CN114450419A - 新型核酸纯化化学物质 - Google Patents

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Abstract

本发明一般性涉及在二氧化硅固体支持物上进行核酸分离的领域。特别地，本文公开了新型二氧化硅‑固体支持物的结合核酸的缓冲液化学物质，其基于在酸性条件下使用小的四元有机化合物，例如氯化四甲铵(TMAC)。这种新型核酸纯化化学物质不仅纯化RNA，而且还能纯化DNA，并具有在各种各样的商业试剂盒中可被用于实施的潜力，所述商业试剂盒包括从离心柱到集成芯片实验室(Lab‑On‑A‑Chip)(LOC)设备，诸如利用固相提取技术的一次性药盒。此外，本发明方法可以使用相对小体积的结合缓冲液并因此可以在此类集成或封闭的分子诊断设备中进行，它们具有允许增加样品输入体积的潜力，这对于诸如血浆或尿液的液体活检样品，可以增加检测稀有核酸靶的机会。

Description

新型核酸纯化化学物质
技术领域
本发明一般性涉及在二氧化硅固体支持物上进行核酸分离的领域。特别地，本文公开了新型二氧化硅-固体支持物的结合核酸的缓冲液化学物质，其基于在酸性条件下使用小的四元有机化合物，例如氯化四甲铵(TMAC)。这种新型核酸纯化化学物质不仅纯化RNA，而且还能纯化DNA，并具有在各种各样的商业试剂盒中可被用于实施的潜力，所述商业试剂盒包括从离心柱到集成芯片实验室(Lab-On-A-Chip)(LOC)设备，诸如利用固相提取技术的一次性药盒。此外，本发明方法可以使用相对小体积的结合缓冲液并因此可以在此类集成或封闭的分子诊断设备中进行，它们具有允许增加样品输入体积的潜力，这对于诸如血浆或尿液的液体活检样品，可以增加检测稀有核酸靶的机会。
技术背景
在1990年提交的专利EP389063中，Boom等人描述了通用的基于固体支持物吸附的核酸纯化技术。Boom提取使用大量离液(chaotropic)盐，在有或无醇存在的情况下，介导核酸与二氧化硅的结合。由于其允许从生物样品中提取>50％的核酸的高性能，其已迅速成为核酸分离中的金标准，至今仍广泛用于许多商购可得的提取试剂盒和集成分子诊断设备中。例如，Boom方案或其轻微变型形成了在QIAGEN’s QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒中或在BiocartisNV的集成药盒诸如Idylla ctRAS中使用的DNA提取原理的基础。
由于需要使用大量的离液盐，以及随后还需要附加的醇，因此Boom方案相对于生物样品的量需要大量的结合缓冲液。出于该原因，鉴于日益小型化的手持、完全集成的芯片实验室(LOC)分子测试设备(所述设备通常旨在最大化样品体积，因此缺乏足够的缓冲液体积的存储)的不断出现，因此需要找到Boom方案的有效替代方案。另一个原因是离液盐价格昂贵，具有很强的PCR抑制特性，并且会给最终产品生产线带来多重挑战。由于上述原因，目前存在对有效且不含离液剂(chaotrope)的核酸纯化化学物质的需求，所述核酸纯化化学物质使得能够增加集成系统中的样品输入，特别是对于液体活检领域中的应用，其中样品尺寸对于检测例如每毫升血浆无细胞(cf)DNA靶标非常稀少的情况变得越来越重要。
迄今为止，已经进行了几次尝试来开发新型不含离液剂的基于二氧化硅的核酸纯化化学物质。其中值得注意的实例包括：
Hourfar等人在2005年发表的方法，其描述了基于酸性条件和亲液(kosmotropic)盐的使用的病毒RNA纯化。该出版物的名称为“High-Throughput Purification of ViralRNA Based on Novel Aqueous Chemistry for Nucleic Acid Isolation”。该方法是RNA特异性的，不适于从血浆中纯化DNA。
Lee等人在2008年发表了类似的方法，该方法涉及通过使用亲液的Hofmeister盐从大肠杆菌(E.coli)中分离总RNA。另外，Lee等人拥有名称为“Method of purifying RNAusing kosmotropic salt”的专利US 7,923,551。该出版物和专利都描述并集中于基于酸性条件和亲液盐(kosmotropic salt)的使用的RNA选择性纯化化学物质，但没有提供任何关于如何将该化学物质应用于DNA的教导。
The Johns Hopkins University拥有名称为“Chaotrope-and volatile-freemethod for purifying nucleic acids from plasma”的专利申请WO2016/073824。其中描述的方法非常类似于Lee等人的方法，并且包括使用酸性条件和亲液盐来介导RNA与二氧化硅的结合。
MiDiagnostics持有名称为“System and method for purifying andamplifying nucleic acids”的非常相似的专利申请WO 2018/156906 A1。该专利申请描述了使用酸性条件和亲液盐来介导病毒核酸与二氧化硅的结合的核酸纯化化学物质。然而，该方法没有提供任何证据证明其至少与Boom方案一样有效，也没有证明其可适用于存在于血浆中的cfDNA的纯化。
尽管广泛用于分子诊断学，对于核酸与二氧化硅的相互作用仍知之甚少。事实上，自从Boom等人在1990年发表了第一个基于二氧化硅的核酸纯化技术以来，并没有太大的变化。迄今为止，试图揭示DNA/RNA吸附到二氧化硅上的基本机制的研究极其有限。
Melzak等人(1996年)是试图揭示Boom提取技术的基本机制的少数人之一。他们描述了被认为是核酸吸附到二氧化硅上的主要贡献者的三种效应，其包括：
·屏蔽的分子间静电力
·DNA和二氧化硅表面的脱水
·核酸-二氧化硅接触层中的分子间氢键形成(被描述为最不重要的贡献者)。
在二氧化硅固体支持物存在的情况下，可通过向核酸溶液中添加不同的盐来调节上述三种因素。Hofmeister根据盐在水溶液中影响大分子(主要是蛋白质)结构的能力对盐进行了分类。根据这一分类，离液盐最初被描述为结构破坏剂，因为它们增加了蛋白质的溶解度(所谓的“盐溶(salting-in)”)。与上述相反，亲液盐被描述为结构构造剂，因为它们降低了蛋白质的溶解度(称为“盐析”)。在基于二氧化硅的核酸分离的情况下，离液盐是自然的选择，因为它们能够影响水的结构并引起脱水作用。从这个角度来看，离液离子被Hofmeister描述为具有低电荷密度的大的单电荷离子，其与水的相互作用弱于水与其自身的相互作用。据信它们很少干扰周围水的氢键。例如，在Boom等人于1990年描述的最初的核酸纯化化学物质中，使用了高浓度的硫氰酸胍盐，这是由于其强的离液性质、其细胞溶解特性以及其灭活核糖核酸酶的潜力。相反，亲液离子被描述为具有高电荷密度的小的或多电荷的离子，因此能够破坏水之间的氢键。
尽管胍鎓阳离子和硫氰酸根阴离子预计不具有大的水合壳，但据信它们在Boom方案中使用的过高浓度(3M-5M)补偿了这一点。据推测，由于盐的这一高浓度，游离水的浓度可以充分降低，导致核酸和二氧化硅膜脱水。另外，据信丰富的胍鎓阳离子屏蔽了核酸中带负电荷的磷酸酯主链与二氧化硅表面上带负电荷的硅烷醇基团之间的静电力。可以假设这两种效应促进了碱基与硅氧烷桥之间的疏水相互作用，从而使得核酸能够被吸附到二氧化硅膜上。后来对原始Boom方案的修改包括在结合缓冲液中加入醇，以进一步降低游离水的浓度并增强这种脱水效果。
根据该改变，随后用浓醇(通常为70％-90％乙醇)洗涤二氧化硅结合的核酸。洗涤程序确保去除源自生物样品或结合缓冲液的残留非核酸化合物。最后，在中性或弱碱性pH下用低离子强度溶液洗脱核酸。洗脱机制使得能够与诸如PCR和NGS等下游应用直接相容。
如上所解释的，Hourfar等人首次发表了用于从生物样品中纯化RNA的基于二氧化硅的替代方法。Samsung electronics、Johns Hopkins University和MiDiagnostics的后续出版物和/或专利基于相同的化学物质，其使用酸性条件和亲液盐来介导RNA(以及在低得多的程度上DNA)与二氧化硅的结合。这种化学物质作用于RNA的可能解释可是基于以下几点。二氧化硅表面硅烷醇基团的pKa值为4-8。将结合缓冲液-样品混合物的pH值降低至这些值以下，会促进弱酸性硅烷醇基团的质子化，从而消除弱酸性硅烷醇基团的强负电荷。因此，与核酸的带负电荷的磷酸酯主链的静电荷排斥被严重降低或者甚至完全消除。
另外，最小量的亲液盐(即(NH4)2SO4)可用于显著减少游离水的量，从而使核酸和二氧化硅膜脱水。如前所解释的，强亲液离子可具有大的水合壳层，捕获大量的自由水。在这方面，可以假设只需要有限量的亲液盐(400mM–1000mM，取决于具体的盐)就可以提供类似于例如5M的硫氰酸胍的效应。这些效应可以用来解释柔性RNA与二氧化硅的结合，以及在低得多的程度上双链的并因此更硬的DNA与二氧化硅的结合。
结合的核酸然后用高百分比的醇洗涤，如在Boom方案中所进行的，尽管描述了其中洗涤完全不含醇的变体方案。在所述变体方案中，用类似于结合缓冲液或其简化形式的缓冲液(即不含或含限量亲液盐的酸性溶液(pH 4-7))进行洗涤。可以假设，这些洗涤程序主要基于试图消除由于硅烷醇基的质子化而产生的静电荷排斥，这阻止了核酸的洗脱。然后，洗脱机制类似于Boom方案的洗涤机制。
必须注意的是，该方法已被证明在RNA的纯化中非常成功(通常甚至被描述为RNA选择性的)，而双链DNA(dsDNA)的纯化的挑战性仍然大得多。已显示根据这些化学方法的dsDNA提取产率低至1/100至1/10，这显然不足以从血浆中提取DNA。
在本文中，我们通过成功使用由小的四元有机化合物阳离子和非常弱的离液的且高度可溶的阴离子构成的盐，解决了无强离液剂的核酸提取方法的缺点。四元化合物是由中心带正电荷的原子和四个不带电荷的取代基(主要是烷基和芳基)构成的阳离子。这些阳离子永久性带电荷，与其溶液的pH值无关。它们通常被描述为惰性阳离子。特别地，我们已观察并证明了由例如四甲基铵(TMA+)阳离子与弱离液的氯(Cl-)或溴(Br-)阴离子的组合构成的盐在酸性pH下产生了用于在二氧化硅固体载体上分离dsDNA的独特条件，其效率与基于离液剂的方案诸如Boom方案相匹配。
据我们所知，由小的四元有机化合物阳离子和弱离液的阴离子构成的盐没有被用于从生物样品中进行基于固体支持物的核酸提取。尽管J.M.Orosz和J.G.Wetmur在1977年使用类似的盐研究了DNA和dsRNA的解链和复性性质(Biopolymers，第16卷，1183-1977)，但他们的研究没有考虑在固相核酸提取中使用这些盐的选择。另外，WO2015165859描述了在用于富集含有单链poly(A)区段(即，主要是信使RNA)的核酸的方法中使用钠盐与季铵盐的组合，同时清除包被有固定化寡-dT捕获探针的固体支持物上的不想要的核酸(诸如例如rRNA)的方法中钠盐与季铵盐组合的用途。WO2015165859的教导暗示了对poly(A)核酸的严格和选择性特异性，并且似乎不适用于从样品诸如液体活检物中分离任何其它类型的核酸。然后，WO1995015970公开了包含氯化四甲铵((CH3)4NCl)和阳离子去垢剂的杂交溶液，其用于将合成寡核苷酸固定到固体表面如聚苯乙烯上。然而，重要的是，WO1995015970没有教导在固体支持物上纯化来自复杂生物样品背景的天然核酸，特别是来自诸如血浆等液体活检样品的天然核酸。总之，上述公开内容都没有教导或暗示将小的四元有机化合物盐作为Boom方案的一般替代方案用于核酸分离。
与Boom方案相比，此处呈现的方法具有几个优点。首先，Boom方案最初被设计用于分离长基因组和质粒DNA/RNA。其在分子诊断中的应用受到了血浆和FFPE样品中通常存在的基因组物质的高度片段化性质的挑战。核酸的短片段天然具有少得多的疏水性结合位点，因此在Boom方案中使用的高离液剂浓度下限制了它们与二氧化硅的结合效率。与这种限制相反，使用本文提出的基于由季阳离子和温和离液剂构成的盐的方法，我们能够分离较短和较长的dsDNA片段。此外，我们已经观察到，短DNA(即长度在10-300bp范围内)的提取效率可以随着pH的升高而降低，而高分子量DNA的提取效率可以随着pH的升高而提高，因此表明通过改变pH值，本文公开的方法另外打开了针对所需DNA靶标长度微调提取效率的方法。
本文公开的方法的下一个优点是结合缓冲液的化学物质组成不会引起蛋白质聚集，这在原则上允许在无蛋白质消化步骤的情况下处理血浆样品。血浆结合缓冲液混合物使得能够实现平稳的流速，这有利于其在微流体设备中的使用。因此，对于低体积或稀释的样品，当使用此处公开的方法时，可以跳过蛋白质消化步骤，即使对于一些体积>400μL的旧血浆样品，蛋白质消化步骤的并入作为增加最终提取产率的任选的步骤仍然是有益的。
然后，如上所述，LOC设备或一次性药盒通常缺乏足够的储存空间，无法容纳Boom方案中使用的相对大量的结合缓冲液。另外，离液盐价格昂贵，具有很强的PCR抑制特性，并且会在生产线上引入许多问题，例如由结晶引起的问题。与此相反，此处提出的方法和结合缓冲液不含强离液剂，价格低廉，并且大大减少了每个样品所需的结合缓冲液体积，从而使得能够在完全集成的分子诊断设备中增加样品输入。后者对于处理例如从癌症患者获得的液体活检物具有很大的优势，其中每毫升血浆的肿瘤来源的突变DNA拷贝的量非常稀少并且难以检测。最后但并非最不重要的是，此处提出的方法是通用的，这意味着它们使得能够从不同的生物样品中高效地纯化短和长的dsDNA以及ssDNA和潜在的RNA。
发明概述
自从Boom等人在1990年发表了最初的方法以来，基于二氧化硅的核酸纯化的化学物质没有太大变化。这主要是由于Boom提取技术的充足性能，其从生物样品中提取核酸的产率>50％。Boom方案通过使用大量的离液盐和醇来介导核酸与二氧化硅的结合。然而，鉴于最近小型化集成芯片实验室(LOC)设备的出现，出现了对最小化其中包含的缓冲体积以便最大化它们可以接受的样品体积输入的需求。因此，显然需要新型核酸纯化化学物质，其不含强离液剂、经济，并且使得能够增加集成系统中的样品输入。
在本文中，我们提出了新型纯化化学物质，其通过仅使用酸性条件和相对少量的由季铵化合物构成的盐来介导核酸与二氧化硅的结合。所公开的方法相对于样品体积显著减少了结合缓冲液体积，因此使得能够增加样品输入，这在完全集成的分子诊断设备中非常有益。此外，所公开的分离方法提供了与基于强离液剂的方案诸如Boom方案的性能相当的足够的核酸产率。
附图说明
为了更全面地理解本文提出的概念，参照以下结合附图的详细说明，其中：
图1：显示了中性pH下不同的离液盐和亲液盐结合缓冲液中dsDNA的提取效率；
图2：显示了酸性pH下不同的离液盐和亲液盐结合缓冲液中dsDNA的提取效率；
图3：显示了Boom提取结合缓冲液与含有或不含季铵化合物的基于氯化物的缓冲液之间的比较；
图4：显示了在不同pH范围下不同DNA提取化学物质的比较；
图5：显示了TMAS与TMAC之间的比较；
图6：显示了不同的含TMA盐的性能；
图7：显示了不同结合浓度下TMAC的性能；
图8：显示了TMAC在不同pH值下的性能；
图9：显示了在有或无不同浓度的CTAB的情况下，TMAC对不同血浆批次的性能；
图10：显示了不同TMAC缓冲液的性能；
图11：显示了不同洗脱条件的研究；
图12：显示了包括蛋白酶预消化的潜在益处；
图13：显示了所述方法在封闭的集成药盒中的性能。
图14和图15：显示了在封闭的集成药盒中针对不同批次的血浆的Boom提取化学物质与TMAC+CTAB提取化学物质之间的比较。
发明详述
本发明总体上涉及核酸提取方法，其包括在pH值为3至6的条件下，在由以下物质构成的盐存在的情况下，使生物样品(可能是液体活检样品)与二氧化硅固体支持物接触：
-小的四元有机化合物，定义为由中心带正电荷原子与四个有机取代基R1-R4构成的四元化合物，其中每个有机取代基R1-R4中的碳原子数不超过2；以及
-溴阴离子或氯阴离子。
换句话说，在此公开了新型结合缓冲液化学物质，其基于使用酸性条件和最少量的包含小的四元有机化合物的盐，其提供了通用的、无离液剂的核酸纯化方案，该方案不仅使得能够有效分离RNA，而且还使得能够有效分离DNA。如本文中所用，术语“四元化合物”可与术语“四元有机化合物”互换使用，所述四元有机化合物应理解为定义为是或具有离子的化合物，所述离子是由中心带正电荷原子与四个有机取代基(即烷基和/或芳基，并且不考虑氢原子)构成的阳离子，所述四个有机取代基被进一步指定为有机取代基R1-R4。如本文中所用，术语“小的四元有机化合物”应理解为这样的四元有机化合物，其中四个有机取代基R1-R4中的每一个中的碳原子数不超过两个碳原子。出于溶解度的考虑，优选有机取代基是单个碳基团，即甲基。我们认为4个有机取代基R1-R4中由甲基构成的越多，溶解性越好，因此更容易和更优选与小的季铵有机化合物一起作用。尽管如上所述，我们还相信在四个有机取代基R1-R4中的一个或多个上包含两个碳原子的有机取代基仍然是充分可溶的，并且适当地适合于实施本文公开的方法。
最熟知的四元化合物是季铵盐，其是包含在中心具有氮原子的季铵阳离子(R4N+)的盐。因此，在实施方案中，提供了方法，其中小的四元有机化合物的带正电荷原子是氮。其它可能的实例和貌似可行的实施方案可以包括季鏻盐(R4P+)、季砷盐(R4As+)如砷甜菜碱，以及一些含砷超导体。取代的锑盐(R4Sb+)和铋盐(R4Bi+)也被描述为存在，并且可能在本文提出的方法的某些实施方案中起作用。
IA在后面的实施例中证明，本发明方法中使用的盐的阴离子也影响最终的核酸提取产率。与上述已知的RNA特异性方法相反，强亲液阴离子似乎不适合提取DNA。相反，我们已经认识到，非常弱的离液离子如溴离子或甚至更弱的离液剂/临界亲液剂(kosmotrope)氯离子通常提供最好的结果，在大多数实验设置中稍微偏向于后者。因此，在下一个实施方案中，提供了其中阴离子是氯离子的方法。
我们假设上面突出显示的RNA和DNA与二氧化硅结合的差异可能源于RNA的至少部分单链性质。也就是说，我们认为RNA与二氧化硅的结合比dsDNA的结合更容易，这可能是由于单链核酸中碱基的旋转移动性增加，从而增加了它们可用的疏水结合位点的数量。相反，双链DNA可能需要对其螺旋结构进行实质性改变，以促进碱基与二氧化硅膜的硅氧烷(Si-O-Si)桥之间的疏水相互作用。
据信DNA双螺旋主要由以下因素稳定：
·碱与水环境之间的氢键；
·带负电荷的磷酸酯主链的静电屏蔽；
·相邻碱基之间的碱基堆积相互作用。
后者被描述为双螺旋稳定性的最主要贡献者。我们已经假定双螺旋的去稳定化是允许与二氧化硅膜有效结合所必需的，并且存在的离子的类型和量在定义双链DNA的螺旋构象中具有主要作用。
根据我们的经验，酸性条件和亲液盐似乎不会促进dsDNA与二氧化硅的结合。有可能使用有限量的亲液盐会改变双螺旋的构象，可能进一步降低dsDNA对二氧化硅膜的亲和力。因此，我们假设，在本方法之前已知的基于亲液剂的方法是RNA选择性的。具有高电荷密度的小阳离子理论上能够在螺旋结构的小沟与大沟之间配合，而强亲液阴离子可以强烈地使双螺旋脱水，可能导致双螺旋的构象变化为刚性A-DNA，因此假设导致与二氧化硅固体支持物结合的碱基的可用性降低。根据这一推理，我们假设，为了抵消这种降低亲和力的效应并促进dsDNA与二氧化硅膜的结合，应该消除阳离子的稳定作用并降低亲液阴离子的脱水作用。我们发现，这种作用可以通过使用由季铵化合物和弱的离液/弱的亲液阴离子诸如氯离子构成的盐来实现，所述盐被描述为处于离液和亲液行为的界线上。季铵化合物是由中心带正电荷氮原子与四个不带电荷的取代基(主要是烷基和芳基)构成的阳离子。这些阳离子永久性带电荷，与其溶液的pH值无关。它们通常被描述为惰性阳离子。
基于我们的理论模型，我们假设使用小的四元有机化合物如TMAC的本发明方法的成功可能至少部分是由于季铵阳离子的惰性和绝对尺寸(sheer size)防止了带负电荷的dsDNA磷酸酯主链的静电屏蔽。TMA+的甲基也可能引起空间位阻，从而阻止其与螺旋结构的小沟或大沟结合。通过使用由这种惰性阳离子构成的盐，我们认为阻止了负面影响dsDNA对二氧化硅的亲和力的构象转变，而弱的离液阴离子仍可提供二氧化硅支持物的充分脱水，以便高效地结合dsDNA双螺旋，这是我们观察到的。
根据上述内容，在下一个实施方案中，提供了其中小的四元有机化合物是氯化四甲铵(也称为TMAC)的方法。在另外的实施方案中，正如在下面的实施例中所支持的，小的四元有机化合物的浓度，例如在二氧化硅结合条件下的TMAC浓度，在0.1M与2M之间，可能在0.5M与1.8M之间，或者可能在0.8M与1.6M之间，或者可能在1M与1.4M之间，或者可以是约1.2M。
所公开方法的优点之一是，根据所需的应用、其潜在的最大化样品输入体积对比所需的结合缓冲液体积。所述特征对于具有限定和有限的内部容积的集成设备(诸如封闭的流体药盒)尤其有利。所述特征直接取决于结合缓冲液组分的溶解度。优选的小的四元有机化合物TMAC具有>1000g/L的优异溶解度，这对应于9M TMAC的在室温下稳定的溶液。乙酸钠是用于确保酸性pH条件的示例性缓冲化合物，在水中也具有等于5.6M的高溶解度。因此，例如，如果在所公开方法的实施方案中，在核酸与二氧化硅结合的条件(即样品和结合缓冲液与二氧化硅固体支持物接触的条件)下使用1.2M TMAC和0.2M乙酸乙酯，则在结合条件下有可能实现6/1的样品与缓冲液的比率。这种示例性结合缓冲液将包含8.4M TMAC和1.4M乙酸盐，这两种浓度在室温下都是可溶的。因此，在可能的实施方案中，样品/缓冲液比率的范围可以从6/1一直到1/6，这取决于什么适合应用。
所公开方法的独特性在于使用由小的四元有机化合物和弱的离液阴离子(即，氯离子，或在一定程度上还有溴离子)构成的盐在酸性条件下介导核酸(不仅是RNA，而且尤其是DNA，特别是dsDNA)与二氧化硅膜的结合。如本文中所用，术语“酸性条件”应理解为是指水溶液中的pH值至少低于为7的值的条件，所述pH值是本领域广泛接受的，并基于氢离子的摩尔浓度(以摩尔/升为单位测量的)的以10为底的对数标度的标准pH值来估计。因此，在另外的实施方案中，提供了方法，其中pH值在4与5.8之间；4.2与5.6之间；4.4与5.4之间；4.6与5.2之间；并且可能约为5。我们相信，在这些pH范围内和在二氧化硅固体结合支持物存在的情况下，上述特定盐组合物的提供提供了通用的核酸纯化技术，其不仅与RNA相容，更重要的是还与DNA相容。
与二氧化硅结合后，然后可通过本领域已知的标准二氧化硅洗涤和洗脱方法洗涤和洗脱核酸。
例如，结合的核酸的洗涤可以以类似于原始Boom方案中使用的方法的方式进行。即可以使用浓度高的醇，通常是90％的乙醇。如前所述，一些先前已知的方法描述了基于不含或含有最少量的亲液盐的酸性溶液的洗涤程序。基于我们的观察，我们认为这种方法仅适用于RNA应用。我们认为dsDNA在洗涤过程中的再水合会由于碱基之间氢键的形成而导致双螺旋的稳定，导致其过早地从二氧化硅固体支持物上释放。
然后，洗脱机制将在很大程度上与从先前已知的方法中已知的机制非常相似。例如，使用中性或弱碱性pH的低离子强度溶液。这可以是水，也可以是常规的PCR缓冲液。我们还观察到洗脱缓冲液中的pH和二价阳离子的量可以显著影响洗脱效率。这可能是因为带负电荷的硅烷醇基与带负电荷的磷酸酯主链之间的电荷排斥可能在洗脱过程中起重要作用。因此，通过提高洗脱缓冲液的pH值来使硅烷醇基团去质子化(负电荷的强化)将导致洗脱效率的提高。小的和/或二价的阳离子的完全不存在也提高了洗脱效率，这可能是由于缺乏静电屏蔽。这些机制在本领域通常是已知的，因此选择适合方案的洗涤和洗脱策略对技术人员来说不会构成大问题，因此在此不再进一步讨论。
在可选的另外实施方案中，对于至少一些类型的生物样品，放弃Boom方案的强离液化学物质可能会引入若干挑战，可引入对目前公开的方法的若干补充。
特别地，当关注基于Boom提取的方案时，离液盐允许：
(i)防止其它生物分子(例如蛋白质、脂蛋白)沉淀在二氧化硅固体支持物上；
(ii)抑制核酸酶的活性；
(iii)从组蛋白中释放DNA以增强与二氧化硅的相互作用。
如本领域技术人员所知，通过引入用于进行蛋白质消化步骤的蛋白酶可以实现相同的效果，这在特别困难的(例如旧的)样品中可能是有利的。因此，在另一个实施方案中，该方法之前进行蛋白酶处理，例如用蛋白酶K处理。
在另一个实施方案中，提供了其中生物样品为液体活检样品的方法。如本文所用，术语“液体活检物”或“液体活检样品”应理解为指从受试者获得的任何非组织样本，尤其是体液样本。液体活检来源包括但不限于血液、血浆、血清、尿液、脑脊液(CSF)液、羊水、其它体液，诸如唾液、汗液、泪液、母乳、精液、粪便、胸膜液、腹膜液或洗液等。分析液体活检样品中的核酸可以最小化对昂贵的、侵入性的和经常疼痛的组织和/或肿瘤活检的需求，以实现动态疾病或其它生理状态监测。例如，在癌症患者中，从液体活检物中提取的无细胞肿瘤DNA或RNA可能用于检测突变、易位或拷贝数改变以及特定癌症标志物的表达。
血液(血浆、血清或全血等)是人的液体活检样品分析中最常使用的流体。在癌症患者中，血液是由肿瘤组织释放的循环肿瘤细胞(CTC)和无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)(分别包括循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤RNA(ctRNA))的来源，其可用于检测患者肿瘤中存在的突变。值得注意的是，然而ctDNA仅包含血液中存在的cfDNA的极小部分，这突出了最大化用于核酸分析以检测罕见突变的样品体积的重要性。此外，cfDNA总是低质量的，并且被片段化至核小体的近似大小(140bp)。因此，对于某些癌症类型，包括肾癌、前列腺癌以及上尿路和下尿路上皮癌，使用尿液的替代液体活检方法可以是肿瘤衍生的材料的更丰富来源。尿液还具有其它独特的益处，诸如易于获取(不需要训练有素的医务人员)、没有患者不适感(增强的患者依从性)，并且与血液相比可具有更少的污染蛋白质。然而，尿液仍然是非常稀释的物质，因此其在诊断方法中的应用，尤其是在PoC设备上的应用，也将受益于样品输入体积的最大化。鉴于目前存在对允许最大化血液或尿液样品体积输入的核酸提取化学物质的需求，特别是在集成PoC设备如流体药盒内部，并且因为本发明方法非常适合于此目的，在另一个示例性实施方案中，提供了其中液体活检样品选自血浆、血清、全血或尿液的方法。
在相关实施方案中，提供了其中核酸为DNA的方法，所述DNA尽管在液体活检样品中被相对稀释，但比RNA更稳定，并且可以使用本文公开的方法以类似于基于Boom提取的方案的效率分离。
在另外的实施方案中，DNA可以是无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA(ctDNA)，其通常是片段化和/或双链DNA类型。
值得注意的是，对于某些全血或旧血浆或血清样品，我们已观察到，本文提出的新型结合化学物质(例如，涉及1M TMAC+0.2M乙酸盐，pH 5)有时可能因过量蛋白质沉淀和/或二氧化硅固体支持物的阻塞而受到挑战，这可导致提取产率降低。根据样品类型，可以通过添加适当的去垢剂来解决这个问题。因此，在另一个替代实施方案中，提供了其中在去垢剂存在的情况下发生接触的方法。如本文中所用，术语“去垢剂”被广义地解释为涉及具有表面活性剂性质的化合物或混合物。如本文中所用，术语“去垢剂”应理解为与术语“表面活性剂”同义，所述表面活性剂涉及具有两亲性质并降低包含它们的液体的表面张力的任何化合物或化合物的混合物。我们还相信，去垢剂可以通过额外增强从组蛋白中去除DNA和抑制核酸酶活性来进一步提高该过程的效率。
在一个特定实施方案中，例如，在可潜在地显示源于白蛋白的大量存在的问题的样品为血浆样品的情况下，提供了其中去垢剂为季铵化合物去垢剂的方法。我们已观察到季铵化合物去垢剂，诸如鲸蜡烷三甲基溴化铵(CTAB)强烈促进白蛋白的溶解性，防止其浸透二氧化硅膜。此类去垢剂的四元性质也可能阻止它们改变DNA的螺旋构象，因此它们可能是有利的，因为假设它们不对dsDNA与二氧化硅的结合效率产生任何影响。在我们使用困难的血浆样品的实验中，我们已经认识到用CTAB获得的效果，特别是由于其在0.25％与1％之间的甚至非常低的二氧化硅结合浓度范围内观察到的功效。这样低的浓度对于封闭的集成设备应用是有意义的，其中最大化样品输入体积是以最小化缓冲液体积为代价的。因此，在另一个实施方案中，提供了其中季铵化合物去垢剂是鲸蜡烷三甲基溴化铵(CTAB)的方法。
在另一个实施方案中，所述方法在射流盒(fluidic cartridge)内进行，所述射流盒可能是封闭的射流盒，可能形成自动化系统的一部分。在上述实施方案中的一个实施方案中，所述药盒可以是直接接受生物样品、使用本文提出的新型核酸提取化学物质从生物样品中获得PCR级核酸并且适于容纳至少一个PCR反应的类型。
如本文中所用，术语“药盒”应理解为腔室和/或通道的独立组件，其形成为单个物体，该单个物体可作为一个配件在适于接受或连接到这种盒的较大仪器的内部或外部传送或移动。药盒及其仪器可以被视为形成自动化系统或自动化平台。包含在药盒中的一些部件可以牢固地连接，而其它部件可以柔性地连接，并且可以相对于药盒的其它部件移动。类似地，如本文中所用，术语“射流盒”应理解为包括至少一个适于处理、加工、排放或分析流体(可能是液体)的腔室或通道的药盒。WO2007004103中给出了这种药盒的实例。有利的是，射流盒可以是微射流盒(microfluidic cartridge)。在射流盒的上下文中，术语“下游”和“上游”可以被定义为与流体在这种药盒中流动的方向相关。即，药盒中流体从其流向同一药盒中的第二部分的流体路径的一部分被解释为位于第二部分的上游。类似地，流体较晚到达的部分相对于所述流体较早经过的部分位于下游。一般而言，如本文中所用，术语“流体的”或有时“微流体的”是指处理流体的行为、控制和操纵的系统和布置，其在至少一个或两个维度(例如，宽度和高度或通道)上被几何限制在小的、通常亚毫米尺度。此类小体积的流体被移动、混合、分离或以其它方式在需要小尺寸和低能耗的微观尺度上处理。微流体系统包括诸如微型气动系统(压力源、液体泵、微型阀等)的结构和用于处理微升、纳升和皮升体积的微流体结构(微流体通道等)。示例性的流体系统描述于EP1896180、EP1904234和EP2419705中，并且因此可以应用于本文公开的某些实施方案中。与上述一致，术语“腔室”应理解为流体或微流体组件内的任何几何形状的任何功能限定的隔室，其由至少一个壁限定并且包括执行归因于该隔室的功能所必需的设备。沿着这些思路，“扩增腔室”应理解为(微)流体组件内的隔室，其适于执行并有目的地提供在所述组件中，以便执行核酸的扩增。扩增腔室的实例包括PCR室和qPCR室。
如本文中所用，术语“自动化系统”是指包括仪器和一次性材料(诸如塑料和溶液)的集成平台，系统以自动化方式使用该平台来完成特定过程。这种过程可以由用户启动，但是在系统内的整个自动处理过程中，用户的干预是不必要的，直到过程完成。如本文中所用，术语“仪器”应理解为配备有至少一个用户界面(例如，包括至少一个启动按钮或电源插头)、带有软件的机载计算机以及被编程以执行某些功能如运行测定的机器，所述测定可包括例如混合、超声处理、加热、数据检测和收集以及可能的分析等。在可能的实施例中，界面可呈控制台的形式，其包括运行用户界面软件的计算机系统，该用户界面软件能够启动测试、显示测试结果并与外部信息系统通信。能够容易地适应本发明方法的优秀自动化系统是由Biocartis NV制造的诊断平台IdyllaTM，其使用一次性试剂承载药盒，该药盒可与药盒处理仪器接合，并提供样品至结果的分析性能。
在替代实施方案中，进一步提供了与上述方法直接相关并且/或者使得能够执行上述方法的产品。在这种产品的最简单的实施方案中，提供了结合缓冲液，其包含适于将pH值保持在3与6之间的值的缓冲剂(例如乙酸盐)，并且还包含TMAC，两者的浓度都直接适于在与选择的样品混合后在二氧化硅固体支持物结合条件下获得期望的浓度。此类结合缓冲液的有利实例包括例如2.33M TMAC和0.47M乙酸盐、3.6M TMAC和0.6M乙酸盐、4.8M TMAC和0.8M乙酸盐、6M TMAC和1M乙酸盐、7.2M TMAC和1.2M乙酸盐、8.4M TMAC和1.4M乙酸盐。
在上述实施方案的替代实施方案中，还提供了包含如上所述的合适浓度的季铵化合物去垢剂和/或蛋白酶K的结合缓冲溶液。使用上面列出的溶液的实例，CTAB浓度可为2.33M TMAC和0.47M乙酸盐和1.17％(w/v)CTAB、3.6M TMAC和0.6M乙酸盐和1.5％(w/v)CTAB。
在本文公开的产品的替代实施方案中，可提供包含任何上述结合缓冲溶液的试剂盒和/或射流盒。如本文中所用，术语“试剂盒”应解释为一组物体，包括至少一个制品或组件或用于特定目的如进行分子生物学方法或测定所需的制品或设备。可以以标准台式核酸纯化试剂盒的形式提供试剂盒，所述试剂盒包括具有试剂如结合缓冲液、洗涤缓冲液等和例如一个或多个二氧化硅固体支持物离心柱、膜、珠粒等的容器。或者，所述试剂盒可包括一个药盒或简单地以药盒的形式提供。沿着这些思路，在另外的实施方案中，提供了药盒，所述药盒包含结合缓冲溶液、适于将pH值保持在3与6之间的缓冲剂，并且还包含TMAC。在另外的实施方案中，这种药盒中的结合缓冲溶液还可包含CTAB。在另外的实施方案中，此类药盒可以有利地进一步容纳或包含用于核酸纯化的二氧化硅固体支持物。在另外的可能的实施方案中，此类药盒可以是射流盒并且/或者可以适于处理液体活检样品，诸如血浆或尿液。
最后，本文还提供了本文所述方法和产品(诸如试剂盒、药盒、自动化系统等)用于从液体活检样品中提取核酸的用途。在另外的实施方案中，提供了所公开的方法和产品用于提取DNA的用途，所述DNA可能是双链DNA(dsDNA)，可能是无细胞DNA(cfDNA)或甚至是循环肿瘤DNA(ctDNA)。
目前描述的新型核酸纯化化学物质及其相关产品具有应用于各种商业试剂盒、芯片实验室(LOC)设备或一次性药盒的潜力，所述试剂盒、芯片实验室(LOC)设备或一次性药盒利用固相提取技术从生物样品分离核酸。更具体地，由于所需结合缓冲液的体积相对较小，其在完全集成的分子诊断设备中的应用可具有很大的价值，这使得能够相对于必要的缓冲体积增加样品输入。下面给出了本文中提出的概念的工作示例。
实施例
通用实验装置。将二氧化硅离心柱(Machery-Nagel,blood column nucleospin)安装在QIAvac 24plus系统上，该系统是通过QIAvac连接系统连接到真空泵的真空歧管。整套设备可用作流通系统。将血浆样品与结合缓冲溶液按照4/3的比例混合(例如1mL血浆与0.75mL结合缓冲液)，并在二氧化硅离心柱上走样。因此，当与血浆混合时，结合缓冲液通常被稀释2.33倍。4/3的比例不是一个要求，而仅仅是一个任意的选择，部分与Idylla药盒的设计(裂解室允许最大7mL的输入)相关，即使这是二氧化硅离心柱实验。绝对有可能进一步增加结合缓冲液的浓度，并因此减少相对于样品体积所需的缓冲液体积。然而，对于这种特定的离心柱设置，从堵塞和流速方面来看，血浆样品的1.75倍稀释似乎是令人满意的。随后用洗涤缓冲液洗涤二氧化硅膜，之后从真空歧管中取出离心柱。然后将该离心柱置于1mLLo-Bind Eppendorf管中，并以每分钟一万转(rpm)进行一分钟的离心步骤。然后将该离心柱转移到新的1mL Lo-Bind Eppendorf管中，随后加入洗脱缓冲液。在室温下孵育两分钟后，然后将离心柱以10000rpm进行一分钟的额外离心步骤。然后通过qPCR分析洗脱产物，提供纯化的DNA的相对定量。
样品类型和结合缓冲液化学物质。血浆(Innovative research)掺入了从全血中分离出来的核小体DNA(nDNA)。当处理较小血浆体积时，加标用于提供稳健的下游基于qPCR的靶标检测。另外，核小体DNA的特征在于片段化模式，其非常类似于无细胞DNA(cfDNA)的片段化模式。短片段的存在使我们能够评估它们的提取效率。100μL血浆中掺入了20000拷贝的nDNA。然后将加标血浆与500μL结合缓冲液混合。所述结合缓冲液由溶解在0.24M乙酸钠pH 5缓冲液中的1.2M氯化四甲铵(TMAC)组成。这导致当与血浆样品混合时，最终浓度为1M TMAC和0.2M乙酸钠。然后将总体积为600μL的该酸性混合物如上所述在二氧化硅离心柱上走样。
洗涤缓冲液化学物质。通过使1000μL 90％的乙醇在离心柱上走样来洗涤二氧化硅膜。随后，通过使离心柱经历一分钟于10000rpm的离心步骤来去除任何残留的乙醇痕迹。
洗脱缓冲液化学物质。通过用水或Tris-HCl pH 8.6缓冲液再水合二氧化硅膜来进行DNA的洗脱。重要的是，洗脱缓冲液处于室温，并与二氧化硅膜接触至少两分钟。随后，使离心柱经受最终离心步骤(一分钟，10000rpm)。然后在1mL Lo-Bind Eppendorf管中回收洗脱的产物。
qPCR设计和条件。为了评估短和长DNA片段的提取效率，使用了由三个扩增子组成的三链体设计，每个扩增子具有不同的大小。靶扩增子的长度分别为62bp、98bp和136bp。最短与最长扩增子之间Ct值的差异表明存在短的靶片段。可根据要求提供引物和探针序列。将20μL洗脱产物与5μL PCR缓冲液混合。最终PCR反应的组成是：50mM KCl、20mM Tris-HClpH 8.6、2mM MgCl2、0.2mM dNTP混合物、300nM的每种引物和探针以及5单位Gotaq DNA聚合酶。qPCR反应在Biorad CFX96 TouchTM实时PCR检测系统上进行。总反应体积为25μL。循环方案包括热启动(5’95℃)，接着是50个变性(3”95℃)和退火(30”64℃)循环。在每个循环后测量荧光信号。
结果。我们首先研究了中性pH下在不同离液盐和亲液盐或温和离液盐结合缓冲液中dsDNA的提取效率。在不同结合缓冲液中提取的62bp和136bp扩增子的PCR的Ct值显示在图1的Y轴上。X轴显示中性pH下不同的结合缓冲液组成。“输入”是参照点，反映了以加标nDNA总量为目标时获得的Ct值。因此，对于参照点的ΔCt表示提取效率(即，1Ct的Δ＝50％提取效率)。如果小扩增子与大扩增子之间的ΔCt保持与参照点相同，这表明小片段(62bp-136bp)没有丢失。结果表明，在中性pH下，当结合缓冲液(NaCl或(NH4)2SO4)中亲液盐的量增加时，dsDNA与二氧化硅的结合效率降低。如前所述，我们假设这可能是由于小的亲液阳离子(Na+和NH4+)对DNA双螺旋产生稳定作用。显然，在中性条件下，优选高浓度的离液盐来介导DNA与二氧化硅膜的结合。
然后我们使用酸性条件(pH 5)重复该实验。结果如图2所示。如前所述，Y轴显示所有三种不同扩增子大小的Ct值，而X轴显示不同的结合缓冲液组成。数据显示，如现有技术中所述，使用酸性条件(pH 5)和亲液盐，不能有效地介导nDNA与二氧化硅膜的结合。pH值为5的0.1M NaCl表现最佳，提取效率约为6.25％(ΔCt＝4)。
然后，我们比较了离液的Boom结合缓冲液(3.68M GuSCN和丁醇)与含有基于氯化物的盐的缓冲液(有或无季铵化合物)的性能。结果如图3所示。Y轴显示所有三种不同扩增子大小的Ct值。X轴显示不同的结合缓冲液组成。数据显示，使用由季铵阳离子(TMA+)和亲液阴离子(Cl-)构成的盐能有效地介导DNA与二氧化硅膜的结合。结果支持这样的假设，即季阳离子的惰性使得DNA的螺旋结构去稳定，从而增加了可用的二氧化硅结合位点的数量。
然后，我们研究了血浆样品的最佳pH范围。结果如图4所示。Y轴显示所有三种不同扩增子大小的Ct值。X轴显示不同的结合缓冲液组成。该实验表明，将结合缓冲液的pH降低至4与天然血浆样品不相容。只要加入0.3M的TMAC，蛋白质聚集就变得非常严重，几乎不可能成功处理样品。这很可能与血浆中丰富的白蛋白的等电点(pI)(4.7)相关。一旦溶液的pH值接近蛋白质的pI，单个蛋白质分子之间的电荷排斥就会降低，从而可能发生沉淀。在这一点上，似乎仅由阴离子产生的轻微脱水作用就足以促进蛋白质聚集。
作为下一步骤，我们比较了TMA硫酸盐(TMAS)与TMAC的性能，其结果如图5所示。Y轴显示所有三种不同扩增子大小的Ct值。X轴显示不同的结合缓冲液组成。实验表明TMAS不能有效介导DNA与二氧化硅的结合。基于我们最初的假设，这些结果最初是令人惊讶的，该假设认为关键的相关结合机制是：
(i)二氧化硅膜和核酸的脱水。这是通过提供足够的亲液阴离子并因此减少游离水量来实现的。
(ii)屏蔽分子间静电力。这是通过使用酸性条件和质子化带负电荷的硅烷醇基来实现的。
基于以上所述，我们预计硫酸盐，由于其双电荷而为比氯离子更强的亲液剂，将提供更强的脱水作用，从而提供DNA与二氧化硅的更高效结合。正如本实验和许多其它实验所证实的，我们得出结论，除了上述机制之外，还必须有其它机制存在。Melzak等人(1996)描述了可能对DNA-二氧化硅相互作用有影响的第三种效应，即(iii)核酸-二氧化硅接触层中的分子间氢键形成。数据似乎表明，这些氢键可能比最初认为的更重要，并且通过使用强的亲液硫酸根阴离子，这些键的形成被强烈干扰或甚至阻止。因此，氯阴离子(其特别地被描述为弱亲液剂或临界亲液剂/离液剂)的性能可能是其独特的特性，即导致其与水的相互作用不比水与自身的相互作用强。
为了进一步研究这一假设，我们在PBS和血浆样品中比较了不同的含TMA的盐在介导加标nDNA与二氧化硅的结合方面的性能。结果如图6所示。Y轴显示62bp扩增子的Ct值。X轴显示不同的结合缓冲液组成。“输入”显示了参照点，并反映了以加标nDNA总量为目标时获得的Ct值。因此，对于参照点的ΔCt表示提取效率(即，1Ct的Δ＝50％提取效率)。数据说明了所选阴离子的重要性。氯化物的电荷密度使得能够在最低浓度下实现最高的提取效率。具有较高电荷密度的更亲液的阴离子如硫酸根可能通过介导B-DNA至A-DNA的构象转变或任何其它未知机制而快速降低提取效率。另一方面，具有较低电荷密度的更离液的阴离子如溴离子，可能会阻止这种构象转变，但在使二氧化硅膜脱水方面效率明显较低，因此需要较高的摩尔浓度才能实现与选择氯离子所赋予的性能同等的性能。还应该注意，更离液的阴离子的电荷密度降低也会对季铵盐的溶解度产生负面影响。从这个角度来看，TMAC在性能和溶解性上都是优越的。
已经证实TMAC是最有前景的季铵盐，然后我们研究了其在我们特定实验设置中的最佳浓度。结果如图7所示。Y轴显示所有三种不同扩增子大小的Ct值。X轴显示不同的结合缓冲液组成。结果表明，将结合缓冲液中TMAC的浓度升高至高于1M对DNA与二氧化硅的结合效率没有有益的影响。当TMAC的浓度升高时，结合效率甚至稍微降低。
然后，我们研究了在不同pH值下使用TMAC的dsDNA提取性能。结果如图8所示。Y轴显示所有三种不同扩增子大小的Ct值。X轴显示不同的结合缓冲液组成。结果显示了结合缓冲液的pH值的重要性。如前所述，在处理未消化的血浆时，将结合缓冲液的pH值降低至白蛋白的等电点(4.7)附近会导致严重的蛋白质聚集，从而使得不可能在离心柱或微流控通道中处理样品。另外，将结合缓冲液的pH值提高至高于5会略微增加DNA的硅烷醇基与磷酸酯主链之间的负电荷排斥，这导致DNA与二氧化硅的结合效率降低。已经描述了二氧化硅膜上的表面硅烷醇基团具有4-8的pKa值。提高pH值可能导致具有最低pKa值的硅烷醇基去质子化，从而使它们带负电荷。
然后，我们以更广泛的方式对多重且不同批次的血浆研究了TMAC的摩尔浓度和乙酸盐缓冲液的pH。另外，我们还向结合缓冲液中加入了季铵盐去垢剂鲸蜡烷三甲基溴化铵(CTAB)。结果如图9所示。Y轴显示62bp扩增子的Cq值。X轴显示结合条件，包括不同量的添加的CTAB。与以前的实验不同，在以前的实验中，有限量的血浆在掺入nDNA后进行处理，本实验的重点是从1mL未加标血浆中提取cfDNA。为了获得额外的改善效果，还在37℃下使用1mg/mL蛋白酶K对血浆样品进行10分钟的蛋白质消化步骤。通过添加0.75mL结合缓冲液(2.33M TMAC 0.47M乙酸盐1.17％CTAB pH 5)处理1mL血浆样品。随后，用1mL第一洗涤缓冲液(1M TMAC 0.2M乙酸盐，pH 5)洗涤膜，最后用另外1mL 90％EtOH洗涤膜。对于每种结合条件，处理10个不同的样品。图9中的箱线图显示了平均Cq值和中位Cq值以及变化。很明显，添加CTAB可具有有益效应，因为其可以减少样品间的差异并增加DNA产率。我们认为这种效应是由于CTAB促进了白蛋白的溶解性，从而防止其在二氧化硅膜上沉淀而产生的。其也可能抑制核酸酶活性，并可能有助于从组蛋白中去除cfDNA。
然后，我们观察不同pH值下的不同TMAC摩尔浓度。通过评估多批血浆的不同结合条件，很明显不同样品对不同条件的反应非常不同，如图10所示。Y轴显示62bp扩增子的Ct值。X轴显示结合条件的不同pH值。图的形状代表不同的TMAC摩尔浓度(如图例中所解释的)。
然后我们研究了洗脱条件的效率。结果如图11所示。Y轴显示所有三种不同扩增子大小的Ct值。X轴显示室温下不同的洗脱缓冲液组成和孵育时间。数据显示，当使用弱碱性缓冲液时，洗脱步骤最高效。同样，这可能与表面硅烷醇基团的pKa值相关。我们认为硅烷醇基与磷酸酯主链之间的负电荷排斥是洗脱过程中的主要驱动力，伴随着再水合。因此，提供pH>最高硅烷醇pKa值(8)的洗脱缓冲液将确保所有硅烷醇基团都带负电荷。从图11可以看出，50mM K+和2mM Mg++的存在对洗脱效率有负面影响。我们假设这种效应可能是由这些强亲液阳离子屏蔽了硅烷醇基与磷酸酯主链之间的负电荷排斥而引起的。当将该方案应用于完全集成的分子诊断设备时，应记住这一观察结果，在所述分子诊断设备中，二氧化硅结合的核酸直接用扩增缓冲液洗脱。
接下来，我们研究了与起始材料体积相关的并入蛋白酶K预消化的潜在有益效果，特别是对于难处理的血浆样品。结果如图12所示。Y轴显示62bp扩增子的Ct值。X轴显示了被处理的不同血浆体积。结果表明，当处理>400μL的血浆样品时，并入蛋白酶K消化步骤提高了DNA产率。将血浆在56℃下消化10分钟。我们怀疑在本文研究的结合缓冲液化学物质条件下，蛋白质与二氧化硅膜的结合也在一定程度上发生。酸性条件减少了pI＝4.7的白蛋白的负电荷，这显著减少了这种丰富的血浆蛋白与二氧化硅膜之间的电荷排斥。因此，预计蛋白质和核酸会竞争结合位点，而二氧化硅膜的表面仍然有限。另外，各个蛋白质分子之间电荷排斥的减少使得它们在与膜结合时能够更紧密地堆积在一起。因此，当处理较大的样品时，从血浆中消化或去除白蛋白可能有益于改善核酸与二氧化硅膜的结合。
然后，我们在属于IdyllaTM集成系统的Biocartis NV药盒的一次性专利产品中评估了血浆样品体积放大。结果如图13所示。Y轴显示62bp扩增子的Ct值。X轴显示使用不同结合缓冲液化学物质处理的不同血浆体积。使用的样品是未加标的血浆样品。结果令人鼓舞地表明，本文提出的新型结合缓冲液化学物质允许在Idylla药盒中实质性地样品放大，这导致线性产率增加。应用的结合条件如下：1.2M TMAC 0.2M乙酸盐0.5％CTAB pH 5。基于药盒的系统中使用的最终缓冲液布局如下：
·结合缓冲液(3mL)：2.8M TMAC 0.47M乙酸盐1.17％CTAB pH 5(用样品稀释2.33倍)
·血浆样品(4mL)(在室温下用1mg/mL蛋白酶K处理10分钟)
·第一洗涤缓冲液(1.25mL)：1.2M TMAC 0.2M乙酸盐，pH 5
·第二洗涤缓冲液(2.4mL)：90％乙醇
·洗脱缓冲液：H2O(体积可根据需要而缩放，对于Idylla，最小洗脱体积为160μL，最大洗脱体积为250μL)
最后，我们决定比较使用所公开的新型提取化学物质的药盒与使用离液的参照化学物质的药盒的性能。为此，我们使用了七个不同的血浆批次，并对于每种提取化学物质每批次进行了五个药盒重复。70个药盒的所有运行都成功完成，而无任何堵塞错误。结果如图14和图15所示。在图14中，Y轴显示62bp靶扩增子的Ct值。X轴规定了提取化学物质(每个组的左手侧为离液参照物，右手侧为新型TMAC+CTAB化学物质)和样品体积(分别为1ml和4ml)。每个组代表不同批次的血浆。在图15中，Y轴显示了同一扩增子的Ct值，而X轴列出了不同批次的血浆。每个组代表不同的提取化学物质(左手侧为离液参照物，右手侧为新型TMAC+CTAB化学物质)。空心点是实心点的10倍稀释液，因此指示PCR抑制。图14和图15的数据显示，通过使用新的提取化学物质而增加的样品输入(4ml)导致显著的产率提高。下表1中列出了实际测量的产率提高。图15还显示，样品提取物均不含有任何抑制PCR的成分。结果表明，新型结合化学物质是稳健的，其标准偏差与离液的参照化学物质相当。此外，对于所有研究的血浆批次，由于能够增加每个药盒的样品输入体积，获得了至少2倍的产率增益，如表1所示。除了这种增加的检测灵敏度之外，还应该注意到新型缓冲化学物质完全不含离液剂并且成本低。
表1：图14中获得的每批血浆的平均Ct值。两种提取化学物质之间的ΔCt反映了cfDNA产率的提高。
Figure BDA0003550816590000251

Claims (20)

1.一种核酸提取方法，其包括在pH值介于3和6之间且在由以下各项组成的盐存在的情况下将液体活检样品与二氧化硅固体支持物接触：
-小的四元有机化合物，定义为由中心带正电荷原子与四个有机取代基R1-R4组成的四元化合物，其中每个有机取代基R1-R4中的碳原子数不超过2；以及
-溴阴离子或氯阴离子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小的四元有机化合物的带正电荷的原子是氮。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述阴离子是氯离子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述小的四元有机化合物是氯化四甲铵，也称为TMAC。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所包含的小的四元有机化合物的浓度在0.1M与2M之间，优选在0.5M与1.8M之间，更优选在0.8M与1.6M之间，甚至更优选在1M与1.4M之间，最优选约为1.2M。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述pH值在4与5.8之间；4.2与5.6之间；4.4与5.4之间；4.6与5.2之间；最优选约为5。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法之前进行蛋白酶处理。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体活检样品选自血浆、血清、全血或尿液。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是DNA。
10.根据权利要求9的方法，其中所述DNA是无细胞DNA。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述DNA是循环肿瘤DNA。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触在去垢剂存在的情况下发生。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述去垢剂是季铵化合物去垢剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述季铵化合物去垢剂是鲸蜡烷三甲基溴化铵，也称为CTAB。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在药盒内部进行，所述药盒优选为射流盒。
16.一种包含结合缓冲溶液的药盒，所述结合缓冲溶液包含适于将pH值保持在3与6之间的缓冲剂，并且还包含TMAC。
17.根据权利要求16所述的药盒，其中所述结合缓冲溶液还包含CTAB。
18.根据权利要求16或17中任一项所述的药盒，其还包括二氧化硅固体支持物。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的药盒，其为射流盒。
20.根据权利要求1-15中任一项所述的方法或根据权利要求16-19中任一项所述的药盒用于从液体活检样品中提取无细胞DNA的用途。
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