为1:2）,在高分辨质谱中其质荷比值为412.18823（理论值412.1884）。
实施例12：超高效液相色谱-质谱联用定性分析D/L-苏氨酸异构体
其余的部分同实施例9，不同之处在于：仅将步骤2.4改为“反应结束后将反应液置在冰浴中，缓慢滴加1% 甲酸，后稀释配置成待测溶液，经超高效液相色谱-质谱联用仪检测衍生化的D/L-苏氨酸。”
结果分析：实施例12的实验结果分别列于图5，6，7中，结果表明衍生后D型苏氨酸先于L型被洗脱出来，提取离子流图积分比值D:L为1:1.98（理论比值为1:2），在高分辨质谱中其质荷比值为398.20902（理论值398.2091）。
实施例13：超高效液相色谱-质谱联用定性分析D/L-亮氨酸异构体
其余的部分同实施例7，不同之处在于：仅将步骤3改为“反应结束后将反应液置在冰浴中，缓慢滴加1% 甲酸，后稀释配置成待测溶液，经超高效液相色谱-质谱联用仪检测衍生化的D/L-亮氨酸。”
结果分析：实施例13的实验结果分别列于图8，9，10中，结果表明衍生后D型亮氨酸先于L型被洗脱出来，提取离子流图积分比值D:L为1：2.95（理论比值为1:2），在高分辨质谱中其质荷比值为410.24359（理论值410.2455）。
实施例14：标记检测D/L-天冬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸等混合样品
步骤14.1：将5 μL的D/L-天冬酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸等标准溶液等体积量混合，再加入15 μL的亮氨酸（D异亮氨酸：D亮氨酸摩尔量比为1:3；L异亮氨酸：L亮氨酸摩尔量比为1:3，用于区分），加入3 μL三乙胺、400μL乙腈。放置冰浴中，冷却10分钟待用。后加入50 uL的实施例2中的溶液B，继续冰浴下反应30小时。
其中标准溶液为1 mmol的D型氨基酸与2 mmol的L氨基酸混合于7.5 mM的碳酸氢钠水溶液中，D型浓度为5 mM，L型浓度为10 mM。
步骤14.2：反应结束后将步骤14.1的反应液置在冰浴中，缓慢滴加1% 甲酸，后稀释配置成待测溶液，经高效液相色谱-质谱联用仪检测其D/L-氨基酸相对含量。
结果分析：实施例14的实验结果分别列于图11中，结果显示，充分反应结束后，所有衍生后的D型氨基酸先于L型被洗脱出来；而对于分子量相同的亮氨酸和异亮氨酸也可被分开，其中洗脱顺序为衍生后的D-异亮氨酸、D-亮氨酸、L-异亮氨酸、L -亮氨酸。
实施例15：核磁共振磷谱相对定量分析D/L-精氨酸异构体比例
步骤15.1：配置溶液C：将标准浓度为5 mM的D，L的精氨酸水溶液分别按D/L为0.5:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20（总共100 uL）混合于400 uL乙腈，3 uL三乙胺中。
其中标准溶液为1 mmol的D型氨基酸与1 mmol的L型氨基酸分别溶于于7.5 mM的碳酸氢钠水溶液中，D型浓度为5 mM, L型浓度为 5 mM。
步骤15.2：在上述混合溶液中，加入31 uL亚膦酸酯试剂（为上述实施例2中溶液B），0℃下反应30小时。
步骤15.3：反应结束后向步骤15.2的反应液内加入60 uL氘代乙腈，经核磁共振仪检测分析。
结果分析：实施例15的实验结果列于图12中，结果显示，在核磁共振磷谱中，衍生后的L型相较于D型在较低场。将实际检测得到的D/L比值与理论D/L比值做线性关系图，如图13所示，得到的线性方程的R2为0.9916，满足比值为0.5-20范围内的相对定量分析。
实施例16：色谱拆分定量分析（紫外检测器）D/L-缬氨酸异构体
步骤16.1：配置溶液D：先分别配置D，L缬氨酸标准水溶液，浓度为40 mM，将D/L的缬氨酸分别按D:L为0.5:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:20（总共100 uL）混合于400 uL乙腈，3 uL三乙胺中。
其中标准溶液为8 mmol的D型氨基酸与8mmol的L型氨基酸分别溶于于20 mM的碳酸氢钠水溶液中，D型浓度为40 mM, L型浓度为 40 mM。
步骤16.2：在上述混合溶液中，加入100 uL亚膦酸酯试剂（为上述实施例2中溶液B），室温下反应30小时。
步骤16.3：将步骤16.2的反应液稀释至1000 mL，经高效液相色谱分析。
结果分析：实施例16的实验结果如图14所示，结果表明在液相色谱图，衍生后D型的缬氨酸先于L型被洗脱出来。将实际检测得到的D/L比值与理论D/L比值做线性关系图，如图15所示，线性方程的R2为0.9985，满足比值为0.5-20范围内的相对定量分析。
以上所述仅是本发明的优选实施例方式，应当指出，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于包括以下的步骤：
(1)衍生：将标准的氨基酸样品与待测的氨基酸样品分别进行衍生化，分别得到所述的衍生化的标准的氨基酸样品与所述的衍生化的待测的氨基酸样品；所述的衍生化的条件如下：在-20℃～40℃条件下，将亚膦酸酯衍生化试剂、卤代试剂、碱、有机溶剂、水和氨基酸混合反应，反应时间为0.1～100小时，得到衍生化的氨基酸；
其中，所述的亚膦酸酯衍生化试剂的化合物结构如下所示：
其中，R1为芳基基团；R2为含有手性的烷氧取代基；所述的含有手性的烷氧取代基选自L-薄荷醇基、D-薄荷醇基、(R)-(+)-1-苯基-1-丙醇基或(S)-(-)-1-苯基-1-丙醇基中的一种；
(2)检测：将所述的步骤(1)的所述的衍生化的标准的氨基酸样品与所述的衍生化的待测的氨基酸样品通过同一检测器并在同等参数条件下检测，得到的谱图进行比对和定性定量分析；
所述的检测器为超高效液相色谱质谱联用仪或高效液相色谱仪，所述的超高效液相色谱质谱联用仪的参数为：
色谱柱为Agilent 5HC-C18(2)，250*4.6mm；流速为0.30mL/min，柱温40℃，进样体积2uL；A相为乙腈，B相为10mmol乙酸铵溶液；
色谱梯度：0-5min，5％A；5-6min，35％A；6-60min，35-55％A；60-66min 85-100％A；67-77min，5％A；
质谱电喷雾温度300℃，喷雾电压3.5kV，毛细管温度360℃，RF值35％，分辨率7000，分子量范围200-900；正离子模式；
所述的高效液相色谱仪的参数为：色谱柱Agilent 5HC-C18(2)，250*4.6mm；流速为1mL/min，柱温40℃，进样体积10uL；A相为乙腈，B相为30mmol乙酸铵溶液；色谱梯度：0-23min，38-40％A；24-30min，100％A。
2.根据权利要求1所述的一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于所述的芳基基团选自苯基、苯氧基、噻吩基或呋喃基中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于所述的亚膦酸酯衍生化试剂:所述的卤代试剂:所述的碱:所述的氨基酸的摩尔质量比为(10-50)：(100-300)：(10-200)：1；所述的有机溶剂的体积、所述的水的体积与所述的氨基酸的摩尔质量比为(100-400)mL：(50-200)mL：1mmol。
4.根据权利要求1所述的一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于所述的碱与所述的氨基酸的摩尔质量比为(10-20)：1。
5.根据权利要求1所述的一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于所述的卤代试剂为四氯化碳、四溴化碳、六氯乙烷、次氯酸钠、次氯酸或次溴酸钠。
6.根据权利要求1所述的一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于所述的碱为三乙胺、三异丙胺、苯胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸铯。
7.根据权利要求1所述的一种手性氨基酸的检测方法，其特征在于所述的有机溶剂选自乙醇、乙腈、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或乙酸乙酯中的一种或多种。
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Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4877908A (en) * | 1983-08-05 | 1989-10-31 | Norsolor | Chiral phosphorus compounds, a process for their manufacture and their application to the catalysis of enantioselective synthesis reactions |
| CN1093368A (zh) * | 1993-12-24 | 1994-10-12 | 清华大学 | 胺类在水体系中直接磷酰化合成n-磷酰化物的方法 |
| CN1095722A (zh) * | 1993-12-31 | 1994-11-30 | 清华大学 | 胺类在水体系中直接磷酰化合成氨基磷酸盐及其混合物的方法 |
| EP1676614A1 (en) * | 2004-12-30 | 2006-07-05 | DSM IP Assets B.V. | Continuous process for the enantioselective enrichment and separation of enantiomers using centrifugal separation |
| JP2009091535A (ja) * | 2007-10-10 | 2009-04-30 | Plascoat Kk | 光学活性ポリマー |
| CN101445516A (zh) * | 2008-12-31 | 2009-06-03 | 厦门大学 | 手性磷酰胺的合成方法 |
| CN103645266A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-03-19 | 光明乳业股份有限公司 | 乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法 |
| CN106596967A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-04-26 | 厦门大学 | 一种稳定同位素磷酰化标记蛋白质的定量方法 |
| CN106596739A (zh) * | 2015-10-14 | 2017-04-26 | 爱普香料集团股份有限公司 | 手性丁位内酯制备中的分析方法 |
| CN106749402A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-05-31 | 厦门大学 | 一种稳定同位素标记手性磷试剂及其制备方法与应用 |
| CN108948077A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-12-07 | 东华理工大学 | 一种α-磷酰化的α-氨基酸酯类化合物及其合成方法 |
| CN113149881A (zh) * | 2021-03-04 | 2021-07-23 | 宁波大学 | 一种手性衍生化试剂及其制备方法和应用 |
| CN113234102A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 宁波大学 | 一种三配位磷衍生物及中间体及制备方法 |
-
2022
- 2022-01-05 CN CN202210008922.1A patent/CN114487169B/zh active Active
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4877908A (en) * | 1983-08-05 | 1989-10-31 | Norsolor | Chiral phosphorus compounds, a process for their manufacture and their application to the catalysis of enantioselective synthesis reactions |
| CN1093368A (zh) * | 1993-12-24 | 1994-10-12 | 清华大学 | 胺类在水体系中直接磷酰化合成n-磷酰化物的方法 |
| CN1095722A (zh) * | 1993-12-31 | 1994-11-30 | 清华大学 | 胺类在水体系中直接磷酰化合成氨基磷酸盐及其混合物的方法 |
| EP1676614A1 (en) * | 2004-12-30 | 2006-07-05 | DSM IP Assets B.V. | Continuous process for the enantioselective enrichment and separation of enantiomers using centrifugal separation |
| JP2009091535A (ja) * | 2007-10-10 | 2009-04-30 | Plascoat Kk | 光学活性ポリマー |
| CN101445516A (zh) * | 2008-12-31 | 2009-06-03 | 厦门大学 | 手性磷酰胺的合成方法 |
| CN103645266A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-03-19 | 光明乳业股份有限公司 | 乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法 |
| CN106596739A (zh) * | 2015-10-14 | 2017-04-26 | 爱普香料集团股份有限公司 | 手性丁位内酯制备中的分析方法 |
| CN106596967A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-04-26 | 厦门大学 | 一种稳定同位素磷酰化标记蛋白质的定量方法 |
| CN106749402A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-05-31 | 厦门大学 | 一种稳定同位素标记手性磷试剂及其制备方法与应用 |
| CN108948077A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-12-07 | 东华理工大学 | 一种α-磷酰化的α-氨基酸酯类化合物及其合成方法 |
| CN113149881A (zh) * | 2021-03-04 | 2021-07-23 | 宁波大学 | 一种手性衍生化试剂及其制备方法和应用 |
| CN113234102A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-10 | 宁波大学 | 一种三配位磷衍生物及中间体及制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Sensitive Bromine-Labeled Probe D‑BPBr for Simultaneous Identification and Quantification of Chiral Amino Acids and Amino- Containing Metabolites Profiling in Human Biofluid by HPLC/MS;Kexin Shen et al.;Anal. Chem.;全文 * |
| 二十种混合氨基酸的质谱鉴定直接磷酰化物的正负离子FAB―MS分析;尹应武 等;化学学报(第11期);全文 * |
| 简单易得试剂与磷-氢化合物交叉偶联合成有机磷化合物;杨佳 等;有机化学;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114487169A (zh) | 2022-05-13 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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