CN114449957A - 利用呼出气诊断结核病和其他疾病 - Google Patents

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Abstract

公开了使用各种诊断工具来分析呼出气气溶胶和呼出气冷凝物的方法和装置，以实现针对包括呼吸道疾病的若干疾病的快速、低成本和自主的即时测定。公开了使用包括MALDI‑MS的质谱分析法来分析呼出气气溶胶和呼出气冷凝物以用于结核病诊断的方法和装置。所公开的系统和方法在小于约20分钟内提供诊断测试结果，并且提供了人工干预最少的自主操作。

Description

利用呼出气诊断结核病和其他疾病
相关申请的交叉引用
本申请涉及并要求于2019年8月26日提交的题为“Diagnosis of Tuberculosisand Other Diseases Using Exhaled Breath”的美国临时申请62/891954和于2020年8月23日提交的题为“Diagnosis of Tuberculosis and Other Diseases Using ExhaledBreath”的美国临时申请63/069120的权益，这两个申请的全部内容通过引用并入本文。
联邦资助研发
没有
技术领域
本公开涉及用于使用各种诊断工具来分析呼出气气溶胶和呼出气冷凝物的方法和装置，以实现针对包括呼吸道疾病的若干疾病的快速、低成本和自主的即时测定。更具体地，但不作为限制，本公开涉及用于使用包括MALDI-MS的质谱分析法来分析呼出气气溶胶和呼出气冷凝物以用于结核病诊断的方法和装置。
背景技术
结核病(TB)已经超过HIV/AIDS成为全球杀手，每天超过4000人死亡。(Patterson,B.,etal.,2018)。发病率的下降率仍然不足，据报道为每年1.5％，并且单独治疗不太可能显著降低疾病的负担。在HIV高度流行的社区中，结核分枝杆菌(Mtb)基因分型研究发现，最近的传播，而不是复发，占TB事件病例的大部分(54％)。TB传播的物理过程仍然知之甚少，并且用于阐明感染性气溶胶产生、释放和吸入中的关键事件的新技术的应用很慢。用于表征空气传播的感染性颗粒的经验研究很少。困扰研究的两个主要困难是天然产生的Mtb颗粒的所谓的低浓度，以及环境和患者衍生的空气传播样本的细菌和真菌污染的并发症。但是，在空气传播检测方面已经有许多尝试。2004年在乌干达的概念证据研究和随后的可行性研究采样了来自肺结核患者的咳嗽产生的气溶胶。咳嗽直接进入配备有两个可行的级联撞击器的采样室中，导致来自超过四分之一的参与者的阳性培养，尽管他们已经接受1至6天的化学疗法。使用相同设备的后续工作发现：具有较高气溶胶杆菌负荷的参与者可能与更大的家庭传播率和疾病发现的发展有关，这表明定量空气传播采样可以用作感染性的临床相关量度。因此，传播的中断很可能对TB发病率具有快速、可测量的影响。
控制结核病传播的最好方法是及时识别和治疗活性TB病例。(Wood,R.C.,etal.,2015)。肺结核的诊断通常通过患者痰的微生物分析、显微镜分析或分子分析来进行。在大部分发展中国家，TB感染的“黄金标准”测试是基于痰样本的涂抹培养。将样本涂抹在培养板上，加入特定于Mtb的染色剂，并使用显微镜对染色的细胞进行计数。如果涂片中细胞浓度大于设定的阈值，则将样本分类为阳性。如果TB计数低于该阈值，则将其分类为阴性。诊断可能需要几个小时。由于从患者收集痰及其复杂的组成具有挑战性，需要痰作为诊断样本是限制因素。材料的粘度限制了测试灵敏度，增加了样本之间的异质性，并且增加了与测试相关的成本和劳动。此外，痰的产生(需要咳嗽)会对医护人员造成职业危害。作为样本介质，痰具有几个缺点。首先，仅约50％的患者可提供良好的痰样本。例如，约八岁以下的儿童通常不能根据要求产生样本，通常因为他们不具备从咽喉深处“咳出”痰的能力。老弱病者可能不能强行咳痰。其他人的咽喉中可能完全没有痰。因此，基于痰分析的诊断方法可能不能为多达50％的提供痰样本的患者提供诊断。如果在用抗生素治疗人后一至两天收集痰，也不能用作诊断样本，因为样本不再代表肺深处的疾病状态，并且在治疗开始后几天内，痰中活的Mtb数目显著减少。已经提出将尿液和血液作为用于诊断TB感染的样本介质。血液是高度侵入性的，并且处理通常为HIV阳性的血液样本需要较高成本，因为在世界的一些地方，许多TB患者也具有HIV共感染。此外，活性TB感染的患者的血液中可能没有太多循环的TB细胞。也已经提出了基于尿液的诊断，但是这些测试寻找疾病的生物标记而不是活的TB杆菌，并且没有一种没有被证实具有广泛的临床用途。
更容易、更安全和更统一地收集和处理的样本将简化TB诊断。呼出气包含可以被非侵入性地收集并分析特征以阐明肺中的生理过程和病理过程的气溶胶(“EBA”)和蒸气。(Hunt,2002)。为了捕获呼吸以用于化验，呼出的空气通过冷凝设备以产生流体的积聚，该积聚被称为呼出气冷凝物(“EBC”)。尽管主要来源于水蒸气，但是EBC已经溶解在其非挥发性化合物中，包括细胞因子、脂质、表面活性剂、离子、氧化产物和腺苷、组胺、乙酰胆碱和血清素。此外，EBC捕获潜在的挥发性水溶性化合物，包括氨、过氧化氢和乙醇，以及其它挥发性有机化合物。EBC具有容易测量的pH。EBC含有雾化的气道粘膜液和挥发性化合物，其提供肺中正在进行的生物化学活动和炎症活动的非侵入性指示。对EBC兴趣的快速增加是由于认识到在肺病中，EBC具有可以用于区分感染个体和健康个体的可测量特征。这些测定提供了在急性和慢性哮喘、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫综合征、职业病和囊性纤维化中的气道和肺的氧化还原偏差、酸-碱状态以及炎症的程度和类型的证据。以不确定的和可变的稀释程度为特征，EBC可能不提供对天然气道粘膜液中的单独溶质浓度的精确评估。然而，当浓度在健康和疾病之间显著不同或者基于样本中发现的溶质的比例时，EBC可以提供有用的信息。
Patterson等人(2018)使用定制的呼吸气溶胶采样室(RASC)，其为一种经设计以优化来自患者的呼出气气溶胶采样、并且隔离和累积来自单个患者的可吸入气溶胶的新颖设备。环境采样检测了在采样室的空气中老化一段时间之后存在的Mtb。35名新诊断的、GeneXpert(美国加州森尼韦尔市的Cepheid公司)痰阳性的TB患者在约1.4m3体积的RASC室中在一小时的封闭期间被监测。GeneXpert遗传测定基于聚合酶链反应(PCR)，可用于分析TB诊断的样本，并指示TB样本中是否存在药物抗性基因。对TB的GeneXpert PCR测定可接受痰样本，并在约一小时内提供阳性或阴性结果。该室结合了空气动力学粒度检测、可行和非可行采样装置、实时CO2监测和咳嗽声音记录。微生物培养和液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)用于检测每个生物气溶胶收集装置中的Mtb。在77％的气溶胶样本中检测到Mtb，42％的样本通过分枝杆菌培养为阳性，92％通过ddPCR为阳性。发现咳嗽率和可培养的生物气溶胶之间存在相关性。在所有可行的级联撞击器级上检测到Mtb，峰在气溶胶尺寸2.0μm至3.5μm处。这表明气溶胶培养阳性的呼出空气的中位数为0.09，呼出的颗粒生物气溶胶的估计中位数浓度为4.5×l07 CFU/ml。使用RASC室在大多数未治疗TB患者呼出的生物气溶胶中检测到Mtb。发现分子检测比固体培养基上的Mtb培养更灵敏。
可以通过培养、ddPCR、电子显微镜、免疫测定和细胞染色(例如oramine和dmnTre)在EBA中识别Mtb。其中，PCR和免疫测定可能是快速的并且具有物种水平特异性(specificto the species level)。PCR和其它基于基因组学的技术可以具有菌株水平特异性(specific to thes strain level)。质谱分析也已经表现为对从细菌感染获得的培养具有菌株水平特异性。例如，来自布鲁克道尔顿公司(Bruker Daltonics)(德国)的Biotyper已经表现为能够识别引起人类感染的高达15000种细菌菌株。这些技术已经表现为能够识别来自EBA的TB感染。用于Mtb检测的免疫测定，例如基于脂阿拉伯甘露聚糖的免疫测定，也是众所周知的。
在TB的情况下，感染TB的人通常通过当个人将他们自己送到诊所时的被动病例发现来诊断。通常认为主动病例发现(active case finding,ACF)包括将疑似TB感染的人到达初级健康护理系统之外的其它方法。根据WHO，ACF是“使用测试、检查或其他可以快速应用的程序，对疑似活性TB的人进行系统性识别”。ACF的目的是使受感染的那些人更早地得到治疗，减少感染的平均周期，从而减少疾病的传播。在TB的情况下，当个人去诊所求助时，该人可能已经将TB感染传播给约10个其他人至约115个其他人。ACF可以帮助减少或防止显著的TB传播。诸如痰分析和血液分析的诊断系统和方法不是自动化和自主操作的，且速度不快。许多系统和方法每次分析都要消耗昂贵的测定物，并且因此不具有用于主动病例发现的一般效用，特别是在发展中国家和不发达国家。如前所述，EBA分析似乎是一种用于TB检测的引人注目的诊断工具，其提供了快速分析、便携性和低成本，因为消除了对昂贵的测定物和消耗品的需要。McDevitt等人(2013)已报道了用于流感诊断的EBA分析装置和方法。使用撞击器从呼出气中除去大颗粒(＞4pm)，随后使用湿膜收集器除去较小的颗粒(＜4pm)。使用基于基因组学的方法(逆转录酶聚合酶链式反应(rt-PCR))，分析流感病毒的两个尺寸等级的收集颗粒。如果特定的DNA序列存在于样本中的话，那么PCR技术使用生物分子探针，结合包括酶的其它生物分子，来扩增该特定的DNA序列。相信靶向序列对所识别的疾病具有特异性。McDevitt等人指出EBA样本可用于诊断流感。所公开的装置和方法从实用的观点来看具有若干缺点。首先，呼吸气溶胶样本被收集为几毫升体积的离散样本，因此需要相当大的努力来浓缩样本。此外，诊断装置不与样本收集器耦接或集成，并且不适合用作ACF工具。使RNA测定自动化以产生用于TB分析的自主诊断工具的能力还不清楚。没有描述确定特定患者是否产生足够体积的咳嗽或呼吸气溶胶的方法。结果，如果发现样本对流感呈阴性，则可能是由于不充分的样本收集而导致的假阴性。众所周知，人类在各种呼吸动作期间产生的雾化肺液体积的差异很大。
GeneXpert Ultra是一种使用PCR技术的最先进的基于基因组学的即时诊断装置。可与EBA样本收集方法结合，对TB及其它呼吸道疾病进行ACF，但样本收集时间太长，不实用。Patterson等人已展示了在EBA中通常产生20至200个TB杆菌，并且可以在一小时的采样时间段内收集到。使用GeneXpert Ultra作为诊断测定需要最少一小时的采样。GeneXpert可以与对空气进行采样的系统集成，以分析空气样本中的空气传播病原体。BDS系统(Northup Grumman，Edgewood，MD)用于在美国邮政服务邮件通过配送中心时，从邮件中筛查导致炭疽的细菌孢子。BDS系统将湿壁旋流器与GeneXpert PCR系统结合，以自主地对空气采样，并报告是否存在病原体。然而，GeneXpert Ultra测定每次测试具有相对高的成本，并且需要大约一个小时来完成测定并提供结果。通常，由于采样和分析所需的时间延长，以及每次测试的成本相对较高，基于PCR的诊断方法不适于ACF应用的TB筛查。
与诊断测定相关的时间是现场或“即时”测试的关键参数。ACF是现场诊断测定的示例，因为根据定义，ACF发生在医疗保健系统之外。在美国，即时测试需要在20分钟或更短时间内提供答案。如果不是，则认为该测试太慢，并且对于实现短的患者等待时间是不可接受的。在发展中国家，尤其是在有TB流行史的国家，GeneXpert可用于在约一小时内提供诊断。如前所述，在“每次测试的成本”的基础上实施该测定是昂贵的，因此它还没有被广泛使用。由于费用高，它不能用于筛查表现为健康(无症状)但可能患有TB感染的患者，而是用于证实基于其它测试或因素而高度疑似的诊断。
Fennelly等人(2004)描述了使用咳嗽气溶胶和收集室的TB分析，所述收集室使用已知具有活动性患者的个体且包含两个安德森(Anderson)级联撞击器。要求个体提供两个离散的五分钟的剧烈咳嗽爆发。受影响的样本的培养花费30至60天，因此该方法不适于自动化。作为临床样本的EBA的挑战性方面是可以从呼吸收集的呼出颗粒的相对小体积的样本。此外，收集的质量的显著部分是水。包含诊断信息(“生物标记”)的分子以纳升或皮克量存在。随后，气溶胶收集方法必须有效地捕获呼出气中的大部分生物质。呼出气包括通过任何数量的动作从肺呼出的空气，所述动作包括潮式呼吸、深呼吸、咳嗽和打喷嚏。诸如用力肺活量(forced vital capacity,FVC)的特定类型的深呼吸动作可以用于通过以下方式来测量最大肺活量：尽可能多地吸气并且尽可能长地(或尽可能深地)呼气以最大化呼出气的体积。用力呼气量(FEV)测量在用力呼吸期间人可以呼出多少空气。呼出的空气量可以在用力呼吸的第一秒(FEV1)、第二秒(FEV2)和/或第三秒(FEV3)期间测量。用力肺活量(FVC)是FEV测试期间呼出的空气的总量。用力呼气量和用力肺活量是在肺活量测定期间测量的肺功能测试。用力呼气量是肺功能的重要测量。
尽管研究已经表明，呼吸道疾病可以从呼吸气溶胶和呼吸冷凝物中检测出来，但是用于感染或疾病(例如结核病、流感、肺炎)的现代临床测试继续利用痰、血液或鼻拭子。呼出气分析工具还没有商业化，因为缺乏能有效收集和浓缩呼出气中存在的微量分析物的方法和装置。此外，没有标准或方法来评估多少呼出气对于特定诊断是足够的。所公开的示例性装置和方法通过以下方法来克服这些限制：以高流速、高效率收集呼出气气溶胶和呼吸冷凝物并将其收集到相对浓缩的样本中。此外，可以结合气溶胶的尺寸分类以在收集分析物之前增加特定分析物的信噪比。然后，可通过几种方法，但优选使用对感兴趣的分析物敏感、快速和高度特异的方法，分析浓缩的样本。更优选地，分析将是快速且接近实时的。质谱、实时PCR和免疫测定具有灵敏、特异的和接近实时的最高潜力。
需要一种样本收集方法，其可以与快速诊断工具如质谱(“MS”)结合并且比痰液分析更快速和可靠，比血液分析具有更小的侵入性，以提供快速、灵敏、特异的并且优选地以每次测试的低成本为特征的诊断测定。这种系统可以用于TB和其它肺或呼吸道疾病的主动病例发现(ACF)。为了有效，ACF系统必须在“每次诊断”的基础上快速且廉价。低的每次测试成本是筛查大量个体以主动预防TB传播从而寻找确实感染了TB的少数个体的要求。流感和其它致病病毒的即时诊断也需要低成本的装置和方法，因为可能感染“普通感冒”的患者可能感染鼻病毒。在一些情况下，呼吸道感染将由细菌或真菌微生物导致，并且可以用抗生素治疗。在其它情况下，微生物可能对抗生素耐药，并且优选可以识别微生物对抗生素耐药的诊断方法。需要快速EBA方法来区分呼吸道中的病毒和细菌感染，同时使由于样本体积不足而导致的假阴性的发生最小化。质谱、包括PCR的基因组学方法和免疫测定在灵敏性和特异性方面具有最大潜力。质谱，特别是MALDI飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)，是分析EBA和EBC样本的优选诊断工具，因为已经证明其是灵敏的、特异的和接近实时的。
发明内容
本文公开了用于EBA和EBC分析的示例性方法和装置，以在少于30分钟内(优选少于20分钟内)提供可靠的诊断(包括TB诊断)结果，以便能够使用主动病例发现进行即时保健服务并使疾病传播最小化。该装置和方法的特征还在于基于每个患者的低成本并且是自主的。
公开了一种用于使用呼出气诊断个体中的呼吸道疾病的示例性自主系统，包括：样本收集子系统，其包括样本提取部件和样本捕获部件，其中所述样本提取部件被配置为接收个体的面部，以将在预定数量的呼吸动作期间从个体排出的呼吸气溶胶(EBA)颗粒提取到被馈送到提取部件中的空气流中，所述样本捕获部件通过接口管流体地连接到样本提取部件，并且被配置为从呼出气和空气中分离和收集EBA颗粒作，为收集的样本；以及样本分析子系统，其流体地连接到样本捕获部件，且样本分析子系统包括样本处理部件和用于分析样本的诊断设备，所述样本处理部件用于将少量的收集的样本点到样本板上，并且将收集的样本浓缩在样本板上。EBA颗粒可以包括具有呼吸道疾病特征的微生物、病毒、代谢物生物标记、脂质生物标记和蛋白质组生物标记中的至少一种。进入样本捕获部件的空气的流速可在约100升/分钟(L/min)和约1000升/分钟之间。进入样本捕获部件的空气的流速可在约50升/分钟和约500升/分钟之间。收集的样本的体积可以在大约100微升和大约1毫升(ml)之间。样本捕获部件还可以包括空气泵和撞击器，其中空气泵提供空气流以将呼出气从提取部件运送到撞击器中，并且其中撞击器将EBA颗粒与呼出气分离以产生收集的样本。撞击器可包括旋流器、湿壁旋流器、一个或多个湿膜撞击器和撞击滤尘器中的至少一个。该系统还可包括设置在撞击器上游的至少一个虚拟撞击台。样本提取部件可包括锥形装置、护罩、CPR救助面罩、CPAP面罩、呼吸机面罩和医用通用接口管中的至少一个。样本收集子系统还可以包括容纳室，其用于容纳个体并将个体的呼出气与环境空气隔离，其中提取部件通过容纳室的壁流体地连接到捕获部件。诊断装置可以包括PCR、rt-PCR、基于免疫的测定物、质谱仪(MS)、MALDI-MS、ESI-MS、GC-MS、GC-IMS和MALDI-TOFMS中的至少一种。该系统还可以包括一个或多个冷却装置，其被配置成与接口管和样本捕获部件中的至少一个的壁进行热连通，以冷却样本捕获部件。可使用一个或多个冷却装置将样本捕获部件冷却到大于约0℃且小于约10℃的温度。可使用一个或多个冷却装置将样本捕获部件冷却到大于约0℃且小于约4℃的温度。一个或多个冷却装置可以包括珀耳帖热电装置。该系统还可以包括一个或多个传感器，其被配置为与样本提取部件流体连通，其中，一个或多个传感器的输出用于计算进入样本捕获部件的呼出气气溶胶颗粒的总累积体积。一个或多个传感器可包括CO2传感器、氧气传感器、湿度传感器、光学粒度计数器、空气动力学粒度仪和浊度计中的至少一种。使用诊断装置诊断呼吸道疾病所需的呼出气动作的数量可以使用呼出气气溶胶颗粒的总累积体积来确定。
示例性系统还可包括消毒部件以对样本收集子系统进行消毒。消毒部件可包括用于喷射消毒剂的喷雾器、用于产生UV辐射的一个或多个UV灯、蒸汽发生器、臭氧发生器、过氧化物蒸汽发生器及其组合中的至少一个。消毒剂可以包括60％乙醇水溶液、至少60％异丙醇水溶液和过氧化物溶液中的至少一种。可以使用分配泵、重力诱导流和机器人样本传送系统中的至少一个将所收集的样本传送到样本处理部件。分配泵可以是蠕动泵。接口管可以由铜和镍铜合金400中的至少一种制成。样本捕获部件可由铜和镍铜合金400中的至少一种制成。诊断装置可以包括MALDI-TOFMS。样本处理部件还可以包括流体储存器和流体分配泵中的至少一个，以将约1微升的流体分配到设置在样本基板上的收集的样本上。流体可以包括溶剂、MALDI基质化学品、水和酸中的至少一种。所述个体是未感染的人和感染以下至少一种疾病的人中的至少一个：结核病和冠状病毒疾病。此外，脂质生物标记可以包括具有Mtb特征的生物标记。样本捕获元件还可以包括填充床柱，其被设置为与样本提取部件流体连通，以选择性地捕获EBA颗粒。填充床柱可以包括固体颗粒，所述固体颗粒包括树脂、纤维素、二氧化硅、琼脂糖和水合Fe3O4纳米颗粒中的至少一种。填充床柱可以包括表面上具有C18官能团的树脂珠粒。
公开了一种使用呼出气诊断个体中呼吸道疾病的自主方法，包括：将在预定数量的呼吸动作期间从个体排出的EBA颗粒提取到被馈送到样本提取部件中的空气流中，所述样本提取部件被配置为接收个体的面部；使用通过接口管流体地连接到样本提取部件的样本捕获部件，从呼出气和空气中收集EBA颗粒，作为收集的样本；将少量的收集的样本点在样本板上；通过使用溶剂、MALDI基质化学品、水和酸及其混合物中的至少一种处理样本，来加工样本；以及使用诊断装置分析样本。EBA颗粒可以包括具有呼吸道疾病特征的微生物、病毒、代谢物生物标记、脂质生物标记和蛋白质组生物标记中的至少一种。加工步骤还可以包括：通过使用合适的干燥装置干燥样本，来浓缩样本。诊断装置可以包括MALDI-TOFMS。使用样本捕获部件的收集步骤可以包括：使来自提取步骤的输出流入填充床柱中，以选择性地捕获EBA颗粒，并且在样本提取系统中使用约12.5％的乙酸、约70％的异丙醇、约5％的TFA、约5％的甲酸和约10％的HCl中的至少一种从填充床柱中提取EBA颗粒，以产生收集的样本。示例性方法可进一步包括以下步骤：消化(digest)收集的样本以产生具有EBA颗粒特征的肽样本。填充床柱可以包括固体颗粒，所述固体颗粒包括树脂、纤维素、二氧化硅、琼脂糖和水合Fe3O4纳米颗粒中的至少一种。填充床柱可以包括表面上具有C18官能团的树脂珠粒。
公开了一种使用呼出气诊断个体中的呼吸道疾病的自主方法，包括：指导个体定位于用于从呼出气中提取EBA颗粒的样本提取部件；启动预定集合的呼吸动作，以将EBA颗粒从呼出气中排出到馈送到样本提取部件中的空气流中；使空气中的EBA颗粒流入样本捕获部件中，同时冷却样本捕获部件的壁和接口管的壁，所述接口管流体地连接样本提取部件和样本捕获部件；产生收集的样本；加工收集的样本包括以下步骤：使用溶剂、MALDI基质化学品、水和酸及其混合物中的至少一种来处理样本，以及使用MALDI-TOFMS分析镀覆的样本。进入样本捕获部件的空气的流速可在约100升/分钟和约1000升/分钟之间。进入样本捕获部件的空气的流速可在约50升/分钟和约500升/分钟之间。收集的样本的体积可以在大约100微升和大约1毫升之间。预定集合的呼吸动作可以包括以下步骤：执行深呼气以清理个体的肺，暂停达10秒；进行FVC吸入，进行深呼出，以及重复上述序列多达10次。该示例性方法还可以包括潮式呼吸、咳嗽、正常FVC呼吸、说话和打喷嚏的各步骤中的至少一种。呼吸道疾病可以包括结核病、流感、肺炎、癌症和由冠状病毒引起的疾病中的至少一种。预定呼吸动作的数量可以由指示呼出颗粒的体积和呼出气的体积中的至少一个的一个或多个传感器确定。一个或多个传感器可包括CO2传感器、氧气传感器、湿度传感器、光学粒度计数器、空气动力学粒度仪和浊度计中的至少一种。
公开了用于诊断由雾化病毒和细菌颗粒引起的呼吸道疾病的示例性系统，该系统包括样本捕获部件和样本分析子系统，其中所述样本捕获部件用于将预定体积的空气中的EBA颗粒收集到被供给到样本捕获部件中的空气流中作为收集的样本，其中空气流在约30L/min和约1000L/min之间，所述样本分析子系统流体地连接到样本捕获部件，样本分析子系统包括样本处理部件和诊断装置，其中所述样本处理部件用于将少量的收集的样本点到样本板上并处理样本板上的收集的样本，所述诊断装置用于分析样本。样本处理部件可以包括流体部件，以使用溶剂、MALDI基质化学品、水和酸及其混合物中的至少一种来处理样本。该系统还可以包括一个或多个传感器，其被配置为与样本提取部件流体连通，其中，一个或多个传感器的输出用于计算进入样本捕获部件的呼出气气溶胶颗粒的总累积体积。一个或多个传感器还可包括CO2传感器、氧气传感器、湿度传感器、光学粒度计数器、空气动力学粒度仪和浊度计中的至少一个。空气的预定体积可以使用一个或多个传感器的输出来确定。
本公开的其它特征和优点将在随后的描述和附图中部分地阐述，其中描述和示出了本公开的优选方面，并且在结合附图阅读以下详细描述时，本公开的优选方面将部分地对本领域技术人员变得显而易见，或者可以通过实践本公开来学习。本公开的优点可以通过在所附权利要求中特别指出的手段和组合来实现和获得。
附图说明
通过结合附图参考以下详细描述，本公开的前述方面及其大部分优点变得被更好地理解且因此变得更容易领会，其中：
图1是示例性的基于EBA的诊断系统的示意图。
图2是示例性EBA样本收集子系统的示意图。
图3是可以可选地用于EBA样本收集子系统中的容纳室的透视图。
图4A至图4B示出呼出气分析中的挥发性有机化合物(离子色谱图)，其示出TB患者(图4A)和非TB患者(图4B)的光谱特征之间的差异。
图5是使用呼出气气溶胶(EBA)和呼出气冷凝物(EBC)分析的示例性诊断方法的示意图。
图6A至图6C示出来自三个健康个体的使用修改的FVC呼吸动作的呼出气中的粒度分布可变性。
图7示出在各种呼吸动作期间呼出气中的二氧化碳测量。
图8示出在不同呼吸动作期间从呼出气收集的肺液的体积。
图9示出从TB样本和非TB样本的正离子模式和负离子模式中获取的MS信号的加权主成分分析(PCA)。
图中的所有附图标记、指示符和标号通过引用并入本文，如同在此完全阐述一样。在图中没有对元素进行编号不是为了放弃任何权利。未编号的参考也可以由附图和附录中的字母符号来标识。
以下详细描述包括对附图的参考，附图构成详细描述的一部分。附图通过图示的方式示出了可以实践所公开的系统和方法的具体实施例。这些实施例被理解为“示例”或“选项”，其被足够详细地描述以使本领域技术人员能够实施本发明。在不脱离本发明的范围的情况下，可以组合实施例，可以利用其它实施例，或者可以进行结构或逻辑改变。因此，以下详细描述不应被理解为限制性的，并且本发明的范围由所附权利要求及其合法等效物来限定。
在本公开中，气溶胶通常是指分散在空气或气体中的悬浮颗粒。“自主”诊断系统和方法意味着“在没有医学专业人员干预或者在医学专业人员干预最小的情况下”，产生诊断测试结果。美国FDA根据与医疗装置相关的风险并通过评估规定量来对该装置进行分类，所述规定量提供对装置的安全性和有效性的合理保证。装置被分类为三个规定类别之一：I类、II类或III类。I类包括风险最低的装置，III类包括风险最大的装置。所有类的装置都受到一般对照。一般对照是应用于所有医疗装置的食品、药物和化妆品(FD&C)法令的基本要求。体外诊断产品是那些用于诊断疾病或其它病症的试剂、仪器和系统，包括确定健康状态，以便治愈、减轻、治疗或预防疾病或其后遗症。这些产品用于收集、制备和检查取自人体的样本。这里公开的示例性装置可以自主地操作并产生高置信度结果，并且因此具有被规定为I类装置的潜力。在世界上一些具有高TB感染负担的地区，对受过医学训练的人员的访问是非常有限的。自主诊断系统优于非自主诊断系统。
术语“一个(a或an)”用于包括一个或一个以上，并且术语“或”用于指代非排他性的“或”，除非另有说明。此外，应当理解，这里使用的措辞或术语，没有另外定义，仅是为了描述的目的而不是限制。除非在本公开中另外指明，为了解释术语“约”的范围，与所公开的值(尺寸、操作条件等)相关联的误差界是本公开中所指示的值的±10％。与作为百分比公开的值相关联的误差界是所示百分比的±1％。在特定词之前使用的词“基本上”包括“在指定范围内相当大”和“所指定的大部分但不是全部”的含义。
具体实施方式
为了说明所公开的方法和系统的组成、原理和操作，下面相当详细地描述了本发明的特定方面。然而，可以进行各种修改，并且本发明的范围不限于所描述的示例性方面。
基于呼出气分析(“EBA”)的示例性诊断系统100可以包括EBA样本收集子系统101和分析子系统102(图1至图3)。下面详细描述这两个子系统。
EBA样本收集子系统101
子系统101可包括样本提取部件104，其可为护罩和宽松的锥形装置中的至少一种的形式。也可以使用适于容纳个体面部的紧身的面罩，或者使用带子等可拆卸地附接到病人/个体105的面部/头部的面罩，但是这不是优选的，因为难以确保适合所有人，尤其是具有胡须/脸毛的男性。个体可以坐在可选的容纳室106中，以将患者的EBA与测试室或测试区域中的环境空气隔离。示例性容纳室106可包括如由Morgan Scientific公司(Haverhill，MA)出售的经修改的肺功能测试体箱，其通过用本文所述的提取部件104来替换体积描记器部件，以使室106与提取部件104流体连通。室106还可以是Wood等人(2016)描述的呼吸气溶胶采样室(RASC)的修改版本并且可以结合其中描述的特征和能力。Wood等人(2016)的公开(在“参考文献”部分引用的非专利文献)在此通过引用整体并入本文。在RASC室中，参与者坐着，被动进行呼出空气采样协议。在Wood等人简述的阶段之后，在该室中大约花费一个小时。简要的，该室是密封的，并且执行空气清洗阶段，通过高效颗粒捕获(HEPA)过滤器夹带环境空气长达10分钟。这之后是参与者驱动的污染阶段，在该阶段，将室与外部环境隔离，并且允许呼出空气的比例上升到10％阈值，该阈值由高于环境水平的4000ppm的室CO2浓度来限定(基于40000ppm的假定呼出空气CO2浓度)。测量的CO2可用于计算呼出空气体积，如Wood等人所述。如果在30分钟过去之后未达到目标，则在较低的呼出空气比例时采样阶段开始。在采样之后，再次净化该室以从空气中除去残留的Mtb。除了自发咳嗽或喷嚏之外，采样室的污染主要由潮式呼吸导致。在采样和初始净化阶段期间，通过参与者佩戴全身杜邦防护服(DuPont Tyvek)套装，使来自呼吸之外的来源的颗粒和生物体最小化，以使环境污染最小化。部件104用于将通过患者105的嘴和鼻子射出的气溶胶颗粒提取到用作从空气源107供应的鞘液(通常为空气)的空气流中，这有助于将气溶胶朝向部件104的出口输送，并且输送到样本捕获部件108中而不沉积在部件104的壁上。空气源107可以是空气泵或压缩机。104的示例是Milton组使用的漏斗形圆锥体或Fennelly使用的面罩。空气鞘流体可以通过壁添加或者在部件104的大边缘处添加，或更一般地空气鞘流体可以添加到室106中。供给到部件104的空气流可以被适当地过滤(例如，使用HEPA过滤器)以去除环境空气中的所有或者几乎所有的颗粒物质，包括但不限于灰尘和污染物。(HEPA代表高效颗粒空气)是用于描述能够捕集99.97％的0.3微米颗粒的过滤器的称号，并且用于去除环境空气中的所有或几乎所有的颗粒物质，包括但不限于灰尘和烟灰。此外，可润湿鞘液流以使EBA粒度能够生长，从而使呼吸中的大部分颗粒能够在气溶胶捕获装置108的下游被捕获。接口管109将提取部件104流体地连接到样本捕获部件108，并且可以进一步冷却以使EBA颗粒的尺寸能够增大。冷却可以使用制冷系统来提供，或者更优选地使用珀耳帖(Peltier)热电冷却装置113来提供，珀耳帖热电冷却装置小、重量轻并且操作消耗更少的功率。例如，由MarlowIndustries公司(Dallas，TX)，TE Technologies公司(Traverse City，MI)提供的珀耳帖冷却装置通常包括交替的n型和p型半导体阵列。该阵列被焊接在两个电串联且热并联的陶瓷板之间。碲化铋、碲化锑和硒化铋是珀尔帖效应装置的优选材料，因为它们提供从180K到400K的最佳性能，并且可以制成n型和p型。当在连接的交替的n型和p型半导体两端施加电压以产生电流时，珀耳帖效应通过在两个电结点之间传递热量来产生温差。在一个结点处移除热量并发生冷却。热量沉积在另一结点处，并且易于用风扇或鼓风机散去。
部件104可以是一次性的，以限制病人被先前病人散发出的病原体污染或感染的风险。替代地，部件104可以是可重复使用的，在这种情况下，可以使用消毒部件110，使用由合适的喷雾器产生的消毒喷雾冲洗、UV辐射、过氧化物溶液或蒸汽处理、蒸汽消毒中的至少一种或其组合来对其进行消毒。喷雾器，例如，碰撞型喷雾器(由CH Technologies提供)，可以流体地连接在锥体的排气口附近，即喉部区域111附近。喷洒冲洗液以消毒提取部件104、管109和捕获部件108。选择冲洗流体以确保EBA和冷凝的EBA(呼出气冷凝物)样本以及采样子系统101中的部件保持在大体无菌的条件下。例如，如果使用70％乙醇的异丙醇溶液，该消毒剂溶液可以通过蒸发容易地从样本中除去，并且不干扰分析。消毒部件110(例如，喷雾器)可以在样本收集期结束时被短暂地激活，以提供对入口管109和捕获部件108的最终冲洗。在被下一个患者再次使用之前，喷雾器110可以再次被激活以清洁样本提取部件108。通过切换阀117以将泵116流体地连接到废物容器，可以使用泵116将废物流体泵送到废物容器。尽管示例性样本提取部件104和样本捕获部件108可以针对各个患者进行消毒，但具有MS诊断装置的示例性系统100不需要针对不同个体对示例性系统进行100％净化，因为即使在存在微量污染物的情况下，对感兴趣的生物气溶胶片段也具有高灵敏度。
虽然提取部件104和管109被示出为直径是会聚/发散的，但是管的直径可以与部件104的喉部111的直径相同，或者可以大于或小于喉部111的直径。传感器112包括但不限于CO2传感器和粒度仪/粒度计数器，并且可在喉部区域111附近流体地连接到部件104。传感器112提供已被采样的呼出气的体积的指示。连续CO2监测允许容纳室106中的每个参与者在任何给定时间内的呼出空气体积的比例的近似。例如，对于肺活量减少并且具有相对小的用力肺活量(FVC)(例如，小于两升)或弱咳嗽(例如，小于1升的呼出气)的人，可以自动地并且实时地指示患者提供更多的FVC呼吸或咳嗽，直到已经收集了足够量的呼出气气溶胶。Wurie(2016)描述了在正常潮式呼吸期间由患有结核病的患者产生的生物气溶胶，并暗示了传播风险。光学颗粒计数器技术用于测量在以下四组中在15次潮式呼吸期间呼出空气(直径在0.3pm至20pm范围内)中随时间变化的气溶胶尺寸和浓度：健康/未感染的、健康/Mtb-感染的、患有胸外TB的患者和患有胸内TB的患者。高颗粒产生被定义为所有参与者中高于中值计数的任何1μm至5μm大小的生物气溶胶计数(中值计数＝2个计数/L)。获得来自188位参与者的数据，进行预处理(基线)。生物气溶胶的生产在个体之间变化很大。多变量分析显示：与健康/未感染个体相比，胸腔内TB与1mm至5mm的生物气溶胶的高产量几率增加3.5倍相关。Wurie(2016)，在参考部分引用的非专利文献通过引用整体并入本文。
EBA样本捕获部件108可以是湿壁旋流器(如图2所示)、一个或多个撞击器(例如，如Milton所示)或撞击滤尘器，它们使用干燥或接近干燥的收集方法，随后通过洗涤导致EBA颗粒从旋流器的收集表面再悬浮。示例性的捕获部件108包括但不限于湿膜撞击器(McDevitt，2013)、CoriolisTM湿壁旋流器(法国Bertin)、撞击滤尘器(诸如Biosampler(SKC公司,Eight Four,PA))、基于冲击的装置(诸如BioCapture(FLIR系统,OR)和300L/min湿壁旋流器(King，2012))以及Biospot采样器(气溶胶装置,Fort Collins,CO)。McDevitt的湿膜撞击器和Biospot采样器使用增湿和冷凝的组合来“生长”气溶胶颗粒的尺寸，从而提高EBA中亚微米尺寸颗粒的收集效率。在参考部分中引用的McDevitt和King公开的每个非专利文献和其中的内容通过引用整体并入本文。EBA气溶胶颗粒可以直接收集到液体中，或者可以收集到过滤介质上，并通过回洗水或溶剂通过过滤器来提取，通过使用可溶解的过滤材料，并将过滤器溶解或者在液体中粉碎过滤器，然后分析得到的浆液。EBA气溶胶颗粒可以通过将颗粒冲击到干燥表面上然后用合适的流体从表面上洗涤颗粒来收集。虚拟撞击器可用于浓缩特定“切割尺寸”的气溶胶，以及大于切割尺寸的气溶胶。虚拟撞击器，例如美国专利No.6,062,392中描述的，可与撞击器和其它装置结合以增加包含呼出气的空气的入口空气流速，如美国专利No.6,267,016中所示。样本捕获部件108可以包括冷凝生长管以将亚微米颗粒生长为微米尺寸的颗粒。生物标记可以包括来自Mtb细胞壁的脂质，并且这些脂质除了Mtb细胞之外还可以用于疾病诊断。收集接近100％的呼出样本。不需要用盐水溶液稀释收集的样本115。
EBA气溶胶颗粒捕获部件108可具有在约100L/min与约1000L/min之间的流动速率鞘液(空气)。空气流速优选大于200L/min，约为300L/min。McDevitt使用的流速为130L/min，其不足以可靠地捕获咳嗽期间产生的EBA。高流速使咳嗽动作期间由于回吹引起的气溶胶的损失最小化。较高的流速导致更多的EBA颗粒夹带。优选地，气溶胶捕获部件108将颗粒收集到小体积的浓缩样本115中，并且因此产生浓缩的气溶胶生物质(例如，至少1纳升的外周肺液/每毫升收集流体)。可以使用泵116将样本115传送到分析子系统102，泵116优选是蠕动泵。阀116可以用于例如在样本收集系统101的净化期间、将冷凝样本115引入分析子系统102或引入废物容器。小于约1ml体积的EBA样本流体是优选的且被作为目标。示例性公开的系统能够产生大约100微升到大约200微升之间的流体。因此，并非所有本文所确定的示例性EBA样本捕获部件都优选地用于所公开的用于自主系统的示例性样本收集子系统101中。例如，生物采样器和Coriolis气溶胶采样器将EBA气溶胶颗粒收集到体积大于10ml的含水样本中。这种大体积导致非常稀的样本，并且需要颗粒浓缩方法。即使在咳嗽期间，呼出气的打喷嚏流速在时间上也非常不均速，优选的气溶胶捕获部件108也具有高的入口空气流速以在呼出气中夹带大部分颗粒。类似地，McDevitt的湿膜撞击器在撞击器的上游使用蒸汽注入，然后将蒸汽冷凝以提供样本，将样本收集到50ml离心管中，然后使用离心机进行浓缩。如前所述，示例性EBA样本收集子系统将捕获在约1ml或更少的液体体积中的颗粒。类似于使用珀耳帖装置将提取部件104流体地连接到部件108的冷却管109，优选地使用一个或多个珀耳帖冷却装置114来冷却所述部件108，以使呼出气中的EBA颗粒能够生长尺寸。在肺深处形成的颗粒直径可以是100微米量级，但是可以生长到大于1微米。部件108和管109的冷却促进了在液体样本中收集的呼出气中的挥发性化合物的冷凝。因此，示例性EBA捕获部件108收集呼出气中的挥发性物质和非挥发性生物质。当旋流器用作捕获部件108时，旋流器和旋流器入口管优选由铜、铜合金(如镍铜合金400)或具有高导热性和低成本的其它合金制成。此外，铜和铜合金具有固有的抗微生物性能。珀尔帖冷却装置113和114优选作为冷却装置，因为它们可以容易和精确地控制旋流器入口109和旋流器108的主体的温度。馈送到样本捕获部件108(例如，旋流器108)的夹带空气可以使用泵118供应，并且使用HEPA过滤器119过滤。
EBA样本分析子系统102
然后，包括EBA气溶胶颗粒的EBA液体样本115被引导到样本处理部件120，以使用用于分析EBA颗粒的诊断装置121和用于分析呼出气中的挥发性有机物的装置122中的至少一个来进行分析。样本处理部件120可以包括执行以下步骤中的一个或多个所必需的元件：
(a)样本115可置于杯或小瓶中。例如，系列110A点采样器(气溶胶装置)使用32个具有圆形孔形状(75μL孔体积)或泪滴孔形状(120μL孔体积)的孔板，其被加热以蒸发样本中过量的流体/液体以浓缩样本。
(b)样本115可放置在杯中并暴露于真空源，以使流体蒸发来浓缩样本。
(c)样本115可与高挥发性溶剂(例如甲醇、乙醇和乙腈)混合以加速蒸发过程。
(d)样本115可进行基于珠粒的提取。基于珠粒的提取可用于从稀溶液中提取生物标记。例如，微米尺寸的磁珠粒可以用与蛋白质生物标记(如EBA颗粒)结合良好的聚糖材料来涂覆。珠粒可以通过振荡磁场与EBA样本紧密混合。混合一段时间后，可以用恒定磁场将珠粒拉到一侧，然后释放到少量溶剂中，以提取EBA颗粒作为浓缩样本。
(e)样本115可以经受溶剂提取过程，由此样本与不混溶流体紧密接触，使得生物标记(EBA颗粒)优先传送到不混溶流体。例如，相对大的水性收集流体样本(＞1ml)可以与相对小体积的有机溶剂(例如己烷或氯仿)接触，从而将来自样本中的EBA颗粒和细胞碎片的脂质传送至有机相。
许多诊断装置可以适于用在分析子系统102，其包括但不限于执行基于基因组学的测定(诸如PCR、rt-PCR和全基因组测序)、生物标记识别测定(诸如ELISA)和光谱分析(诸如质谱(MS))的装置。在这些诊断装置中，MS由于其分析速度而是优选的。优选用于生物标记识别的MS技术是电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)MS。ESI可以耦接到高分辨率质谱仪，例如Oribtrap(ThermoFisher)，ESI-MS装置通常非常大并且笨重，并且需要高水平的专业技术来操作，并且不适合自主操作或应用，例如即时诊断。相反，MALDI-MS装置可以是紧凑的、重量轻的、消耗小于100瓦的功率并且在小于15分钟内提供样本分析。MALDI-MS是优选的适用于ACF的即时诊断的诊断装置。包括样本制备的时间，使用MS的分析时间可以小于约15分钟。在将样本插入MALDI光谱仪之前，必须将样本干燥，并且在没有分析物损失或降解的情况下，大(＞1ml)样本不能被快速干燥。对于浓缩的样本115，使用MALDI MS的样本分析可以少于5分钟(包括样本制备)，因为需要较少的时间将水从样本中蒸发。
在“基质辅助激光解吸电离”(MALDI)中，可以使用质谱完整地分析大分子。在该技术中，目标颗粒(分析物)被基质化学品涂覆，该基质化学品优先吸收来自激光器的光(通常是紫外波长)。在没有基质的情况下，当在质谱仪中生物分子暴露于激光束时，生物分子将通过热解而分解。基质化学品还将电荷传送到汽化的分子，产生离子，然后通过电场使离子在飞行管中加速向下。微生物学和蛋白质组学已经成为质谱的主要应用领域；示例包括细菌的识别、发现化学结构和衍生蛋白质功能。MALDI-MS也已经用于藻类的脂质分布型分析。在MALDI-MS过程中，通常由酸(如三氟乙酸(TFA))和MALDI基质化学品(如α-氰基-4-羟基苯丙烯酸)组成的液体溶解于溶剂中并加入样本中。溶剂包括乙腈、水、乙醇和丙酮。通常加入TFA以抑制盐杂质对样本质谱的影响。水使亲水性蛋白质溶解，乙腈使疏水性蛋白质溶解。将MALDI基质溶液滴在MALDI板上的样本上，在样本上产生均匀同质的MALDI基质材料层。溶剂蒸发，仅留下再结晶的基质，其中样本扩散通过基质晶体。酸部分降解了样本的细胞膜，使得蛋白质可用于MS中的电离和分析。其它MALDI基质材料包括3,5-二甲氧基-4-羟基苯丙烯酸(芥子酸)、α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(α-氰基或α-基质)和2,5-二羟基苯甲酸(DHB)，如美国专利8,409,870中所述。
在示例性系统100中，使用冷却器来冷却捕获部件108和入口管线109产生包括呼出气中的冷凝的挥发性有机化合物和含有EBA的冷却的液体样本的样本115。因此，样本115可以被引入诊断装置122，以分析冷凝的挥发性有机物，并且被引入装置121，以分析非挥发性EBA颗粒。在步骤204(图5)的样本处理期间，可以使用加热器来加热液体样本115，以驱动挥发性化合物进入诊断装置122，例如GC-MS、GC-IMS、挥发性离子色谱或任何其它类型的适于分析挥发性有机化合物的分析方法。图4示出了呼出气的离子色谱可以用于区分健康个体和TB感染患者。Hashoul(2019)公开了用于使用传感器从呼出气中检测包括TB的肺部疾病。Hashoul描述了使用GC(气相色谱)-MS对226个有症状的高危患者进行的呼吸分析，指出了活性肺TB的几种生物标记。他们提出了氧化应激产物(如烷烃和烷烃衍生物)以及结核分枝杆菌的挥发性代谢物(如环己烷和苯衍生物)中的生物标记。使用C统计值，将这些结果在阳性和阴性TB之间进行区分，总体准确性是85％、灵敏度为84％，特异性为64.7％。使用金属氧化物传感器。此外，传感器阵列在区分健康对照与TB患者方面具有93.5％的灵敏度和85.3％的特异性，在识别整个测试群体中TB患者方面具有76.5％的灵敏度和87.2％的特异性。还讨论了金纳米颗粒(GNP)和QMB(石英微量天平传感器)的使用。在参考部分引用的Hashoul公开的非专利文献在此全部并入本文。如果如上所述在子系统101中不采用冷却，则液体样本115可以不包含任何冷凝的挥发性有机物。结果，诊断装置可以限于使用装置121分析液体中的EBA颗粒。
图5是使用如本文先前公开的示例性系统100的示例性诊断方法200的示意图。示例性方法200可以用于基于呼出气执行自主的即时诊断。在步骤201中，个体105可被引导就坐；该椅子可以可选地位于容纳间106中。在步骤202中，提取部件104可以可移除地配合到个体的头部，或者定位比头部大的锥体以松散地配合在个体的头部周围。样本捕获部件108被激活，这使得空气被抽吸到患者头部周围并且进入样本捕获装置。当旋流器用作样本捕获部件108时，空气流动到部件108且对旋流器主体和入口管109的冷却开始。优选地，将过滤的鞘空气供应至部件104。可以将鞘空气加湿，优选加湿到大于90％的相对湿度。然后，指示个体105执行一个或多个预定动作203，其可包括预设的重复次数。该动作可包括执行用于从下呼吸道产生EBA样本的一个或多个FVC动作或修改的FVC动作，从而产生用于主要从上呼吸道产生EBA的一个或多个咳嗽样本，以及产生主要从鼻道/上呼吸道产生EBA的一个或多个喷嚏样本。修改后的FVC是先深呼气，然后停顿5秒到10秒的FVC。这种呼出和暂停引起细支气管关闭，随后在FVC吸入期间重新打开。包括肺泡在内的小的肺通道的关闭和重新打开被认为导致增加的颗粒产生。对于使用示例性系统100的TB诊断，可能需要约3至约5次的修改的FCV重复。动作可以包括咳嗽、FVC呼吸、修改的FVC呼吸和打喷嚏。对于一些其它疾病的诊断，可能需要所有的动作。打喷嚏可通过将小剂量的胡椒或其它香料以气溶胶形式注射到鼻道中引起。优选地，可能需要至少三次修改的FVC呼吸以对下呼吸道采样，以及一系列咳嗽以对上呼吸道采样。下呼吸道通常包括气管、肺和支气管树的所有段(包括肺泡)，并且下呼吸道的器官位于胸腔内。上呼吸道通常包括鼻、咽和喉，并且上呼吸道的器官位于胸腔外。在一些情况下，可能需要至少十次修改的FVC呼吸。可以诱发一系列喷嚏以对鼻通道采样。一种优选的增加每次呼吸的生物量收集的修改的FVC是患者首先呼气，然后在FVC吸气之前暂停达10秒，随后完全呼气，如Bake等人(2019)所公开的，该文献在参考部分中引用，其全部内容通过引用并入本文。优选的呼吸动作可以包括10x咳嗽/FVC/支气管爆炸。代替锥体或护罩，样本提取部件104可以包括用于治疗睡眠呼吸暂停的连续气道正压(CPAP)面罩(例如，飞利浦伟康公司(Philips Respironics)出售的Dreamware和Amara面罩)。CPAP通过面罩将空气吹入咽喉，精细地增加咽喉中的气压并防止气道变窄来工作，但其被修改为使用空气流作为鞘液来收集来自各种呼吸动作的呼出气。
然后指示患者离开椅子并坐在等待区域中。提取部件104可以在UV光中消毒。在样本处理步骤204中，样本115被自动地从收集子系统101传送以用于分析子系统102中的样本处理。样本处理的类型取决于诊断装置的类型。当诊断装置为MALDI-MS时，样本处理可包括以下步骤：使用蠕动泵将样本115放置到MALDI-MS样本盘上，加热盘以浓缩样本，加入MALDI基质/酸/溶剂(如下所述)并干燥盘。然后在步骤205中使用MALDI-MS分析样本盘。将获得的光谱与来自对特定呼吸道感染已知为阳性的样本的光谱进行比较，并且还与来自已知为健康的患者的样本的光谱进行比较，并且生成患者的诊断。然后，可以将结果传送给临床医生或患者。一旦提取部件204附接到患者，并且开始样本提取，示例性方法在执行所需的动作之后是自主的(除了要求患者离开椅子之外)并且生成诊断的测试结果。
关于步骤203中的FVC动作，图6A至图6C示出了来自健康个体进行10次重复的FVC呼吸动作的呼吸气溶胶的正常变化。即使对于健康个体，呼出气气溶胶的量和粒度分布的可变性也非常大。使用LASEX II(PMS，City，CO)捕获数据。在EBA收集期间，从咳嗽动作中也注意到了类似的可变性。粒度分布有助于通过对粒度分布随时间的积分来确定总呼出颗粒质量。这个方面有助于确定所收集的样本是否足以用于分析。图7示出在细支气管薄膜爆裂(BB)、FCV和咳嗽动作期间呼出气中的二氧化碳测量。Patterson等人观察到在CO2产生速率和气溶胶颗粒产生之间的强相关性。测量的CO2也可用于计算呼出空气体积，如Wood等人所述的。
图8示出基于LASEX仪器测量的粒度分布和颗粒浓度的呼出气流体体积的体积(纳升)。如果优选的方法是提供最大样本的方法，则修改的FVC动作优于标准FVC。咳嗽提供了相似量的EBA样本体积，主要来自上呼吸道。这两种方法都产生了足够的样本来检测已知被感染的但是尚未接受治疗的患者的TB感染。
关于使用MS来检测呼出气中TB感染的生物标记，使用高分辨率Orbitrap质谱仪(ThermoFisher Scientific)从自TB患者(n＝20)和非TB/对照样本(n＝13)收集的样本获得(或提取)包含1000s特征的正离子信号和负离子信号。选择高于5:1信噪比(SNR)的质量。加权主成分分析(PCA)(一种无监督的降维算法)用于将大的信号集合减少到两个分量。PCA提供2D可视化，其用于探究提取的信号是否会揭示两类样本TB和非TB之间的内在差异。PCA结果(图9)表明，每组样本易于聚集在一起，这表明从高分辨率质谱收集的提取信号可用于区分两类样本。
本文所述的示例性系统和方法不限于其对呼吸道感染的诊断能力方面。例如，肺癌也可将生物标记释放到周围肺液中，并且这些生物标记将通过所公开的系统和方法容易地检测。此外，因为血液与肺中的肺泡衬里紧密接触，所以身体的其他部分(肺以外)中的感染和癌症的生物标记可以被传送穿过肺泡衬里并且进入外周肺液中，并且因此可以通过EBA的分析来检测到。因此，本发明的范围不限于检测和诊断呼吸疾病。
示例性的样本提取部件可以包括填充床柱，以选择性地捕获呼出气中的包括EBA颗粒的非挥发性有机组分。呼出气中的非挥发性组分可包括呼吸气溶胶颗粒，其包括具有呼吸道疾病特征的微生物、病毒、代谢生物标记、脂质生物标记和蛋白质组生物标记中的至少一种。填充床柱可以包括固体颗粒，其包括树脂、纤维素、二氧化硅、琼脂糖和水合Fe3O4纳米颗粒中的至少一种。填充床柱可以包括表面上具有C18官能团的树脂珠粒。树脂珠粒的标称直径在约12μm与约20μpm之间。固体颗粒可以包括固定在颗粒表面上的官能团，其中所述官能团包括以下中的至少一种：C18(十八烷基)、辛基、乙基、环己基、苯基、氰丙基、氨丙基、2,3-二羟基丙氧基丙基、三甲基-氨丙基、羧基丙基、苯磺酸、丙基磺酸、离子交换相、聚合物相、抗体、聚糖、脂质、DNA和RNA。离子交换相可以包括二乙基氨基乙基纤维素、QAESephadex、Q琼脂糖和羧甲基纤维素中的至少一种。聚合物相包括聚苯乙烯-共-l,4-二乙烯基苯、甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、淀粉和琼脂糖中的至少一种。抗体可以包括抗人白蛋白、抗甲型流感病毒NP和抗SARS-CoV-2病毒中的至少一种。抗体可以固定在蛋白A/G琼脂糖珠粒上。捕获元件可被冷却至等于或低于环境温度的温度。题为“DIAGNOSIS OF RESPIRATORYDISEASES USING ANALYSIS OF EXHALED BREATH AND AEROSOLS”的共同拥有的美国临时专利申请No.63/069,029提供了与包括填充床柱的示例性样本提取部件相关的附加细节，并且通过引用将其全部内容并入本文。
本文公开的示例性系统和方法可包括机器人系统和部件。例如，所述系统和方法可以包括机器人样本传送系统，以将收集的样本点在样本板上，并且进行进一步的处理或样本处理，以及分析处理的样本。共同拥有的美国临时专利申请。题为“SYSTEMS ANDMETHODS OF RAPID AND AUTONOMOUS DETECTION OF AEROSOL PARTICLES”的共同拥有的美国临时专利申请No.62/931,200提供了与示例性机器人样本传送系统相关的附加细节，该申请通过引用整体并入本文。
在处理和分析之前，收集的样本不需要点在样本板上。例如，在收集的液体样本中的EBA颗粒可以使用喷雾器雾化，并使用MALDI基质“即时”涂覆，以形成涂覆的气溶胶EBA颗粒。可以使用气溶胶飞行时间质谱仪(ATOFMS)来分析涂覆的颗粒。“即时”是指包含气溶胶的颗粒没有被收集到表面上(例如，MALDI板的表面上)或液体中作为涂布过程中的一个步骤。题为“COATING OF AEROSOL PARTICLES USING AN ACOUSTIC COATER”的共同拥有的美国专利申请No.15/755063提供了另外的细节，在此通过引用将其全部内容并入本文。
提供摘要以符合37C.F.R.§1.72(b)，以允许读者从粗略的检查中快速地确定技术公开的性质和要点。它不应被用于解释或限制权利要求的范围或含义。
尽管已经结合实施本公开的优选形式描述了本公开，但是本领域普通技术人员将理解，在不脱离本公开的精神的情况下，可以对本公开进行许多修改。因此，本公开的范围不旨在以任何方式受到以上描述的限制。
还应当理解，在不背离本公开的本质的情况下，可以进行各种改变。这些改变也隐含地包括在本说明书中。但是它们仍然落入本公开的范围内。应当理解，本公开旨在产生独立地并且作为整体系统并且在方法和设备模式两者中覆盖本公开的许多方面的专利。
此外，本公开和权利要求的各个要素中的每一个还可以以各种方式实现。本公开应当被理解为涵盖每个这样的变化，其是任何设备实施方式、方法或过程实施方式的变化，或者甚至仅仅是这些实施方式的任何元件的变化。
特别地，应当理解，即使仅功能或结果是相同的，每个元件的词语也可以由等同的设备术语或方法术语来表达。这样的等同的、更广泛的、或甚至更一般的术语应当被认为包含在每个元件或动作的描述中。在需要明确本公开所赋予的隐含的广泛范围的情况下，可以替换这些术语。应当理解，所有动作可以被表达为用于采取该动作的手段或引起该动作的元件。类似地，所公开的每个物理元件应当被理解为涵盖该物理元件所促进的动作的公开。
另外，对于所使用的每个术语，应当理解，除非其在本申请中的使用与这种解释不一致，否则对于每个术语应当理解为并入了通用字典定义，并且所有定义、替代术语和同义词(例如包含在由技术人员识别的标准技术字典和最新版的韦伯斯特字典(Random HouseWebster’s Unabridged Dictionary)中的至少一个中的定义、替代术语和同义词)通过引用并入本文。
此外，根据传统的权利要求解释，过渡短语“包括”的使用用于保持本文的“开放的”权利要求。因此，除非上下文另有要求，否则应理解，诸如“包括(comprises或comprising)”的变型旨在暗示包括所述元件或步骤或元件或步骤的组，但不排除任何其它元件或步骤或元件或步骤的组。应当以其最广泛的形式来解释这些术语以使申请人呈现出法律允许的最大的范围。
参考文献
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2.Fennelly K.P.,Martyny J.W.,Fulton K.E.,Orme FM.,Cave D.M.,et al.(2004)Cough-generated aerosols of Mycobacterium tuberculosis:a new method tostudy infectiousness.Am J Respir Crit Care Med 169:604-609.
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6.James J.McDevitt,Petros Koutrakis,Stephen T.Ferguson,JackM.Wolfson,M.Patricia Fabian,Marco Martins,Jovan Pantelic,and Donald K.Milton,“Development and Performance Evaluation of an Exhaled-Breath BioaerosolCollector for Influenza Virus,”Aerosol Sci.Technol.2013 January 1；47(4):444-451.
7.Benjamin Patterson,Carl Morrow,Vinayak Singh,Atica Moosa,MelittaGqada,Jeremy Woodward,Valerie Mizrahi,Wayne Bryden,Charles Call,ShwetakPatel,Digby Warner,Robin Wood,“Detection of Mycobacterium tuberculosisbacilli in bio-aerosols from untreated TB patients,”Gates Open Research 2018,1:11.
8.Wood R.,Morrow C.,Barry C.E.,III,Bryden W.A.,Call C.J.,Hickey A.J.,et al.:Real-Time Investigation of Tuberculosis Transmission:Developing theRespiratory Aerosol Sampling Chamber(RASC).PLoS One.2016；11(1):e0146658.
9.Rachel C.Wood,Angelique K.Luabeya,Kris M.Weigel,Alicia K.Wilbur,Lisa Jones-Engel,Mark Hatherill,and Gerard A.Cangelosi,“Detection ofMycobacterium tuberculosis DNA on the oral mucosa of tuberculosis patients,”Sci.Rep.5,8668(2015).
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Claims (55)

1.一种用于使用呼出气来诊断个体中的呼吸道疾病的自主系统，所述系统包括：
样本收集子系统，包括：
样本提取部件，其被配置为接收个体的面部，以将在预定数量的呼吸动作期间从所述个体排出的呼吸气溶胶(EBA)颗粒提取到被馈送到所述提取部件中的空气流中；以及
样本捕获部件，其通过接口管流体地连接到所述样本提取部件，并且被配置为从呼出气和空气中分离和收集所述EBA颗粒，作为收集的样本；以及
样本分析子系统，其流体地连接到所述样本捕获部件且所述样本分析子系统包括：
样本处理部件，其将少量的所述收集的样本点在样本板上，并将收集的样本浓缩在所述样本板上；以及
诊断装置，其用于分析样本。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述EBA颗粒包括具有所述呼吸道疾病特征的微生物、病毒、代谢物生物标记、脂质生物标记和蛋白质组生物标记中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的系统，其中，进入所述样本捕获部件的空气的流速在约100L/min与约1000L/min之间。
4.根据权利要求1所述的系统，其中，进入所述样本捕获部件的空气的流速在约50L/min与约500L/min之间。
5.根据权利要求1所述的系统，其中，所述收集的样本的体积在约100微升和约1毫升之间。
6.根据权利要求1所述的系统，其中，所述样本捕获部件还包括空气泵和撞击器，其中所述空气泵提供所述空气流以将所述呼出气从所述提取部件运送到所述撞击器中，并且其中所述撞击器将所述EBA颗粒与呼出气分离以产生所述收集的样本。
7.根据权利要求6所述的系统，其中，所述撞击器包括旋流器、湿壁旋流器、一个或多个湿膜撞击器和撞击滤尘器中的至少一个。
8.根据权利要求6所述的系统，还包括设置在所述撞击器上游的至少一个虚拟撞击台。
9.根据权利要求1所述的系统，其中，所述样本提取部件包括锥形装置、护罩、CPR救助面罩、CPAP面罩、呼吸机面罩和医用通用接口管中的至少一个。
10.根据权利要求1所述的系统，其中，所述样本收集子系统还包括容纳室，所述容纳室用于容纳所述个体并将所述个体的呼出气与环境空气隔离，其中所述提取部件通过所述容纳室的壁流体地连接到所述捕获部件。
11.根据权利要求1所述的系统，其中，所述诊断装置包括PCR、rt-PCR、基于免疫的测定物、质谱仪(MS)、MALDI-MS、ESI-MS、GC-MS、GC-IMS和MALDI-TOFMS中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的系统，还包括一个或多个冷却装置，所述一个或多个冷却装置被配置成与所述接口管和所述样本捕获部件中的至少一个的壁进行热连通，以冷却所述样本捕获部件。
13.根据权利要求12所述的系统，其中，使用所述一个或多个冷却装置将所述样本捕获部件冷却到大于约0℃且小于约10℃的温度。
14.根据权利要求12所述的系统，其中，使用所述一个或多个冷却装置将所述样本捕获部件冷却到大于约0℃且小于约4℃的温度。
15.根据权利要求12所述的系统，其中，所述一个或多个冷却装置包括珀耳帖热电装置。
16.根据权利要求1所述的系统，还包括一个或多个传感器，所述一个或多个传感器被配置为与所述样本提取部件流体连通，其中，所述一个或多个传感器的输出用于计算进入所述样本捕获部件的呼出气气溶胶颗粒的总累积体积。
17.根据权利要求16所述的系统，其中，所述一个或多个传感器包括CO2传感器、氧气传感器、湿度传感器、光学粒度计数器、空气动力学粒度仪和浊度计中的至少一种。
18.根据权利要求16所述的系统，其中，使用所述诊断装置诊断呼吸道疾病所需的呼出气动作的数量是使用呼出气气溶胶颗粒的所述总累积体积来确定的。
19.根据权利要求1所述的系统，还包括用于对所述样本收集子系统进行消毒的消毒部件。
20.根据权利要求19所述的系统，其中，所述消毒部件包括用于喷射消毒剂的喷雾器、用于产生UV辐射的一个或多个UV灯、蒸汽发生器、臭氧发生器、过氧化物蒸汽发生器及其组合中的至少一个。
21.根据权利要求20所述的系统，其中，所述消毒剂包含60％乙醇水溶液、至少60％异丙醇水溶液和过氧化物溶液中的至少一种。
22.根据权利要求1所述的系统，其中，使用分配泵、重力诱导流和机器人样本传送系统中的至少一个将所述收集的样本传送到所述样本处理部件。
23.根据权利要求22所述的系统，其中，所述泵是蠕动泵。
24.根据权利要求1所述的系统，其中，所述接口管由铜和镍铜合金400中的至少一种制成。
25.根据权利要求1所述的系统，其中，所述样本捕获部件由铜和镍铜合金400中的至少一种制成。
26.根据权利要求1所述的系统，其中所述诊断装置包括MALDI-TOFMS。
27.根据权利要求1所述的系统，其中，所述样本处理部件还包括流体储存器和流体分配泵中的至少一个，以将约1微升的流体分配到设置在所述样本基板上的所述收集的样本上。
28.根据权利要求27所述的系统，其中，所述液体包括溶剂、MALDI基质化学品、水和酸中的至少一种。
29.根据权利要求1所述的系统，其中，所述个体是未感染的人和感染以下至少一种疾病的人中的至少一个：结核病和冠状病毒疾病。
30.根据权利要求2所述的系统，其中，所述脂质生物标记包括具有Mtb特征的生物标记。
31.根据权利要求1所述的系统，其中，所述样本捕获元件包括与所述样本提取部件流体连通的填充床柱，以选择性地捕获EBA颗粒。
32.根据权利要求31所述的系统，其中，所述填充床柱包括固体颗粒，所述固体颗粒包括树脂、纤维素、二氧化硅、琼脂糖和水合的Fe3O4纳米颗粒中的至少一种。
33.根据权利要求31所述的系统，其中，所述填充床柱包括表面上具有C18官能团的树脂珠粒。
34.一种使用呼出气诊断个体中呼吸道疾病的自主方法，该方法包括：
将在预定数量的呼吸动作期间从所述个体排出的EBA颗粒提取到被馈送到样本提取部件中的空气流中，所述样本提取部件被配置为接收个体的面部；
使用通过接口管流体地连接到所述样本提取部件的样本捕获部件，从呼出气和空气中收集所述EBA颗粒，作为收集的样本；
将少量的所述收集的样本点在样本板上；
通过使用溶剂、MALDI基质化学品、水和酸及其混合物中的至少一种处理所述样本，来加工所述样本；以及
使用诊断装置分析所述样本。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述EBA颗粒包括具有呼吸道疾病特征的微生物、病毒、代谢物生物标记、脂质生物标记和蛋白质组生物标记中的至少一种。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，加工步骤还包括：通过使用合适的干燥装置干燥所述样本来浓缩所述样本。
37.根据权利要求34所述的方法，其中，所述诊断装置包括MALDI-TOFMS。
38.根据权利要求34所述的方法，其中，使用所述样本捕获部件的收集步骤包括：
使来自提取步骤的输出流入填充床柱中，以选择性地捕获所述EBA颗粒，以及
在样本提取系统中使用约12.5％的乙酸、约70％的异丙醇、约5％的TFA、约5％的甲酸和约10％的HCl中的至少一种，从所述填充床柱中提取所述EBA颗粒，以产生收集的样本。
39.根据权利要求34所述的方法，还包括以下步骤：消化所述收集的样本以产生具有所述EBA颗粒特征的肽样本。
40.根据权利要求38所述的系统，其中，所述填充床柱包括固体颗粒，所述固体颗粒包括树脂、纤维素、二氧化硅、琼脂糖和水合Fe3O4纳米颗粒中的至少一种。
41.根据权利要求38所述的系统，其中，所述填充床柱包括表面上具有C18官能团的树脂珠粒。
42.一种使用呼出气诊断个体中的呼吸道疾病的自主方法，该方法包括：
指导所述个体定位于用于从呼出气中提取EBA颗粒的样本提取部件；
启动预定数量的呼吸动作，以将EBA颗粒从呼出气中排出到馈送到所述样本提取部件中的空气流中；
使空气中的EBA颗粒流入样本捕获部件中，同时冷却所述样本捕获部件的壁和接口管的壁，所述接口管流体地连接所述样本提取部件和所述样本捕获部件；
产生收集的样本；
加工所述收集的样本包括以下步骤：使用溶剂、MALDI基质化学品、水和酸及其混合物中的至少一种来处理样本，以及
使用MALDI-TOFMS分析镀覆的样本。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，进入所述样本捕获部件的空气的流速在约100L/min与约1000L/min之间。
44.根据权利要求42所述的方法，其中，进入所述样本捕获部件的空气的流速在约50L/min与约500L/min之间。
45.根据权利要求42所述的方法，其中，所述收集的样本的体积在约100微升和约1毫升之间。
46.根据权利要求42所述的方法，其中，所述预定数量的呼吸动作包括以下步骤：
a.执行深呼气以清理所述个体的肺；
b.暂停达10秒；
c.进行FVC吸入；
d.进行深呼出；以及
e.重复上述序列多达10次。
47.根据权利要求46所述的方法，还包括潮式呼吸、咳嗽、正常FVC呼吸、说话和打喷嚏的各步骤中的至少一个。
48.根据权利要求42所述的方法，其中，所述呼吸道疾病包括结核病、流感、肺炎、癌症和冠状病毒引起的疾病中的至少一种。
49.根据权利要求42所述的方法，其中，所述预定呼吸动作的数量由指示呼出颗粒的体积和呼出气的体积中的至少一个的一个或多个传感器确定。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述一个或多个传感器包括CO2传感器、氧气传感器、湿度传感器、光学粒度计数器、空气动力学粒度仪和浊度计中的至少一种。
51.一种用于诊断由雾化病毒和细菌颗粒引起的呼吸道疾病的系统，该系统包括：
样本捕获部件，其用于将预定体积的空气中的EBA颗粒收集到被供给到所述样本捕获部件中的空气流中作为收集样本，其中所述空气流在约30L/min和约1000L/min之间，以及
样本分析子系统，其流体地连接到所述样本捕获部件，且所述样本分析子系统包括：
样本处理部件，其用于将少量的所述收集的样本点到样本板上并处理所述样本板上的所述收集的样本；以及
诊断装置，其用于分析所述样本。
52.根据权利要求51所述的系统，其中，所述样本处理部件包括流体部件，以使用溶剂、MALDI基质化学品、水和酸及其混合物中的至少一种来处理所述样本。
53.根据权利要求51所述的系统，还包括一个或多个传感器，所述一个或多个传感器被配置为与所述样本提取部件流体连通，其中，所述一个或多个传感器的输出用于计算进入所述样本捕获部件的呼出气气溶胶颗粒的总累积体积。
54.根据权利要求53所述的系统，其中，所述一个或多个传感器包括CO2传感器、氧气传感器、湿度传感器、光学粒度计数器、空气动力学粒度仪和浊度计中的至少一个。
55.根据权利要求51所述的系统，其中，所述预定体积的空气使用所述一个或多个传感器的输出来确定。
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