CN114457086A

CN114457086A - 白介素1受体拮抗蛋白的表达盒以及基于aav的基因递送系统

Info

Publication number: CN114457086A
Application number: CN202210203864.8A
Authority: CN
Inventors: 吴侠; 周凯艺; 肖啸; 郑静; 袁梦; 孙嘉宝; 郑浩; 陈慧; 蒋威; 杜增民
Original assignee: Shanghai Mianyi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Mianyi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-03-02
Also published as: WO2023165477A1; CN114457086B

Abstract

本发明涉及编码白介素1受体拮抗蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的转基因表达盒、包含该转基因表达盒的基因递送系统及其应用。本发明的转基因表达盒和基因递送系统可用于治疗可通过阻断IL‑1信号通路而改善的各种疾病，包括恶性肿瘤和炎症疾病，如关节炎症，特别是骨性关节炎。

Description

白介素1受体拮抗蛋白的表达盒以及基于AAV的基因递送系统

技术领域

本公开涉及编码白介素1受体拮抗蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的转基因表达盒、包含该转基因表达盒的基因递送系统及其应用。

背景技术

白介素1(IL-1)是一个多效性的细胞因子，主要影响炎症和免疫反应，也调节机体其它生理功能，对疾病的发病机制有重要影响。IL-1在急性炎症疾病(如败血性休克)、慢性炎症疾病(如类风湿关节炎)和恶性肿瘤中的水平均升高。IL-1由巨噬细胞分泌，启动炎性反应。此外，研究表明，IL-1在肿瘤生成中起重要作用(Krelin Y等，Cancer Res，2007；67(3):1062–1071)。IL-1家族主要包括IL-1α和IL-1β。IL-1β在正常生理情况下不产生，只在炎性信号下分泌；而IL-1α在正常生理情况下存在于细胞质中和细胞膜上，在炎症发生时，它的表达水平升高(WU X等，Chinese journal of lung cancer，2010；13(12):1145-1148)。

白介素1受体拮抗蛋白(IL-1Ra或IL1RA)是天然存在的IL-1β抑制蛋白分子，它可与细胞表面的IL1受体结合而不启动信号转导，从而竞争性阻断IL1的信号通路。将编码IL-1Ra的cDNA导入患者靶组织的细胞中，以实现目的蛋白IL-1Ra的表达，从而起到治疗作用。研究表明，重组的IL-1Ra可以减小鼠肿瘤的体积，抑制肿瘤介导的新血管生成(Bar D等，FASEB J.，2004；18(1):161–163)。Anakinra是一款已经上市的重组IL-1Ra，用于治疗骨性关节炎(OA)，但由于药物半衰期短，难以维持有效的治疗浓度，因此它对于OA的治疗效果并不理想。此外，反复注射也会给患者带来诸多不便和痛苦。

骨性关节炎(OA)是一种常见的关节疾病。据统计，60岁以上的老年人群中男性约占比10％，而女性约18％，临床上主要表现为关节疼痛，僵直，严重甚至引起关节功能完全丧失，这给患者家庭和社会带来沉重的人力和财力负担。骨性关节炎的发病机制是复杂多样的，研究表明该疾病是由遗传、生物(包括衰老、炎症等)和生物力学等多种因素共同作用导致的，迄今为止还没有一种有效的治疗方法。

骨性关节炎发病过程中最常见的症状是产生滑膜炎症。关节炎症会引起促炎因子如白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNFα)等的生成，进而加剧OA的发生发展。尽管OA的发病机制尚未阐明，但白介素-1作为促炎因子在骨性关节炎发展中起关键作用。在关节中，IL-1β是由软骨细胞、成骨细胞、滑膜细胞和单核细胞合成，并通过与膜受体IL-1受体(IL-1R)结合而发挥作用。另外，IL-1β通过激活转录核因子κB(NF-κB)、p38MAPK和c-Jun N-端激酶及其下游信号通路，减少软骨细胞中关键细胞外基质蛋白(II型胶原蛋白和蛋白聚糖)以及刺激基质降解蛋白酶(MMP-3和ADAMTS-4)的生成。IL-1β还可以通过上调软骨细胞中Bcl-2蛋白家族成员、线粒体去极化以及产生活性氧诱导软骨细胞的凋亡。因此，阻断IL-1的信号通路成为研究治疗OA的热门靶标。

目前，许多病毒载体已被用于基因治疗，包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒以及腺相关病毒(AAV)。但逆转录病毒、慢病毒、腺病毒出于安全和技术等方面考虑并不适合大规模生产应用，而具有低免疫原性的AAV目前已得到了广泛认可。AAV具有较好的安全性和高效的感染效率，以及介导基因长期表达的特点。目前，已有AAV介导的基因治疗药物获得审批，AAV载体是较理想的基因治疗工具。

尽管AAV具有较低的免疫原性，但临床上常报道系统性给药AAV后会引发的较重免疫反应，这大部分是由于使用较高的剂量所引起的。对于OA，关节腔局部注射病毒载体能有效避开系统性给药引起的不良反应。通过增加转录的蛋白表达水平，可以降低病毒载体用量，并保持高水平的外源基因表达。

因此，为了更有效地阻断IL1的信号通路，从而实现对恶性肿瘤和/或炎症疾病(如关节炎症，特别是骨性关节炎)更好的治疗效果，期望获得表达水平更高的IL-1Ra编码序列以及表达盒。

发明内容

为了解决上述技术问题，在第一方面，本公开提供一种编码白介素1受体拮抗蛋白的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少50％的同一性，优选具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

在一个实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

本公开的编码人源白介素1受体拮抗蛋白的核酸分子包含经密码子优化的人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸序列(SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)，与未经密码子优化的原始人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸序列(SEQ ID NO：6)相比，经密码子优化的人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸序列(SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)具有更高的白介素1受体拮抗蛋白表达水平。

在第二方面，本公开提供一种转基因表达盒，其包括：启动子、根据第一方面所述的核酸分子、polyA。

在一个优选实施方式中，polyA为bGH polyA(SEQ ID NO：2)。

在一个实施方式中，启动子选自：CB启动子、CAG启动子、SV40启动子、胶原蛋白collagen启动子、蛋白聚糖aggrecan启动子、滑膜蛋白基因启动子、脂肪组织特异性启动子PPAR白基因启动子、转录因子SOX9启动子和骨钙蛋白启动子。在一个优选实施方式中，启动子为CB启动子(SEQ ID NO：1)。

在一个实施方式中，转基因表达盒还包括：位于启动子之后的内含子(简称为启动子后内含子)，和/或位于两端的两个ITR，所述两个ITR各自独立地为正常ITR或缩短ITR。在一个优选实施方式中，位于启动子之后的内含子选自：SV40内含子(SEQ ID NO：3)、VH4内含子(SEQ ID NO：4)、Chi内含子(SEQ ID NO：5)、U12内含子、RHD内含子等1类内含子。在一个更优选实施方式中，位于启动子之后的内含子为SV40或VH4。

在一个优选实施方式中，启动子为CB启动子，位于启动子之后的内含子为VH4。在一个优选实施方式中，启动子为CB启动子，位于启动子之后的内含子为SV40。

在一个实施方式中，转基因表达盒还包括：插入至根据第一方面所述的核酸分子中的至少一个(例如，1个或2个)内含子。在一个优选实施方式中，插入的内含子选自：SV40内含子、VH4内含子和Chi内含子。本发明人发现，插入这样的内含子可以更好地提高目的蛋白质(白介素1受体拮抗蛋白)的表达和分泌。

在一个实施方式中，转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示，优选SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：19，更优选SEQ ID NO：19。

在第三方面，本公开提供一种基因递送系统，其包括：根据第二方面所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。

在一个实施方式中，上述AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白。在一个优选实施方式中，AAV选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ和AAV843。在一个更优选实施方式中，AAV衣壳蛋白为AAV843，其氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。

本公开的转基因表达盒和基因递送系统可以表达更高水平的白介素1受体拮抗蛋白(IL1RA)，从而阻断IL-1的信号通路，实现对恶性肿瘤以及炎症疾病(如关节炎症，特别是骨性关节炎)更好的治疗效果。此外，本公开的基因递送系统可以实现治疗性蛋白质的长效稳定递送。

在第四方面，本公开提供根据第一方面所述的核酸分子、根据第二方面所述的转基因表达盒或根据第三方面所述的基因递送系统在制备用于治疗疾病的药物中的应用，所述疾病为可通过阻断IL-1信号通路而改善的疾病，如急性炎症疾病、慢性炎症疾病和恶性肿瘤。

在一个优选实施方式中，疾病为关节炎症，包括骨性关节炎(OA)、类风湿关节炎(RA)、滑膜炎、血友病关节炎和其他炎症引起的关节炎症。

在一个更优选实施方式中，疾病为骨性关节炎(OA)。

在第五方面，本公开提供一种药物，其包含：根据第一方面所述的核酸分子、根据第二方面所述的转基因表达盒或根据第三方面所述的基因递送系统；以及赋形剂。

在一个实施方式中，赋形剂包括盐、有机物和/或表面活性剂。

在一个实施方式中，药物用于治疗可通过阻断IL-1信号通路而改善的疾病。在一个优选实施方式中，疾病为急性炎症疾病、慢性炎症疾病和/或恶性肿瘤。在一个更优选实施方式中，疾病为关节炎症，包括骨性关节炎(OA)、类风湿关节炎(RA)、滑膜炎、血友病关节炎和其他炎症引起的关节炎症。

在第六方面，本公开提供一种治疗疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第五方面所述的药物，所述疾病选自急性炎症疾病、慢性炎症疾病和恶性肿瘤。

在一个更优选实施方式中，疾病为骨性关节炎(OA)。

在一个实施方式中，药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、局部接触和病灶内施用，优选局部施用于关节腔，例如通过关节腔注射。

在第七方面，本公开提供一种工程化的AAV衣壳蛋白(AAV843)，其中，所述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。

在第八方面，本公开提供一种核酸分子，其编码根据第七方面所述的AAV843衣壳蛋白。在一个实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。

在一个实施方式中，由本公开的AAV衣壳蛋白包装的AAV载体包含外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含编码治疗性蛋白质的核苷酸序列。在一个实施方式中，治疗性蛋白质为具有阻断IL1信号通路作用的蛋白质。在一个实施方式中，治疗性蛋白质为白介素1受体拮抗蛋白。在一个实施方式中，外源多核苷酸包含编码白介素1受体拮抗蛋白的核苷酸序列。

附图说明

图1是B93、B94、B95、B96、B97、B98、B126、B127、B128、B129、B130、B131、B132和B133表达盒的示意图。

图2A显示了B94、B95、B96、B97和B98表达盒转染Huh7细胞72h后细胞分泌上清液中的IL1RA表达水平，ELISA检测结果。n＝3，*p<0.05，t检验。

图2B显示了B94、B95、B96、B97和B98表达盒用AAV843衣壳包装后感染Huh7细胞72h后细胞分泌上清中的IL1RA表达水平，MOI＝7E+5vg/细胞，ELISA检测结果。n＝3，**p<0.01，t检验。

图2C显示了B93、B94、B95、B96、B97和B98表达盒用AAV843衣壳包装后，小鼠尾静脉注射病毒，3周后小鼠血清中的IL1RA表达水平，剂量为1E+13vg/kg，ELISA检测结果。n＝3，*p<0.05，t检验。

图2D显示了B126、B127、B128、B129、B130、B131、B132和B133表达盒转染Huh7细胞72h后细胞分泌上清液中的IL1RA表达水平，ELISA检测结果。n＝3，*p<0.05，t检验。

图2E显示了B126、B127、B128、B129、B130、B131、B132和B133表达盒用AAV843衣壳包装后感染Huh7细胞72h后细胞分泌上清中的IL1RA表达水平，MOI＝7E+5vg/细胞，ELISA检测结果。n＝3，*p<0.05，t检验。

图2F显示了B126、B127、B128、B129、B130、B131、B132和B133表达盒用AAV843衣壳包装后，小鼠尾静脉注射病毒，3周后小鼠血清中的IL1RA表达水平，剂量为1E+13vg/kg，ELISA检测结果。n＝3，*p<0.05，t检验。

图2G显示了B126、B127、B128、B129、B130、B131、B132和B133表达盒用AAV843衣壳包装后，小鼠尾静脉注射病毒，4周后小鼠血清中的IL1RA表达水平，剂量为1E+13vg/kg，ELISA检测结果。n＝3，*p<0.05，t检验。

图2H示出了B94、B96、B127、B130表达盒IL1RA表达水平的比较结果。表达盒用AAV843衣壳包装后感染Huh7细胞72h后，测定细胞分泌上清液中的IL1RA表达水平，MOI＝7E+5vg/细胞，ELISA检测结果。n＝3，**p<0.01，t检验。

图3A显示了B93、B94、B95、B96、B97和B98表达盒对IL1β诱导的炎症因子和软骨外基质降解蛋白酶水平升高的抑制作用。表达盒用AAV843衣壳包装后预先感染C28/I2细胞(MOI＝7E+5vg/细胞)，IL1β诱导48h后，qPCR检测IL1、IL6、TNFα和MMP13的mRNA表达水平。n＝3，*p<0.05，**p<0.01，t检验。

图3B显示了B126、B127、B128、B129、B130、B131、B132和B133表达盒对IL1β诱导的炎症因子和软骨外基质降解蛋白酶水平升高的抑制作用。表达盒用AAV843衣壳包装后预先感染C28/I2细胞(MOI＝7E+5vg/细胞)，IL1β诱导48h后，qPCR检测IL1、IL6和TNFα和MMP13的mRNA表达水平。n＝3，*p<0.05，t检验。

图4显示了通过剪交叉韧带与摘除部分半月板手术诱导骨性关节炎的大鼠模型图。造模2周后向SD大鼠关节腔内分别注射剂量为1×10¹¹vg/关节和1×10¹²vg/关节的AAV颗粒，该颗粒具有AAV843衣壳且包装了B130表达盒。病毒注射后第0、2、4、8周，测量大鼠的关节肿胀度。病毒注射后第2、4、8周采血，测量大鼠血清的炎症水平。病毒注射后第8周，通过micro-CT对大鼠病变关节部位进行扫描拍摄。最后对大鼠实行安乐死，取关节，用于石蜡切片进行免疫组化，并提取mRNA进行qPCR测定。

图5A显示了具有AAV843衣壳且包装了B130表达盒的AAV病毒颗粒(AAV843-B130)关节腔注射OA大鼠模型后第0、2、4、8周，大鼠关节肿胀度的测量结果，n＝4。

图5B显示了AAV843-B130病毒颗粒关节腔注射OA大鼠模型后第8周的micro-CT扫描结果，n＝3。

图5C显示了micro-CT扫描的骨参数分析统计图。平均值±sd，n＝3，*P<0.05。

图6显示了AAV843-B130病毒颗粒关节腔注射OA大鼠模型后第2、4、8周，大鼠的血清中炎症水平的ELISA检测结果，n＝4。

图7显示了AAV843-B130病毒颗粒关节腔注射OA大鼠模型后，大鼠的关节病理切片结果。番红-O和HE染色，n＝3，比例尺：200微米。

图8显示了AAV843-B130病毒颗粒关节腔注射OA大鼠模型后第8周，关节提取mRNA对目的蛋白、炎症因子、降解酶以及软骨基质蛋白的表达水平进行qPCR的检测结果。n＝3，*p<0.05，**p<0.01，t检验。LD：低剂量；HD：高剂量。

图9A和图9B显示了AAV843-B130病毒颗粒关节腔注射OA大鼠模型的安全性评价。n＝3，*p<0.05，t检验。

图10显示密码子优化的人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸优化序列一(SEQ IDNO：7)。

图11显示密码子优化的人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸优化序列二(SEQ IDNO：8)。

图12显示B94表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。

图13显示B95表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。

图14显示B96表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。

图15显示B97表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。

图16显示B98表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。

图17显示B127表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。

图18显示B128表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。

图19显示B129表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。

图20显示B130表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)。

图21显示B131表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。

图22显示B132表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)。

图23显示B133表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)。

图24显示编码AAV843衣壳蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)。

图25显示AAV843衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

除非另有说明，否则本文列出的核酸或多核苷酸序列是单链形式，方向是从5'至3'，从左至右。本文提供的核苷酸和氨基酸采用IUPACIUB生化命名委员会建议的格式，对于氨基酸采用单字母代码或三字母代码。

除非另有说明，“多核苷酸”是“核酸”的同义词，指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它们的混合序列或类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化或限制的核苷酸和核苷酸类似物。

在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。

在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物(例如，啮齿动物或其他哺乳动物)。

在一个实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。

在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。

在本文中，术语“治疗有效量”指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。例如，适用于治疗关节炎症疾病的药物的治疗有效量可为能够预防或改善与该关节炎症疾病相关的一种或多种症状的量。

在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。

在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。

在本文中，术语“局部施用”或“局部途径”是指具有局部作用的给药。

在本文中，术语“转导”、“转染”和“转化”是指将外源核酸递送到宿主细胞中，然后多核苷酸产物的转录和翻译的过程，该过程包括使用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。

在本文中，术语“基因送递”指的是将外源多核苷酸引入细胞来进行基因传递，包括靶向、结合、摄取、转运、复制子整合和表达。

在本文中，术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。

在本文中，术语“感染”是指包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒将多核苷酸递送至细胞中并产生其RNA和蛋白质产物的过程，也可指病毒在宿主细胞中的复制过程。

在本文中，术语“载体”指封装多核苷酸的一个或一系列大分子，其促进多核苷酸在体外或体内递送至靶细胞。载体的种类包括但不限于质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。待递送的多核苷酸有时被称为“表达盒”或“转基因表达盒”，其可以包含但不限于某些蛋白质或合成多肽(其可以增强、抑制、削弱、保护、触发或预防某些生物学和生理功能)的编码序列、疫苗开发中感兴趣的编码序列(例如表达适于在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白质、多肽或肽的多核苷酸)、RNAi材料的编码序列(例如，shRNA、siRNA、反义寡核苷酸)或可选的生物标记。

在本文中，术语“表达盒”、“转基因盒”和“转基因表达盒”可互换地使用，指编码特定蛋白质、多肽或RNAi元件的多核苷酸片段，其可以克隆到质粒载体中。

在一些实施方式中，“盒”也可以包装到AAV颗粒中并用作病毒基因组以将转基因产物递送到靶细胞中。“盒”还可以包括其他调控元件，例如特异性启动子/增强子、polyA、内含子等，以增强或减弱转基因产物的表达。

在一个实施方式中，除了编码蛋白质产物的序列外，转基因盒还包含许多调控元件以使转基因包装到病毒中，例如145bp的正常ITR、长度大约100bp的缩短ITR。在一些实施方式中，转基因盒还包含用于控制蛋白质产物表达的多核苷酸元件，例如复制起点、聚腺苷酸化信号、启动子和增强子(例如，具有脊椎动物β-肌动蛋白、β-球蛋白或β-球蛋白调节元件的CMV启动子或其他杂种CMV启动子(称为CB和CAG启动子)、SV40启动子)。启动子和增强子可以被化学药品或激素(例如强力霉素或他莫昔芬)激活，以确保在特定时间点的进行基因表达。此外，启动子和增强子可以是天然或人工或嵌合序列，即原核或真核序列。

在一些优选实施方式中，用于基因表达的诱导型调控元件可以是组织或器官特异性启动子或增强子，其包括但不限于：对各种类型的关节组织细胞具有特异性的启动子，例如，关节软骨细胞谱系特异性启动子(例如，collagen启动子、aggrecan启动子)、滑膜蛋白基因启动子、脂肪组织特异性启动子(例如PPAR白基因启动子)、骨祖细胞特异性启动子(例如转录因子SOX9启动子)，以及成骨细胞谱系的特异性启动子(例如骨钙蛋白启动子)。

在本文中，术语“反向末端重复(ITR)”包括形成发夹结构并用作顺式元件以介导病毒复制、包装和整合的任何AAV病毒末端重复或合成序列。本文的ITR包括但不限于来自1-11型AAV(禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的末端重复序列)。此外，AAV末端重复序列不必具有天然末端重复序列，只要该末端重复序列可用于病毒复制、包装和整合即可。

在本文中，术语“顺式元件”是指包装在AAV颗粒中并在靶细胞中表达以产生具有治疗作用的蛋白质产物的转基因盒。

在本文中，术语“密码子优化”是指从其天然形式修饰的多核苷酸序列。这样的修饰导致一个或多个碱基对的差异，其相应的氨基酸序列中有或没有改变，可能增强或抑制基因的表达和/或对修饰的多核苷酸序列的细胞应答。

本领域技术人员已知，AAV衣壳蛋白含有VP1、VP2和VP3蛋白，VP2和VP3蛋白在VP1蛋白内部的起始密码子处经历转录和翻译过程，即，VP1序列包含VP2和VP3序列。

在一个实施方式中，AAV衣壳蛋白可以为任何AAV血清型衣壳蛋白，包括天然AAV衣壳蛋白(例如，天然的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)和其他人工改造的AAV衣壳蛋白(例如，人工改造的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)。不同AAV血清型的基因组序列、ITR序列、Rep和Cap蛋白在本领域内是已知的。这些序列可以在文献或在公共数据库查找，例如GenBank数据库。

在一个实施方式中，本公开提供了具有拮抗IL1信号通路作用的治疗工具，可以用于治疗具有相关病理机制的多种疾病，包括但不限于：恶性肿瘤和炎症疾病(包括急性炎症疾病和慢性炎症疾病，如关节炎症疾病，例如骨性关节炎、类风湿关节炎、滑膜炎、血友病关节炎或其他炎症引起的关节炎症疾病)。

在一个实施方式中，治疗工具(例如转基因表达盒)的蛋白产物包括具有拮抗IL1信号通路作用的蛋白质，例如但不限于，IL-1Ra、重组IL-1R可溶性受体、抗IL-1抗体。

本发明人发现，具有AAV843衣壳(SEQ ID NO：24)的AAV载体表现出高效的关节腔转导效率。因此，在一些优选实施方式中，AAV843载体用于递送表达IL-1Ra的基因。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为VH4，构建未经密码子优化的原始人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸序列的转基因表达盒B93，其核苷酸序列如SEQID NO：9所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为VH4，构建经密码子优化的人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸序列(优化序列一(IL1Ra(1))，SEQ ID NO：7)的转基因表达盒B94，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为VH4，在优化序列一(SEQ IDNO：7)中插入Chi内含子，构建转基因表达盒B95，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为VH4，在优化序列一(SEQ IDNO：7)中依次插入Chi和SV40两个内含子，构建转基因表达盒B96，其核苷酸序列如SEQ IDNO：12所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为VH4，在优化序列一(SEQ IDNO：7)中插入SV40内含子，构建转基因表达盒B97，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为VH4，在优化序列一(SEQ IDNO：7)中依次插入SV40和Chi两个内含子，构建转基因表达盒B98，其核苷酸序列如SEQ IDNO：14所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为SV40，构建未经密码子优化的原始人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸序列的转基因表达盒B126，其核苷酸序列如SEQID NO：15所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为SV40，构建经密码子优化的人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸序列(优化序列二(IL1Ra(2))，SEQ ID NO：8)的转基因表达盒B127，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为SV40，在优化序列二(SEQID NO：8)中插入Chi内含子，构建转基因表达盒B128，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为SV40，在优化序列二(SEQID NO：8)中插入Chi内含子并在优化序列二的末端连接VH4内含子，构建转基因表达盒B129，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为SV40，在优化序列二(SEQID NO：8)中依次插入Chi和VH4两个内含子，构建转基因表达盒B130，其核苷酸序列如SEQID NO：19所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为SV40，在优化序列二(SEQID NO：8)中插入VH4内含子，构建转基因表达盒B131，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为SV40，在优化序列二(SEQID NO：8)中插入VH4内含子并在优化序列二的末端连接Chi内含子，构建转基因表达盒B132，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。

在一个实施方式中，以CB为启动子，启动子后内含子为SV40，在优化序列二(SEQID NO：8)中依次插入VH4和Chi两个内含子，构建转基因表达盒B133，其核苷酸序列如SEQID NO：22所示。

在一个优选实施方式中，表达白介素1受体拮抗蛋白的转基因表达盒包括：CB启动子序列(SEQ ID NO：1)、SV40内含子(SEQ ID NO：3)、bGH聚腺苷酸化(polyA)序列(SEQ IDNO：2)和密码子优化的人源IL-1Ra编码序列(SEQ ID NO：8)，该密码子优化的人源IL-1Ra编码序列内插入有Chi内含子(SEQ ID NO：5)和VH4内含子(SEQ ID NO：4)以增强蛋白质的表达，如此形成B130表达盒(SEQ ID NO：19)。B130表达盒的两侧是一个正常的ITR和一个缩短的ITR，以实现将B130表达盒作为自互补AAV载体包装到AAV颗粒中。

在一些实施方式中，通过HEK293细胞的三质粒(质粒1：顺式元件质粒；质粒2：AAVRep/Cap质粒；质粒3：辅助质粒)转染来生产IL-1Ra的AAV颗粒。

在一个实施方式中，为了产生具有治疗功能的AAV颗粒，按如下进行HEK293细胞的三质粒转染：质粒1：具有ITR的顺式元件质粒(例如，B130表达盒)；质粒2：具有衣壳蛋白(例如，AAV843衣壳蛋白)编码序列的AAV Rep/Cap质粒；质粒3：具有腺病毒成分的辅助质粒，其能够促进AAV病毒体的复制、组装和包装。在一个实施方式中，将HEK293细胞产生的AAV颗粒通过亲和层析和碘克沙醇密度梯度超速离心进行纯化(Xiao X等，J Virol(1998)72(3)：2224-32)。

本领域技术人员可以使用已知的标准方法来生产重组和合成的多肽或其蛋白质、设计核酸序列、生产转化细胞、构建重组AAV突变体、改造衣壳蛋白质、包装表达AAV Rep和/或Cap序列的载体，以及瞬时或稳定转染包装细胞。这些技术是本领域技术人员已知的。参见例如，分子克隆(MOLECULAR CLONING)：实验室手册(A LABORATORY MANUAL)，第二版，(冷泉港，纽约州，1989年)。

在一些实施方式中，本公开的基因递送系统用于辅助细胞移植治疗。具体地，具有转基因的AAV颗粒可用于体外转导各种类型的细胞以产生表达蛋白质产物的稳定细胞系，然后可将其引入体内以用于治疗目的。细胞的类型包括但不限于软骨细胞、滑膜细胞、间充质干细胞。

在一个实施方式中，用于移植的细胞是受试者的自体细胞，其允许体外培养。将细胞引入或移植到受试者中的原理和技术是本领域技术人员已知的。

在一个实施方式中，从HEK293细胞的培养基和裂解物中收获AAV颗粒。纯化方法例如亲和色谱、离子交换色谱、氯化铯和碘克沙醇梯度超速离心。与AAV生产和纯化有关的化学物质或试剂包括但不限于：用于细胞培养的化学物质或试剂(例如，细胞培养基的成分，包括牛、马、山羊、鸡或其他脊椎动物血清、谷氨酰胺、葡萄糖、蔗糖、丙酮酸纳、酚红；抗生素，例如青霉素、卡那霉素、链霉素、四环素)；用于细胞裂解、多核苷酸沉淀或超速离心的化学物质或试剂(例如Triton X-100、NP-40、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化多米芬、钠十二烷基水杨酸酯、氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钡、硝酸盐、氯化钾、氯化铵、过硫酸铵、硫酸铵、PEG-20、PEG-40、PEG-400、PEG-2000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-20000、Tris-HCl、Tris-乙酸盐、氯化锰、磷酸盐、碳酸氢盐、氯化铯、甲醇、乙醇、甘油、碘克沙醇、异丙醇、丁醇、安息香酶、DNase I、RNase)；亲和柱材料(例如AAVX亲和树脂、硫酸肝素蛋白聚糖和粘蛋白树脂、与AAV特异性抗体相关的其他材料)；离子交换色谱材料和洗涤缓冲液中包含的酸、碱和有机物(例如盐酸、硫酸、乙酸、甲酸、硝酸、尿素、丙酮、氯仿、乙腈、三氟乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化铵、Tris碱或其他有机胺、泊洛沙姆188、吐温20、吐温40、吐温80、盐酸胍)。

在一个实施方式中，本公开的AAV载体可以装载外源多核苷酸用于将基因递送到靶细胞中。因此，本公开的AAV载体可用于在体外或体内将核酸递送至细胞。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的外源多核苷酸编码用于治疗用途的天然蛋白质，所述天然蛋白质经密码子优化或未经密码子优化。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的外源多核苷酸编码合成多肽。

在一个实施方式中，本公开的AAV载体或转基因表达盒或基因递送系统被制成药物制剂(例如，注射剂)施用于人或其他哺乳动物。此外，药物制剂可以通过全身或局部(例如，静脉内、关节腔内)的给药方式以单剂量或多剂量递送。

在一个实施方式中，本公开的药物用于体外转导细胞或体内转导哺乳动物(例如啮齿动物、灵长类动物和人类)，从而治疗可通过阻断IL-1信号通路而改善的疾病，如急性炎症疾病、慢性炎症疾病和恶性肿瘤，优选关节炎症。

在一个实施方式中，关节炎症选自：骨性关节炎、类风湿关节炎、滑膜炎、血友病关节炎和其他炎症引起的关节炎症。在一个实施方式中，关节炎症涉及关节功能的退化。

在一个实施方式中，治疗或改善关节炎症疾病是指改善接受治疗的患者的关节疼痛、软骨磨损以及关节功能。

下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例

实施例1：IL1Ra基因的密码子优化以及质粒构建

首先，基于NCBI基因库中的人源IL1Ra的cDNA基因序列，对IL1Ra的原始序列(SEQID NO：6)进行密码子优化，得到两个密码子优化的序列：IL1Ra优化序列一(IL1Ra(1))(SEQID NO：7)和IL1Ra优化序列二(IL1Ra(2))(SEQ ID NO：8)。

接着，分别构建基于IL1Ra原始序列、IL1Ra优化序列一和IL1Ra优化序列二的表达盒：

以CB为启动子，VH4作为内含子，以IL1Ra原始序列构建质粒B93(SEQ ID NO：9)；以CB为启动子，VH4作为内含子，以IL1Ra优化序列一构建质粒B94(SEQ ID NO：10)；以CB为启动子，VH4作为内含子，以IL1Ra优化序列一为基础在转录单元上的5’端和3’端插入Chi和/或SV40内含子构建质粒B95至B98(SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14)；

以CB为启动子，SV40作为内含子，以IL1Ra原始序列构建质粒B126(SEQ ID NO：15)；以CB为启动子，SV40作为内含子，以IL1Ra优化序列二构建质粒B127(SEQ ID NO：16)；以CB为启动子，SV40作为内含子，以IL1Ra优化序列二为基础在转录单元上的5’端和3’端插入Chi和/或VH4内含子构建质粒B128至B133(SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：22)。

实施例2：密码子优化的人源IL1Ra编码核酸序列的表达

将Huh7细胞铺于12孔板中，接种密度为2E+5个细胞/孔，待细胞涨至80-90％时，更换无血清DMEM。配制转染体系，转染质粒量为2.5μg(质粒：PEI＝1:2)，加入每孔转染12h后，更换为10％胎牛血清的DMEM继续培养48h。用具有IL1Ra优化序列一的5个质粒(B94-B98)转染Huh7细胞，72h后收集上清液，测定IL1Ra蛋白的浓度。

ELISA结果显示，通过插入Chi和/或SV40内含子进一步优化得到的4个质粒(B95-B98)表达均比B94质粒高(图2A)，这表明通过插入Chi或SV40内含子可以提高基因的表达。

将具有IL1Ra优化序列一的质粒包装成AAV843病毒感染Huh7细胞，感染MOI为7.5E+5vg/细胞，72h后收集上清液，测定IL1Ra蛋白浓度。

ELISA结果显示(图2B)，病毒感染的结果与质粒转染的结果基本一致，其中B96病毒表达升高最显著。

将包装IL1Ra原始序列的B93病毒以及包装IL1Ra优化序列一的B94至B98病毒尾静脉注射进C57小鼠体内，剂量为1E+13vg/kg。注射3周后提取血清，测定IL1Ra的表达。

结果表明，经密码子优化的IL1Ra(1)具有增加的IL1Ra蛋白表达，并且，通过插入Chi和/或SV40内含子进一步优化的基因在动物体内的蛋白表达也进一步得到了改善(图2C)。

将具有IL1Ra优化序列二的7个质粒(B127-B133)以及未优化的对照质粒(B126)转染Huh7细胞，48h后收集上清液，测定IL1Ra蛋白的浓度。

ELISA结果显示，经密码子优化的B127的IL1Ra蛋白表达(10ng/ml)显著高于未优化的对照组质粒(1.5ng/ml)，表明经密码子优化的IL1Ra(2)增加了其蛋白表达。并且，以IL1Ra(2)为基础，通过插入Chi和/或VH4内含子进一步优化得到的6个质粒(B128-B133)的表达均得到进一步提高，其中B130质粒表达的升高最显著(19.6ng/ml)，相对于未优化的原始基因(B126)提高了13.9倍，相对于未插入内含子的B127质粒大约提高了1.9倍(图2D)。

将具有IL1Ra优化序列二的质粒包装成AAV843病毒感染Huh7细胞，感染MOI为7.5E+5vg/细胞，48h后收集上清液，测定IL1Ra蛋白浓度。

ELISA结果显示(图2E)，病毒感染的结果与质粒转染的结果基本一致，表明插入Chi和/或VH4内含子可进一步提高基因的表达。

将包装IL1Ra原始序列的B126病毒以及包装IL1Ra优化序列二的B127至B133病毒尾静脉注射进C57小鼠体内，注射3周和4周后提取血清，测定IL1Ra的表达。

结果表明，经密码子优化的IL1Ra(2)具有增加的IL1Ra蛋白表达，并且，通过插入Chi和/或VH4内含子进一步优化的基因在动物体内的蛋白表达也进一步得到了改善(图2F，图2G)。

最后，为对比IL1Ra优化序列一和IL1Ra优化序列二的IL1Ra蛋白表达效率，选择B94(优化序列一)、B96(优化序列一+内含子插入)、B127(优化序列二)和B130(优化序列二+内含子插入)病毒进行比较。转染Huh7细胞72h后，收集上清液，测定IL1Ra蛋白的浓度。

ELISA结果显示，B127病毒的IL1Ra蛋白表达显著高于B94病毒(图2H，**p<0.01)，且B130病毒的IL1Ra蛋白表达也优于B96病毒，表明IL1Ra优化序列二比IL1Ra优化序列一具有更高的IL1Ra蛋白表达。

实施例3：密码子优化的IL1Ra基因的体外生物学功能

C28/I2软骨细胞在IL1的刺激下会发生炎症反应，促进IL1、IL6、TNFa等炎症因子的产生，进而引起软骨基质降解酶MMP13的升高，导致软骨基质的降解。在本实施例中，为了验证经密码子优化的IL1Ra基因转录翻译表达的蛋白的生物学活性，选择使用C28/I2软骨细胞进行验证。

将C28/I2细胞铺于12孔板中，接种密度为2e5个细胞/孔。待汇合度达到80-90％时，更换无血清培养基，病毒感染MOI为7.5E+5vg/细胞。感染24h后，更换含10％胎牛血清的DMEM培养基。除空白对照孔外，每孔加入一定量的IL1(10ng/ml)刺激诱导，48h后收集细胞提取mRNA，测定IL1、IL6、TNFa以及MMP13的表达水平。

针对优化序列一的病毒体外功能实验结果显示，在IL1的作用下，模型组中IL1、IL6、TNFa以及MMP13水平(分别是6.4、23.8、2.1、9.4)显著高于空白对照组(1、1、1、1)(图3A)。IL1Ra病毒的预先感染弱化了IL1的刺激作用，IL1、IL6和MMP13的水平显著降低。同病毒滴度条件下，B96组的治疗效果最好，IL1、IL6、TNFa以及MMP13水平分别降低至1.9、3.5、1.9、2.3，这与其表达量最高的结果一致(图2B)。

针对优化序列二的病毒体外功能实验结果显示，B127组的IL1、IL6、TNFa以及MMP13水平分别降低至2.5、8.5、1.3、4.6，该结果优于B126病毒组(分别为5.0、19.1、1.7、10.5)。同病毒滴度条件下，B130组的治疗效果较好，IL1、IL6、TNFa以及MMP13水平分别降低至2.1、4.6、1.0、3.3(图3B)。

体外功能实验结果表明，经优化包装的病毒能有效表达目的蛋白IL1RA，拮抗IL1信号通路引起的炎症反应，从而减少软骨基质的降解，起到保护软骨的作用。

实施例4：AAV介导的IL1Ra表达对关节炎的治疗作用

如图4所示，切断大鼠一侧膝关节前交叉韧带和摘除部分半月板构建OA模型，造模2周后，关节注射AAV843-B130病毒(低剂量1x10¹¹vg/关节，高剂量1x10¹²vg/关节)，治疗持续2个月。给药后每周测量关节肿胀度，结果如图5A所示，模型组大鼠关节明显比空白对照组肿胀严重，而病毒低剂量组和高剂量组均有效减轻了关节的肿胀。

治疗结束后，利用Micro-CT机对大鼠关节进行扫描观察病毒的治疗效果。结果显示，相比于模型组，低剂量组和高剂量组治疗的大鼠的关节表面明显更光滑完整(图5B)，其中高剂量组的效果更佳。骨小梁参数分析也表明，IL1Ra病毒低剂量组和高剂量组均能有效减轻模型大鼠关节的磨损(图5C)，对关节软骨具有一定的保护作用。

在关节腔注射药物后的第2、4、8周，采取大鼠血清样本，测定炎症因子水平。如图6所示，模型组大鼠血清中炎症因子IL1、IL6、TNFa水平明显增高，而给药后降低了炎症水平，且高剂量降低的效果比低剂量好。

治疗8周后，取关节组织进行病理分析。番红O固绿染色结果显示(图7)，正常对照组关节软骨染色均匀，表面光滑完整；而模型组的软骨细胞减少，排列紊乱，软骨表面缺损较严重，出现番红部分失染。给药治疗后，明显改善了OA大鼠关节软骨的病理发展进程，软骨磨损减少。同时，HE染色结果显示(图7)，相比于模型组，给药组OA大鼠关节滑膜的炎症浸润明显减少。此外，关节qPCR结果显示，关节腔注AAV843-B130病毒后，IL1RA表达显著升高，且具有剂量依赖性(图8)。

结果显示，病毒治疗能有效降低造模关节中炎症因子如IL1、IL6、TNFα的表达，并且减少软骨基质降解酶的产生，从而抑制软骨基质蛋白聚糖和二型胶原蛋白的减少。

以上结果表明，AAV843-B130病毒关节腔注射后能表达IL1Ra蛋白，有效拮抗IL1炎症因子，发挥抗炎效果，有效保护关节软骨，最终延缓OA的发病进程。

最后，对病毒进行安全性评价。在病毒关节注射1周时取各组大鼠血液，其中全血用于测血常规，血清用于测肝指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平。

ELISA结果显示，病毒注射1周后，大鼠肝功能ALT、AST水平相对于未注射病毒组无明显变化(图9A)。血常规检测结果显示，病毒注射组大鼠血液中的白细胞数目(WBC)、淋巴细胞百分比(Lymph)、血小板数目(PLT)、中性粒细胞百分比(Gran)、红细胞数目(RBC)和血红蛋白(HGB)与未注射病毒组无显著性差异(图9B)，这表明AAV病毒关节注射后对大鼠无明显的毒副作用。

虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

序列表

<110> 上海勉亦生物科技有限公司

<120> 白介素1受体拮抗蛋白的表达盒以及基于AAV的基因递送系统

<130> PCNCNN21F727G

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 590

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CB启动子核苷酸序列

<400> 1

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggtgg gcggggttga agctaacaaa 590

<210> 2

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bGH PolyA核苷酸序列

<400> 2

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208

<210> 3

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SV40核苷酸序列

<400> 3

gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60

agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97

<210> 4

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH4核苷酸序列

<400> 4

gtgagtatct cagggatcca gacatgggga tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca 60

ctgtgggtct ctctgttcac ag 82

<210> 5

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Chi核苷酸序列

<400> 5

gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60

cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120

tttctctcca cag 133

<210> 6

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 原始（未经密码子优化的）人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸序列

<400> 6

atggaaatct gcagaggcct ccgcagtcac ctaatcactc tcctcctctt cctgttccat 60

tcagagacga tctgccgacc ctctgggaga aaatccagca agatgcaagc cttcagaatc 120

tgggatgtta accagaagac cttctatctg aggaacaacc aactagttgc tggatacttg 180

caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag atagatgtgg tacccattga gcctcatgct 240

ctgttcttgg gaatccatgg agggaagatg tgcctgtcct gtgtcaagtc tggtgatgag 300

accagactcc agctggaggc agttaacatc actgacctga gcgagaacag aaagcaggac 360

aagcgcttcg ccttcatccg ctcagacagc ggccccacca ccagttttga gtctgccgcc 420

tgccccggtt ggttcctctg cacagcgatg gaagctgacc agcccgtcag cctcaccaat 480

atgcctgacg aaggcgtcat ggtcaccaaa ttctacttcc aggaggacga gtag 534

<210> 7

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 密码子优化的人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸优化序列一

<400> 7

atggaaatct gcagaggcct ccgcagtcac ctaatcactc tcctcctctt cctgttccat 60

tcagagacga tctgcagacc ctctggcaga aagtccagca agatgcaggc cttcagaatc 120

tgggatgtga accagaaaac cttctacctg aggaacaatc agctggtggc aggctacctg 180

cagggcccca atgtgaacct ggaagagaag attgatgtgg tgcccattga gccccatgct 240

ctgtttctgg gcatccatgg tggcaagatg tgcctgagct gtgtgaagtc tggggatgag 300

acaagactgc agctggaagc tgtgaacatc acagacctgt ctgagaacag aaagcaggac 360

aagagatttg ccttcattag atctgactct ggccccacca ccagctttga gtctgctgct 420

tgtcctggct ggttcctgtg cactgccatg gaagcagacc agcctgtgtc tctgaccaac 480

atgcctgatg agggtgtcat ggtcaccaag ttctacttcc aagaggatga gtga 534

<210> 8

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 密码子优化的人源白介素1受体拮抗蛋白编码核酸优化序列二

<400> 8

atggaaatct gcagaggcct ccgcagtcac ctaatcactc tcctcctctt cctgttccat 60

tcagagacga tctgccgacc ctctgggaga aaatccagca agatgcaagc cttcagaatc 120

tgggatgtta accagaagac cttctatctg aggaacaacc aactagttgc tggatacttg 180

caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag atagatgtgg tacccattga gcctcatgct 240

ctgttcttgg gaatccatgg agggaagatg tgcctgtcct gtgtcaagtc tggtgatgag 300

accagactcc agctggaggc agttaacatc actgacctga gcgagaacag aaagcaggac 360

aagcgcttcg ccttcatccg ctcagacagc ggccccacca ccagttttga gtctgccgcc 420

tgccccggtt ggttcctctg cacagcgatg gaagctgacc agcccgtcag cctcaccaat 480

atgcctgacg aaggcgtcat ggtcaccaaa ttctacttcc aggaggacga gtag 534

<210> 9

<211> 1535

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B93表达盒的核苷酸序列

<400> 9

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggtgg gcggggttga agctaacaaa gaccacgacg 600

atatcacggt cgtggtctca aagaacaaca aacaacaaag tccgactgag aaggtgagta 660

tctcagggat ccagacatgg ggatatggga ggtgcctctg atcccagggc tcactgtggg 720

tctctctgtt cacaggaacc ggtgccacca tggaaatctg cagaggcctc cgcagtcacc 780

taatcactct cctcctcttc ctgttccatt cagagacgat ctgccgaccc tctgggagaa 840

aatccagcaa gatgcaagcc ttcagaatct gggatgttaa ccagaagacc ttctatctga 900

ggaacaacca actagttgct ggatacttgc aaggaccaaa tgtcaattta gaagaaaaga 960

tagatgtggt acccattgag cctcatgctc tgttcttggg aatccatgga gggaagatgt 1020

gcctgtcctg tgtcaagtct ggtgatgaga ccagactcca gctggaggca gttaacatca 1080

ctgacctgag cgagaacaga aagcaggaca agcgcttcgc cttcatccgc tcagacagcg 1140

gccccaccac cagttttgag tctgccgcct gccccggttg gttcctctgc acagcgatgg 1200

aagctgacca gcccgtcagc ctcaccaata tgcctgacga aggcgtcatg gtcaccaaat 1260

tctacttcca ggaggacgag tagaagctta tcgataccgt cgactagagc tcgctgatca 1320

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1380

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1440

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1500

gaggattggg aagacaatag caggcatgct gggga 1535

<210> 10

<211> 1535

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B94表达盒的核苷酸序列

<400> 10

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggtgg gcggggttga agctaacaaa gaccacgacg 600

atatcacggt cgtggtctca aagaacaaca aacaacaaag tccgactgag aaggtgagta 660

tctcagggat ccagacatgg ggatatggga ggtgcctctg atcccagggc tcactgtggg 720

tctctctgtt cacaggaacc ggtgccacca tggaaatctg cagaggcctc cgcagtcacc 780

taatcactct cctcctcttc ctgttccatt cagagacgat ctgcagaccc tctggcagaa 840

agtccagcaa gatgcaggcc ttcagaatct gggatgtgaa ccagaaaacc ttctacctga 900

ggaacaatca gctggtggca ggctacctgc agggccccaa tgtgaacctg gaagagaaga 960

ttgatgtggt gcccattgag ccccatgctc tgtttctggg catccatggt ggcaagatgt 1020

gcctgagctg tgtgaagtct ggggatgaga caagactgca gctggaagct gtgaacatca 1080

cagacctgtc tgagaacaga aagcaggaca agagatttgc cttcattaga tctgactctg 1140

gccccaccac cagctttgag tctgctgctt gtcctggctg gttcctgtgc actgccatgg 1200

aagcagacca gcctgtgtct ctgaccaaca tgcctgatga gggtgtcatg gtcaccaagt 1260

tctacttcca agaggatgag tgaaagctta tcgataccgt cgactagagc tcgctgatca 1320

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1380

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1440

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1500

gaggattggg aagacaatag caggcatgct gggga 1535

<210> 11

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B95表达盒的核苷酸序列

<400> 11

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggtgg gcggggttga agctaacaaa gaccacgacg 600

atatcacggt cgtggtctca aagaacaaca aacaacaaag tccgactgag aaggtgagta 660

tctcagggat ccagacatgg ggatatggga ggtgcctctg atcccagggc tcactgtggg 720

tctctctgtt cacaggaacc ggtgccacca tggaaatctg cagaggcctc cgcagtcacc 780

taatcactct cctcctcttc ctgttccatt cagagacgat ctgcagaccc tctggcagaa 840

agtccagcaa gatgcaggcc ttcagaatct gggatgtgaa ccagaaaacc ttctacctga 900

ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag 960

acagagaaga ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc 1020

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ggtggcaaga tgtgcctgag ctgtgtgaag tctggggatg agacaagact gcagctggaa 1200

gctgtgaaca tcacagacct gtctgagaac agaaagcagg acaagagatt tgccttcatt 1260

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tgcactgcca tggaagcaga ccagcctgtg tctctgacca acatgcctga tgagggtgtc 1380

atggtcacca agttctactt ccaagaggat gagtgaaagc ttatcgatac cgtcgactag 1440

agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 1500

ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 1560

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 1620

ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 1668

<210> 12

<211> 1765

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B96表达盒的核苷酸序列

<400> 12

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggtgg gcggggttga agctaacaaa gaccacgacg 600

atatcacggt cgtggtctca aagaacaaca aacaacaaag tccgactgag aaggtgagta 660

tctcagggat ccagacatgg ggatatggga ggtgcctctg atcccagggc tcactgtggg 720

tctctctgtt cacaggaacc ggtgccacca tggaaatctg cagaggcctc cgcagtcacc 780

taatcactct cctcctcttc ctgttccatt cagagacgat ctgcagaccc tctggcagaa 840

agtccagcaa gatgcaggcc ttcagaatct gggatgtgaa ccagaaaacc ttctacctga 900

ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag 960

acagagaaga ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc 1020

ctttctctcc acaggaacaa tcagctggtg gcaggctacc tgcagggccc caatgtgaac 1080

ctggaagaga agattgatgt ggtgcccatt gagccccatg ctctgtttct gggcatccat 1140

ggtggcaaga tgtgcctgag ctgtgtgaag tctggggatg agacaagact gcagctggaa 1200

gctgtgaaca tcacagacct gtctgagaac agaaagcagg taagtttagt ctttttgtct 1260

tttatttcag gtcccggatc cggtggtggt gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg 1320

ttgcctttac ttctaggaca agagatttgc cttcattaga tctgactctg gccccaccac 1380

cagctttgag tctgctgctt gtcctggctg gttcctgtgc actgccatgg aagcagacca 1440

gcctgtgtct ctgaccaaca tgcctgatga gggtgtcatg gtcaccaagt tctacttcca 1500

agaggatgag tgaaagctta tcgataccgt cgactagagc tcgctgatca gcctcgactg 1560

tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 1620

aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 1680

gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 1740

aagacaatag caggcatgct gggga 1765

<210> 13

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B97表达盒的核苷酸序列

<400> 13

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggtgg gcggggttga agctaacaaa gaccacgacg 600

atatcacggt cgtggtctca aagaacaaca aacaacaaag tccgactgag aaggtgagta 660

tctcagggat ccagacatgg ggatatggga ggtgcctctg atcccagggc tcactgtggg 720

tctctctgtt cacaggaacc ggtgccacca tggaaatctg cagaggcctc cgcagtcacc 780

taatcactct cctcctcttc ctgttccatt cagagacgat ctgcagaccc tctggcagaa 840

agtccagcaa gatgcaggcc ttcagaatct gggatgtgaa ccagaaaacc ttctacctga 900

ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca 960

aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt acttctagga acaatcagct ggtggcaggc 1020

tacctgcagg gccccaatgt gaacctggaa gagaagattg atgtggtgcc cattgagccc 1080

catgctctgt ttctgggcat ccatggtggc aagatgtgcc tgagctgtgt gaagtctggg 1140

gatgagacaa gactgcagct ggaagctgtg aacatcacag acctgtctga gaacagaaag 1200

caggacaaga gatttgcctt cattagatct gactctggcc ccaccaccag ctttgagtct 1260

gctgcttgtc ctggctggtt cctgtgcact gccatggaag cagaccagcc tgtgtctctg 1320

accaacatgc ctgatgaggg tgtcatggtc accaagttct acttccaaga ggatgagtga 1380

aagcttatcg ataccgtcga ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 1440

ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 1500

cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 1560

tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 1620

gcatgctggg ga 1632

<210> 14

<211> 1765

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B98表达盒的核苷酸序列

<400> 14

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggtgg gcggggttga agctaacaaa gaccacgacg 600

atatcacggt cgtggtctca aagaacaaca aacaacaaag tccgactgag aaggtgagta 660

tctcagggat ccagacatgg ggatatggga ggtgcctctg atcccagggc tcactgtggg 720

tctctctgtt cacaggaacc ggtgccacca tggaaatctg cagaggcctc cgcagtcacc 780

taatcactct cctcctcttc ctgttccatt cagagacgat ctgcagaccc tctggcagaa 840

agtccagcaa gatgcaggcc ttcagaatct gggatgtgaa ccagaaaacc ttctacctga 900

ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca 960

aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt acttctagga acaatcagct ggtggcaggc 1020

tacctgcagg gccccaatgt gaacctggaa gagaagattg atgtggtgcc cattgagccc 1080

catgctctgt ttctgggcat ccatggtggc aagatgtgcc tgagctgtgt gaagtctggg 1140

gatgagacaa gactgcagct ggaagctgtg aacatcacag acctgtctga gaacagaaag 1200

caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc aatagaaact gggcttgtcg 1260

agacagagaa gactcttgcg tttctgatag gcacctattg gtcttactga catccacttt 1320

gcctttctct ccacaggaca agagatttgc cttcattaga tctgactctg gccccaccac 1380

cagctttgag tctgctgctt gtcctggctg gttcctgtgc actgccatgg aagcagacca 1440

gcctgtgtct ctgaccaaca tgcctgatga gggtgtcatg gtcaccaagt tctacttcca 1500

agaggatgag tgaaagctta tcgataccgt cgactagagc tcgctgatca gcctcgactg 1560

tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 1620

aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 1680

gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 1740

aagacaatag caggcatgct gggga 1765

<210> 15

<211> 1599

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B126表达盒的核苷酸序列

<400> 15

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780

aattgtaccc gcggccgatc caccggtgcc accatggaaa tctgcagagg cctccgcagt 840

cacctaatca ctctcctcct cttcctgttc cattcagaga cgatctgccg accctctggg 900

agaaaatcca gcaagatgca agccttcaga atctgggatg ttaaccagaa gaccttctat 960

ctgaggaaca accaactagt tgctggatac ttgcaaggac caaatgtcaa tttagaagaa 1020

aagatagatg tggtacccat tgagcctcat gctctgttct tgggaatcca tggagggaag 1080

atgtgcctgt cctgtgtcaa gtctggtgat gagaccagac tccagctgga ggcagttaac 1140

atcactgacc tgagcgagaa cagaaagcag gacaagcgct tcgccttcat ccgctcagac 1200

agcggcccca ccaccagttt tgagtctgcc gcctgccccg gttggttcct ctgcacagcg 1260

atggaagctg accagcccgt cagcctcacc aatatgcctg acgaaggcgt catggtcacc 1320

aaattctact tccaggagga cgagtagaag cttatcgata ccgtcgacta gagctcgctg 1380

atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 1440

ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 1500

atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 1560

gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctgggga 1599

<210> 16

<211> 1576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B127表达盒的核苷酸序列

<400> 16

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780

aattgtaccc gcggccgatc caccggtgcc accatggaaa tctgcagagg cctgagaagc 840

cacctgatta ccctgctgct gttcctgttc cacagcgaga caatctgcag gcccagcggc 900

agaaagtcca gcaagatgca ggccttccgg atctgggacg tgaaccagaa aaccttctac 960

ctgcggaaca atcagctggt ggccggctat ctgcagggcc ccaatgtgaa cctggaagag 1020

aagatcgacg tggtgcccat cgagccccac gctctgtttc tgggaattca cggcggcaag 1080

atgtgcctga gctgtgtgaa gtctggcgac gagacacggc tgcagctgga agccgtgaac 1140

atcaccgacc tgagcgagaa ccggaagcag gacaagagat tcgccttcat cagaagcgac 1200

agcggcccca ccacaagctt tgagtctgct gcttgccctg gctggttcct gtgtacagcc 1260

atggaagccg accagcctgt gtctctgacc aacatgcctg acgagggcgt gatggtcacc 1320

aagttctact tccaagagga cgagtgagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta 1380

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 1440

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 1500

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 1560

gcaggcatgc tgggga 1576

<210> 17

<211> 1709

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B128表达盒的核苷酸序列

<400> 17

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780

aattgtaccc gcggccgatc caccggtgcc accatggaaa tctgcagagg cctgagaagc 840

cacctgatta ccctgctgct gttcctgttc cacagcgaga caatctgcag gtaagtatca 900

aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga cagagaagac 960

tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc tttctctcca 1020

caggcccagc ggcagaaagt ccagcaagat gcaggccttc cggatctggg acgtgaacca 1080

gaaaaccttc tacctgcgga acaatcagct ggtggccggc tatctgcagg gccccaatgt 1140

gaacctggaa gagaagatcg acgtggtgcc catcgagccc cacgctctgt ttctgggaat 1200

tcacggcggc aagatgtgcc tgagctgtgt gaagtctggc gacgagacac ggctgcagct 1260

ggaagccgtg aacatcaccg acctgagcga gaaccggaag caggacaaga gattcgcctt 1320

catcagaagc gacagcggcc ccaccacaag ctttgagtct gctgcttgcc ctggctggtt 1380

cctgtgtaca gccatggaag ccgaccagcc tgtgtctctg accaacatgc ctgacgaggg 1440

cgtgatggtc accaagttct acttccaaga ggacgagtga gagctcgctg atcagcctcg 1500

actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 1560

ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 1620

ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 1680

tgggaagaca atagcaggca tgctgggga 1709

<210> 18

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B129表达盒的核苷酸序列

<400> 18

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780

aattgtaccc gcggccgatc caccggtgcc accatggaaa tctgcagagg cctgagaagc 840

cacctgatta ccctgctgct gttcctgttc cacagcgaga caatctgcag gtaagtatca 900

aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga cagagaagac 960

tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc tttctctcca 1020

caggcccagc ggcagaaagt ccagcaagat gcaggccttc cggatctggg acgtgaacca 1080

gaaaaccttc tacctgcgga acaatcagct ggtggccggc tatctgcagg gccccaatgt 1140

gaacctggaa gagaagatcg acgtggtgcc catcgagccc cacgctctgt ttctgggaat 1200

tcacggcggc aagatgtgcc tgagctgtgt gaagtctggc gacgagacac ggctgcagct 1260

ggaagccgtg aacatcaccg acctgagcga gaaccggaag caggacaaga gattcgcctt 1320

catcagaagc gacagcggcc ccaccacaag ctttgagtct gctgcttgcc ctggctggtt 1380

cctgtgtaca gccatggaag ccgaccagcc tgtgtctctg accaacatgc ctgacgaggg 1440

cgtgatggtc accaagttct acttccaaga ggacgagtga gcttatcgat accgtcaggt 1500

gagtatctca gggatccaga catggggata tgggaggtgc ctctgatccc agggctcact 1560

gtgggtctct ctgttcacag gacgagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 1620

ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 1680

cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 1740

tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 1800

gcatgctggg ga 1812

<210> 19

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B130表达盒的核苷酸序列

<400> 19

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780

aattgtaccc gcggccgatc caccggtgcc accatggaaa tctgcagagg cctgagaagc 840

cacctgatta ccctgctgct gttcctgttc cacagcgaga caatctgcag gtaagtatca 900

aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga cagagaagac 960

tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc tttctctcca 1020

caggcccagc ggcagaaagt ccagcaagat gcaggccttc cggatctggg acgtgaacca 1080

gaaaaccttc tacctgcgga acaatcagct ggtggccggc tatctgcagg gccccaatgt 1140

gaacctggaa gagaagatcg acgtggtgcc catcgagccc cacgctctgt ttctgggaat 1200

tcacggcggc aagatgtgcc tgagctgtgt gaagtctggc gacgagacac ggctgcagct 1260

ggaagccgtg aacatcaccg acctgagcga gaaccggaag caggtgagta tctcagggat 1320

ccagacatgg ggatatggga ggtgcctctg atcccagggc tcactgtggg tctctctgtt 1380

cacaggacaa gagattcgcc ttcatcagaa gcgacagcgg ccccaccaca agctttgagt 1440

ctgctgcttg ccctggctgg ttcctgtgta cagccatgga agccgaccag cctgtgtctc 1500

tgaccaacat gcctgacgag ggcgtgatgg tcaccaagtt ctacttccaa gaggacgagt 1560

gagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 1620

ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 1680

tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 1740

gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg a 1791

<210> 20

<211> 1658

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B131表达盒的核苷酸序列

<400> 20

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780

aattgtaccc gcggccgatc caccggtgcc accatggaaa tctgcagagg cctgagaagc 840

cacctgatta ccctgctgct gttcctgttc cacagcgaga caatctgcag gtgagtatct 900

cagggatcca gacatgggga tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca ctgtgggtct 960

ctctgttcac aggcccagcg gcagaaagtc cagcaagatg caggccttcc ggatctggga 1020

cgtgaaccag aaaaccttct acctgcggaa caatcagctg gtggccggct atctgcaggg 1080

ccccaatgtg aacctggaag agaagatcga cgtggtgccc atcgagcccc acgctctgtt 1140

tctgggaatt cacggcggca agatgtgcct gagctgtgtg aagtctggcg acgagacacg 1200

gctgcagctg gaagccgtga acatcaccga cctgagcgag aaccggaagc aggacaagag 1260

attcgccttc atcagaagcg acagcggccc caccacaagc tttgagtctg ctgcttgccc 1320

tggctggttc ctgtgtacag ccatggaagc cgaccagcct gtgtctctga ccaacatgcc 1380

tgacgagggc gtgatggtca ccaagttcta cttccaagag gacgagtgag agctcgctga 1440

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 1500

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 1560

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 1620

ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 1658

<210> 21

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B132表达盒的核苷酸序列

<400> 21

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780

aattgtaccc gcggccgatc caccggtgcc accatggaaa tctgcagagg cctgagaagc 840

cacctgatta ccctgctgct gttcctgttc cacagcgaga caatctgcag gtgagtatct 900

cagggatcca gacatgggga tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca ctgtgggtct 960

ctctgttcac aggcccagcg gcagaaagtc cagcaagatg caggccttcc ggatctggga 1020

cgtgaaccag aaaaccttct acctgcggaa caatcagctg gtggccggct atctgcaggg 1080

ccccaatgtg aacctggaag agaagatcga cgtggtgccc atcgagcccc acgctctgtt 1140

tctgggaatt cacggcggca agatgtgcct gagctgtgtg aagtctggcg acgagacacg 1200

gctgcagctg gaagccgtga acatcaccga cctgagcgag aaccggaagc aggacaagag 1260

attcgccttc atcagaagcg acagcggccc caccacaagc tttgagtctg ctgcttgccc 1320

tggctggttc ctgtgtacag ccatggaagc cgaccagcct gtgtctctga ccaacatgcc 1380

tgacgagggc gtgatggtca ccaagttcta cttccaagag gacgagtgag cttatcgata 1440

ccgtcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga aactgggctt 1500

gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta ctgacatcca 1560

ctttgccttt ctctccacag gacgagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 1620

ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 1680

cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 1740

tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 1800

gcatgctggg ga 1812

<210> 22

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B133表达盒的核苷酸序列

<400> 22

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780

aattgtaccc gcggccgatc caccggtgcc accatggaaa tctgcagagg cctgagaagc 840

cacctgatta ccctgctgct gttcctgttc cacagcgaga caatctgcag gtgagtatct 900

cagggatcca gacatgggga tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca ctgtgggtct 960

ctctgttcac aggcccagcg gcagaaagtc cagcaagatg caggccttcc ggatctggga 1020

cgtgaaccag aaaaccttct acctgcggaa caatcagctg gtggccggct atctgcaggg 1080

ccccaatgtg aacctggaag agaagatcga cgtggtgccc atcgagcccc acgctctgtt 1140

tctgggaatt cacggcggca agatgtgcct gagctgtgtg aagtctggcg acgagacacg 1200

gctgcagctg gaagccgtga acatcaccga cctgagcgag aaccggaagc aggtaagtat 1260

caaggttaca agacaggttt aaggagacca atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag 1320

actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac atccactttg cctttctctc 1380

cacaggacaa gagattcgcc ttcatcagaa gcgacagcgg ccccaccaca agctttgagt 1440

ctgctgcttg ccctggctgg ttcctgtgta cagccatgga agccgaccag cctgtgtctc 1500

tgaccaacat gcctgacgag ggcgtgatgg tcaccaagtt ctacttccaa gaggacgagt 1560

gagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 1620

ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 1680

tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 1740

gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg a 1791

<210> 23

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAV843编码序列

<400> 23

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60

gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120

gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420

ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480

ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540

gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600

cctaatacaa tggcttcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660

ggagtgggta atgcctcagg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720

atcaccacca gcacccgaac atgggccttg cccacctata acaaccacct ctacaagcaa 780

atctccagtg cttcaacggg ggccagcaac gacaaccact acttcggcta cagcaccccc 840

tgggggtatt ttgatttcaa cagattccac tgccatttct caccacgtga ctggcagcga 900

ctcatcaaca acaattgggg attccggccc aagagactca acttcaagct cttcaacatc 960

caagtcaagg aggtcacgac gaatgatggc gtcacgacca tcgctaataa ccttaccagc 1020

acggttcaag tcttctcgga ctcggagtac cagttgccgt acgtcctcgg ctctgcgcac 1080

cagggctgcc tccctccgtt cccggcggac gtgttcatga ttccgcaata cggctacctg 1140

acgctcaaca atggcagcca agccgtggga cgttcatcct tttactgcct ggaatatttc 1200

ccttctcaga tgctgagaac gggcaacaac tttaccttca gctacacctt tgaggaagtg 1260

cctttccaca gcagctacgc gcacagccag agcctggacc ggctgatgaa tcctctcatc 1320

gaccagtacc tgtattacct gaacagaact cagaatcagt ccggaagtgc ccaaaacaag 1380

gacttgctgt ttagccgtgg gtctccagct ggcatgtctg ttcagcccaa aaactggcta 1440

cctggaccct gttaccggca gcagcgcgtt tctaaaacaa aaacagacaa caacaacagc 1500

aactttacct ggactggtgc ttcaaaatat aacctcaatg ggcgtgaatc catcatcaac 1560

cctggcactg ctatggcctc acacaaagac gacaaagaca agttctttcc catgagcggt 1620

gtcatgattt ttggaaagga gagcgccgga gcttcaaaca ctgcattgga caatgtcatg 1680

atcacagacg aagaggaaat caaagccact aaccccgtgg ccaccgaaag atttgggact 1740

gtggcagtca atctccagag cagcagcaca gaccctgcga ccggagatgt gcatgttatg 1800

ggagccttac ctggaatggt gtggcaagac agagacgtat acctgcaggg tcctatttgg 1860

gccaaaattc ctcacacgga tggacacttt cacccgtctc ctctcatggg cggctttgga 1920

cttaagcacc cgcctcctca gatcctcatc aaaaacacgc ctgttcctgc gaatcctccg 1980

gcagagtttt cggctacaaa gtttgcttca ttcatcaccc agtattccac aggacaagtg 2040

agcgtggaga ttgaatggga gctgcagaaa gaaaacagca aacgctggaa tcccgaagtg 2100

cagtatacat ctaactatgc aaaatctgcc aacgttgatt ttactgtgga caacaatgga 2160

ctttatactg agcctcgccc cattggcacc cgttacctca cccgtcccct gtaa 2214

<210> 24

<211> 737

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAV843氨基酸序列

<400> 24

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn

210 215 220

Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn

260 265 270

His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr

405 410 415

Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn

435 440 445

Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe

450 455 460

Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu

465 470 475 480

Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp

485 490 495

Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu

500 505 510

Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His

515 520 525

Lys Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe

530 535 540

Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met

545 550 555 560

Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu

565 570 575

Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro

580 585 590

Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp

595 600 605

Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro

610 615 620

His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly

625 630 635 640

Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro

645 650 655

Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile

660 665 670

Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu

675 680 685

Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser

690 695 700

Asn Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly

705 710 715 720

Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro

725 730 735

Leu

Claims

1.编码白介素1受体拮抗蛋白的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少50％的同一性，优选具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列，优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

3.转基因表达盒，其包括：启动子、权利要求1或2所述的核酸分子、polyA；优选地，所述polyA为bGH polyA。

4.根据权利要求3所述的转基因表达盒，其中，所述启动子选自：CB启动子、CAG启动子、SV40启动子、胶原蛋白collagen启动子、蛋白聚糖aggrecan启动子、滑膜蛋白基因启动子、脂肪组织特异性启动子PPAR白基因启动子、转录因子SOX9启动子和骨钙蛋白启动子；优选地，所述启动子为CB启动子。

5.根据权利要求3或4所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒还包括：位于启动子之后的内含子，和/或位于两端的两个ITR；优选地，所述内含子选自：SV40内含子、VH4内含子、Chi内含子、U12内含子、RHD内含子等1类内含子，所述两个ITR各自独立地为正常ITR或缩短ITR。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒还包括：插入至权利要求1或2所述的核酸分子中的至少一个内含子，优选地，所述内含子选自：SV40内含子、VH4内含子和Chi内含子。

7.根据权利要求3至6中任一项所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示，优选地，所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：19所示，更优选如SEQ ID NO：19所示。

8.基因递送系统，其包括：权利要求3至7中任一项所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。

9.根据权利要求8所述的基因递送系统，其中，所述AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白；优选地，所述AAV选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ和AAV843。

10.根据权利要求8或9所述的基因递送系统，其中，所述AAV衣壳蛋白为AAV843，其氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。

11.权利要求1或2所述的核酸分子、权利要求3至7中任一项所述的转基因表达盒或权利要求8至10中任一项所述的基因递送系统在制备用于治疗疾病的药物中的应用，所述疾病为可通过阻断IL-1信号通路而改善的疾病，如急性炎症疾病、慢性炎症疾病和恶性肿瘤；优选地，所述疾病为关节炎症，包括骨性关节炎、类风湿关节炎、滑膜炎、血友病关节炎和其他炎症引起的关节炎症；更优选地，所述疾病为骨性关节炎。

12.药物，其包含：权利要求1或2所述的核酸分子、权利要求3至7中任一项所述的转基因表达盒或权利要求8至10中任一项所述的基因递送系统，以及赋形剂。

13.根据权利要求12所述的药物，其中，所述药物用于治疗可通过阻断IL-1信号通路而改善的疾病；优选地，所述疾病为急性炎症疾病、慢性炎症疾病和/或恶性肿瘤；更优选地，所述疾病为关节炎症，包括骨性关节炎、类风湿关节炎、滑膜炎、血友病关节炎和其他炎症引起的关节炎症；更优选地，所述疾病为骨性关节炎。

14.根据权利要求12或13所述的药物，其中，所述药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、局部接触和病灶内施用，优选局部施用于关节腔，例如通过关节腔注射。