CN114480405B - 无色孔雀石绿的核酸适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了无色孔雀石绿核酸适配体及其应用，属于核酸适配体领域。本发明公开了核酸适配体A5‑b及其突变体，核酸适配体A5‑b及其突变体是核苷酸序列分别为序列1‑6的单链DNA。核酸适配体A5‑b及其突变适配体具有高度的特异性和亲和力，能够特异性识别LMG，故可以建立以LMG为检测靶标的快速检测方法，这样可以避免样品前处理中LMG还原为MG的过程，大大简化了操作过程，便于现场快速检测。

Description

无色孔雀石绿的核酸适配体及其应用

技术领域

本发明属于核酸适配体领域，具体涉及无色孔雀石绿的核酸适配体及其应用。

背景技术

孔雀石绿(Malachite Green，MG)，又名碱性绿、孔雀绿或者中国绿，属于三苯甲烷类染料。孔雀石绿既是染料，也是杀菌剂，具有较强的抗真菌、抗寄生虫、防腐的功效。由于MG价格低廉且抗菌效果显著，故被广泛应用于水产养殖业。然而，因其具有高毒性、高残留性，目前已被世界各国列为水产养殖禁用药物。孔雀石绿在生物体内会很快代谢为脂溶性的无色孔雀石绿(Leuco malachite Green，LMG)，且在生物体内90％以上的MG以LMG形式存在。与MG相比，LMG的残留时间更长、毒性更强，可作为MG残留检测的主要标志物(参考文献：H.Wan,H.Zhang,Developmental Toxicity of Leucomalachite Green onZebrafish.Birth Defects Research 109,682-682(2017).)。

目前，针对水产品中MG残留的检测方法主要有仪器分析法和免疫分析法两大类(参考文献：X.H.Zhou,J.R.Zhang,Z.L.Pan,D.L.Li,Review of Methods for theDetection and Determination of Malachite Green and Leuco-Malachite Green inAquaculture.Crit.Rev.Anal.Chem.49,1-20(2019).)。然而，现有的这些检测方法均有一定的局限性。仪器分析法如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)等，具有灵敏度高、准确性及重复性好等优点，但所需的仪器设备昂贵、检测成本高、耗时长。而且，样品的前处理过程十分复杂、操作繁琐，仅适合于专业检测机构和实验室研究，难以满足基层现场快速筛查的需求。免疫分析法如酶联免疫吸附法(ELISA)、侧流免疫层析法等，具有操作简便、快速、灵敏、特异、成本低等优点，无需特殊的仪器设备和专业操作技术人员即可进行，适合于现场的大规模快速检测。这类方法多数是基于抗原-抗体的特异性反应的原理进行检测，故多以单克隆抗体(mAb)为检测探针。而单抗则必须通过体内免疫筛选获得，像LMG这种小分子、有毒化合物很难获得理想的单抗。另外，单抗的筛选过程也十分繁琐、耗时，存在制备困难、周期长、重复性差、成本高等缺点。此外，现有的检测方法大多需要在样品前处理过程中，需要将LMG转化为MG才能进行检测，操作较为繁琐。因此，寻找一种更为简便、有效、新型的检测探针，以取代传统单抗，为后期研发低成本、高灵敏度的LMG残留快速检测试剂盒提供技术支撑，这对于保障水产品质量安全、消费者健康具有重要意义。

适配体是一类具有高度特异性和亲和性的单链寡核苷酸(ssDNA或RNA)，可发生适应性折叠形成特殊的三维结构(如发夹、假结、凸环、G-四分体等)。这些特殊的三维结构使适配体具有高度的分子识别能力，能够与靶物质特异性结合。这种特异性可与单克隆抗体相媲美，因此，被誉为“人工单抗”。而且，适配体与目标靶的结合力更强，其结合的解离常数可达nmol甚至pmol水平。与传统的单抗相比，核酸适配体具有筛选周期短、易制备、易修饰、热稳定性和重复性好、无免疫原性等优点。此外，核酸适配体是经过体外筛选获得，故更适合于筛选LMG这种小分子且有毒性的靶标。因此，核酸适配体在检测小分子靶标方面具有极大的优势和潜力。

胶体金比色适配体传感技术，由于其灵敏度高、对操作人员的专业性要求较低，且不需要昂贵的大型仪器和设备，被认为是现阶段最具有应用价值和发展潜力的检测分析技术之一。引起胶体金聚集的方式通常分为两类。一是交联与解交联法，对适配体进行修饰，然后通过偶联的方式固定到胶体金表面，当加入靶标时，适配体与靶标相结合，两端探针互补，而引起胶体金交联凝聚或解交联分散，改变溶液的颜色，从而达到检测靶标的目的。另一种是改变胶体金溶液的稳定性法(非交联聚合法)，胶体金表面带有大量的负电荷，颗粒之间通过静电排斥作用来保持其稳定性，一旦破坏了粒子之间的稳定性，胶体金就会发生聚集现象，常用的聚集诱导剂主要有高浓度盐和带正电荷的聚合物。

聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)是一种水溶性的阳离子聚合物，带有大量正电荷。研究表明，PDDA本身带有正电荷，会破坏AuNPs表面的电荷平衡，对AuNPs有很好的聚集效果，而且PDDA还能通过静电作用与带负电荷的单链DNA结合，从而形成“复式”结构。

目前，虽然针对水产品中MG/LMG残留的检测报道已有很多，但是基于核酸适配体识别的检测方法却鲜有报道。仅见一篇基于RNA适配体识别的MG残留快速检测(参考文献：S.L.Stead et al.,An RNA-Aptamer-Based Assay for the Detection and Analysis ofMalachite Green and Leucomalachite Green Residues in FishTissue.Anal.Chem.82,2652-2660(2010).)。然而，RNA适配体虽然结构更灵活、更多样化，但其稳定性差，极易降解，须进行化学修饰以提高其稳定性，导致检测成本大大提高，从而限制了它的实际应用。相较于RNA适配体，单链DNA(ssDNA)不易降解、稳定性更好，易于合成、成本更低。此外，现有的检测方法多是以MG为检测指标。在样品前处理过程中，故需要将LMG转化为MG才能进行检测，操作较为繁琐。若以LMG为检测指标，则可以简化操作流程。目前，国内外基于ssDNA适配体识别LMG的快速检测研究尚属空白。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，如何快速简便的检测无色孔雀石绿。

为解决上述技术问题，第一个方面本发明提供核酸适配体，所述核酸适配体是如下A1)-A6)中任一种的单链DNA：

A1)核苷酸序列为序列1的单链DNA；

A2)核苷酸序列为序列2的单链DNA；

A3)核苷酸序列为序列3的单链DNA；

A4)核苷酸序列为序列4的单链DNA；

A5)核苷酸序列为序列5的单链DNA；

A6)核苷酸序列为序列6的单链DNA。

为解决上述技术问题，第二个方面本发明提供所述的核酸适配体在制备检测或鉴定无色孔雀石绿(LMG)的产品中的应用。

所述产品可为试剂、试剂盒或传感器。

为解决上述技术问题，第三个方面本发明提供用于检测或鉴定无色孔雀石绿(LMG)的传感器，所述传感器含有上述的核酸适配体。

进一步地，上述的传感器中，所述传感器为溶液，所述核酸适配体浓度为40-120nM。

进一步地，所述传感器中核酸适配体的浓度为40-80nM。

进一步地，所述传感器中核酸适配体的浓度为60nM。

进一步地，上述的传感器中，所述传感器还包括聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)和胶体金(AuNPs)。

进一步地，上述的传感器中，所述传感器中聚二烯二甲基氯化铵的浓度为18nM-45nM。

进一步地，上述的传感器中，所述传感器中聚二烯二甲基氯化铵的浓度为24nM。

进一步地，上述的传感器中，所述传感器中的核酸适配体、聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)和胶体金(AuNPs)分别单独包装。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供检测无色孔雀石绿的方法，所述方法包括使用上述的核酸适配体或使用上述的传感器检测无色孔雀石绿(LMG)。

为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供上述的核酸适配体在检测或鉴定无色孔雀石绿(LMG)中的应用。

为解决上述技术问题，第六个方面，本发明提供上述的传感器在检测或鉴定无色孔雀石绿(LMG)中的应用。

利用荧光光谱法，对核酸适配体A5-b及其单碱基突变体的亲和力进行验证，其A5-b的Kd值为2.03±0.1303μM，突变体A5b-12^C Kd值为1.038±0.06079μM。特异性分析表明，A5-b与LMG的结构类似物MG、结晶紫(CV)无交叉反应。

本发明取得的有益效果如下：

1、核酸适配体A5-b及其突变体A5b-12^C具有高度的特异性和亲和力，这种特性可以与单克隆抗体相媲美。然而，传统的单抗具有制备成本高、重复性差等缺点。核酸适配体则可以弥补其缺点，可以大大降低检测成本及批次差异，而且更容易制备及修饰。

2、核酸适配体A5-b及其突变体A5b-12^C能够特异性识别LMG，故可以建立以LMG为检测靶标的快速检测方法，这样可以避免样品前处理中LMG还原为MG的过程，大大简化了操作过程，便于现场快速检测。

附图说明

图1为适配体A5-b的二级结构图。

图2为适配体A5-b亲和力鉴定结果。

图3为适配体A5-b特异性鉴定。

图4为A5-b的原始序列、突变序列及突变位点、预测的二级结构。

图5为A5-b及其突变体的亲和力测定。

图6为A5b-12^C的特异性验证。

图7为LMG的检测原理。

图8为PDDA浓度优化结果。

图9不同物质处理的AuNPs透射电子显微镜(TEM)图像。

图10为Apt浓度优化结果。

图11为AuNPs比色适配体(A5-b)传感器灵敏度检测，不同LMG浓度下AuNPs溶液的吸收光谱(A)和A670/A520比值饱和曲线图(B)。

图12为AuNPs比色适配体传感器特异性检测。

图13为加标样品中LMG的平均回收率(n＝3)。

图14为比色适体传感器与ELISA法对比分析结果(n＝3)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，孔雀石绿(MG)为色谱纯标准品，其CAS编号为：569-64-2，购自上海源叶生物科技有限公司，产品货号为：B25385。

下述实施例中，无色孔雀石绿(LMG)为色谱纯标准品，其CAS编号为：129-73-7，购自Sigma-Aldrich公司，产品货号为：69669。

下述实施例中，结晶紫(CV)为色谱纯标准品，548-62-9，购自上海源叶生物科技有限公司，产品货号为：B26890。

下述实施例中，无色结晶紫(LCV)为色谱纯标准品，其CAS编号为：603-48-5，购自上海源叶生物科技有限公司，产品货号为：B26891。

下述实施例中，酚酞为分析纯产品，其CAS编号为：77-09-8，购自上海源叶生物科技有限公司，产品货号为B24592。

下述实施例中，玫红酸为分析纯产品，其CAS编号为：603-45-2，购自阿拉丁生化科技有限公司，产品货号为R110706。

下述实施例中，磺胺嘧啶(SDZ)为色谱纯标准品，其CAS编号为：547-32-0，购自上海源叶生物科技有限公司，产品货号为B24503。

下述实施例中，硝基呋喃妥因(NFT)为色谱纯标准品，其CAS编号为：67-20-9，购自上海源叶生物科技有限公司，产品货号为B26393。

下述实施例中，聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)为分析纯产品，其CAS编号为：26062-79-3，购自阿拉丁生化科技有限公司，产品货号为P109718。

下述实施例中，胶体金(AuNPs)为分析纯产品，其CAS编号为：7440-57-5，购自上海杰一生物技术有限公司，产品货号为JY-SJ101。

下述实施例中，3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)为超纯产品，其CAS编号为：1132-61-2，购自上海源叶生物科技有限公司，产品货号为S16036。

本发明所需其他试剂均为分析纯，试验用水均为去离子水，由EasypureⅡ超纯水发生器制备。

本发明所用适配体由生工生物工程股份有限公司(上海)合成并纯化。

实施例1、核酸适配体序列及二级结构预测

1.1、A5-b的筛选

本发明采用磁珠SELEX(Mag-SELEX)方法筛选针对无色孔雀石绿(LMG)的单链DNA(ssDNA)适配体，得到名称为A5-b的ssDNA适配体。

A5-b是核苷酸序列如下的单链DNA：5'-CTGCGCGTCCTATGCGTGCT-3'，由生工生物工程股份有限公司(上海)合成并纯化。

1.2、核酸适配体序列及二级结构预测

适配体的空间结构会影响与靶分子的结合能力，对于获得高亲和力适配体具有重要意义。研究表明，吉布斯自由能△G值越小，代表适配体所形成二级结构越稳定。

通过mfold软件，对适配体A5-b的二级结构和吉布斯自由能(△G)进行预测。

适配体A5-b的二级结构如图1所示，图1中5'-CCTATGCGTGCT-3'为固定引物序列、5'-CTGCGCGT-3'为随机序列。该适配体具有典型的茎环结构，能够识别靶标，其自由能△G为-4.84kcal/mol，自由能较低，说明该序列结构稳定。

实施例2、适配体亲和力测定

2.1、核酸适配体亲和力分析方法

无色孔雀石绿(LMG)本身具有很强的荧光，且与适配体结合时自身的荧光强度会降低，因此利用荧光法测定适配体与LMG结合时的荧光变化，从而对其亲和力进行鉴定，具体步骤如下，以下所述室温孵育的温度均为25℃：

(1)适配体溶解。先将适配体A5-b在12000r/min的转速下离心10分钟，离心后用DPBS缓冲液(0.9mM CaCl₂，2.68mM KCl，1.47mM KH₂PO4，0.5mM MgCl₂·6H₂O，136.8mMNaCl，8.1mM Na₂HPO₄·12H₂O)稀释将A5-b稀释为100μmol/L的储备液，涡旋混匀后置于-20℃条件下储存，备用。

(2)适配体-靶标孵育。使用时将适配体储备液再次用DPBS缓冲液稀释至终浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5、5、10、15μmol/L，95℃水浴加热10min，冰浴冷却1min。与终浓度为5μmol/L的LMG室温混合孵育30min，试验反应体系总体积为200μL，每组试验平行重复3次。

(3)荧光测量。LMG的激发波长(excitation，Ex)为265nm，发射波长(emission，Em)在300-500nm范围内，狭缝宽度为10nm。通过荧光光谱扫描存在或不存适配体时LMG的荧光强度变化，利用Origin9.0软件呈现LMG与配体结合的荧光光谱图。

(4)计算Kd值。将不存在适配体时LMG的荧光强度记为F₀，与适配体孵育后Apt-LMG复合物的荧光强度记为F，LMG的荧光变化差值△F＝F₀-F，根据公式Y＝Bmax×X/(Kd+X)，通过GraphpadPrism7.0软件，用单点结合饱和曲线进行非线性拟合，得到适配体A5-b的Kd值。式中Bmax为最大结合位点的数目，X为适配体浓度，Y为荧光强度差值。

2.2、适配体亲和力分析结果

选用荧光分析法对适配体A5-b与LMG的亲和力进行测定分析，结果如图2所示。图2中A为A5-b与LMG的结合荧光光谱图。图2中B为结合饱和曲线图。

由图2中A可知，随着适配体A5-b浓度的增加，LMG荧光强度逐渐减弱，说明适配体A5-b与LMG有一定的结合能力。

由图2中B可知，通过非线性拟合得到A5-b的Kd值为2.03±0.1303μM，进一步说明该适配体对LMG有亲和性且亲和力较高，且相关系数达到0.99以上，说明该结果可靠性较高。在适配体浓度为10μM时，Apt-LMG复合物的荧光强度也逐渐趋于平稳，此时结合反应基本达到饱和。

实施例3、核酸适配体特异性验证

3.1、核酸适配体特异性测定方法

利用荧光分析法进行适配体A5-b特异性验证，研究表明，结晶紫(CV)、孔雀石绿(MG)自身几乎没有荧光，与适配体结合后荧光强度增强，无色结晶紫(LCV)、无色孔雀石绿(LMG)自身带有很强的荧光，但与适配体结合后荧光强度下降。

参照实施例2所述方法分别测定适配体A5-b与LMG、LCV、MG、CV进行亲和力鉴定，通过Kd值来判断A5-b的特异性。以适配体浓度为横坐标，ΔF为纵坐标(LMG和LCV的ΔF＝F0-F，MG和CV的ΔF＝F-F0)，绘制单点结合饱和曲线图。LCV的Ex为300nm，Em为320-500nm；MG的Ex为620nm，Em为640-800nm；CV的Ex为580nm，Em为600-800nm，狭缝宽度均为10nm。

3.2、适配体特异性验证结果

利用荧光分析法对适配体A5-b的特性进行鉴定，对不同靶标的亲和力进行对比，从而确定适配体与LMG的特异性是否良好。试验结果如图3，图3中为LMG及其结构类似物的化学结构式。

如图3中B所示，尽管随着适配体A5-b浓度的增加，MG和CV的荧光强度有所增加，但拟合得到的Kd值均远大于LMG、LCV，由于LMG和LCV的化学结构及其相似(如图3中A所示)，因此该适配体对LCV存在一定的交叉反应。

实施例4、无色孔雀石绿核酸适配体A5-b的突变体

4.1、A5-b突变体的获得

利用RNAstructure软件预测分析发现，A5-b为典型的茎环结构，具有开发裂分适配体(SPA)的潜力。因此，拟对其进行裂分，构建裂分核酸适配体。对环区的5个碱基进行逐个突变，得到5条突变序列，分别为A5b-9^T、A5b-10^T、A5b-11^C、A5b-12^C和A5b-13^A(见图4)。A5-b的原始序列、突变序列及突变位点、预测的二级结构见图4。

4.2、A5-b突变体的功能验证

参照实施例2中的测定方法对分别对原始序列及5条突变序列即A5-b、A5b-9^T、A5b-10^T、A5b-11^C、A5b-12^C和A5b-13^A进行亲和力测定，结果如图5所示(A5b-11^C没有亲和力，结合饱和曲线没有拟合成功)。

由图5可知，第12位碱基突变序列即A5b-12^C(A→C，图5中D)，其与LMG的亲和力(1.038±0.06079μM)高于原始序列A5-b(1.49±0.1381μM)。

由图5中A可知，通过非线性拟合得到A5-b的Kd值为1.49μM，进一步说明该适配体对LMG有亲和性且亲和力较高，且相关系数达到0.98以上，说该结果可靠性较高。在适配体浓度为8μM时，Apt-LMG复合物的荧光强度也逐渐趋于平稳，此时结合反应基本达到饱和。

由图5中B可知，通过非线性拟合得到A5b-9^T的Kd值为2.95μM，进一步说明该适配体对LMG有亲和性且亲和力较高，且相关系数达到0.96以上，说该结果可靠性较高。在适配体浓度为8μM时，Apt-LMG复合物的荧光强度也逐渐趋于平稳，此时结合反应基本达到饱和。

由图5中C可知，通过非线性拟合得到A5b-10^T的Kd值为2.55μM，进一步说明该适配体对LMG有亲和性且亲和力较高，且相关系数达到0.97以上，说该结果可靠性较高。在适配体浓度为8μM时，Apt-LMG复合物的荧光强度也逐渐趋于平稳，此时结合反应基本达到饱和。

由图5中D知，通过非线性拟合得到A5b-12^C的Kd值为1.04μM，进一步说明该适配体对LMG有亲和性且亲和力较高，且相关系数达到0.99以上，说该结果可靠性较高。在适配体浓度为8μM时，Apt-LMG复合物的荧光强度也逐渐趋于平稳，此时结合反应基本达到饱和。

由图5中E可知，通过非线性拟合得到A5b-13^A的Kd值为3.11μM，进一步说明该适配体对LMG有亲和性且亲和力较高，且相关系数达到0.97以上，说该结果可靠性较高。在适配体浓度为8μM时，Apt-LMG复合物的荧光强度也逐渐趋于平稳，此时结合反应基本达到饱和。

考虑到该序列的碱基已发生突变，故其特异性可能会受影响。因此，参照实施例3测定适配体特异性的方法，其区别仅在于我们仅设立了一个适配体浓度和靶标浓度。靶标的终浓度为5μmol/L，适配体A5b-12^C的终浓度为4μmol/L，我们对该突变序列的特异性进行了验证，结果如图6所示

图6可知，突变序列A5b-12^C的特异性几乎没有改变，其与MG、CV无交叉反应，与LCV略有交叉反应。

实施例5、LMG免标记比色适配体传感器的构建

在本实施例中，通过无色孔雀石绿(LMG)、核酸适配体(Apt)和聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)之间独特的相互作用来控制胶体金(AuNPs)的聚集和分散，从而改变溶液的颜色，构建了一个相对简单、快速的比色分析法，用来检测LMG的残留。并对该方法的灵敏度和特异性进行了测定。

基于PDDA的独特性建立了LMG的检测方法，PDDA自身所带的正电荷会破坏AuNPs表面电荷平衡，使AuNPs发生聚集反应，同时，PDDA还会因为静电作用与适配体结合形成“复式(Duplex)”结构。当检测体系内没有LMG时，适配体会和PDDA发生静电反应，结合成“复式(Duplex)”结构，此时体系中没有多余的PDDA，因此AuNPs也不会聚集，溶液颜色为红色，如图7中(I)所示；一旦体系内含有LMG时，适配体便会优先于LMG结合，由于体系内适配体的消耗导致PDDA有剩余，剩余的PDDA就会诱导AuNPs发生聚集现象，此时，溶液颜色变为蓝色如图7中(II)所示。我们便可以通过观察溶液颜色变化初步判断体系中是否存在LMG，同时可以通过对溶液吸光度的测量来计算体系内LMG的具体浓度。

下面以适配体A5-b为例进行详细阐述。

5.1、适配体传感器检测体系优化

控制适配体传感器检测体系的总体积为200μL，其中AuNPs溶液的体积固定为100μL，终浓度为1.62nmol/L，适配体用10mM的3-吗琳丙磺酸(MOPS)溶液进行稀释，体系总体积不足200μL是用MOPS溶液补足。检测体系的孵育温度均设定为25℃，本实施例中提到的溶液浓度均为终浓度，每个试验均设定三次重复。

5.1.1、PDDA浓度优化

将PDDA用去离子水稀释，将不同体积的PDDA溶液分别加入到每个离心管中，将其终浓度分别稀释为0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44nM。

然后加入100μL的AuNPs溶液，孵育15min。利用多功能酶标仪扫描溶液波长。在400～800nm之间的吸收光谱，并分别测得670nm和520nm处的吸光度，计算吸光度比值A670/A520，以A670/A520为纵坐标，以PDDA浓度作为横坐标，绘制饱和度曲线，选择出吸光度比值最大时所对应的PDDA浓度，即为PDDA的最佳浓度。

结果表明：PDDA是控制AuNPs聚集情况的决定性因素其用量是构建传感体系的关键。当固定AuNPs的用量时，PDDA过少会导致AuNPs聚集不完全，而过多的PDDA会降低传感体系的灵敏度，因此要控制体系中的PDDA可以使AuNPs完全聚集且无剩余，优化结果如图8所示。

由图8中A可知，随着PDDA浓度的增加，AuNPs在520nm处的吸光度值逐渐减小，而在670nm处吸光度值逐渐升高，特征峰出现向右偏移的情况，同时AuNPs也由红色逐渐变为蓝色，通过吸光度比值A670/A520来衡量AuNPs的聚集程度，随着AuNPs逐渐聚集，比值也会逐步升高。由图8中B可知，当PDDA浓度为24nM时，A670/A520达到最大值，随后比值由于AuNPs聚集完全而趋于平稳。选择添加最小量浓度的PDDA为本试验最佳选择，因此检测体系中PDDA的最佳浓度为24nM。

5.1.2、核酸适配体浓度优化

将核酸适配体(Apt)用MOPS稀释，将不同体积的Apt加入离心管中，将其终浓度分别稀释为0、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140nM，然后，加入试验5.1.1中所优化后的PDDA并混合孵育20min，随后加入100μL的AuNPs溶液孵育15min。利用多功能酶标仪扫描溶液波长在400～800nm之间的吸收光谱，并分别测得670nm和520nm处的吸光度，计算吸光度比值A670/A520，以A670/A520为纵坐标，以适配体浓度作为横坐标，绘制饱和度曲线，选择出吸光度比值最小时所对应的Apt浓度，即为Apt的最佳浓度。

结果表明：适配体在传感体系中不仅可以识别LMG，还会与PDDA结合，因此优化其用量也是建立检测体系的关键环节。Apt过少会导致PDDA有剩余进而导致AuNPs发生聚集，而Apt过多时即使溶液中存在靶标，其与靶标充分结合后，还是会有充足的Apt与PDDA反应，使AuNPs仍然呈分散状态，导致检测体系灵敏度降低。因此要控制Apt的量刚好与PDDA充分反应且无剩余，优化结果如图10所示。图10中A为不同Apt浓度下AuNPs的吸收光谱图；图10中B为A670/A520比值饱和曲线图。

由图10中A可知，随着Apt(A5-b)浓度的增加，AuNPs的特征峰逐渐红移，说明体系中的PDDA逐渐被Apt(A5-b)消耗，AuNPs聚集程度减弱，由图10中B可知，A670/A520的比值随着Apt(A5-b)的增加呈下降趋势，当Apt浓度超过60nM后趋于稳定，此时Apt(A5-b)与PDDA完全结合，AuNPs不聚集，选择添加最小量浓度的Apt(A5-b)为本试验最佳选择，因此检测体系中Apt(A5-b)的最佳浓度为60nM。

5.2、适配体传感器的表征

通过透射电子显微镜(TEM)可以对AuNPs的粒径大小及微观形貌进行表征。因此选用TEM对传感器进行形态表征，判断AuNPs的聚集情况。将样品分为四组：(A)100μL AuNPs；(B)24nM PDDA溶液，100μL AuNPs；(C)60nM Apt，24nM PDDA，100μL AuNPs；(D)2μM LMG，60nM Apt，24nM PDDA溶液，100μL AuNPs。将上述四组样品按时间孵育后进行超声处理5min，取1-2滴溶液滴在铜网上，待溶液干燥后送入样品台检测，设置加速电压为150KV。

结果表明：LMG、Apt和PDDA之间的相互作用会直接影响AuNPs粒子的分散或聚集情况。因此，进一步验证了聚集现象，通过TEM可以非常清晰的观察Apt分别与LMG、PDDA作用后的结构变化。如图9所示，图9中A为1.62nMAuNPs；图9中B为24nMPDDA+1.62nMAuNPs；图9中C为60nMApt+24nMPDDA+1.62nMAuNPs；图9中D为2μMLMG+60nMApt+24nMPDDA+1.62nMAuNPs。

可以明显看出AuNPs的良好分散性，AuNPs粒子程球形且分布均匀(图9中A；加入PDDA后，PDDA和AuNPs之间通过静电相互作用导致AuNPs粒子高度聚集，从而使溶液呈蓝色(图9中B)；然而，在Apt存在的情况下，PDDA与Apt形成了复合结构，因此，由于缺乏足够的PDDA，AuNPs粒子仍程分散状态，溶液仍然保持红色(图9中C)；相反，当加入一定量的LMG后，Apt-LMG复合物的形成使体系中存在一部分游离的PDDA，从而导致一部分AuNPs粒子发生聚集，溶液的颜色变为蓝紫色(图9中D)。

实施例6、适配体传感器灵敏度分析

将60nM Apt溶液分别与0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、13μM的LMG混合孵育20min，加入24nM PDDA溶液继续孵育20min，最后加入100μL AuNPs孵育15min，利用多功能酶标仪扫描溶液400～800nm波长之间的吸收光谱，并测得670nm和520nm处的吸光度，计算吸光度比值A670/A520。以A670/A520为纵坐标，以LMG浓度作为横坐标，绘制饱和度曲线及标准曲线。

用该方法对无LMG样品进行10次检测，计算标准偏差和该检测体系的最低检出限(LOD)，从而确定该检测方法的灵敏度，根据国标GB/T27404-2008，检出限的计算方式为LOD＝3SD/K(SD为10个平行空白样品的标准偏差，K为线性方程的斜率)。

在离心管中分别加入终浓度为1、4、8μM的LMG标准液进行上述试验，

每个样品进行6次平行试验并计算相对标准偏差(RSD)，从而确定该方法的重复性。

在最优条件下，分别测定不同LMG浓度下的A670/A520值。其结果如图11所示。图11中A为不同LMG浓度下AuNPs溶液的吸收光谱；图11中B为A670/A520比值饱和曲线图。

随着LMG浓度的增加，溶液的吸收光谱发生变化，520nm处的特征峰值逐渐下降，670nm左右出现新的特征峰，AuNPs溶液颜色逐渐由红色变为蓝紫色最终变成稳定的蓝色(图11中A)；A670/A520的值随LMG浓度的增加而升高，当LMG浓度超过8μM后，A670/A520基本趋于稳定状态。当LMG的浓度在0～8μM之间时吸光度的比值(A670/A520)与其呈现良好的线性关系，相关系数R²＝0.9956，线性回归方程y＝0.1192x+0.2696。

经过不同浓度标准液的6次平行测定，空白液的10次平行测定，计算其相对标准偏差，结果见表1和表2。由表1可知，当LMG添加量在1～8μM时，相对标准偏差(RSD)在4.44～5.84％之间，说明精密度良好，由表2可知，空白液的标准偏差SD＝0.024，经计算得出检出限LOD＝0.604μM，说明该方法有较高的灵敏度。

表1.标准液6次平行试验

表2.空白溶液10次平行试验

实施例7、适配体传感器特异性验证

7.1、适配体传感器特异性验证检测方法

为了验证该检测体系的特异性，选取了LMG的3种结构类似物和2种水产养殖常用的抗生素作为非靶标干扰物质。结构类似物包括无色结晶紫(LCV)、玫红酸(Rosolicacid)和酚酞(Phenolphthalein)；常用抗生素包括磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)和硝基呋喃妥因(Nitrofurantoin，NFT)。

分别向反应体系中加入LMG、LCV、玫红酸、酚酞、磺胺嘧啶、硝基呋喃妥因以及Mix1(C_LMG：C_LCV：C_玫红酸：C_酚酞＝1:1:1:1)和Mix2(C_LMG：C_SDZ：C_NFT＝1:1:1)，使其含量均为6μM；与Apt(A5-b)混合孵育20min，再加入PDDA混合孵育20min，最后加入AuNPs孵育15min，具体操作参照实施例6，计算每个样品的A670/A520，并与空白对照组(不含任何检测物质)进行对比。试验数据以用GraphpadPrism7.0软件绘制单式柱状图，根据结果分析该传感器的特异性。

7.2、适配体传感器特异性验证结果

检测体系的特异性验证是衡量该传感器是否符合要求的一个重要的指标。将LMG与LCV、玫红酸、酚酞、SDZ、NFT、Mix1和Mix2分别加入检测体系中，结果如图12所示。当体系中存在LMG或LCV后，体系出现了A670/A520比值显著增加的情况，而其他物质吸光度比值变化不明显，这说明除了LCV以外，试验所选取的其他干扰物对本传感器检测LMG的影响较小，这说明此方法用于检测LMG有较高的特异性，抗干扰能力较强。LCV的吸光度比值与LMG的比值无显著性差异，这主要是由于LCV在化学结构上与LMG极其相似所导致的，但是，将LMG与LCV1:1混合后进行检测，吸光度比值仍然没有显著性增加，说明适配体A5-b可能同时存在可特异性识别LMG和LCV的结合位点，该传感器不仅能用于LMG的检测，还可以用于检测LCV。

实施例8、比色适配体传感器初步应用

8.1、样本准备

本试验所用的鲫鱼样本和水样均从延吉市当地购买，水样用0.45μm滤膜过滤备用，将鲫鱼去皮去骨后的鱼肉切小片，用去离子水洗涤，排干并进行均质化处理，分别取5g鱼样匀浆和5mL水样与离心管中，分别加入100μL终浓度为160μM的LMG标准溶液充分混合均匀进行人工污染，鱼样中加入10mL乙腈，然后进行超声波振荡提取2min，8000r/min匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至25mL比色管中，另取一个离心管加入10mL乙腈，清洗匀浆刀头并重复上述操作，合并2次上清液并用乙腈定容至25mL备用(参照国标GB/T19857-2005)。然后，用MOPS缓冲液将上清液分别稀释至终浓度1，5，8μM进行LMG检测，检测方法参照实施例6。制备的样品均一式三份，计算加标回收率以确定该方法的准确度。

8.2、比色适配体传感器检测分析法

在市场上随机抽取的20份水样，利用比色适配体传感器检测法对其进行LMG残留量检测。具体检测方法如下：

样品前处理：将待测水样进行4000r/min离心5分钟，上清液分别用0.45μm滤膜过滤备用。取50μL上清液用于检测。

检测步骤：将50μL上清液与终浓度为60nM的适配体A5-b混合孵育20min，加入终浓度为24nM的PDDA充分孵育20min，最后加入100μL的AuNPs混合孵育15min。控制检测体系总体积为200μL，不足200μL用MOPS补足。利用多功能酶标仪测定670nm处和520nm处的吸光度，计算吸光度比值A670/A520。以A670/A520为x值，代入公式y＝0.1192x+0.2696，计算得出样品中LMG的浓度。

不同浓度LMG加标回收分析结果如图13所示。比色适配体传感器对鱼样的平均加标回收率为81.36～95.96％，相对标准偏差为4.86～5.85％。对水样的平均加标回收率为95.58～101.86％，相对标准偏差为3.61～6.53％。两者相对标准偏差均小于10％，说明该方法重复性较好，能够实现水产中的LMG快速检测。

结果表明该比色适配体传感器在鱼样和水样中检测LMG均具有应用潜力，为实际样品中LMG的检测应用提供了一定依据。水样加标回收率略高于鱼样，这可能是由于在鱼肉复杂的样品前处理过程中部分LMG被破坏所导致的。

8.3、ELISA试剂盒检测分析法

选用ELISA试剂盒检测法对上述20份水样进行LMG检测，具体检测方法如下：

样品前处理：在离心管中加入1mL样品、0.3mL乙腈和6mL乙酸乙酯并充分振荡5分钟，4000r/min离心10分钟，取上清液3mL加入玻璃试管中，再加入50μL氧化剂，振荡2分钟，每管加入50μL，50℃水浴环境下氮气吹干；加入1mL1×样品复溶液，溶解混匀，取50μL用于检测。

检测步骤如下：

1.绘制标准曲线：将标准液分别稀释至终浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4ng/mL，用于标准曲线的绘制；

2.加样反应：在酶标板中分别加入标准品或样本50μL，然后加抗体50μL/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光反应30分钟，结束后用洗涤液充分洗涤，吸水纸拍干；

3.加酶反应：加酶标记物100μL/孔，25℃避光反应30分钟，结束后重分洗涤；

4.显色反应：加底物液A50μL/孔，再加底物液B50μL/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟；

5.终止：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.测吸光度：用酶标仪测定450nm处每孔的吸光度值，带入标准曲线中，计算得出样品的LMG含量。

检测结果如图14所示，传感器检测法的LMG检出率为15％，ELISA试剂盒的检出率为20％。两种方法对LMG的检测结果无显著性差异，二者的RSD小于10％，说明本研究所建立的适配体传感器结果可靠，可以用实际样品中LMG的检测，由于该方法的检测限略高于ELISA试剂盒，因此在实际样品检测过程中可能发生检出率比实际检出率低的情况，但是该方法检测时间较短，且操作过程简便，成本更低，对于检测大量样本时更有优势。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 延边大学

<120> 无色孔雀石绿的核酸适配体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcgcgtcc tatgcgtgct 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcgcgtcc taagcgtgct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgcgcgtcc catgcgtgct 20

Claims (10)

1.核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体是如下A1)-A6)中任一种的单链DNA：

A1)核苷酸序列为序列1的单链DNA；

A2)核苷酸序列为序列2的单链DNA；

A3)核苷酸序列为序列3的单链DNA；

A4)核苷酸序列为序列4的单链DNA；

A5)核苷酸序列为序列5的单链DNA；

A6)核苷酸序列为序列6的单链DNA。

2.权利要求1所述的核酸适配体在制备检测或鉴定无色孔雀石绿的产品中的应用。

3.用于检测或鉴定无色孔雀石绿的传感器，其特征在于：所述传感器含有权利要求1所述的核酸适配体。

4.根据权利要求3所述的传感器，其特征在于，所述传感器为溶液，所述核酸适配体浓度为40-120nM。

5.根据权利要求3或4所述的传感器，其特征在于：所述传感器还包括聚二烯二甲基氯化铵和胶体金。

6.根据权利要求5所述的传感器，其特征在于：所述传感器中聚二烯二甲基氯化铵的浓度为24nM。

7.根据权利要求6所述的传感器，其特征在于：所述传感器中的核酸适配体、聚二烯二甲基氯化铵和胶体金分别单独包装。

8.检测无色孔雀石绿的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1所述的核酸适配体或使用权利要求3-7中任一所述的传感器检测无色孔雀石绿。

9.权利要求1所述的核酸适配体在检测或鉴定无色孔雀石绿中的应用。

10.权利要求3-7中所述的传感器在检测或鉴定无色孔雀石绿中的应用。

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