CN114460313A - 一种包括血型卡和抗人球蛋白卡在内血型血清学分析卡及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，具体公开了一种包括血型卡和抗人球蛋白卡在内的血型血清学分析卡及其制备方法。本发明所述血型血清学分析卡利用一定直径PMMA微球形成分子筛的机制，实现了血型血清学的高效分析，同时本发明血型血清分析卡填充物粒径均一性高，耐温效果好，结果判读干扰小，人体环境模拟度高，对外技术依存度低且价格低廉，为血型鉴定、不规则抗体筛查和交叉配血试验提供保障。

Description

一种包括血型卡和抗人球蛋白卡在内血型血清学分析卡及其 制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，更具体的说是涉及一种包括血型卡和抗人球蛋白卡在内的血型血清学分析卡及其制备方法。
背景技术
输血是临床必不可少的治疗方法之一，主要用于改善缺氧和纠正凝血，安全有效的输血可快速缓解病情，为进一步治疗争取时间。但是，如果处置不当，输血也会引起多种不良反应，加重患者病情甚至威胁生命。因此，所有患者输血前均需进行包括血型鉴定、交叉配血和不规则抗体筛选在内的血型血清学分析，以确保输入受血者体内的红细胞和受者本身的红细胞不受损伤。具体内容如下：
输血前首先需要确认供血者与受血者ABO和Rh(D)血型，因为在各类血型系统中以A抗原和B抗原的抗原性最强，其次为D抗原。任何ABO血型不合的输血，几乎均产生特异性同种抗体。而D抗原不合的输血，有2/3的人可产生抗D抗体。因此在输血前必须确认受血者与供血者的ABO和Rh(D)血型，选择血型相合的供血者输注。根据方法不同血型鉴定又分为正定型和反定型。正定型是将待测者红细胞与血型抗体反应，检测待测者红细胞上是否含有对应血型抗原。反定型是将待测者血清与血型抗原反应，检测待测者血清内是否含有对应血型抗体。《临床输血技术规范》第十五条规定：“输血科(血库)要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO血型(正、反定型)，并常规检查患者Rh(D)血型(急诊抢救患者紧急输血时Rh(D)检查可除外)，正确无误时可进行交叉配血。”
交叉配血是指将供血者红细胞或血清分别与受血者血清或红细胞混合，观察有无凝集或溶血，两侧均不凝集或溶血方可输血。交叉配血试验的根本目的是输血前通过体外试验，预测输血后体内血液的相容性,以避免因血型抗原抗体反应引发的溶血性输血反应。根据目的不同，交叉配血试验又分为主侧配血和次侧配血。主侧配血是将受血者血清与供血者红细胞共孵育，检测受血者血清中是否含有可与供血者红细胞发生特异性反应的抗体。次侧配血是将供血者血清与受血者红细胞共孵育，检测供血者血清中是否含有可与受血者红细胞发生特异性反应的抗体。《临床输血技术规范》第十六条规定：“凡输注全血、浓缩红细胞、红细胞悬液、洗涤红细胞、冰冻红细胞、浓缩白细胞、手工分离浓缩血小板等患者，应进行交叉配血试验。”
人类血型抗体可分为不规则抗体和规则抗体两大类。不规则抗体主要是分子量较小的IgG，虽然能够结合红细胞上的抗原，但在盐水介质中不能使红细胞凝集。规则抗体能够在盐水介质中凝集相应的红细胞所以又称为盐水抗体，主要是分子量较大的IgM。抗体筛选是对受血者的血清进行常规检测，以发现能引起同种免疫性输血不良反应的不规则抗体。《临床输血技术规范》第十七条规定：“凡遇有下列情况必须按《全国临床检验操作规程》有关规定作抗体筛选试验：交叉配血不合时；对有输血史、妊娠史或短期内需要接收多次输血者。”
在国内外，虽然已有部分厂家发明了用于血型鉴定的血型卡，以及交叉配血和不规则抗体筛选的抗人球蛋白卡，但这些卡几乎均采用葡聚糖凝胶颗粒、葡聚糖凝胶颗粒基质和对应的抗体混合物作为填充物用于分离凝集与未凝集红细胞。但其具有如下缺陷：
(1)机械强度低，高速离心时易发生变形，所以要确保细胞筛孔径的稳定，只能在低速下通过延长离心时间达到应有的离心效果，进而降低检测速度；
(2)密度小、自润滑性差且凝聚作用弱，运输过程中的颠簸或颠倒可引发凝胶颗粒重新分布，最终导致细胞筛孔径变大，须重新离心后方能使用，无形中增加了用户的工作量；
(3)耐温性低，葡聚糖凝胶的溶胀率会随着环境温度的变化而发生改变，造成葡聚糖凝胶颗粒的粒径易变，直接导致细胞筛孔径忽大忽小，为了确保质量稳定，必须在2-25℃条件下运输或保存，给储存运输带来不便；
(4)粒径均一性差，生产葡聚糖凝胶的技术要求高，影响因素较多，进而导致葡聚糖凝胶颗粒的大小差异较大，对实验的稳定性造成影响。
(5)人体酸碱度模拟性不佳，葡聚糖凝胶颗的稳定性易受pH变化的影响，所以当前应用于血型血清学分析的葡聚糖凝颗粒体系的pH均在6.5～7.0之间，显著低于正常人体的7.35～7.45。而pH是影响抗原抗体反应的最重要因素之一。因此，在葡聚糖凝胶颗粒体系下的抗原抗体反应并不能完全代表体内环境中的抗原抗体反应。
(6)用于细胞分离的葡聚糖凝胶颗粒的生产工艺复杂，截止目前该技术只被欧美少数国家掌握，国内使用完全依赖于进口，使得国产血型卡和抗人球蛋白卡的对外技术依存度和价格较高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包括血型卡和抗人球蛋白卡在内的血型血清学分析卡及其制备方法，使得所述分析卡检测速度快、使用方便、储存运输条件简单、结果判读干扰小、填充物粒径均一性高、质量稳定、人体环境模拟度高、对外技术依存度低且价格低廉。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种包括血型卡和抗人球蛋白卡在内的血型血清学分析卡，由用于检测血型的微柱和/或用于筛查不规则抗体的微柱构成；
其中，所述用于检测血型的微柱包括填充有悬浮基质、单克隆IgM型抗A抗体和封闭过的PMMA(polymethylmethacrylate，聚甲基丙烯酸甲酯)微球的混合物的微柱1，填充有悬浮基质、单克隆IgM型抗B抗体和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱2，填充有悬浮基质、单克隆IgM型抗D抗体和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱3，以及填充有悬浮基质和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱4；
所述用于检测抗人球蛋白的微柱为填充有悬浮基质、抗人球蛋白抗体和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱5；
所述微柱1-4中的PMMA微球的直径为80-150μm，所述微柱5中的PMMA微球的直径为75-125μm；所述悬浮基质包括防腐剂、抗体稳定剂和缓冲液，其pH值处于人体正常范围。
与一般的将抗体或抗原通过表面基团包被在微球外表面不同，本发明是利用一定直径微球堆积在一起可以形成的对应大小的微球孔隙，结合离心作用，将单一的红细胞和多个红细胞凝集形成的凝块分离开来，发挥其细胞筛作用。例如：直径100μm的PMMA微球堆积在一起后，PMMA微球之间的孔隙可达到15μm左右。而单一红细胞的直径为6-9μm，在IgM型血型抗体作用下，可以将单一的红细胞凝集为由多个红细胞聚合而成的直径为50μm以上的凝块。因为PMMA微球的空隙只有15μm左右，所以只能允许直径在15μm以下的单一红细胞通过，而直径为50μm以上的红细胞凝块则无法通过，进而将两者分离。
不规则抗体筛查实验实现原理与上述类似。直径100μm的PMMA微球堆积在一起后，PMMA微球之间的孔隙可达到15μm左右。虽然不规则抗体属于IgG型，只能与单一红细胞上的抗原发生连接，不能同时结合多个红细胞。但IgM型抗人球蛋白抗体可以同时结合多个红细胞上的不规则抗体，进而将结合有不规则抗体的多个红细胞连接在一起，形成直径为50μm以上的凝块。因为PMMA微球的空隙只有15μm左右，所以只能允许直径在15μm以下的单一红细胞通过，而直径为50μm以上的红细胞凝块则无法通过，进而将两者分离。
本发明中的PMMA微球在与悬浮基质和抗体混合之前需经过封闭处理，主要原因在于未封闭处理的PMMA微球会非特异性结合红细胞，进而产生假阳性或假阴性实验结果。举例说明如下：理论上讲，如果对不含不规则抗体的标本开展不规则抗体筛查实验，因为没有不规则抗体的参与，红细胞不会发生聚集，在离心力的作用下，未发生聚集的红细胞会沉降至微柱底部，结果应为阴性。但是，因为未封闭处理的PMMA微球会非特异性结合红细胞，导致原本经过离心处理即可沉至管底的红细胞依然位于微柱的上层或中部，进而产生假阳性结果。不仅如此，即便含有不规则抗体的标本开展不规则抗体筛查实验，因为未封闭处理的PMMA微球会非特异性结合红细胞，在离心力的作用下，非特异性结合于PMMA微球的红细胞会随着PMMA微球的少许下移发生假性下沉，进而产生假阴性结果。为了避免上述假阳性和假阴性结果的出现，本发明使用封闭液对PMMA微球进行预处理，让封闭液中的蛋白首先与PMMA微球的空白位置结合，“占有”非特异性结合位点，避免未封闭处理的PMMA微球结合红细胞，进而解决假阳性和/或假阴性实验结果的干扰。作为优选，所述封闭液采用脱脂奶粉，牛血清白蛋白、胎牛血清、小牛血清或任意组合，本发明也不排除其他可同样实现封闭作用的物质。
此外，高速离心条件不会对本发明新型血型血清学分析卡的实验结果造成影响，但市售葡聚糖凝胶分析卡会在高速离心条件下受到影响，故葡聚糖凝胶分析卡一般离心速度都较低，时间较长，与之相比能够高速离心的本发明新型血型血清学分析卡的检测速度更快。
同时，市售葡聚糖凝胶分析卡经颠簸后，在使用前必须再次离心方可使用。而本发明新型血型血清学分析卡经颠簸后，只要垂直静置2分钟即可再次使用，无需离心处理。因此，与传统的葡聚糖凝胶分析卡相比，新型血型血清学分析卡使用更方便。
在低温、常温和高温的耐温试验中，市售葡聚糖凝胶分析卡储存温度低至-20℃或高至40℃时，均会对凝胶质量产生影响，出现假阳性结果；而本发明的血型血清分析卡并未出现假阳性或假阴性结果。不仅如此，本发明分析卡的视野更干净，颜色对比更加明显。这些结果说明，与传统的葡聚糖凝胶分析卡相比，本发明新型血型血清学分析卡的耐温性更好，结果判读时干扰更小。
此外，本发明新型血型血清学分析卡微柱内填充物粒径均一性检测实验结果显示，传统的葡聚糖凝胶分析卡填充物的粒径分布在20～120μm，而本发明分析卡微柱填充物的粒径分布在70～120μm。该结果说明新型血型血清学分析卡填充物的粒径均一性优于葡聚糖凝胶分析卡填充物。
作为优选，所述悬浮基质包括防腐剂、抗体稳定剂和缓冲液，其pH值处于人体正常范围。在本发明具体实施方式中，所述悬浮基质包括2-4g/L NaN3、2-5g/L脱脂奶粉、8-10g/L Glycine、1.8-2.0g/L NaCl、0.1-0.2g/L KCl、80-120ml Tris-Hcl缓冲液，pH值为7.35-7.45。
各血型抗体在确定效价时，应用不同体积比稀释的各血型抗体与对应的各血型红细胞混匀，以有肉眼可见凝集为标准确定效价；在本发明具体实施方式中，应用体积比1:128稀释的单克隆IgM型抗A抗体与A型红细胞混匀，300g离心2min后振荡，有肉眼可见凝集为抗A抗体的标准；应用体积比1:128稀释的单克隆IgM型抗B抗体与B型红细胞混匀，300g离心2min后振荡，有肉眼可见凝集为抗B抗体的标准；应用体积比1:64稀释的单克隆IgM型抗D抗体与Rh D阳性红细胞混匀，300g离心2min后振荡，有肉眼可见凝集为抗D抗体的标准；因此，所述IgM型抗A抗体效价≥128，IgM型抗B抗体效价≥128，IgM型抗D抗体效价≥64。
在本发明具体实施方式中，所述微柱1中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g和IgM型抗A抗体100-200ml，所述微柱2中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g和IgM型抗B抗体100-200ml，所述微柱3中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g和IgM型抗D抗体100-200ml，所述微柱4中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g。
在本发明具体实施方式中，所述微柱1-3的个数均为1，所述微柱4的个数为3。
不规则抗体IgG抗体在确定效价时，应用不同体积比的IgM型抗人球蛋白抗体，与IgG致敏的红细胞混匀，有肉眼可见凝集为标准；在本发明具体实施方式中，应用体积比1:64稀释的IgM型抗人球蛋白抗体，与体积比1:8稀释的IgG致敏的红细胞混匀，300g离心10min后振荡，有肉眼可见凝集为标准；因此，所述抗人球蛋白抗体效价≥64。
在本发明具体实施方式中，所述微柱5中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g和抗人球蛋白抗体100-200ml；微柱5的个数为6个。
同时，本发明还提供了所述分析卡的制备方法，按照微柱1-5的填充物组成，用悬浮基质、各血型抗体、封闭过的PMMA微球和抗人球蛋白抗体混合配制，填充于各微柱中。
作为优选，所述制备方法分为用于血型检测的微柱制备，以及用于筛查不规则抗体的微柱制备；
用于血型检测的微柱制备包括以下步骤：
(1)PMMA微球悬浮基质的配制：应用蒸馏水将NaN3、脱脂奶粉、Glycine、NaCl、KCl、Tris-Hcl缓冲液按比例溶解配制PMMA微球悬浮基质；
(2)目标PMMA微球的筛选：使用筛网筛选出目标PMMA微球；
(3)PMMA微球的封闭：首先应用封闭液(2-10％脱脂奶粉溶液、2-10％牛血清白蛋白溶液、2-10ml/L胎牛血清或2-10ml/L小牛血清等)将PMMA微球在25℃下浸泡1小时，然后1000g离心5分钟并弃掉上清，接着使用PMMA微球悬浮基质按照相同条件洗涤三次后备用；
(4)血型抗体的选择：分别应用A型红细胞、B型红细胞和Rh D阳性红细胞选择目标单克隆IgM型抗A抗体、单克隆IgM型抗B抗体和单克隆IgM型抗D抗体；
(5)各血型抗体和PMMA微球混合物的配制：将配制好的PMMA微球悬浮基质、封闭过的PMMA微球和对应的血型抗体按一定比例混合，分别配制成不同血型抗体和PMMA微球的混合物；
(6)PMMA微球悬浮物的制备：将配制好的PMMA微球悬浮基质和的封闭过的PMMA微球按一定比例混合，配制成PMMA微球悬浮物；
(7)罐装和封口。
用于筛查不规则抗体的微柱制备包括以下步骤：
(1)悬浮基质的配制：与前述用于血型检测的微柱制备步骤(1)相同；
(2)目标PMMA微球的筛选：使用筛网筛选出目标PMMA微球；
(3)PMMA微球的封闭：与前述用于血型检测的微柱制备步骤(3)相同；
(4)抗人球蛋白抗体的选择：应用IgG致敏的红细胞选择目标抗人球蛋白抗体；
(5)PMMA微球和抗人球蛋白抗体混合物的配制：将配制好的PMMA微球悬浮基质、封闭过的PMMA微球和筛选出的抗人球蛋白抗体按一定比例混合，配制成PMMA微球和抗人球蛋白抗体混合物；
(6)罐装和封口。
由以上技术方案可知，本发明利用一定直径PMMA微球形成分子筛的机制，实现了血型血清学的高效分析，同时本发明血型血清分析卡填充物粒径均一性高，耐温效果好，结果判读干扰小，人体环境模拟度高，对外技术依存度低且价格低廉，为血型鉴定、不规则抗体筛选和交叉配血试验提供保障。
附图说明
图1所示为本发明新型抗人球蛋白卡高速离心验证的实验结果；A.葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡正常条件离心的实验结果；B.葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡高速离心的实验结果；C.新型抗人球蛋白卡高速离心的实验结果；
图2所示为本发明PMMA微球封闭效果验证的实验结果；A.葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡的实验结果；B.使用未经封闭预处理的PMMA微球制备的新型抗人球蛋白卡的实验结果；C.使用经封闭预处理的PMMA微球制备的新型抗人球蛋白卡的实验结果；
图3所示为本发明新型抗人球蛋白卡抗颠簸验证的实验结果；A.葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡内填充物的正常分布及形状；B.葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡经旋转处理并垂直静置2分钟后内部填充物的分布及形状；C.葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡经旋转处理并垂直静置24小时后内部填充物的分布及形状；D.葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡经旋转处理并重新离心后内部填充物的分布及形状；E.新型抗人球蛋白卡内填充物的正常分布及形状；F.新型抗人球蛋白卡经旋转处理并垂直静置2分钟后内部填充物的分布及形状；G.新型抗人球蛋白卡经旋转处理并垂直静置24小时后内部填充物的分布及形状；
图4所示为本发明新型抗人球蛋白卡耐温验证的实验结果；A.10℃放置葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡的实验结果；B.40℃放置葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡的实验结果；C.-20℃放置葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡的实验结果；D.10℃放置新型抗人球蛋白卡的实验结果；E.40℃放置新型抗人球蛋白卡的实验结果；F.-20℃放置新型抗人球蛋白卡的实验结果；
图5所示为本发明新型抗人球蛋白卡填充物粒径均一性检测结果；A.葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡内填充物的镜下观察，B.新型抗人球蛋白卡内填充物的镜下观察。
具体实施方式
本发明公开了一种包括血型卡和抗人球蛋白卡在内的血型血清学分析卡及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述分析卡及其制备方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述分析卡及其制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所提供的对比试验各处理组所采用的原料、试剂，除去应有的区别外其他试验条件保持一致。本发明所涉及原料、试剂等，如无特殊说明均可通过市售途径获得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：制备本发明血型血清学分析卡
1、血型卡(用于ABO和Rh D血型检测)的制备
所述血型卡由6个微柱组成，其中前3个依次分装有IgM型抗A抗体和聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)微球混合物、IgM型抗B抗体和PMMA微球混合物，以及IgM型抗D抗体和PMMA微球混合物，后3个均分装有PMMA微球悬浮物。具体实施包括以下步骤：
(1)PMMA微球悬浮基质的配制
应用蒸馏水将下述溶质按各自比例溶解：
Figure BDA0002980223040000091
调PH为7.35-7.45后混匀；
(2)直径80-150μm PMMA微球的筛选
应用180目和100目的筛网筛选出直径在80-150μm的PMMA微球；
(3)PMMA微球的封闭处理
应用PMMA微球悬浮基质配制封闭液；
应用封闭液将PMMA微球在25℃下浸泡1小时；
应用1000g离心5分钟并弃掉上清；
应用PMMA微球悬浮基质洗涤三次(1000g离心5分钟)后备用；
(4)血型抗体的选择
应用体积比1:128稀释的单克隆IgM型抗A抗体与A型红细胞混匀，1000g离心2min后振荡，有肉眼可见凝集为抗A抗体的标准；
应用体积比1:128稀释的单克隆IgM型抗B抗体与B型红细胞混匀，1000g离心2min后振荡，有肉眼可见凝集为抗B抗体的标准；
应用体积比1:64稀释的单克隆IgM型抗D抗体与RhD阳性红细胞混匀，1000g离心2min后振荡，有肉眼可见凝集为抗D抗体的标准；
(5)各血型抗体和PMMA微球混合物的制备
应用PMMA微球悬浮基质将下述物质按各自比例混匀：
Figure BDA0002980223040000101
(6)PMMA微球悬浮物的制备
应用PMMA微球悬浮基质与封闭过的直径为80-150μm的PMMA微球(400-600g/L)混匀；
(7)血型抗体和PMMA微球混合物，以及PMMA微球悬浮物的罐装
用注射器分别吸取步骤(4)制备的单克隆IgM型抗A抗体和PMMA微球混合物、单克隆IgM型抗B抗体和PMMA微球混合物、以及单克隆IgM型抗D抗体和PMMA微球混合物，按照每孔80μL的量从管底依次注入前3个微柱。用注射器吸取步骤(6)制备的PMMA微球悬浮物，按照每孔80μL的量从管底注入后3个微柱；
(8)封口
用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。
2、抗人球蛋白卡(用于筛查不规则抗体)的制备
所述抗人球蛋白卡由6个微柱组成，其中每个微柱均分装有抗人球蛋白抗体和PMMA微球混合物。具体实施包括以下步骤：
(1)PMMA微球悬浮基质的配制
与上述PMMA微球悬浮基质的配制相同；
(2)直径75-125μmPMMA微球的筛选
应用200目和120目的筛网筛选出直径在75-125μm的PMMA微球；
(3)PMMA微球的封闭
与上述PMMA微球的封闭相同；
(4)抗人球蛋白抗体的选择
应用体积比1:64稀释的IgM型抗人球蛋白抗体，与体积比1:8稀释的IgG致敏的红细胞混匀，1000g离心10min后振荡，有肉眼可见凝集为标准；
(5)抗人球蛋白抗体和PMMA微球混合物的制备
应用PMMA微球悬浮基质将下述物质按各自比例混匀：
封闭过的直径为75-125μm的PMMA微球 400-600g/L
效价≥64的抗人球蛋白抗体 100-200ml/L
(6)抗人球蛋白抗体和PMMA微球混合物的灌装
用注射器吸取步骤(5)制备的抗人球蛋白抗体和PMMA微球混合物，按照每孔80μL的量从管底注入6个微柱；
(7)封口
用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封备用。
实施例2：本发明新型抗人球蛋白卡高速离心适用验证
所述新型抗人球蛋白卡通过实施例1方法制备，传统葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡购自市面，所用葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡均为同一种。
(1)不规则抗体筛查阴阳性检测
正常离心：取一张葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡作为对照组，前两孔作为阳性对照分别加入经Coombs试验确认过的不规则抗体筛查阳性血浆和对应的不规则抗体筛查细胞，后两孔作为阴性对照分别加入经Coombs试验确认过的不规则抗体筛查阴性血浆和对应的不规则抗体筛查细胞，37℃孵育15分钟后，采用厂家推荐条件离心处理(100g，离心9分钟)；
高速离心：取另一张葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡作为实验组1，前两孔作为阳性对照分别加入与步骤(1)相同的不规则抗体筛查阳性血浆和不规则抗体筛查细胞，后两孔作为阴性对照分别加入与步骤(1)相同的不规则抗体筛查阴性血浆和不规则抗体筛查细胞，37℃孵育15分钟后进行高速离心处理(300g，离心2分钟)；
取一张新型抗人球蛋白卡作为实验组2，前两孔作为阳性对照分别加入与步骤(1)相同的不规则抗体筛查阳性血浆和不规则抗体筛查细胞，后两孔作为阴性对照分别加入与步骤(1)相同的不规则抗体筛查阴性血浆和不规则抗体筛查细胞，37℃孵育15分钟后进行高速离心处理(300g，离心2分钟)；
(2)实验结果及分析
新型抗人球蛋白卡高速离心验证实验结果如图1所示。与对照组(图1A)相比，虽然实验组1阳性孔内的红细胞位于凝胶上层，但阴性孔内的红细胞却分布于凝胶的中部和底部(图1B)，该结果提示在高速离心条件下，使用葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡开展不规则抗体筛查实验可能会出现假阳性。而实验组2结果与对照组相同，阳性孔内的红细胞依然位于PMMA微球上层，且阴性孔内的红细胞也还位于PMMA微球底部(图1C)，该结果证明，高速离心条件不会对新型抗人球蛋白卡的不规则抗体筛查实验造成影响。综合分析这些实验结果可以得出，新型抗人球蛋白卡可耐受高速离心，但葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡不能。因为要达到相同的离心效果，提高离心速度可以降低离心时间，因此，与传统的葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡相比，使用新型抗人球蛋白卡开展不规则抗体筛查的检测速度更快。
实施例3：PMMA微球封闭效果验证
所述新型抗人球蛋白卡通过实施例1方法制备，传统葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡购自市面，所用葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡均为同一种。
(1)不规则抗体筛查阴阳性检测
取一张葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡作为对照组，前一孔作为阳性对照分别加入经Coombs试验确认过的不规则抗体筛查阳性血浆和对应的不规则抗体筛查细胞，后一孔作为阴性对照分别加入经Coombs试验确认过的不规则抗体筛查阴性血浆和对应的不规则抗体筛查细胞，37℃孵育15分钟后，采用厂家推荐条件离心处理(100g，离心9分钟)；
取一张经封闭处理的PMMA微球制备的新型抗人球蛋白卡作为实验组1，前一孔作为阳性对照分别加入与步骤(1)相同的不规则抗体筛查阳性血浆和不规则抗体筛查细胞，后一孔作为阴性对照分别加入与步骤(1)相同的不规则抗体筛查阴性血浆和不规则抗体筛查细胞，37℃孵育15分钟后进行高速离心处理(300g，离心2分钟)；
取另一张未经封闭处理，但其他工艺相同的PMMA微球制备的新型抗人球蛋白卡作为实验组2，前一孔作为阳性对照分别加入与步骤(1)相同的不规则抗体筛查阳性血浆和不规则抗体筛查细胞，后一孔作为阴性对照分别加入与步骤(1)相同的不规则抗体筛查阴性血浆和不规则抗体筛查细胞，37℃孵育15分钟后进行高速离心处理(300g，离心2分钟)；
(2)实验结果及分析
PMMA微球封闭效果验证实验结果如图1所示。与对照组(图2A)相比，实验组1阳性孔内的红细胞位于PMMA微球上层和中部，且阴性孔内的红细胞分布于PMMA微球的中部和底部(图2B)，该结果提示使用未经封闭处理的PMMA微球制备的新型抗人球蛋白卡开展不规则抗体筛查实验会出现假阳性和假阴性结果。而实验组2结果与对照组相同，阳性孔内的红细胞依然位于PMMA微球上层，且阴性孔内的红细胞也还位于PMMA微球底部(图2C)，该结果证明，封闭预处理可解决上述假阴性和假阳性实验结果的问题。
实施例4：本发明新型抗人球蛋白卡抗颠簸验证
所述新型抗人球蛋白卡通过实施例1方法制备，传统葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡购自市面，所用葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡均为同一种。
(1)颠簸模拟
取一张葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡正常条件离心后作为对照组1。取一张新型抗人球蛋白卡垂直放置5分钟后作为对照组2。分别另取一张葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡和新型抗人球蛋白卡作为实验组1和实验组2，将实验组1和实验组2的抗人球蛋白卡一同固定于多用途旋转摇床，每分钟60次，旋转30秒；
(2)填充物形状及分布观察
拍照观察对照组1和对照组2的卡内填充物的分布情况。将实验组1和实验组2的抗人球蛋白卡从多用途旋转摇床取下，分别垂直静置2分钟和24小时后拍照观察，再将实验组1的抗人球蛋白卡正常离心处理后拍照观察；
(3)实验结果及分析
新型抗人球蛋白卡抗颠簸验证实验结果如图2所示。与对照组1(图3A)相比，经旋转处理并垂直静置2分钟后，葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡内填充物已由垂直于管底的规则柱形变为随机粘附于管壁的不规则片状(图3B)，而且即便将垂直静置时间由2分钟延长至24小时，随机贴于管壁的不规则片状凝胶的位置依然未发生改变(图3C)，只有将分析卡重新离心处理后才能重新恢复至之前的规则柱形(图3D)。该结果说明颠簸会导致葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡内填充物发生分离，且需离心后才能重新结合为规则柱形。
和上述实验结果不同，与对照组2(图3E)相比，不仅经旋转处理并垂直静置24小时后，新型抗人球蛋白卡内填充物可恢复至之前的规则柱形(图3F)，而且在垂直静置2分钟后，其卡内填充物已恢复至之前的规则柱形(图3G)。该结果说明不需要离心处理，仅垂直静置2分钟即可将卡内填充物恢复至之前的规则柱形。
这些实验结果提示，葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡经颠簸后，在使用前必须再次离心方可使用。而新型抗人球蛋白卡经颠簸后，只要垂直静置2分钟即可再次使用，无需离心处理。因此，与传统的葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡相比，新型抗人球蛋白卡使用更方便。
实施例5：本发明新型抗人球蛋白卡耐温验证
所述新型抗人球蛋白卡通过实施例1方法制备，传统葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡购自市面，所用葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡均为同一种。
(1)葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡和新型抗人球蛋白卡的前期准备
取三张葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡，分别作为对照组1在10℃放置24小时、实验组1在-20℃放置24小时、实验组2在40℃放置24小时。取三张新型抗人球蛋白卡，分别作为对照组2在10℃放置24小时、实验组3在-20℃放置24小时、实验组4在40℃放置24小时；
(2)不规则抗体筛查阴阳性检测
将上述对照组1、对照组2、实验组1、实验组2、实验组3和实验组4的共计六张抗人球蛋白卡放置25℃平衡30分钟。每张卡的前两孔作为阳性对照分别加入经Coombs试验确认过的不规则抗体筛查阳性血浆和对应的不规则抗体筛查细胞，后两孔作为阴性对照分别加入经Coombs试验确认过的不规则抗体筛查阴性血浆和对应的不规则抗体筛查细胞，37℃孵育15分钟后，葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡采用厂家推荐条件离心处理(100g，离心9分钟)，新型抗人球蛋白卡采用高速离心处理(300g，离心2分钟)；
(3)实验结果及分析
葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡耐温验证实验结果如图4所示。与对照组1(图4A)相比，虽然实验组1阳性孔内的红细胞位于凝胶上层，但阴性孔内的红细胞却分布于凝胶的中部和底部(图4B)，而且实验组2与实验组1类似，阳性孔内的红细胞位于凝胶上层，阴性孔内的红细胞分布于凝胶的中部和底部(图4C)，该结果提示储存温度低至-20℃或高至40℃时，均会对凝胶质量产生影响，出现假阳性实验结果。但是，与对照组1相比，不仅对照组2阳性孔内的红细胞位于PMMA微球上层，阴性孔内的红细胞位于PMMA微球底部(图4D)，而且实验组3(图4E)和实验组4(图4F)阳性孔内的红细胞也均位于PMMA微球上层，阴性孔内的红细胞也均位于PMMA微球底部，并未出现假阳性或假阴性实验结果。不仅如此，与对照组1相比，对照组2、实验组3和实验组4的视野更清晰，颜色对比更加明显。这些实验结果说明，与传统的葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡相比，新型抗人球蛋白卡的耐温性更好，结果判读时干扰更小。
实施例6：本发明新型抗人球蛋白卡填充物粒径均一性检测
所述新型抗人球蛋白卡通过实施例1方法制备，传统葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡购自市面，所用葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡均为同一种。
(1)填充物观察
将葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡(对照组)和新型抗人球蛋白卡(实验组)内填充物取出，涂片后显微镜下拍照观察；
(2)实验结果及分析
新型抗人球蛋白卡填充物粒径均一性检测实验结果如图4所示。对照组填充物的粒径分布在20～120μm(图5A)，而实验组填充物的粒径分布在70～120μm(图5B)。该结果说明新型抗人球蛋白卡填充物的粒径均一性优于葡聚糖凝胶抗人球蛋白卡填充物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种包括血型卡和抗人球蛋白卡在内的血型血清学分析卡，其特征在于，由用于检测血型的微柱和/或用于筛查不规则抗体的微柱构成；
其中，所述用于检测血型的微柱包括填充有悬浮基质、单克隆IgM型抗A抗体和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱1，填充有悬浮基质、单克隆IgM型抗B抗体和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱2，填充有悬浮基质、单克隆IgM型抗D抗体和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱3，以及填充有悬浮基质和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱4；
所述用于检测抗人球蛋白的微柱为填充有悬浮基质、抗人球蛋白抗体和封闭过的PMMA微球的混合物的微柱5；
所述微柱1-4中的PMMA微球的直径为80-150μm，所述微柱5中的PMMA微球的直径为75-125μm；
所述微柱1-5中的PMMA微球均经过封闭处理；
所述悬浮基质包括防腐剂、抗体稳定剂和缓冲液，其pH值处于人体正常pH值范围。
2.根据权利要求1所述分析卡，其特征在于，所述悬浮基质包括NaN3、脱脂奶粉、Glycine、NaCl、KCl、Tris-Hcl缓冲液，其pH值处于人体正常范围。
3.根据权利要求2所述分析卡，其特征在于，所述悬浮基质包括2-4g/L NaN3、2-5g/L脱脂奶粉、8-10g/L Glycine、1.8-2.0g/L NaCl、0.1-0.2g/L KCl、80-120ml Tris-Hcl缓冲液，pH值为7.35-7.45。
4.根据权利要求1所述分析卡，其特征在于，所述IgM型抗A抗体效价≥128，IgM型抗B抗体效价≥128，IgM型抗D抗体效价≥64。
5.根据权利要求1或4所述分析卡，其特征在于，所述微柱1中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g和IgM型抗A抗体100-200ml，所述微柱2中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g和IgM型抗B抗体100-200ml，所述微柱3中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g和IgM型抗D抗体100-200ml，所述微柱4中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g。
6.根据权利要求1所述分析卡，其特征在于，所述抗人球蛋白抗体效价效价≥64。
7.根据权利要求1或6所述分析卡，其特征在于，所述微柱5中每升混合物含有封闭过的PMMA微球400-600g和抗人球蛋白抗体100-200ml。
8.权利要求1所述分析卡的制备方法，其特征在于，按照微柱1-5的填充物组成，用悬浮基质、各血型抗体、封闭过的PMMA微球和抗人球蛋白抗体混合配制，填充于各微柱中。
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