CN114441756A - 一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法 - Google Patents

一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于唾液检测技术领域，具体涉及一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，具体包括以下步骤：步骤一、收集患者的唾液样本，并加入到柠檬酸保存液中；步骤二、取样本保存液进行离心，取离心完成的上清，加入到迁移液中，混匀，得到样本溶液；步骤三、将样本溶液滴加在胶乳免疫层析试纸上，观察胶乳免疫层析试纸的反应变化，建立标准曲线，进而实现胃蛋白酶的检测。克服了现有技术的不足，实现对唾液种的胃蛋白酶快速检测，具有检测精准、灵敏度高的特点，应用范围高，适合广泛推广，对胃反流疾病进行检测提供有力的辅助。

Description

一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法
技术领域
本发明属于唾液检测技术领域，具体涉及一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法。
背景技术
胃食管反流病(GERD)系指胃内容物反流入食管，引起不适症状和(或)并发症的一种疾病。
胃蛋白酶仅在胃里产生，当发生反流后，胃蛋白酶则随其他胃内容物进入食管甚至食管以外区域。胃蛋白酶作为只存在胃中的生物标志物，可以为诊断胃食管反流病提供客观的反流证据。因此，本领域技术人员提供了一种用于胃蛋白酶检测的胶乳免疫层析检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，克服了现有技术的不足，实现对唾液种的胃蛋白酶快速检测，具有检测精准、灵敏度高的特点，应用范围高，适合广泛推广，对胃反流疾病进行检测提供有力的辅助。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，具体包括以下步骤：
步骤一、收集患者的唾液样本，并加入到柠檬酸保存液中；
步骤二、取样本保存液进行离心，取离心完成的上清，加入到迁移液中，混匀，得到样本溶液；
步骤三、将样本溶液滴加在胶乳免疫层析试纸上，观察胶乳免疫层析试纸的反应变化，建立标准曲线，进而实现胃蛋白酶的检测。
进一步，所述胶乳免疫层析试纸包括PVC底板以及依次依次搭接并粘贴在底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫；所述反应膜上远离结合垫的一端设置有质控线，在质控线和结合垫之间还设置有检测线，所述的结合垫上涂覆有胶乳-胃蛋白酶抗体1结合的液体，所述的检测线上包被有胃蛋白酶抗体2，所述的质控线上包被有鼠抗人IgG单抗。
进一步，所述检测线上包被的胃蛋白酶抗体2的浓度为0.5-2.0mg/ml。
进一步，所述质控线上包被的鼠抗人IgG单抗浓度为0.5-1mg/ml。
进一步，所述胶乳-胃蛋白酶抗体1结合的液体由以下方法制备得到：使用浓度为4％的荧光胶乳溶液再加入MES缓冲溶液，离心舍去上清液，再加入MES缓冲溶液，超声、震荡后加入EDC，混匀后加入胃蛋白酶抗体1，混匀再加入浓度为5％的bsa，离心舍去上清，加入保存液保存待用。
进一步，所述柠檬酸缓冲液采用10mM-50mM，PH值范围为4.0-6.0。
进一步，步骤三中所述建立标准曲线的具体步骤为：制备不同浓度的胃蛋白酶标准品，通过定量检测仪检测检测线和质控线的灰度值，根据不同浓度胃蛋白酶的检测线和质控线灰度值的不同，得出检测线和质控线的比值，该比值对应胃蛋白酶的浓度做标准曲线。
本发明与现有技术相比较，具有以下有益效果：
本发明采用胶乳层析方法，通过定量检测仪检测检测线和质控线的灰度值，根据不同浓度胃蛋白酶的检测线和质控线灰度值的不同，得出检测线和质控线的比值，该比值对应胃蛋白酶的浓度做标准曲线，进而实现对唾液种的胃蛋白酶快速检测，具有检测精准、灵敏度高的特点，应用范围高，适合广泛推广，对胃反流疾病进行检测提供有力的辅助。
附图说明
图1为胶乳免疫层析试纸的结构示意图。
图2为采用柠檬酸保存的唾液检测的结果示意图。
图3为未采用柠檬酸保存的唾液检测的结果示意图。
图4为胶乳免疫层析检测方法拟合标准曲线。
图中：1、PVC底板；2、吸水垫；3、反应膜；4、结合垫；5、样品垫；6、检测线；7、质控线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
请参阅图1，本发明实施例中，一种用于胃蛋白酶检测的胶乳免疫层析检测方法，其检测方法如下：
步骤1：将胃蛋白酶抗体1制成胶乳-胃蛋白酶1结合的液体，并用喷金划膜仪喷在结合垫4上，于40±5℃下干燥形成胶乳标记抗体。
步骤2：将胃蛋白酶抗体2以及鼠抗人IgG单抗分别包被于反应膜3上，于40℃±5℃下干燥形成检测线6和质控线7。
步骤3：将吸水垫2、反应膜3、结合垫4、样品垫5按顺序组装到PVC底板1上，组成胶乳免疫层析试纸。
步骤4：制备柠檬酸保存液用于长时间保存唾液；制备迁移液用于稀释唾液并进行检测。
步骤5：将样品加入柠檬酸保存液中，并进行离心，去除唾液中的大颗粒杂志和大量粘蛋白。取离心完成的上清，加入到迁移液中，混匀。将样品溶液滴在样品垫5上，在毛细虹吸作用下沿层析方向移动，在到达检测线6和质控线7时，通过定量检测仪检测检测线6和质控线7的灰度，根据不同浓度胃蛋白酶的检测线6和质控线7灰度值的不同，得出检测线6和质控线7的比值，该比值对应胃蛋白酶的浓度做标准曲线，进而实现胃蛋白酶的检测。
进一步，结合垫4采用玻纤结合垫4。
进一步，样品保存液采用柠檬酸保存液，用于长时间保存唾液中的胃蛋白酶。
胃蛋白酶不能长时间保存于唾液中，从口腔中取出4小时以上，胃蛋白酶会出现明显的减少，当采用柠檬酸保存液保存时，采用一个酸性环境可以长时间保存唾液中的胃蛋白酶。
柠檬酸缓冲液采用10mM-50mM,PH值范围是4.0-6.0；具有最好的保存效果。
进一步，保存后的唾液实验之前采用离心检测的方式，去除唾液中的大颗粒杂质和大量粘蛋白；去除大量杂质和粘蛋白有助于判断胃蛋白的准确度。
进一步，胶乳-胃蛋白酶抗体1结合的液体由以下方法制备得到：使用浓度为100ul4％的荧光胶乳溶液再加入400ul MES缓冲溶液，离心舍去上清液，再加入500ul MES缓冲溶液，超声、震荡后加入8ul-15ul 10mg/mLEDC，混匀后加入500ul 0.2mg/ml胃蛋白酶抗体1，混匀再加入1mL-1.5mL浓度为5％的bsa，离心舍去上清，加入保存液保存待用。
测试例1
测试组别：采用实施例所公开的检测方法。
测试人员：收集胃反流人员的唾液1mL(10人份)。
测试方法：分别分成500ul两组，一组采用直接保存方式，一组采用本实验的柠檬酸保存液进行稀释保存并进行检测。
实验结果如图2和图3所示。
测试例2：
测试组别：实施例2，参考例1(未离心直接进行检测)。
测试人员：收集胃反流人员的唾液1mL(50人份)。
测试方法：分别分成500ul两组，1组采用离心方式检测；一组不离心直接检测。
测试结果如下：
项目 样本数 检出数
实施例 50 50
参考例1 50 46
测试例3：
测试组别：采用实施例公开的检测方法。
测试方法：制备不同浓度的胃蛋白酶标准品进行检测，并制备标准曲线。
测试结果如下如图4所示。
综上所述：本发明胃蛋白酶检测的胶乳免疫层析检测方法，通过定量检测仪检测检测线和质控线的灰度值，根据不同浓度胃蛋白酶的检测线和质控线灰度值的不同，得出检测线和质控线的比值，该比值对应胃蛋白酶的浓度做标准曲线，进而实现对胃蛋白酶的快速检测，具有检测精准、灵敏度高的特点，应用范围高，适合广泛推广，可以为诊断胃食管反流病提供客观的反流证据。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (7)

1.一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤一、收集患者的唾液样本，并加入到柠檬酸保存液中；
步骤二、取样本保存液进行离心，取离心完成的上清，加入到迁移液中，混匀，得到样本溶液；
步骤三、将样本溶液滴加在胶乳免疫层析试纸上，观察胶乳免疫层析试纸的反应变化，建立标准曲线，进而实现胃蛋白酶的检测。
2.根据权利要求1所述的一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，其特征在于：所述胶乳免疫层析试纸包括PVC底板以及依次依次搭接并粘贴在底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫；所述反应膜上远离结合垫的一端设置有质控线，在质控线和结合垫之间还设置有检测线，所述的结合垫上涂覆有胶乳-胃蛋白酶抗体1结合的液体，所述的检测线上包被有胃蛋白酶抗体2，所述的质控线上包被有鼠抗人IgG单抗。
3.根据权利要求2所述的一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，其特征在于：所述检测线上包被的胃蛋白酶抗体2的浓度为0.5-2.0mg/ml。
4.根据权利要求2所述的一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，其特征在于：所述质控线上包被的鼠抗人IgG单抗浓度为0.5-1mg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，其特征在于：所述胶乳-胃蛋白酶抗体1结合的液体由以下方法制备得到：使用浓度为4％的荧光胶乳溶液再加入MES缓冲溶液，离心舍去上清液，再加入MES缓冲溶液，超声、震荡后加入EDC，混匀后加入胃蛋白酶抗体1，混匀再加入浓度为5％的bsa，离心舍去上清，加入保存液保存待用。
6.根据权利要求1所述的一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，其特征在于：所述柠檬酸缓冲液采用10mM-50mM，PH值范围为4.0-6.0。
7.根据权利要求1所述的一种用于胃蛋白酶的胶乳免疫层析检测方法，其特征在于：步骤三中所述建立标准曲线的具体步骤为：制备不同浓度的胃蛋白酶标准品，通过定量检测仪检测检测线和质控线的灰度值，根据不同浓度胃蛋白酶的检测线和质控线灰度值的不同，得出检测线和质控线的比值，该比值对应胃蛋白酶的浓度做标准曲线。
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