CN114438013A - 一种物理交联制备细胞培养肉生物支架的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物材料和食品领域，特别是涉及一种物理交联制备细胞培养肉生物支架的方法，物理交联方法使生物支架材料内部通过物理力结合从而形成生物支架，所述物理交联方法包括以下步骤：1)将支架材料定型并干燥；2)将干燥后的支架材料蒸汽交联。本发明采用物理交联方法制备可食用蛋白或多糖支架以支持动物细胞培养，生产过程中未使用化学交联试剂，未使用ECM蛋白等涂层，同时细胞在支架上增殖良好。本方法的物理交联步骤可与灭菌步骤合二为一，操作步骤简单，成本低廉，且适用于各种形态的支架制备。

Description

一种物理交联制备细胞培养肉生物支架的方法
技术领域
本发明涉及生物材料和食品领域，特别是涉及一种物理交联制备细胞培养肉生物支架的方法。
背景技术
由于肉类消费增长、环境恶化、动物福利问题、人类营养、食品安全和其他因素，需要开发替代蛋白质。细胞培养肉是一种新兴技术，也被称为体外肉、培养肉、清洁肉或实验室培养肉，是通过体外培养细胞而不是通过收获动物组织来生产的。培养肉商业化的一个重大挑战是大规模生产，这包括：(1)细胞系开发；(2)无血清培养基开发；(3)生物反应器设计；(4)支架开发。支架生物材料作为支持网络，使细胞附着，并促进氧气和营养物质运输到厚组织。此外，支架可以指导细胞的增殖、分化和对齐。理想情况下，用于养殖肉类的支架材料应该易于消化，食用安全且美味。此外，细胞肉支架还需要满足特定的口味、质地、热稳定性和营养要求，并能大规模、低成本地供应。
目前，报道用于细胞培育肉的支架生产方式有采用浸入式旋转喷射纺丝技术制备了纤维明胶支架，再现了天然肉制品的一些结构和机械特性，但此方法只适用于含有大量明胶成分的支架，在支架配方上具有限制。大豆组织蛋白(TSP)支架最近被用来支持牛骨骼肌细胞的生长和分化，其中纤维蛋白原在细胞播种期间用于改善细胞粘附。由植物蛋白和天然多糖组成的支架通常需要包覆细胞外基质(ECM)蛋白(如胶原蛋白、层粘连蛋白、玻璃蛋白)或带正电荷的聚合物(如多赖氨酸和多鸟氨酸)来改善细胞粘附。虽然动物ECM蛋白支持细胞粘附和增殖，但在养殖肉类支架的生产中需要避免它们，因为它们需要牲畜来生产，在一定程度上否定了非动物蛋白丰富来源产品的好处。
在组织工程和再生医学中，许多支架都是由合成高分子材料组成，以保证机械强度。交联剂在生产过程中经常需要保持性能，常见的交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)和戊二醛。然而，这些化学品不具有普遍认可的食品安全性，因此它们不能用于食品生产。对于细胞培养肉生产来说，生产支架需要避免使用化学交联剂或添加剂，因为这些交联剂会影响味道、质量和健康。因此，培养肉生产支架需要选择符合食品安全的交联剂或交联方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种物理交联制备细胞培养肉生物支架的方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种细胞培养肉生物支架的制备方法，所述制备方法包括使用物理交联方法使生物支架材料内部通过物理力结合形成生物支架。
在一种实施方式中，所述物理交联方法包括以下步骤：
1)将支架材料定型并干燥；
2)将干燥后的支架材料蒸汽交联。
所述生物支架材料内部通过物理力结合为通过氢键结合。
本发明还提供所述制备方法获得的细胞培养肉生物支架。
本发明还提供一种细胞培养肉，所述细胞培养肉包括所述细胞培养肉生物支架与附着在其上的细胞。
如上所述，本发明的物理交联制备细胞培养肉生物支架的方法，具有以下有益效果：采用一种新的方法制备可食用蛋白或多糖支架以支持动物细胞培养。生产过程中未使用化学交联试剂，未使用ECM蛋白等涂层，但细胞在支架上增殖良好。本方法采用水退火方法物理交联支架，既在高温水蒸气条件下引入氢键交联的方式稳定支架，又与支架制备的高温高压蒸汽灭菌步骤相结合，操作步骤简单，成本低廉，且适用于各种形态的支架制备。
附图说明
图1显示为本发明的海绵支架的制备方法示意图。
图2显示为本发明的定向仿生支架的制备方法示意图。
图3显示为实施例1面筋蛋白海绵状支架的宏观(左上)、微观形貌(左)及细胞生长情况(右图，死活染)。
图4显示为实施例2麦谷蛋白仿生取向状支架的宏观(左上)、微观形貌(左)及细胞生长情况(右图，死活染)
图5显示为实施例3魔芋胶海绵状支架的宏观(左上)、微观形貌(左)及细胞生长情况(右图，死活染)。
图6显示为本发明的自制模具示意图。
图7显示为本发明的细胞培养肉的制备流程图。
具体实施方式
本发明提供一种细胞培养肉生物支架的制备方法，所述制备方法包括使用物理交联方法使生物支架材料内部通过物理力结合形成生物支架。
在一种实施方式中，所述物理交联方法包括以下步骤：
1)将支架材料定型并干燥；
2)将干燥后的支架材料蒸汽交联。
所述支架材料为分散系。在一种实施方式中，所述分散系的分散质选自蛋白和/或多糖。所述蛋白包含但不限于大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦蛋白、面筋蛋白、土豆蛋白、大米蛋白、鹰嘴豆蛋白、绿豆蛋白、花生蛋白、海藻蛋白、酵母蛋白、玉米蛋白、杏仁蛋白、藜麦蛋白等中的一种或几种。所述多糖为可食用多糖。所述多糖包含但不限于可得然胶、魔芋胶、阿拉伯胶、黄原胶、透明质酸、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、海藻酸钠等中的一种或几种。具体的，所述支架材料例如为面筋蛋白、麦谷蛋白、魔芋胶。
在一种实施方式中，所述支架材料为溶液。所述支架材料溶液的浓度为1mg/mL～200mg/mL。所述支架材料溶液的浓度可以根据不同的支架材料确定。所述支架材料溶液的浓度选自如下中的任一范围：1～25mg/mL、25～50mg/mL、50～75mg/mL、75～100mg/mL、100～125mg/mL、125～150mg/mL、150～175mg/mL、175～200mg/mL。例如在一种实施方式中，所述面筋蛋白溶液作为支架材料溶液时，浓度为10mg/mL～150mg/mL；在另一种实施方式中，所述麦谷蛋白溶液作为支架材料溶液时，浓度为1mg/mL～150mg/mL。在另一种实施方式中，所述魔芋胶溶液作为支架材料溶液时，浓度为5mg/mL～50mg/mL。
在本发明的某些实施方式中，面筋蛋白溶液、麦谷蛋白溶液支架材料的pH为1-5。具体的，pH可以是1～2、2～3、3～4或4～5。另一些实施例中，魔芋胶溶液支架材料的pH为7-12。
在本发明的某些实施方式中，将支架材料定型的方法为将支架材料溶液冷冻使其固化从而定型。在本发明的一种实施方式中，将支架材料溶液转移至预设形状的模具中再冷冻。
所述模具的形状可以根据支架想要形成的形状自制或选择。在本发明的某些实施方式中，所述模具为孔板。所述孔板选自六孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。利用孔板作为模具形成的支架的形状即与孔板上的各孔一致。
在本发明的某些实施方式中，所述模具为自制模具。所述自制模具为敞口容器，所述敞口容器的内腔通过温度传导件分隔为冷冻部和支架材料容纳部。在一种实施方式中，所述自制模具如图6所示。
所述自制模具的材料的能够耐受-200℃的低温。在本发明的某些实施方式中，所述敞口容器的材料为PDMS。所述温度传导件可以传导温度。所述温度传导件的材料为金属材料。所述金属材料选自钢、铁、铜、铝、锡。
所述冷冻部用于盛放液氮。
所述步骤1)中定型时冷冻固化的温度只要将支架材料溶液冻住即可。温度例如为-10℃～-200℃。所述温度选自以下中的任一范围：-10℃～-40℃、-40℃～-70℃、-70℃～-80℃、-80℃～-85℃、-85℃～-90℃、-90℃～-100℃、-100℃～-150℃、-150℃～-180℃、-180℃～-190℃或-190℃～-200℃。
在一种实施方式中，所述定型为将含有支架材料溶液的模具转移至超低温冰箱内进行冷冻定型。
在另一种实施方式中，所述定型的步骤为将冷冻部内充满液氮，利用液氮进行定向冷冻从而固化成型。所述冷冻部和支架材料容纳部分别加入液氮和支架材料溶液后，所述温度传导件可以将液氮的温度传导至支架材料溶液，并且距离温度传导件较近的溶液会首先被冷冻，距离较远的溶液逐渐冷冻，从而达到定向冻结的效果。
在一种实施方式中，所述步骤1)中干燥为冷冻干燥；在一较佳实施方式中，所述步骤1)中冷冻干燥的温度为-40℃～-100℃，和/或，冷冻干燥的时间为24-72小时。在一种实施方式中，所述冷冻干燥的温度选自以下任一：-40℃～-50℃、-50℃～-60℃、-60℃～-70℃、-70℃～-80℃、-80℃～-90℃或-90℃～-100℃。所述冷冻干燥在冷冻干燥机内进行。
所述冷冻干燥可以是在不同或相同温度下进行一次或多次冷冻干燥。具体的冷冻干燥步骤需根据支架材料溶液的性质决定。
在一种实施方式中，当所述支架材料溶液为魔芋胶溶液时，定型之前先冷冻干燥一次，经过碱液浸泡后，再进行定型和第二次冷冻干燥，从而形成冻干海绵。在碱液中浸泡可去除乙酰基，去除乙酰基后的魔芋胶能在加热条件下交联。所述碱液例如选自Na2CO3溶液或Ca(OH)2溶液。
在一种实施方式中，所述蒸汽交联的具体步骤为：将冷冻干燥后的支架材料脱模后放入耐热容器中，将耐热容器用透气材料封口后蒸汽交联。蒸汽可以同时达到灭菌和交联的目的。
在一种实施方式中，所述耐热容器选自玻璃瓶、金属容器或耐热塑料。
在一种实施方式中，所述透气材料选自吸水纸或织物。所述透气材料可以限制水蒸气凝结，确保蒸汽充满了耐热容器与支架材料。
所述蒸汽灭菌并交联的温度为50～200℃，和/或，气压为1psi～100psi。
所述温度选自以下范围中的任一：50～70℃、70～90℃、90～110℃、110～130℃、130～150℃、150～170℃、170～190℃、190～200℃。
所述气压为选自以下范围中的任一：1psi～10psi、10psi～20psi、20psi～30psi、30psi～40psi、40psi～50psi、50psi～60psi、60psi～70psi、70psi～80psi、80psi～90psi或90psi～100psi。
蒸汽交联的时间为1～60分钟。蒸汽交联时间选自以下范围中的任一：1～10分钟、10～20分钟、20～40分钟、40～60分钟。
在一种实施方式中，步骤2)中蒸汽交联后还包括干燥。
蒸汽交联是生产稳定支架的关键步骤。蒸汽交联是一种水退火工艺，在大分子之间引入氢键，促进结晶，稳定三维结构。蛋白质，例如丝素蛋白，在水退火后形成稳定的三维结构，这是由于β-片含量增加的区域的结晶形成。FTIR结果表明，水退火后谷蛋白的二级结构中随机卷曲的含量降低，α-螺旋和β-片状结构增加，这意味着分子内氢键的形成。在水溶液中，蛋白分子分散在溶液中。随着水分子的去除(干燥)，蛋白分子在空间上更加紧密。在水退火的作用下，水分子渗透到蛋白链网络中，并使系统塑化，形成具有较高链迁移率的蛋白-水结合网络。蛋白系统吸收游离水蒸气分子的热能，并以长距离分子迁移的方式将热能转移到蛋白-水系统中，最终自组装形成堆积的β片晶体。高温加热也增加了蛋白网络中二硫交联的重组。水退火引入的物理交联避免了有毒化学交联剂的使用。
所述生物支架材料内部通过物理力结合为通过氢键结合。
所述蒸汽交联方法也可用于各种一维材料(例如纤维)、二维材料(例如膜)、三维材料(如本发明的多孔海绵或定向冷冻支架)的交联稳定。
本发明还提供所述制备方法获得的细胞培养肉生物支架。
所述细胞培养肉生物支架为多孔海绵支架和定向冷冻多孔支架。所述细胞培养肉多孔支架的直径为10～500μm。
本发明还提供一种细胞培养肉，所述细胞培养肉包括所述细胞培养肉生物支架与附着在其上的细胞。
所述细胞为动物细胞。在一种实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。
所述细胞选自成肌细胞、肌肉卫星细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪前体细胞、成体干细胞和多能干细胞。
所述细胞包括但不限于肌细胞、肝细胞、成骨细胞、成纤维细胞、成脂细胞、造牙本质细胞、成体神经元祖细胞、神经干细胞、来自脑室下前脑区的多个多潜能干细胞、室管膜神经干细胞、造血干细胞、肝造血干细胞、骨髓干细胞、脂肪的成纤维细胞、脂肪干细胞、产生多个胰岛细胞的干细胞、胰源性多能产生胰岛干细胞、间质干细胞、胎盘细胞、骨髓基质细胞、肌肉侧群细胞、骨髓来源的回收细胞、血液来源的间质前体细胞、骨髓来源的侧群细胞、肌肉前体细胞、循环的骨骼干细胞、神经祖细胞、多潜能成体祖细胞、中胚层祖细胞、脊髓祖细胞及孢子样细胞及任何组合所组成的群组。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明采用一种新的方法用于稳定生物支架的制备以支持动物细胞培养。实验采用C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞、原分离的牛卫星细胞(BSCs)和小鼠胚胎成纤维细胞(3T3-L1)，制备并表征了三维多孔海绵和定向排列多孔支架，探讨了肌肉细胞在材料上的生长情况。生产过程中未使用化学交联试剂，在植物蛋白支架的制备上未使用ECM蛋白等涂层，但肌细胞在蛋白支架上增殖良好。本方法采用水退火方法物理交联支架，既在高温水蒸气条件下引入氢键交联的方式稳定支架，这种方式可与支架制备的高温高压蒸汽灭菌步骤相结合，操作步骤简单，且适用于各种形态的支架制备。
实施例1
海绵状多孔面筋蛋白支架的制备方式：将面筋蛋白40mg/mL溶于水中，室温搅拌24h，用0.1N HCl和0.1M NaOH调节pH为3。然后将这些面筋蛋白溶液置于90℃水浴中搅拌5-60分钟，使面筋蛋白充分分散展开，然后将溶液分散到48孔板中，经过-20℃冷冻48小时后，再在-81℃冷冻干燥48小时，冷冻干燥后成为海绵状称为冻干海绵。将冻干海绵转移到玻璃小瓶中，用吸水餐巾纸与橡皮筋封上玻璃小瓶的瓶口，从而限制水蒸气凝结，确保蒸汽充满了玻璃小瓶与多孔支架。封口后蒸汽灭菌(高压灭菌法)121℃15分钟，干燥10分钟，使其交联并灭菌。
将C2C12细胞接种在所获得支架上，接种密度为五十万细胞每毫升。
面筋蛋白海绵状支架的宏观、微观形貌及细胞生长情况如图3所示，蒸汽交联后的面筋蛋白支架在缓冲液中可保持稳定(稳定时间可长达6个月)，呈多孔状，孔直径范围在10-500μm之间。死活染结果为细胞接种后在支架上生长7天后情况，如图所示绿色为活细胞，红色为死细胞，红色细胞数量少，几乎不可见；绿色活细胞呈梭形贴附支架，显示细胞在支架上生长状态良好。
实施例2
PDMS模具的制备：使用PDMS溶液，倒入一个10*6*2cm的长方体开口槽中，平铺一薄层，放入烘箱中，60℃定型，然后取出，在薄层中间放入6*3*1cm的长方体模块，再围绕模块倒入PDMS溶液，放入烘箱中，60℃定型，然后取出模块，获得中空的PDMS模具，用钢板分开一个横截面为矩形的腔。
仿生取向麦谷蛋白支架的制备方式：将浓度为30mg/mL、pH值为3的麦谷蛋白转移到PDMS模具的一个矩形腔。PDMS模具的另一侧加入液氮，使麦谷蛋白溶液立即定向冻结。冷冻后-81℃冻干形成具有定向排列孔的麦谷蛋白支架。最后将具有定向孔的麦谷蛋白支架装入灭菌密封袋中在121℃蒸压灭菌15分钟后干燥10分钟，使其交联并灭菌。
将牛原代细胞接种在所获得支架上，接种密度为五十万细胞每毫升。
麦谷蛋白仿生取向状支架的宏观、微观形貌及细胞生长情况如图4所示，蒸汽交联后的麦谷蛋白支架呈定向多孔状，孔直径范围在10-200μm之间。死活染结果为细胞接种后在支架上生长7天后情况，如图所示绿色为活细胞，红色为死细胞，红色细胞数量少，几乎不可见；绿色活细胞呈梭形贴附支架，显示细胞在支架上生长状态良好。
实施例3
魔芋多孔支架的制备：10mg/mL魔芋胶在水中搅拌均匀，然后将溶液分散到孔板或模具中，在-20℃冷冻定型，然后在-81℃冻干48小时，然后在1M Na2CO3溶液中浸泡2小时，再进行一次-81℃冷冻干燥48小时。冷冻干燥后成为海绵状，称为冻干海绵。将冻干海绵转移到玻璃小瓶中，用吸水餐巾纸与橡皮筋封上玻璃小瓶的瓶口，从而限制水蒸气凝结，确保蒸汽充满了玻璃小瓶与多孔支架。封口后蒸汽灭菌(高压灭菌法)121℃15分钟，干燥10分钟，使其交联并灭菌。
将小鼠脂肪前体细胞(3T3-L1)接种在所获得支架上，接种密度为五十万细胞每毫升。
魔芋胶海绵状支架的宏观、微观形貌及细胞生长情况如图5所示，蒸汽交联后的魔芋支架呈多孔状，孔直径范围在20-500μm之间。死活染结果为细胞接种后在支架上生长7天后情况，如图所示绿色为活细胞，红色为死细胞，红色细胞数量少，几乎不可见；绿色活细胞大多呈梭形贴附支架，显示细胞在支架上生长状态良好。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (16)

1.一种细胞培养肉生物支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括使用物理交联方法使生物支架材料内部通过物理力结合形成生物支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述物理交联方法包括以下步骤：
1)将支架材料定型并干燥；
2)将干燥后的支架材料蒸汽交联。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述支架材料为分散系，所述分散系的分散质选自合成高分子材料、蛋白或多糖中的任一种或几种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述分散质选自面筋蛋白、麦谷蛋白或魔芋胶。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述分散系中分散质的浓度为1～200mg/mL，和/或，所述分散系的分散剂选自水。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将支架材料定型的方法为将支架材料冷冻使其固化从而定型；优选的，将支架材料转移至预设形状的模具中再冷冻。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，定型时冷冻固化的温度为-10℃～-200℃。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中干燥为冷冻干燥；优选的，冷冻干燥的温度为-40℃～-100℃，和/或，冷冻干燥的时间为24-72小时。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，当所述支架材料为魔芋胶时，定型之前先冷冻干燥一次，经过碱液浸泡后，再进行定型和第二次冷冻干燥。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蒸汽交联的具体步骤为：将步骤1)处理后的支架材料放入耐热容器中，将耐热容器用透气材料封口后蒸汽交联。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述耐热容器选自玻璃瓶、金属容器或耐热塑料，和/或，所述透气材料选自吸水纸或织物。
12.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蒸汽交联的条件包括以下任一项或多项：
1)温度为50～200℃；
2)气压为1psi～100psi；
3)时间为1～60分钟。
13.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述生物支架材料内部通过氢键结合形成生物支架。
14.权利要求1-13任一所述的制备方法获得的细胞培养肉生物支架。
15.一种细胞培养肉，其特征在于，所述细胞培养肉包括权利要求14所述的细胞培养肉生物支架与附着在其上的细胞。
16.根据权利要求15所述的细胞培养肉，其特征在于，附着在细胞培养肉纤维支架上的细胞为动物细胞；优选的，所述细胞选自成肌细胞、肌肉卫星细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、脂肪前体细胞、成体干细胞或多能干细胞。
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CN114874978A (zh) * 2022-05-07 2022-08-09 南京周子未来食品科技有限公司 一种基于多孔支架材料的细胞培养肉个性化定制及其生产方法

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