CN114451300A - 一种耐盐多倍体苹果砧木的诱导方法 - Google Patents

一种耐盐多倍体苹果砧木的诱导方法 Download PDF

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CN114451300A CN202210013818.1A CN202210013818A CN114451300A CN 114451300 A CN114451300 A CN 114451300A CN 202210013818 A CN202210013818 A CN 202210013818A CN 114451300 A CN114451300 A CN 114451300A
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李超
马锋旺
靳一勃
刘长海
毛柯
龚小庆
赵永娟
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Abstract

本发明涉及苹果组组织培养技术领域，具体涉及一种耐盐多倍体苹果砧木的诱导方法。包括以下步骤：取在继代培养基中生长45±2天的苹果组织培养苗的叶片，将叶片远轴面朝上置于含有DMSO和秋水仙素的诱导培养基上诱导培养，时间2‑3d；所述诱导培养基以再生培养基为基础培养基，添加质量百分比浓度为1‑3％的DMSO和0.05‑0.10％的秋水仙素。本发明的研究结果证实，DMSO和秋水仙素可协同配合提高富平楸子的多倍体诱导率，得到的多倍体富平楸子的耐盐性显著提高，研究成果对于开展苹果耐盐砧木定向育种具有重要的理论意义和实际应用价值。

Description

一种耐盐多倍体苹果砧木的诱导方法
技术领域
本发明涉及苹果组组织培养技术领域，具体涉及一种耐盐多倍体苹果砧木 的诱导方法。
背景技术
苹果是世界上最重要的水果之一，苹果的生产很大程度上依赖于接穗品种 嫁接的砧木。作为一种重要的经济果树，它的生产也受到各种环境胁迫(干旱、 低温、盐碱等)的影响。虽然在很多报道中说明染色体加倍在耐盐性方面发挥 着重要作用，但经检索，未发现利用秋水仙素加DMSO诱导多倍体培育耐盐苹 果砧木品种的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐盐多倍体苹果砧木的诱导方法，弥补现有技 术的空白。
本发明采用如下技术方案：
一种耐盐多倍体苹果砧木的诱导方法，包括以下步骤：
取在继代培养基中生长45±2天的苹果组织培养苗的叶片，将叶片远轴面 朝上置于含有DMSO和秋水仙素的诱导培养基上诱导培养，时间2-3d；所述诱 导培养基以再生培养基为基础培养基，添加质量百分比浓度为1-3％的DMSO 和0.05-0.10％的秋水仙素。
进一步的，所述苹果为富平楸子。
更进一步的，诱导培养前，叶片进行如下处理：在叶背处的叶脉上横切4-5 刀，然后用滤纸吸干多余水分。
更进一步的，诱导培养的培养温度为23-27℃，光照时间为13h/d，光照强 度为2000lx。
更进一步的，所述再生培养基为含有0.2mg/L TDZ、30g/L蔗糖、1mg/L NAA、5mg/L6-BA和0.8％琼脂的MS培养基，pH＝5.8。
更进一步的，将诱导后的叶片从诱导培养基中取出，再接种到所述再生培 养基中，暗培养4周后，进行光培养，培养温度为23-27℃，光照强度为2000lx。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用不同浓度的DMSO、秋水仙素，不同的诱导天数诱导叶片 和茎段，并利用多倍体富平楸子盐胁迫处理下的表型比较和生理参数测定，详 细鉴定了染色体加倍植物耐盐性的生物学功能，获得的研究成果对于开展苹果 耐盐砧木定向育种具有重要的理论意义和实际应用价值。
2、本发明诱导的富平楸子染色体加倍，能降低盐胁迫下多倍体植物的钠含 量，提高多倍体植物的抗氧化酶活性和植物激素(JA、ABA、GAs)含量，从 而提高多倍体植物的耐盐性，在提高植株耐盐的染色体工程育种方面有重要的 参考价值。
附图说明
图1为本发明秋水仙素诱导富平楸子后气孔观察和对比；
其中，图a和b为二倍体和拟多倍体富平楸子气孔大小和气孔密度比对， 图c、d、e、f为二倍体和拟多倍体富平楸子气孔长度、宽度、开长度和密度比 对。
图2为二倍和多倍体富平楸子叶片细胞核DNA相对含量比对。
其中图a为二倍体，图b、c、e为四倍体，图d、f为非整倍体。
图3为盐胁迫下多倍体富平楸子的表型分析。
其中，图a为植株形态比对，图b为植株高度比对；图c为植株茎粗比对；图 d为植株根长比对；图e为二倍体和多倍体富平楸子植株的叶片微结构比对(标尺 ＝50μm)；图f为盐处理后二倍体和四倍体富平楸子的叶片微观结构比对(标尺 ＝50μm)；图g为盐处理后二倍体和四倍体富平楸子的根系微观结构比对(标尺 ＝50μm)；图h为根系氯化三苯基四唑根(TTC)的还原强度比对；图i为植株相对 电导率(REL)比对；图j为植株叶绿素总含量比对；图k为植株丙二醛(MDA)含量
图4为盐胁迫下二倍体和多倍体富平楸子光合作用能力分析。
其中，图a为植株净光合速率Pn比对；图b为植株气孔导度Gs比对；图 c为植株蒸腾速率Tr比对；图d为植株Fv/Fm值比对。
图5为盐处理下二倍体和多倍体富平楸子的抗氧化系统分析。
其中，图a为植株NBT组织化学染色；图b为植株DAB组织化学染色； 图c为植株H2O2含量比对；图d为植株SOD活性比对；图e为植株POD活性 比对；图f为植株CAT活性比对。
图6为盐胁迫下二倍体和四倍体富平楸子中钠钾离子含量分析。
其中，图a-c为根、茎和叶中Na+含量比对；图d-f为根、茎和叶中K+含量 比对；图g-i为根、茎和叶中的Na+/K+。
图7为盐胁迫下二倍体和多倍体富平楸子植株叶片中离子转运相关基因表 达分析。
其中，图a为MdAKT1相对表达量比对；图b为MdHKT1相对表达量比对； 图c为MdNHX1相对表达量比对；图d为MdNHX2相对表达量比对；图e为MdNHX4相对表达量比对；图f为MdSOS1相对表达量比对；图g为MdSOS2 相对表达量比对；图h为MdSOS3相对表达量比对。
图8为盐胁迫下二倍体和多倍体叶片中ABA、JA、GAs含量分析和GAs 相关基因表达分析。
其中，图a为叶片中ABA含量比对；图b为JA含量比对；图c为叶片中 GAs含量比对；图d为MdKO相对表达量比对；图e为MdKS相对表达量比对； 图f为MdCPS相对表达量比对。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明 的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商 业途径得到。
以下实施例的实验在中国陕西杨凌(北纬34°20'，东经108°24')的西北 农林科技大学进行，富平楸子是我们实验室现有的材料。收集在继代培养基(0.4 mg/L NAA、30g/L蔗糖、0.8mg/L 6BA和0.8％琼脂(pH＝5.8)的Murashige and Skoog(MS)培养基)中，培养室温度为(25±2)℃，光周期13h，光照强度2000lx， 生长45±2天的苹果组织培养苗的叶片，采用锋利的无菌手术刀在叶背处的叶 脉上垂直切(横切)4-5刀，具体刀数根据叶片大小进行调整。取材后再用滤 纸吸干多余水分，将处理过的叶子远轴面朝上放置在含有0.2mg/LTDZ、30g/L 蔗糖、1mg/L NAA、5mg/L 6-BA和0.8％琼脂(pH＝5.8)的Murashige and Skoog(MS)培养基上。诱导培养基以再生培养基为基础培养基，加入秋水仙素和 DMSO。每个进程有180个叶子，分为三组。暗培养4周后，进行光培养。培 养室温度为23-27℃，光照时间为13小时，光照强度为2000lx。
实施例1：富平楸子多倍体诱导
1)DMSO浓度筛选
将处理过的叶子反向置于含有不同浓度DMSO和秋水仙素的诱导培养基 上。诱导培养基以再生培养基为基础培养基，加入不同浓度的秋水仙素和 DMSO，如表1所示。每道工序每处理180片叶，每个处理重复四次。暗培养 4周后，进行光培养。60天后，统计存活的叶片和愈伤组织的数量；并计算愈 伤组织率和成活率。如表一所示，当DMSO浓度为2％时，最有利于秋水仙素 诱导多倍体试验。愈伤组织率计算为存活叶片中生长愈伤组织的叶片的比率。 叶子变成棕色或黑色被定义为枯叶。成活率计算为整个处理样品中叶子保持绿 色的比例。
表1 DMSO浓度对秋水仙素诱导富平楸子多倍体的影响
Figure BDA0003458648020000051
2)秋水仙素浓度筛选
取生长45天的富平楸子组织培养苗的叶片，进行叶片处理，将处理过的叶 片反向置于含0.01％、0.02％、0.03％、0.04％和0.05％秋水仙素的诱导基础培养 基上。诱导5天后，将它们转移到正常再生培养基中。每次处理180片叶片， 重复3次。暗处理4周后，进行光培养。60天后统计存活外植体数、再生芽 数、愈伤组织数。并计算出芽率、再生率和诱导率。出芽率等于出芽叶片数与 存活外植体数之比；再生率等于再生芽数与存活外植体数之比，诱导率等于多 倍体植株数与外植体数之比。如表2所示，混合5天时，秋水仙素的最佳诱导浓度为0.01％。
表2秋水仙素浓度对诱导富平楸子多倍体的影响
Figure BDA0003458648020000061
3)诱导天数筛选
由表1结果可知，在相同DMSO浓度下，0.05％和0.1％浓度秋水仙素在成 活率和诱导愈伤组织率上无显着差异，预试验后叶片用0.1％浓度秋水仙素处理 死亡率极高，故选用0.05％浓度的秋水仙素进行诱导。而诱导天数为1天时， 不能诱导多倍体，故不计算。取生长45天的富平楸子组培苗的叶片，进行叶片 处理，处理后的叶片反向置于含0.05％秋水仙素的诱导培养基上。诱导2、3、 4、5或6天后，将它们转移到正常再生培养基中，每次处理180片叶片，重复 3次。暗培养4周后，进行光培养。60天后，统计存活外植体数、再生芽数、愈伤组织数。并计算出芽率、再生率和诱导率。如表3所示，0.05％秋水仙素 混合培养时，混合培养2天效果最好。
表3不同诱导天数对诱导富平楸子多倍体的影响
Figure BDA0003458648020000062
4)茎段秋水仙素浓度筛选
将带腋芽的富平楸子茎切成5cm左右的小段，平铺在0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％秋水仙素的诱导培养基上，转移到诱导培养基上诱导18天后，在 再生培养基中加入秋水仙素。然后将其转移到富平楸子的继代培养基中。每个 处理包含60个茎段，并重复3次。暗培养4周后，进行光培养。90天后，统计 存活茎数、诱导芽数、潜在多倍体植株数、多倍体植株数，计算成活率、增殖 系数、诱导率。增殖系数计算为诱导芽数与存活数的比值。如表4所示，0.02％ 秋水仙素作为最佳茎段诱导浓度。
表4秋水仙素浓度对茎段诱导富平楸子多倍体的影响
Figure BDA0003458648020000071
因此，叶片诱导多倍体诱导最佳体系为：秋水仙素质量百分比浓度0.05％， DMSO质量百分比浓度2％，诱导时间2天。
实施例2：富平楸子多倍体的筛选与鉴定
在实施例1实验的最后一天，从选定的植株上切下相同位置的成熟叶子， 并立即在戊二醛溶液中切成小块。用JSM-6360LV扫描电子显微镜观察叶气孔。 使用Image J图像分析软件测量气孔的长度、宽度、孔径和密度。楸子二倍体 WT的气孔较圆，Y3、Y5、Y86、Y18的气孔长宽比较大，呈椭圆形(图1a、 b)。与WT明显不同，叶片上的气孔显得大小不均，偶尔会出现超大气孔，气孔 又窄又长，开度很低；或形状与大多数多倍体气孔相似，但开口很大。被鉴定 为潜在的多倍体植物。二倍体气孔在叶片上分布较为均匀，潜在的多倍体气孔部分集中在某一区域(图1c-f)。为了进一步确定它是否是多倍体，我们使用流 式细胞术来鉴定潜在的多倍体植物。
取每株植物的新鲜叶子，用于使用流式细胞术研究多倍性水平。分析步骤 如下进行：首先通过将植物组织切碎到Sysmex Partec CyStain UV Precise Plysate 中提取细胞核悬浮液。使用30μm过滤网将释放的细胞核悬浮液过滤到1.5mL 离心管中。将100μL0.05mg/mL碘化丙啶(PI染液(含有200μg/mLRNA酶)加 入细胞核悬浮液中。在分析前，将细胞核悬浮液在黑暗中染色30分钟以上。通 过计算机测试检测细胞核中染色的AT碱基的荧光强度。输出图的横坐标代表荧 光强度，纵坐标为细胞数。如果二倍体的荧光强度为100，则单倍体的荧光强度 为50，四倍体的荧光强度为200。WT和染色体组加倍植物的典型直方图分别如 图2所示。峰荧光强度X-Mean与细胞DNA含量成正比，通过峰的横坐标位置 可以判断倍性。峰出现在横坐标100的位置为二倍体WT，所以Y3、Y5和Y86 是多倍体，Y18是非整倍体。研究结果也存在Y19等非单峰性，甚至多峰现象。 信号峰值显得更低、更高、更宽或更窄。它表明植物的细胞染色体只有一部分 加倍。
实施例3：富平楸子多倍体的盐胁迫处理与耐盐性状鉴定
以诱导后检测为二倍体的富平楸子作为对照，命名为WT，将多倍体富平楸 子命名为Y3和Y5。将其移植到装满土壤/珍珠岩/蛭石(4:1:1,v:v:v)的塑料盆 (12×12cm)中，并放置在生长室中。将处于同一生长阶段(7-9片真叶)的二倍 体和多倍体楸子转移到塑料容器(52×37×15cm3)中，该容器用黑色塑料包裹， 并装有13L半强度的Hoagland营养液。用H3PO4或KOH将营养液的pH值调 至6.0±0.2，每3天更换一次。预培养15天后，挑选大小一致且健康的植物进行 处理。将幼苗随机分为两组，每组45株：(1)对照组(CK)为pH值为6.0±0.2 的半强度Hoagland营养液；(2)在此基础上加入100mmol/L NaCl。对照组的溶 液pH值用1M NaHCO3和1M Na2CO3(1:1)调节，处理持续15天。
盐胁迫处理结束后，进行如下指标的测定：
1)植物生理指标及叶绿素含量测定
盐胁迫处理结束时，为了评价盐处理后二倍体和多倍体富平楸子幼苗生长 的差异，水培盐处理后每个处理采集9株植株。与二倍体植物相比，盐胁迫后， 多倍体对盐胁迫的耐受性更强(图3a)用尺子测量植株从茎基部到主茎顶芽的 高度，并测量植株的根长和茎粗。多倍体系受到的影响比WT更严重(图3b)， 多倍体的茎比二倍体粗(图3c)，并且发现多倍体的根长明显短于二倍体的根长 (图3d)。在盐胁迫处理结束时，从每个处理中随机挑选10株植物的叶子并彻 底清洗。叶片和根部用单面刀片处理至合适大小后，用FAA固定液(40％甲醛 5mL、冰醋酸5mL、95％乙醇90mL配比)浸泡24小时以上，固定。用RM2016 病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)切成合适的大小。切片在二甲苯和 100％Ⅰ％～100％Ⅱ～75％酒精两种溶液中复水。每一步都需要分钟。最后，用 流水冲洗。将切片放入番红染色溶液中15-30秒和三缸无水乙醇进行快速脱水。 将玻片放入50％、70％和80％酒精中3～8秒。切片放入植物固绿染色液染色6～20 s，无水乙醇三缸脱水。将切片放入三缸二甲苯中5分钟。在显微镜(NIKON ECLIPSE E100)下观察并拍摄图像。结果表现为多倍体中细胞更大，表皮和栅 栏组织更厚(图3e，f)；盐处理后，多倍体富平楸子的根细胞更大，排列更紧 密(图3g)。使用三苯基四唑氯化物(TTC)方法测量根部活体染色发现多倍体系 的根活性显着高于二倍体系(图3h)。测量相对电导率(REL)以及叶绿素浓度 后发现多倍体植物相对电导率增加幅度较小，叶绿素含量较高(图3i、j)。使 用硫代巴比妥酸反应测量叶子的MDA水平，发现各株系MDA含量增加，但多 倍体显著低于二倍体。
2)光合参数和叶绿素荧光参数的测定
使用CIRAS-3便携式光合作用系统(CIRAS-3,PP Systems,Amesbury, USA)。对于每个处理，从相同位置的十片完全暴露和成熟的叶子测量光合参 数。盐处理后，各菌株的Pn、Gs和Tr均呈现逐渐下降的趋势，但WT的下 降幅度更大(图4a-c)。叶绿素荧光(Fv/Fm)采用双PAM-100系统(Heinz Walz, Effeltrich,Germany)进行监测。叶片暗适应20min后测定叶绿素荧光参数，多 倍体植物的Fv/Fm值高于二倍体植物，且差异显著(图4d)。以上结果表明， 盐胁迫处理后，多倍体楸子的光合能力受到的损害比二倍体要小。
3)ROS积累和抗氧化酶活性的测定
通过分别在3,3'-二氨基联苯胺(DAB)和硝基蓝四唑(NBT)的溶液中对叶子进 行染色来测量H2O2和O2-的积累。WT叶片上更强烈的棕色着色或蓝色斑块， 表明多倍体系积累的ROS少于二倍体(图5a-c)。对H2O2浓度和超氧化物歧化 酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性测定。过氧化氢酶(CAT)的活性通过苏州 科敏生物技术检测试剂盒(苏州科敏生物科技有限公司，苏州，中国)检测。 结果表示，与二倍体植物相比，多倍体植物具有更高的SOD、POD和CAT酶活 性(图5d-f)，差异显著。这些数据表明，在盐胁迫下，多倍体植株对有毒活性氧的清除能力强于二倍体植株。
4)Na+和K+浓度通过火焰光谱法(M410；Sherwood Scientific，Cambridge， UK)测定。结果表示，与二倍体植物相比，多倍体植物各组织部分中钠离子的 增加量较低(图6a、b、c)；多倍体植株各组织部分的钾离子减少较少(图6d、 e、f)因此Na+/K+比值也显着高于多倍体植物(图6g、h、i)。综上所述，染色 体加倍影响楸子根系的离子稳态，更有利于较高盐分胁迫下植物的发育生长。
ABA、JA和GAs等使用LC-MS系统测量。简而言之，在2ml溶剂(甲 醇：异丙醇，20：80(v：v)和1％冰醋酸)中提取200mg冷冻叶样品。离 心后，将上清液通过0.22-μm过滤器过滤以使用上述相同的系统进行分析，但 配备InertSustain AQ-C18柱(4.6×150mm，5μm)，流速为0.5ml/min。溶剂 系统由含有0.1％(v:v)甲酸(A)和甲醇(B)的水组成。试验结果表明，在盐 胁迫下，多倍体植物的ABA含量低于二倍体植物(图8a)；多倍体植物在盐胁 迫下的JA增加高于二倍体植物(图8b)，这表明多倍体植物会通过在盐胁迫下 积累更多的JA和ABA来增加其对盐胁迫的抵抗力；盐胁迫前GAs含量不同。 二倍体植物GAs含量明显高于多倍体植物。然而，盐胁迫处理后，多倍体植物 的GAs含量与盐胁迫前相比显着增加(图8c)。
5)RNA提取和定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析
提取盐处理中材料的总RNA。进行定量实时PCR分析。结果表明，多倍体 系中的MdAKT1、MdHKT1、MdNHX1、MdNHX2、MdSOS1、MdSOS2和MdSOS3 基因表达高于二倍体植物(图7a-h)。这些发现表明多倍体富平楸子对盐胁迫的 耐受性与Na+/K+比率的平衡相关。盐胁迫后，多倍体富平楸子中MdKO、MdKS 和MdCPS的表达水平显着上调，且上调水平也高于二倍体植物(图8d-f)。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值 范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本 发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基 本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要 求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发 明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及 其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种耐盐多倍体苹果砧木的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
取在继代培养基中生长45±2天的苹果组织培养苗的叶片，将叶片远轴面朝上置于含有DMSO和秋水仙素的诱导培养基上诱导培养，时间2-3d；所述诱导培养基以再生培养基为基础培养基，添加质量百分比浓度为1-3％的DMSO和0.05-0.10％的秋水仙素。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述苹果为富平楸子。
3.根据权利要求2所述的诱导方法，其特征在于，诱导培养前，叶片进行如下处理：在叶背处的叶脉上横切4-5刀，然后用滤纸吸干多余水分。
4.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，诱导培养的培养温度为23-27℃，光照时间为13h/d，光照强度为2000lx。
5.根据权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，所述再生培养基为含有0.2mg/L TDZ、30g/L蔗糖、1mg/L NAA、5mg/L 6-BA和0.8％琼脂的MS培养基，pH＝5.8。
6.根据权利要求5所述的诱导方法，其特征在于，将诱导后的叶片从诱导培养基中取出，再接种到所述再生培养基中，暗培养4周后，进行光培养，培养温度为23-27℃，光照强度为2000lx。
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