CN114480310B - 传染性病毒液的封装工艺和灭活方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种传染性病毒液的封装工艺和灭活方法。传染性病毒液的封装工艺，包括如下步骤：(1)取一支冻存管，冻存管包括相互旋紧的端盖和管体，端盖上设置有两个通孔，通过其中一个通孔向冻存管内注入传染性病毒液，同时通过另一个通孔排出气体，使冻存管内的气体残留量≤1vol％；(2)擦拭溢出的传染性病毒液，静置至端盖的端面干燥；(3)取造牙树脂粉和义齿基托树脂液混合，搅拌，得到树脂混合液；(4)将树脂混合液填充至冻存管上的两个通孔中，静置10～30min，得到密封的冻存管；其中，造牙树脂粉和义齿基托树脂液的重量比为1.95～2.3:1。本发明的传染性病毒液的封装工艺，可以使冻存管在超高压力的作用下保持较低的泄漏率。

Description

传染性病毒液的封装工艺和灭活方法

技术领域

本发明涉及一种传染性病毒液的封装工艺和灭活方法。

背景技术

超高压灭菌技术，是指将待处理的物品置于100～1000MPa的高压下处理一段时间，以达到杀菌、灭活的效果。超高压灭菌技术对细菌、酵母菌等的灭活率较高，而且不会像高温杀菌那样造成营养成分破坏和风味变化，因而被广泛应用于食品加工领域。

研究指出，在一定时间的高压作用下，DNA病毒、流感病毒、RAN病毒等病毒将丧失生物活性。由于传染性病毒液中溶有一定的气体，且传染性病毒液的灭活一般需要施加500MPa以上的压力，在超高压力的作用下，冻存管或密封袋易发生泄露，存在一定的安全隐患。因此，目前的超高压灭菌技术主要用于处理医用口罩、手套、防护服等医疗废物，无法应用于传染性病毒液的灭活。

发明内容

有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种传染性病毒液的封装工艺，其可以使冻存管在超高压力的作用下保持较低的泄漏率。

本发明的另一个目的在于提供一种传染性病毒液的灭活方法，其对传染性病毒液的灭活率≥99.996％，且安全性较高。

一方面，本发明提供一种传染性病毒液的封装工艺，包括如下步骤：

(1)取一支冻存管，所述冻存管包括相互旋紧的端盖和管体，所述端盖上设置有两个通孔，通过其中一个通孔向所述冻存管内注入传染性病毒液，同时通过另一个通孔排出气体，使所述冻存管内的气体残留量≤1vol％；

(2)擦拭溢出的传染性病毒液，静置至所述端盖的端面干燥；

(3)取造牙树脂粉和义齿基托树脂液混合，搅拌，得到树脂混合液；

(4)将树脂混合液填充至所述冻存管上的两个通孔中，静置10～30min，得到密封的冻存管；

其中，所述造牙树脂粉和义齿基托树脂液的重量比为1.95～2.3:1。

本发明意外地发现，在冻存管的端盖上扎两个通孔，可以实现传染性病毒液的注入和气体的排出，有助于降低超高压力下冻存管的泄露率。根据本发明的一些实施方式，控制冻存管内的气体残留量≤1vol％时，冻存管在超高压力下的泄漏率可以达到5％以下。采用造牙树脂粉和义齿基托树脂液对通孔进行密封，不仅可以有效防止在超高压力下传染性病毒液从通孔中泄露出来，而且造牙树脂粉和义齿基托树脂液的塑形时间较短，操作简单，有助于提高传染性病毒液的封装效率。

本发明中，传染性病毒液是指含有传染性病毒毒株的液体。本发明对传染性病毒液的种类没有特殊要求，可以为流感病毒(甲型H1N1)、脊髓灰质炎病毒I型、人类冠状病毒(HCoV-229E)等。

本发明中，超高压力是指大于等于500MPa的压力。

本发明中，传染性病毒液的封装工艺在生物安全柜中进行操作。在某些实施方式中，传染性病毒液的封装在P2级生物实验室的生物安全柜中进行。

本发明中，传染性病毒液的注入完成后，需要擦拭排气时溢出的传染性病毒液，静置，直至端盖的端面干燥。这样可以增加造牙树脂粉和义齿基托树脂液的树脂混合液对通孔的封堵效果。在某些实施方式中，在传染性病毒液的注入完成后，采用干燥的无菌脱脂棉擦拭排气时溢出的传染性病毒液，然后静置5min。

根据本发明的封装工艺，优选地，所述冻存管为内旋螺纹冻存管。这样可以增加冻存管的密封性。

根据本发明的封装工艺，优选地，所述冻存管的端盖与所述冻存管的管体之间的旋紧度为：旋紧后，端盖的密封圈的厚度为其原始厚度的60％～70％。当端盖的密封圈的厚度小于其原始厚度的60％时，试管端盖内螺纹容易受力过大致使其脱扣；当端盖的密封圈的厚度大于其原始厚度的70％时，由于旋紧度不够，病毒液受到针筒压力后有溢出的可能。

根据本发明的封装工艺，优选地，所述冻存管在使用前采用环氧乙烷抗力仪进行消毒处理；

所述消毒处理的工艺参数为：环氧乙烷浓度为600mg/l，相对湿度为60％，消毒温度为54℃，消毒时间为60min。这样可以提高密封工艺的安全性。

本发明对步骤(3)中的搅拌时间并没有特别要求，只要搅拌均匀即可。例如搅拌20～120s。根据本发明的一些实施方式，搅拌时间为30s，这样能够搅拌均匀，减少缺陷性气孔的形成，有助于提高冻存管的密封效果。

根据本发明的封装工艺，优选地，步骤(3)中，所述搅拌时间为30s，所述静置时间为10～15min。这样不仅便于填孔，而且形成的密封效果良好，在超高压力下不易泄露。

根据本发明的封装工艺，优选地，所述造牙树脂粉和义齿基托树脂液的重量比为2～2.1:1。

根据本发明的一些实施方式，所述造牙树脂粉和义齿基托树脂液的重量比为2:1，这样能够在较短的静置时间内形成质量良好的密封体，既能提高封装工艺的效率，又能保证冻存管在超高压力下较低的泄漏率。

根据本发明的封装工艺，优选地，将树脂混合液填充至所述冻存管上的两个通孔中，使所述树脂混合液的液位高于端盖的端面1～1.5mm。这样有助于降低冻存管在超高压力下的泄漏率。

根据本发明的封装工艺，优选地，还包括：将所述密封的冻存管放入尼龙材质的包装袋中，抽真空至相对真空度≤-0.1MPa，密封。这样可以进一步防止冻存管泄露，增加传染性病毒液灭活时的安全性。

另一方面，本发明提供一种传染性病毒液的灭活方法，包括如下步骤：按照上述的封装工艺将传染性病毒液进行封装；然后置于超高压设备中，加压至500MPa以上进行灭活处理。

本发明对超高压设备的具体结构并没有特殊要求，只要能够加压至500MPa以上即可。

根据本发明的一些实施方式，超高压设备的加压过程采用多级连续升压的方式，对传染性病毒液的灭活效果更佳。

在某些实施方式中，所述超高压设备的加压过程包括：

1)将压力增加至300～350MPa，保压30～60s；

2)继续加压至500～700MPa，保压5～8min，随后泄压至0.1MPa，泄压速度为100MPa/s。

根据本发明的灭活方法，优选地，所述超高压设备的加压过程包括：

1)将压力增加至300～350MPa，保压30～60s；

2)继续加压至500～700MPa，保压5～8min，随后泄压至2～10MPa，泄压速度为100MPa/s；

3)继续加压至500～700MPa，保压5～8min，随后泄压至0.1MPa，泄压速度为100MPa/s。

本发明的传染性病毒液的封装工艺，可以使冻存管在超高压力的作用下保持较低的泄漏率。本发明的传染性病毒液的灭活方法，对传染性病毒液的灭活率≥99.996％，且安全性较高。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

下面介绍测试方法：

(1)泄漏率测试：将待测试的冻存管置于超高压设备(中国兵器工业第五二研究所自主设计研制的超高压增压机，额定工作压力为1000MPa)的高压容器内。高压介质为癸二酸二辛酯。设定超高压设备的加压过程为：

1)将压力增加至300MPa，保压30s；

2)继续加压至500MPa，保压5min，随后泄压至10MPa，泄压速度为100MPa/s；

3)继续加压至700MPa，保压5min，随后泄压至0.1MPa，泄压速度为100MPa/s。

统计数据，并按照以下公式计算泄漏率：

泄露率(％)＝(发生泄露的冻存管的支数/参与测试的冻存管的总支数)×100％

(2)灭活率测试：依据2002年版《消毒技术规范》进行病毒增殖和病毒滴度测定。具体测试过程如下：

1)从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心(3000r/min，3min)，去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，离心(3000r/min，3min)后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在宿主细胞长满单层时，可用于试验。

2)取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层宿主细胞的培养瓶内，置于37℃温箱中，使之与宿主细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4宿主细胞出现病变时，收获病毒。

3)将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波(或反复冻融)破碎宿主细胞，释放病毒；然后，尽快离心(6000r/min，15min)去除沉淀(主要为细胞碎片)，上清液即为所需的病毒悬液。将病毒悬液按每管1.0ml分装于无菌离心管1.5ml中。

4)取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度，病毒滴度以组织细胞培养半数感染量(TCID50)表示，即病毒含量对数值。

分别测定未经灭活处理组的病毒滴度和经过灭活处理组的病毒滴度，然后根据测定的病毒滴度计算灭活率，计算公式如下：

灭活率(％)＝(1-10^-x)×100％，

其中，X为灭活对数值，X＝未经灭活处理组的病毒含量对数值-实验组的病毒含量对数值。

以下制备例、对比制备例、实施例和对比例中，

造牙树脂粉：购自上海新世纪齿科材料有限公司，型号：造牙树脂II型-(自凝型)。

义齿基托树脂液：购自上海新世纪齿科材料有限公司，型号：义齿基托树脂II型(自凝型)。

502胶水：采用得力牌502强力胶。

病毒液：人类冠状病毒(HCoV-229E)疫苗株及其宿主细胞MRC-5细胞、流感病毒(甲型H1N1)及其宿主细胞MDCK细胞：均购自(ATCC)美国模式培养物集存库。

制备例1

(1)选用1ml的内旋螺纹冻存管，用直径0.45mm、长22mm的针头向冻存管的端盖中心扎两个通孔，两个通孔的间距为2mm；将管体与端盖旋紧，控制旋紧度，使旋紧后端盖的密封圈的厚度为其原始厚度的60％，得到端盖上设置有通孔的冻存管。

(2)将端盖上设置有通孔的冻存管置于环氧乙烷抗力仪中消毒，消毒处理的工艺参数为：环氧乙烷浓度为600mg/l，相对湿度为60％，消毒温度为54℃，消毒时间为60min，得到消毒后的冻存管。

(3)在P2级生物实验室的生物安全柜中，采用2ml的一次性无菌注射器(针头直径0.3mm，长4mm)，通过任意一个通孔向消毒后的冻存管中注入人类冠状病毒(HCoV-229E)病毒液，注入过程中，管内的气体通过另一个通孔排出，控制管内的气体残留量V：0≤V≤0.01ml。

(4)用镊子夹取干燥的无菌脱脂棉，将溢出的人类冠状病毒(HCoV-229E)病毒液吸附干净，然后静置5min，直至残留在端盖上的液体蒸发干。

(5)将造牙树脂粉和义齿基托树脂液混合(造牙树脂粉和义齿基托树脂液的重量比为2:1)，并用玻璃棒搅拌30s，得到树脂混合液；

然后将树脂混合液用5ml注射器(不带针头)注入到冻存管的端盖上的两个通孔内，控制树脂混合液的液位高出端盖的端面1～1.5mm，静置15min，得到密封的冻存管。

按照上述步骤，重复制备20支密封的冻存管，然后分别置于超高压设备中进行泄漏率测试，测试结果如表1所示。

制备例2

除了以下区别，其余条件与制备例1相同：

本制备例中，还包括：将密封的冻存管放入尼龙材质的透明包装袋，然后放入真空封口机(安盛科公司，DZQ-390C型)上进行抽真空、密封，得到带有包装袋的冻存管。封口机的参数设置为：抽真空时间30s、加热封口时间3s、冷却时间3.5s。

按照上述步骤，重复制备20支带有包装袋的冻存管，然后分别置于超高压设备中进行泄漏率测试，测试结果如表1所示。

对比制备例1

除了以下区别，其余条件与制备例1相同：

本对比制备例中，内旋螺纹冻存管的端盖上未设置通孔，直接将人类冠状病毒(HCoV-229E)病毒液注入管体内，然后旋紧端盖。

对比制备例2

除了以下区别，其余条件与制备例1相同：

本对比制备例中，控制管内的气体残留量V：0.01≤V≤0.05ml。

对比制备例3

除了以下区别，其余条件与制备例1相同：

本对比制备例中，控制管内的气体残留量V：0.05≤V≤0.1ml。

对比制备例4

除了以下区别，其余条件与制备例1相同：

本对比制备例中，采用橡胶垫和502胶水对冻存管的端盖上的两个通孔进行密封。

实施例1

(1)选用人类冠状病毒(HCoV-229E)疫苗株，按照制备例2的封装工艺进行封装，得到带有包装袋的冻存管。

(2)将带有包装袋的冻存管置于超高压设备(中国兵器工业第五二研究所自主设计研制的超高压增压机，工作压力为1000MPa)的高压容器内进行灭活处理。

其中，高压介质为癸二酸二辛酯。超高压设备的加压过程为：

1)将压力增加至300MPa，保压30s；

2)继续加压至500MPa，保压5min，随后泄压至10MPa，泄压速度为100MPa/s；

3)继续加压至700MPa，保压5min，随后泄压至0.1MPa，泄压速度为100MPa/s。

按照上述步骤，重复测试3次，得到带有包装袋的冻存管的泄漏率和人类冠状病毒(HCoV-229E)的灭活率，测试结果如表2所示。

实施例2

除了以下区别，其余条件与实施例1相同：

本实施例中，选用流感病毒(甲型H1N1)疫苗株。

对比例1

除了以下区别，其余条件与实施例1相同：

本实施例中，超高压设备的加压过程为：直接将压力增加至500MPa，保压10min，随后泄压至0.1MPa，泄压速度为100MPa/s。

表1

表2

由表1可以看出，采用制备例1和制备例2的封装工艺，冻存管在700MPa下的泄漏率控制在5％以内，远低于对比制备例1～4的冻存管的泄漏率，说明本发明的封装工艺能够提高冻存管在超高压力下的密封性，降低泄漏率。

由表2可以看出，实施例1对人类冠状病毒(HCoV-229E)的灭活率以及实施例2对流感病毒(甲型H1N1)的灭活率均达到99.996％。对比例1的冻存管的灭活率低于实施例1，说明加压过程对灭活率有影响。整体数据表明，本发明的传染性病毒液的灭活方法，能够有效对传染性病毒液进行灭活，且安全性较高。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种传染性病毒液的封装工艺，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取一支冻存管，所述冻存管包括相互旋紧的端盖和管体，所述端盖上设置有两个通孔，通过其中一个通孔向所述冻存管内注入传染性病毒液，同时通过另一个通孔排出气体，使所述冻存管内的气体残留量≤1vol％；

(2)擦拭溢出的传染性病毒液，静置至所述端盖的端面干燥；

(3)取造牙树脂粉和义齿基托树脂液混合，搅拌，得到树脂混合液；

(4)将树脂混合液填充至所述冻存管上的两个通孔中，静置10～30min，得到密封的冻存管；

其中，所述造牙树脂粉和义齿基托树脂液的重量比为1.95～2.3:1。

2.根据权利要求1所述的封装工艺，其特征在于，所述冻存管为内旋螺纹冻存管。

3.根据权利要求2所述的封装工艺，其特征在于，所述端盖与所述管体之间的旋紧度为：旋紧后，端盖的密封圈的厚度为其原始厚度的60％～70％。

4.根据权利要求3所述的封装工艺，其特征在于，所述冻存管在使用前采用环氧乙烷抗力仪进行消毒处理；

所述消毒处理的工艺参数为：环氧乙烷浓度为600mg/l，相对湿度为60％，消毒温度为54℃，消毒时间为60min。

5.根据权利要求1所述的封装工艺，其特征在于，步骤(3)中，所述搅拌时间为30s。

6.根据权利要求5所述的封装工艺，其特征在于，所述造牙树脂粉和义齿基托树脂液的重量比为2～2.1:1。

7.根据权利要求6所述的封装工艺，其特征在于，将树脂混合液填充至所述冻存管上的两个通孔中，使所述树脂混合液的液位高于端盖的端面1～1.5mm。

8.根据权利要求1～7任一项所述的封装工艺，其特征在于，还包括：将所述密封的冻存管放入尼龙材质的包装袋中，抽真空至相对真空度≤-0.1MPa，密封。

9.一种传染性病毒液的灭活方法，其特征在于，包括如下步骤：按照权利要求1～8任一项所述的封装工艺将传染性病毒液进行封装；然后置于超高压设备中，加压至500MPa以上进行灭活处理。

10.根据权利要求9所述的灭活方法，其特征在于，所述超高压设备的加压过程包括：

1)将压力增加至300～350MPa，保压30～60s；

2)继续加压至500～700MPa，保压5～8min，随后泄压至2～10MPa，泄压速度为100MPa/s；

3)继续加压至500～700MPa，保压5～8min，随后泄压至0.1MPa，泄压速度为100MPa/s。