CN114441467B - 一种双模式探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双模式探针及其应用，属于探针检测技术领域。它包括一种双模式探针HTI，它能够通过比率荧光法和比色法甚至肉眼来区分D2O和H2O，并能够定量测定水和重水混合溶液中痕量重水以及痕量水的含量。HTI采用荧光法对重水的检测限为0.026％(v/v)，采用紫外法对水的检测限为0.041％(v/v)，适用于D2O和H2O的全量程检测，能够用于实时、高灵敏度地检测区分D2O与H2O，实现了痕量水与重水的定量检测以及常见品牌重水的纯度的定性判断。

Description

一种双模式探针及其应用
技术领域
本发明属于重水检测技术领域，更具体地说，涉及一种双模式探针及其应用。
背景技术
D2O在化学分析、核电生产、光谱表征和生物分析中有着非常重要的作用。然而，由于D2O易吸水而影响其纯度，为相关的研究与重水的存储带来不便。因此，定性和定量的检测、区分D2O与H2O对重水进一步的广泛应用和安全使用至关重要。但是，由于D2O和H2O在物理性质和化学性质上几乎相同，使它们很难区分。在各种检测D2O的方法中，荧光技术因成本低，操作简单和灵敏度高的特点被广泛应用。因此，一些用来检测D2O的荧光材料也被研究开发出来，其中大多数是金属有机配合物(MOFs)。虽然MOFs对D2O/H2O很敏感，但往往需要复杂的预处理，比如需预热形成脱水的MOFs，这限制了MOFs用于实时、原位检测D2O。同时，MOFs的水溶性差，只能在固液界面进行检测，不利于对体系的全范围检测。此外，MOFs中金属的使用还有可能造成金属中毒。
作为MOFs的高效替代者，小分子有机探针具有简单、易操作、检测快速等突出优势，广泛用于各种物质的检测。然而，目前鲜有报道检测D2O的有机探针。最近，卢志云等人构建了两例D2O有机传感器(A facile strategy for the construction of purelyorganic optical sensors capable of distinguishing D2O from H2O，Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,6280-6284)，但需要使用高比例有机溶剂，且响应范围很窄(0-47.1％，v/v)，这无疑不利于D2O体系中的传感。林伟英团队提出了一种基于两种染料的传感器，这种染料只能表现出单模式的荧光打开型响应(A dual-site controlledfluorescent sensor for the facile and fast detection of H2O in D2O by twoturn-on emission signals，Chem.Commun.2020,56,1191-1194.)。上述探针所具有的缺点使它们不能广泛应用于全量程范围内D2O精确地定量检测。相比之下，双模式探针有效地结合了比率荧光法和比色法的优势，可以降低背景信号，实现更准确和更灵敏地检测与“裸眼”识别。因此，发展水溶性的且能够用于实时、原位定量检测D2O的双模式探针十分必要。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有技术中有机传感器难以实现全量程范围内D2O的定量检测的问题，本发明提供一种双模式探针HTI及其应用，它能够通过比率荧光法和比色法甚至肉眼来区分D2O和H2O，并能够定量测定水和重水混合溶液中痕量重水或痕量水的含量。HTI采用荧光光谱法对重水的检测限为0.026％(v/v)，采用紫外-可见光谱法对水的检测限为0.041％(v/v)，适用于D2O的全量程检测，实现了实时、高灵敏度地区分D2O与H2O。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明首先一种双模式探针，用于区分水和重水，所述双模式探针具有如下结构：
Figure BDA0003492789240000021
该式I的双模式探针HTI为半菁衍生物，具有水溶性，如图1所示。由于HTI可发生基态质子转移，在H2O和D2O溶液中具有不同的结构，造成不同含量的D2O溶液中荧光与颜色的变化，通过比率荧光法和比色法甚至“裸眼”即可区分D2O和H2O。
探针HTI在溶液中存在羟基结构(HTI，质子化结构)和氧负离子结构(DHTI，去质子化结构)两种构型。H2O的pH在6.5～7.0，D2O的pD为7.4，而本发明所述化合物HTI的pKa为7.12(注：通过紫外光谱得到)，介于H2O与D2O之间。因此，HTI在H2O和D2O水中去质子化程度不同。其中，HTI在H2O中主要以质子化的结构存在，在D2O中主要以去质子化的结构存在。质子化与去质子化的HTI均可以吸收能量跃迁至其相应的激发态，表现出不同的紫外吸收波长；随后，其由激发态跃迁回到基态，分别释放出不同波长的荧光。因此，HTI质子化结构与去质子化结构的比例不同，相应紫外吸收峰和荧光发射峰的强度比例则不同。将HTI置于不同比例的D2O/H2O中时，HTI质子化结构与去质子化结构的比例不同，相应紫外的吸收峰与荧光光谱也将不同，进而能够实现荧光发射和紫外吸收的同步比例变化。于此，本发明充分利用此种不同，设计了酚类化合物HTI用于实现D2O与H2O的区分。
本发明还提供一种采用双模式探针区分水和重水的方法，所述双模式探针具有如下结构：
Figure BDA0003492789240000022
将所述双模式探针加入到重水中，在激发波长为520nm条件下具有发射波长为558±20nm的荧光发射峰；或具有最大吸收位于520±20nm处的紫外可见吸收峰；或
将所述双模式探针加入到水中，在激发波长为420nm条件下具有发射波长为515±20nm的荧光发射峰；或具有最大吸收位于420±20nm处的紫外可见吸收峰；或
将所述双模式探针加入到水和重水的混合溶液中，在激发波长为452nm条件下具有发射波长为558±20nm和/或515±20nm的荧光发射峰；或具有最大吸收位于520±20nm和/或420±20nm处的紫外可见吸收峰。
本发明还提供一种双模式探针检测重水的方法，包括将式I的化合物加入到含有重水的水溶液中或重水中：
Figure BDA0003492789240000031
所述含有重水的水溶液或重水在激发波长为520nm条件下具有发射波长为558±20nm的荧光发射峰，狭缝宽度为5nm/5nm；或
所述含有重水的水溶液或重水具有最大吸收位于520±20nm处的紫外可见吸收峰。
需要说明的是，含有重水的水溶液中或重水中，包括重水含量为0～100％的情形。也就是说，本发明的双模式探针HTI可以用于检测水中是否含有重水、重水的含量以及是否为纯的重水等。
优选地，采用荧光法对重水的检测限低于0.026％(v/v)。值得注意的是，在0％至100％体积含量范围内的D2O溶液中，一方面，双模式探针HTI在520nm和452nm(A520nm/A452nm)处的紫外吸收强度比例随D2O增加呈线性增加关系(例如，图3b)；另一方面，双模式探针HTI在558nm和540nm(I558nm/I540nm)处的荧光强度比例随D2O增加呈线性增加关系(例如，图3d)。可以分别基于该紫外吸收和荧光滴定实验计算检测限。对H2O溶液中探针HTI的紫外吸收光谱或荧光光谱进行30次测量，得到此空白值测量的标准偏差(σ)。由D2O或H2O定量分析的标准曲线导出斜率(k)。检测限由下式确定：
检测限＝3σ/k
由荧光法得到HTI对D2O的检测限低于0.026％(v/v)，证实了HTI可以用于定量检测痕量D2O。
由紫外法得到HTI对D2O的检测限低于0.18％(v/v)。
一种双模式探针检测水的方法，包括将式I的化合物加入到含有重水的水溶液中或水中：
Figure BDA0003492789240000032
所述含有重水的水溶液或水在激发波长为420nm条件下具有发射波长为515±20nm的荧光发射峰；或
所述含有重水的水溶液或水具有最大吸收位于420±20nm处的紫外可见吸收峰。
优选地，采用紫外法对水的检测限低于0.041％(v/v)。值得注意的是，在0％至100％体积含量范围内的H2O溶液中，一方面，双模式探针HTI在520nm和452nm(A520nm/A452nm)处的吸收强度比例随H2O增加呈线性减少关系(例如，图3b，其中，VH2O/VH2O+D2O＝100％-VD2O/VH2O+D2O)；另一方面，双模式探针HTI在558nm和540nm(I558nm/I540nm)处的荧光强度比例随H2O增加呈线性减少关系(例如，图3d，其中，VH2O/VH2O+D2O＝100％-VD2O/VH2O+D2O)。可以分别基于该紫外吸收和荧光滴定实验计算检测限。对D2O溶液中探针HTI的紫外吸收光谱进行30次测量，得到此空白值测量的标准偏差(σ)。由D2O或H2O定量分析的标准曲线导出斜率(k)。检测限由下式确定：
检测限＝3σ/k
由紫外法得到HTI对H2O的检测限低于0.041％(v/v)，证实了HTI可以用于定量检测痕量H2O。由荧光法得到HTI对H2O的检测限低于0.17％(v/v)。
优选地，所述检测重水或水的方法包括如下步骤：
1)绘制双模式探针在含有不同重水比例的水溶液中的工作曲线；
2)配制式I双模式探针的溶液；
3)测定并计算重水或水的含量。
优选地，所述步骤1)中，采用紫外可见吸收光谱法对重水或水进行检测，根据紫外-可见光谱法测定的520nm处的吸光度与452nm处的吸光度的比值制定含有0～100％重水的水溶液的工作曲线：
A520nm/A452nm＝αVH2O/VH2O+D2O+β
或A520nm/A452nm＝α’VD2O/VH2O+D2O+β’
其中，α、β为A520nm/A452nm与VH2O/VH2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数；α’、β’为A520nm/A452nm与VD2O/VH2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数。
优选地，所述步骤1)中，采用荧光法对重水或水进行检测，根据荧光光谱法测定的558nm处的荧光强度与540nm处的荧光强度的比值制定含有0～100％重水的水溶液的工作曲线，所述荧光光谱法测定的发射波长为Ex＝452nm：
I558nm/I540nm＝aVH2O/VH2O+D2O+b
或I558nm/I540nm＝a’VD2O/VH2O+D2O+b’
其中，a、b为I558nm/I540nm与VH2O/VH2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数；a’、b’为I558nm/I540nm与VD2O/VH2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数。
本发明还提供一种双模式探针在检测重水或水中的应用，所述双模式探针具有式I的结构：
Figure BDA0003492789240000051
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的双模式探针HTI，具有水溶性，能够通过基态质子转移策略检测D2O或H2O；由于HTI在不同比例的D2O-H2O混合溶液中荧光与颜色均发生变化，故通过比率荧光法和比色法甚至“裸眼”即可区分D2O和H2O；
(2)本发明的双模式探针HTI检测重水或水的方法，通过荧光法在特定激发波长下测定荧光发射峰，或通过紫外可见吸收光谱法测定最大吸收峰，能够检测水和重水混合溶液中痕量重水以及痕量水，该方法能够实现全量程范围内重水或水的检测；采用荧光法对重水的检测限低于0.026％(v/v)，采用紫外法对水的检测限低于0.041％(v/v)；
(3)本发明进一步采用紫外可见吸收光谱法对重水或水进行定量检测，通过紫外法测定的520nm处的吸光度与452nm处的吸光度的比值制定工作曲线，对含有0～100％重水的水溶液的重水进行定量测定，或采用荧光法对重水或水进行定量检测，根据荧光法测定的558nm处的荧光强度与540nm处的荧光强度的比值制定含有0～100％重水的水溶液的工作曲线，对含有0～100％重水的水溶液的重水进行定量测定，能够实现全量程范围内D2O和H2O的定量检测。
(4)本发明的双模式探针HTI检测重水或水的方法，受试剂及干扰离子的影响很小，具有良好的抗干扰能力；HTI在重水中储存一夜紫外和荧光光谱均未表现出明显差异，具有良好的稳定性。
附图说明
图1双模式探针及其区分D2O/H2O的示意图。
图2探针HTI(20μM)在纯H2O和D2O中的a)荧光光谱和b)紫外可见吸收光谱，狭缝宽度：5nm/5nm；插图：20μM HTI在含有0.2％DMSO的H2O(左)和含有0.2％DMSO的D2O(右)中在a)紫外线灯和b)日光下的照片；Ex(H2O)＝420nm，Ex(D2O)＝520nm。
图3探针HTI(20μM)在不同H2O含量的D2O(0.2％DMSO)中的(a)紫外可见吸收光谱和(c)荧光光谱；(b)吸光度比(A520nm/A452nm)和(d)荧光强度比(I558nm/I540nm)与混合溶液中的D2O含量的线性关系(工作曲线)；Ex＝452nm，狭缝：10nm/10nm；(e)在日光(上)和紫外光(UV，Ex＝365nm，下)下拍摄的H2O含量不同的D2O(0.2％DMSO)中的HTI(20μM)照片。
图4在H2O中有无其他常见离子(10当量，200μM)的情况下，HTI(20μM)的(a)紫外吸收光谱和(b)荧光光谱；(c)在515nm处，探针HTI的H2O溶液中含有干扰离子时的荧光发射峰强度与探针HTI在纯水中荧光发射峰强度的比值；从1到11分别为：H2O,MeOH,EtOH,PhMe,NaCl,Na2SO4,KCl,CaCl2,Mg(ClO4)2,Cu(ClO4)2,Zn(ClO4)2；Ex＝452nm。
图5HTI(20μM)在D2O(含0.2％DMSO)中的(a)吸收和(b)荧光稳定性；Ex＝452nm。
图6基于(a)荧光光谱和(b)紫外吸收光谱对不同品牌的D2O进行评估。HTI＝20μM，Ex＝452nm。
图7HTI在新打开的未经蒸馏和经蒸馏后的来自品牌C的D2O样品中的(a)荧光光谱和(b)吸收光谱；HTI＝20μM，Ex＝452nm。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除非另有说明，否则所有试剂和溶剂均直接购买使用，无需进一步纯化。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
薄层色谱分析(TLC)在硅胶板上进行，并通过紫外灯或高锰酸钾染色并加热后进行分析。利用硅胶(200-300目)进行快速柱层析。
除非另有说明，核磁共振1H和13C谱均是在室温下用DMSO-d6在Bruker AM-400光谱仪(400MHz 1H，100MHz 13C)中测定的。1H NMR的数据分析如下：化学位移(δppm)，峰的裂分(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，m＝多重峰，dd＝双二重峰)，耦合常数(Hz)，积分。13C NMR的数据分析为化学位移。高分辨质谱(HRMS)在Bruker Apex II质谱器(ESI)上进行检测。
所有紫外可见吸收光谱和荧光光谱分别使用日立UV-2910分光光度计和日立F-7100荧光光谱仪测试。
一、化合物HTI的制备过程
Figure BDA0003492789240000071
2-[(E)-2-(4-羟基苯基)乙烯基]-1，3，3-三甲基-3H-吲哚-1-碘化铵(HTI)
将1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚(903.5毫克，3.0毫摩尔)和对羟基苯甲醛(439.6mg，3.6毫摩尔)加入盛有40mL乙醇的100mL的史莱克瓶中。将混合物在氩气气氛下不断搅拌回流12h。通过薄层色谱(TLC)监测反应进程。冷却至室温后，过滤反应混合物，用石油醚洗涤并干燥，得到橙红色固体，无需进一步纯化(968.8mg，79.7％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6δ(ppm)10.82(s,1H),8.37(d,J＝16.2,1H),8.15(d,J＝8.8,2H),7.85(ddd,J＝4.6,2.6,1.3Hz,2H),7.58(pd,J＝7.4,1.4,2H),7.47(d,J＝16.2,1H),6.96(d,J＝8.8,2H),4.10(s,3H),1.77(s,6H)。13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm)181.8,163.7,154.2,143.7,142.3,134.1,129.3,126.5,123.3,116.9,115.2,109.8,52.2,34.6,26.2。HRMS：C19H29NO+计算为278.3676，实际为278.1493.
二、检测方法
在DMSO中制备浓度为10mM的HTI备用溶液。用于光谱分析的探针溶液(20μM)是通过用蒸馏的H2O或纯D2O稀释备用溶液而新制备的。将新制备的HTI备用溶液(10mM，4μL)加入蒸馏的H2O或纯D2O或D2O-H2O混合溶液中(总体积2.0mL)，并在室温下测试光谱。
NaCl,KCl,CaCl2,Mg(ClO4)2,Zn(ClO4)2,Cu(ClO4)2,Na2SO4溶液的制备是将其对应的盐溶解到蒸馏水中。
四、检测限的确定
分别基于荧光和紫外吸收滴定实验计算检测限。对D2O溶液中探针HTI的荧光光谱或紫外吸收光谱进行了30次测量，得到此空白值测量的标准偏差(σ)。由D2O、H2O定量分析的标准曲线导出斜率(k)。D2O溶液中H2O的检测限由下式确定：
检测限＝3σ/k
根据图3(b)所示的吸收滴定实验，计算出D2O中H2O(含0.2％DMSO)的检出限为0.041％。
H2O的检测限＝3*0.0003824/2.76607＝0.000414＝0.041％(v/v)
根据图3(d)所示的荧光滴定实验，计算出D2O中H2O(含0.2％DMSO)的检出限为0.17％。
H2O的检测限＝3*0.0013294/2.30507＝0.00173＝0.17％(v/v)
对H2O溶液中探针HTI的荧光光谱或紫外吸收光谱进行了30次测量，得到此空白值测量的标准偏差(σ)。由D2O、H2O定量分析的标准曲线导出斜率(k)。H2O溶液中D2O的检测限由下式确定：
检测限＝3σ/k
根据图3(b)所示的吸收滴定实验，计算出H2O中D2O(含0.2％DMSO)的检出限为0.18％。
D2O的检测限＝3*0.0016617/2.76607＝0.0018＝0.18％(v/v)
根据图3(d)所示的荧光滴定实验，计算出H2O中D2O(含0.2％DMSO)的检测限为0.026％。
D2O的检测限＝3*0.0001973/2.30507＝0.00256＝0.026％(v/v)
五、初始光谱研究(定性)
分别在H2O和D2O中进行了HTI初始光谱的研究。如图2，在荧光光谱中，HTI在H2O中的发射波长约515nm，在D2O中的发射波长为558nm，因此分别显示出绿色和深橙色的荧光。在紫外可见吸收光谱中，HTI溶解在H2O中时为黄色，其最大吸收主要位于420nm处，溶解在D2O中时呈橙色，最大吸收位于520nm处。因此，HTI可通过荧光和紫外可见吸收光谱，甚至裸眼来方便地区分D2O和H2O。
机理研究表明，HTI在D2O中以去质子化结构存在，而在水中以质子化结构存在。
利用HTI在D2O和水中的不同结构，可以得到双模式探针HTI用于区分水和重水，或者检测水或重水，将HTI加入到重水中，在激发波长为520nm条件下具有发射波长为558±20nm的荧光发射峰；或具有最大吸收位于520±20nm处的紫外可见吸收峰；此为HTI的去质子化结构呈现的荧光发射峰及紫外可见吸收峰；
将HTI加入到水中，在激发波长为420nm条件下具有发射波长为515±20nm的荧光发射峰；或具有最大吸收位于420±20nm处的紫外可见吸收峰；HTI在水溶液中以质子化结构存在；此为HTI的质子化结构呈现的荧光发射峰及紫外可见吸收峰；
将HTI加入到水和重水的混合溶液中，在激发波长为452nm条件下具有发射波长为558±20nm和/或515±20nm的荧光发射峰；或具有最大吸收位于520±20nm和/或420±20nm处的紫外可见吸收峰。
六、定量测定H2O或D2O的含量
随后，此探针被用来分析D2O–H2O混合体系中H2O或D2O的含量(包括纯H2O与纯D2O的情形)。紫外可见吸收光谱中，随着D2O比例的增加，可以观察到420nm处的吸光度减弱，520nm处新的红移峰出现(图3a)；同时，荧光光谱中，515nm处的荧光强度逐渐减弱，红移后出现在558nm处的荧光强度增强(图3c)。这一比率响应表明当D2O–H2O混合体系中D2O含量增加时，促进了HTI的解离，使其发生了从苯酚到苯酚盐结构的转化。值得注意的是，558nm和540nm(I558nm/I540nm)处的荧光强度比率与D2O在0％至100％的范围的含量呈线性增加关系(图3d)。该方法提供了全量程D2O和H2O检测策略，采用荧光法得到的D2O检测限低于0.026％(v/v)。同时，HTI采用紫外吸收法对H2O的检测限为0.041％(v/v)，证实了HTI可以用于定量检测痕量D2O和H2O。HTI在不同比例的D2O–H2O溶液中颜色与荧光的变化，实现了通过比率荧光法和比色法甚至“裸眼”区分D2O和H2O。
七、干扰离子的影响
常见试剂(离子Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cu2+,Cl-,ClO4 -,和SO4 2-；溶剂：甲醇、乙醇和甲苯，图4)对H2O(0.2％DMSO)中HTI的紫外吸收和荧光光谱无影响或影响很小。在测试的1小时内，HTI在H2O中的发射光谱几乎没有变化。
八、储存稳定性
同时，HTI在D2O中储存一夜后，其紫外和荧光也没有表现出明显差异(图5)。这说明HTI具有良好的稳定性和抗干扰能力，使其有望应用于复杂的条件。
九、不同含量D2O-H2O样品的定量检测
采用HTI测定了4个不同含量的D2O-H2O样品，分别为D2O％：99.6％、97.0％、92.0％、91.0％。
1)绘制双模式探针HTI在含有不同重水比例的水溶液中的工作曲线，如图3b和3d所示；
1-1)采用紫外可见吸收光谱法对不同比例的重水进行检测，该紫外吸收谱线随着D2O含量的增加表现出420±20nm吸光度逐渐减低，520±20nm吸光度逐渐升高的变化；根据紫外可见光谱测定的520nm处的吸光度与452nm处的吸光度的比值制定含有0～100％重水的水溶液的工作曲线：
A520nm/A452nm＝α’VD2O/VH2O+D2O+β’
其中，α’、β’为A520nm/A452nm与VD2O/VH2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数。图3b中，α’＝2.76607，β’＝0.26834。
1-2)采用荧光法对不同比例的重水进行检测，该荧光发射谱线随着D2O含量的增加表现出515±20nm荧光强度逐渐减低，558±20nm荧光强度逐渐升高的变化；根据荧光光谱测定的558nm处的荧光强度与540nm处的荧光强度的比值制定含有0～100％重水的水溶液的工作曲线，荧光光谱测定的发射波长为Ex＝452nm，狭缝宽度为10nm/10nm：
I558nm/I540nm＝a’VD2O/VH2O+D2O+b’
其中，a’、b’为I558nm/I540nm与VD2O/VH2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数。图3d中，a’＝2.30507，b’＝0.84644。
2)按照“二、检测方法”中配制HTI备用溶液；
3)将新制备的HTI探针溶液(10mM，4μL)分别加入不同含量的D2O-H2O样品溶液中(总体积2.0mL)，并在室温下测试荧光光谱及紫外可见吸收光谱；
3-1)实际测得A520nm/A452nm值分别为：2.9459、2.8740、2.8159、2.7543，将测得的A520nm/A452nm值代入步骤1-1)中的工作曲线，确定其D2O％分别为：96.8、94.2、92.1、90.0；
3-2)实际测得的I558nm/I540nm值分别为：3.17853、3.0136、3.03273、2.9660，将测得的I558nm/I540nm值代入步骤1-2)中的工作曲线，确定其D2O％分别为：101.1、94.0、94.8、91.9；
经测定，理论值与实际值相对误差均小于3％。
十、常用品牌D2O样品的定性检测
本实施例采用HTI评估了来自7个常用品牌的D2O样品的质量。
1)绘制双模式探针HTI在含有不同重水比例的水溶液中的光谱曲线，如图3a和3c所示，光谱曲线见第九部分的不同含量D2O-H2O样品的定量检测；
2)按照“二、检测方法”中配制HTI备用溶液；
3)将新制备的HTI探针溶液(10mM，4μL)加入不同品牌的D2O样品溶液中(总体积2.0mL)，并在室温下测试荧光光谱及紫外可见吸收光谱；
3-1)将所得样品紫外光谱与3a进行定性比较，并比较各个品牌样品在相同条件下的吸收强度；
3-2)将所得样品荧光光谱与3c进行定性比较，并比较各个品牌样品在相同条件下的荧光发射强度；
如图6，在所有筛选的样品中，来自C品牌的样品被证明纯度最低。由于不同的重水样品还受到其他杂质如pH的影响，不同的样品间存在差异，但经过预处理的D2O在蒸馏后可以恢复到几乎一致的光谱性质(图7)。进一步证实了D2O的储存和湿度控制在相关使用中的重要性。
综上所述，本发明合理地利用基态质子转移策略开发了一种双模式探针HTI。该探针基于含羟基半菁骨架具有典型的D-π-A结构，其光谱可以通过苯酚羟基和去质化后的羟基盐结构之间的转换进行调节。HTI在H2O和D2O中表现出不同的基态解离能力，能够对不同比例的D2O和H2O进行比色和荧光的全范围检测。显著的溶液颜色与荧光颜色变化有助于裸眼识别区分D2O和H2O。最重要的是，HTI实现了实时、高灵敏度地定量检测D2O，为双模式D2O和H2O检测提供了一个有价值的方案，为进一步扩展检测D2O和H2O的方法奠定了坚实的基础。
以上内容是对本发明及其实施方式进行了示意性的描述，该描述没有限制性，实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的实施方式并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的实施方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种双模式探针，用于区分水和重水，其特征在于，所述双模式探针具有如下结构：
Figure FDA0004198925750000011
所述双模式探针加入到重水中，在激发波长为520nm条件下具有发射波长为558±20nm的荧光发射峰；或具有最大吸收位于520±20nm处的紫外可见吸收峰；或
所述双模式探针加入到水中，在激发波长为420nm条件下具有发射波长为515±20nm的荧光发射峰；或具有最大吸收位于420±20nm处的紫外可见吸收峰。
2.双模式探针检测重水或水的方法，其特征在于，所述双模式探针具有如下结构：
Figure FDA0004198925750000012
所述方法包括如下步骤：
1)绘制所述双模式探针在含有不同重水比例的水溶液中的工作曲线：
根据紫外-可见光谱法测定的520nm处的吸光度与452nm处的吸光度的比值制定含有0～100％重水的水溶液的工作曲线：
A520nm/A452nm＝αVH2O/V H2O+D2O+β
或A520nm/A452nm＝α’VD2O/V H2O+D2O+β’
其中，α、β为A520nm/A452nm与VH2O/V H2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数；α’、β’为A520nm/A452nm与VD2O/V H2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数；或
根据荧光光谱法测定的558nm处的荧光强度与540nm处的荧光强度的比值制定含有0～100％重水的水溶液的工作曲线，所述荧光光谱法测定的发射波长为Ex＝452nm：
I558nm/I540nm＝a VH2O/V H2O+D2O+b
或I558nm/I540nm＝a’VD2O/V H2O+D2O+b’
其中，a、b为I558nm/I540nm与VH2O/V H2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数；a’、b’为I558nm/I540nm与VD2O/V H2O+D2O工作曲线一次函数的拟合系数；
2)配制式I双模式探针的溶液；将所述溶液加入到重水、水或含有重水的水的溶液中；
3)测定并计算重水或水的含量。
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