CN114437209B - 特异性结合相思子毒素的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性结合相思子毒素的抗体或其活性片段、检测所述相思子毒素的试剂盒及其应用。本发明的检测试剂盒生产方便，效果稳定，无非特异反应，包被量低，有利于大批量生产。本发明的方法操作简便快捷、重现性好、极其方便现场使用。

Description

特异性结合相思子毒素的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫领域，具体涉及相思子毒素的纯化、特异性结合相思子毒素的抗体以及检测相思子毒素的试剂盒及应用。
背景技术
相思子毒素是从豆科藤本植物相思子(Abrus precatorius)的种子中提取的一种剧毒性高分子蛋白毒素，具有极强的细胞毒性作用，可引起意外中毒，对公共安全存在潜在威胁，已被列为潜在的重要毒素战剂和生物恐怖病原物质之一。相思子毒素中毒后，通常要经数小时至数天的潜伏期才出现综合征。经静脉注射或皮下给药，临床症状与经消化道给药相似，但胃肠道症状较轻，而注射部位通常会发生严重的炎症。
相思子毒素是一种分子质量约为63ku～67ku的糖蛋白，分子由 A、B两条多肽链通过1个二硫键连接而成。完整毒素在SDS-PAGE 分析时呈一条蛋白带，经二巯基乙醇处理后，A、B两条链分离开。有关试验表明，相思子毒素两条链经二巯基乙醇还原分离开后，其活性并不丧失。
胶体金侧向免疫层析技术已被广泛的应用于毒素检测领域，操作简便、快速，不需额外设备，特别适合现场检测，其检测试纸的准确性高度依赖于抗体的特异性。
因此，开发和建立特异、灵敏的检测相思子毒素的方法是十分迫切和重要的。
发明内容
本发明的第一个目的是提供特异性结合相思子毒素的抗体及其活性片段。
具体而言，本发明提供的抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中：
所述重链可变区具有SEQ ID NO:3所示的CDR1，SEQ ID NO: 4所示的CDR2和/或SEQ ID NO:5所示的CDR3；或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO:13所示的CDR1，SEQ IDNO:14所示的 CDR2和/或SEQ ID NO:15所示的CDR3；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的CDR1，SEQ ID NO: 9所示的CDR2和/或SEQ ID NO:10所示的CDR3；或者，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:18所示的CDR1，SEQ IDNO:19所示的 CDR2和/或SEQ ID NO:20所示的CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有 SEQ ID NO:3所示的CDR1，SEQ ID NO:4所示的CDR2和/或SEQ ID NO:5所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的 CDR1，SEQ ID NO:9所示的CDR2和/或SEQ ID NO:10所示的 CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有 SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有 SEQ ID NO:13所示的CDR1，SEQ ID NO:14所示的CDR2和/或 SEQ ID NO:15所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:18 所示的CDR1，SEQ ID NO:19所示的CDR2和/或SEQ ID NO:20所示的CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。优选地，所述抗体或活性片段包括但不限于单克隆抗体、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、scFv、dsFv和dAb。
本发明的第二个目的是提供编码所述特异性结合相思子毒素的抗体或活性片段的核苷酸序列。
在本发明中，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1 所示氨基酸序列；SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列；SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:11所示氨基酸序列；SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列编码SEQID NO:16所示氨基酸序列。
本发明的第三个目的是提供检测相思子毒素的试剂盒，所述试剂盒包括检测试纸，所述试纸上含有本发明所述的抗体或活性片段。
优选地，所述试纸为胶体金免疫层析检测试纸。
作为本发明优选的方案，所述试纸包含结合垫、检测线(T线) 和控制线(C线)；所述结合垫上包被有所述抗体或活性片段与胶体金的偶联物，所述检测线上包被有所述抗体或活性片段，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
其中，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段中，重链可变区具有SEQ ID NO:3所示的CDR1，SEQ ID NO:4所示的 CDR2和/或SEQ ID NO:5所示的CDR3，且轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的CDR1，SEQ ID NO:9所示的CDR2和/或SEQ ID NO: 10所示的CDR3。优选地，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段中，重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体，且轻链可变区具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
其中，包被于所述检测线上的抗体或活性片段中，重链可变区具有SEQ ID NO:13所示的CDR1，SEQ ID NO:14所示的CDR2和/或 SEQ ID NO:15所示的CDR3，且轻链可变区具有SEQ ID NO:18所示的CDR1，SEQ ID NO:19所示的CDR2和/或SEQ ID NO:20所示的CDR3。优选地，包被于所述检测线上的抗体或活性片段中，重链可变区具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体，且轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
作为本发明的优选方案，所述胶体金免疫层析检测试纸采用包括如下步骤的方法制备而成：
将本发明提供的抗体或活性片段与胶体金偶联后所得的溶液，喷于结合垫上；将本发明提供的抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的检测线上；将抗小鼠的IgG抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的控制线上；将所述结合垫以及硝酸纤维素膜组装于背板上，制成大版，裁成裸条，即试纸。
本发明的第四个目的是提供本发明所述的抗体或活性片段，或者所述的试纸或试剂盒在样品中检测相思子毒素的应用。
本发明的第五个目的是提供本发明所述的抗体或活性片段在制备用于检测相思子毒素的试剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供利用本发明所述的抗体或活性片段，或者所述的试纸或试剂盒检测样品中相思子毒素的方法。
作为本发明的优选方案，所述方法包括以下步骤：将待检样品的溶液滴加到胶体金免疫层析检测试纸上，或滴加到内部装配有所述试纸的试剂盒的加样孔中，静置，观察试纸上的T线和C线的显色情况。
作为本发明的优选方案，如果T线与C线均显色，则样品中含有浓度大于或等于20ng/mL的相思子毒素；如果C线显色，T线不显色，则样品中含有浓度小于20ng/mL的相思子毒素或不含有相思子毒素；如果C线不显色，检测试剂失效。
本发明的第七个目的是提供相思子毒素的提纯方法，所述方法包括以下步骤：相思子粉碎后用磷酸盐缓冲液浸提，离心，取上清液加入饱和硫酸铵溶液，静置，离心，取沉淀溶于磷酸盐缓冲液，透析，离心，所得上清液即为相思子粗毒；采用琼脂糖亲和柱吸附相思子粗毒，用半乳糖-磷酸盐缓冲液洗脱，经过分子筛层析，制备得到纯度大于90％的相思子毒素。
优选地，所述琼脂糖亲和柱的介质为氨苯基-β-D-半乳糖苷琼脂糖亲和介质。
优选地，所述分子筛层析的介质为Sephacryl S-100。
本发明通过对相思子毒素提取纯化方法进行优化、改进，得到较高纯度的相思子毒素蛋白，免疫小鼠制备特异性单克隆抗体，通过配对筛选，建立了基于胶体金侧向免疫层析检测技术的快速、特异和灵敏的检测、鉴定相思子毒素的方法，同时本发明制备的单克隆抗体得到很好的应用。本发明的检测试剂盒生产方便，效果稳定，无非特异反应，包被量低，有利于大批量生产。本发明的方法操作简便快捷、重现性好、极其方便现场使用。
附图说明
图1示出胶体金免疫侧向层析检测卡照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明实施例仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1.相思子粗毒的提取
称取相思子50g并去壳，置食品用粉碎机内，加液氮粉碎后取出。加入0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.2)200mL，在4℃的环境中浸提24h。取出浸提液，以12000g、4℃离心40min，收集上清。向收集的上清中加入饱和硫酸铵溶液，搅拌使其溶解为80％饱和溶液，置4℃过夜，以12000g、4℃离心40min，收集沉淀。将所得沉淀溶于PBS(0.01M，pH 7.2)中，并用相同的PBS(0.01 M，pH 7.2)透析过夜。第二天以12000g、4℃离心15min，所得上清液即为相思子粗毒。
实施例2.相思子粗毒的纯化
(1)亲和层析
取5mL氨苯基-β-D-半乳糖苷琼脂糖亲和介质真空脱气后，缓慢装入层析柱，注意避免产生气泡和断层，以至少10倍柱床体积的PBS (0.01M，pH 7.2)进行清洗平衡。将相思子粗毒经0.45μm的滤膜过滤后，以平衡液10倍体积稀释，以缓慢加入层析柱内，使粗毒中的相思子毒素和凝集素充分吸附在柱上。将层析柱连接恒流泵并控制流速70r/min，用HD-A层析图谱采集分析仪记录层析图谱。用PBS (0.01M，pH 7.2)洗杂蛋白，待UV曲线洗平后，加入150mM的半乳糖-PBS(pH 7.2)洗脱蛋白，并收集洗脱峰。
(2)分子筛层析
将亲和后的收集液以0.5mL/min的流速上SephacrylTMS-100G75 预装柱，用PBS(0.01M，pH 7.2)洗脱并收集洗脱峰。
实施例3.相思子毒素蛋白的电泳鉴定及其浓度测定
将得到的相思子毒素进行PAGE凝胶电泳鉴定，电泳过程中，在 DTT存在条件下，相思子毒素分子内的二硫键被打开，得到A、B单链，分子量分别为31kDa、33kDa。当电泳不存在DTT时，相思子毒素分子内的二硫键没有被打开，分子量大小约为64kDa。通过电泳图谱分析，得到了电泳纯的相思子毒素，用BCA法测定得到的相思子毒素的蛋白浓度可达4mg/mL。
实施例4.相思子单克隆抗体的制备
经过亲和层析和凝胶过滤两步纯化得到的电泳纯相思子毒素蛋白，经背部皮下免疫6只约8周龄的Balb/c健康雌性小鼠。初次免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原，后续免疫用弗氏不完全佐剂乳化的抗原，免疫剂量均为100μg/只·每次，免疫间隔为2周；免疫3次后对小鼠进行眼眶采血，用间接ELISA方法检测小鼠血清中的抗体效价，观测免疫效果。
取抗体效价大于10000的小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞混合，按照常规方法用50％的PEG进行融合。用1μg/mL的相思子毒素蛋白为包被抗原，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞的培养上清来筛选阳性融合细胞，再对阳性孔中的细胞以有限稀释法进行3次细胞克隆。
以0.5mL/只将石蜡油注射到雌性小鼠腹腔内，一周后注入克隆后的杂交瘤细胞，制备腹水，并测定其分泌单抗的稳定性。取生长良好，分泌稳定的杂交瘤细胞建株，扩大培养后保存于液氮中。应用A/G 蛋白亲和层析法纯化腹水中的单克隆抗体，检测纯化后的抗体ELISA 效价大于1:128000，纯度大于90％。
实施例5.相思子单克隆抗体CDR区序列扩增及测定
杂交瘤细胞株503和902培养至最佳状态，收集约5×107个/mL 的细胞，参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书提取杂交瘤细胞的总RNA。将1μL的Oligo dT引物(50μM)、1μL 的dNTP混合物(各10mM)和小于5μg的RNA混合后，在65℃放置5min，迅速置冰上冷却。后再加入4μL的5×PrimeScriptⅡ缓冲液， 0.5μL(20U)的RNase抑制剂，1μL(200U)的PrimeScriptⅡRTase (200U/μL)，42℃放置1h，70℃放置15min，25℃放置1min进行第一链(1st-Strand)cDNA的合成。
用表1所示的引物对，以反转录的cDNA为模板，PCR扩增单克隆抗体轻链、重链的可变区核苷酸序列。将扩增的核酸片段用T4 连接酶连接到pMDTM19-T载体后，再转化至TOP10感受态细胞中。经PCR做菌液鉴定后，选取阳性菌落进行扩大培养，后按照天根质粒小提试剂盒说明书提取连有单克隆抗体可变区序列的pMD19-T质粒，送至测序公司进行测序。
表1.可变区引物序列
Figure BDA0003488752600000081
实施例6.相思子毒素单克隆抗体可变区序列比对分析
将扩增的杂交瘤细胞株503和902的单克隆抗体可变区的核酸序列的测序结果，在GeneBank数据库中进行Blast比对分析，结果显示扩增的抗体可变区序列与数据库中Balb/c小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列同源性最高，说明测序得到的基因序列为小鼠单克隆抗体序列。利用IgBLAST和ABYSIS软件分析测序结果，分别得到抗体重链和轻链可变区序列的CDR区划分，分析结果如下。
(1)相思子毒素单克隆抗体株503可变区重链测序结果氨基酸序列：
LTMAVLGLLFCLVTFPSCVLSQVQVNQSGPGLVQPSQSLSITC TVSGFSLTTSATYWVRQPPGKGLEWLGAITSGARTSYNAPYMSRL SISKDNSNSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARNLYACSTDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLVPVCGD(SEQ ID NO:1)
核苷酸序列(共465bp)：
CTCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGAC ATTCCCAAGCTGTGTCCTATCCCAGGTGCAGGTGAATCAGTCAG GACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTG CACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTACATCTGCTACATACTGGGT TCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGCAATAACGAGTGGTGCTAGGACATCCTATAATGCACCTTACATGTCCAG ACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAACAGCCAAGTTTTCTTT AAAATGAACAGTCTACAAGCTGATGACACAGCCATATACTACTG TGCCAGAAATCTCTACGCCTGTAGCACTGACTACTGGGGCCAA GGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCAT CTGTCTATCCACTGGTCCCTGTGTGTGGAGAT(SEQ ID NO:2)
相思子毒素单克隆抗体株503重链可变区CDR1-3序列见表2。
表2.相思子毒素单克隆抗体株503重链可变区序列
Figure BDA0003488752600000091
Figure BDA0003488752600000101
(2)相思子毒素单克隆抗体株503可变区轻链测序结果氨基酸序列：
DIVLTQTPASLAVSLGQRATISYRASKSVTTSDYRYMHWNQQ KPGQPPRLLIYLLSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAAT YYCQHITDLTRSEGGPSWKSNGLMLHQLYP(SEQ ID NO:6)
核苷酸序列(共357bp)：
GATATTGTGCTGACCCAAACTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCT CTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTG TCACTACATCTGACTATAGATATATGCACTGGAACCAACAGAAA CCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTACTATCCAACCT AGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATG CTGCAACCTATTACTGTCAGCACATAACGGACCTTACACGTTCG GAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCAC CAACTGTATCCA(SEQ IDNO:7)
相思子毒素单克隆抗体株503轻链可变区CDR1-3序列见表3。
表3.相思子毒素单克隆抗体株503轻链可变区序列
Figure BDA0003488752600000102
Figure BDA0003488752600000111
(3)相思子毒素单克隆抗体株902 可变区重链测序结果氨基酸序列：
LTMDFGLSWVFLVLVLKGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLKL SCAASGFTFSDSNMIWIRQTPEKRLEWVATISNGASYTSCGDTVKG RFTISRDNAKNNLYLQMNSLKSEDTAMYYCVRAGLSTTYLDYWG QGATLTVSAAK(SEQ ID NO:11)
核苷酸序列(共426bp)：
CTCACCATGGACTTCGGGTTGAGCTGGGTTTTCCTTGTCCT TGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCT GGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTTACTTTCAGTGACTCTAACATGATTTGG ATTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAATGGGTCGCAACCA TCAGTAATGGTGCTAGTTACACGTCCTGTGGAGACACTGTGAAG GGGCGATTCACCATTTCCAGAGACAATGCCAAAAACAACCTGT ACCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTA TTACTGTGTGAGAGCGGGACTATCTACAACATACCTTGACTACT GGGGCCAAGGCGCCACTCTCACCGTCTCTGCAGCCAAA (SEQ ID NO:12)
相思子毒素单克隆抗体株902 重链可变区CDR1-3序列见表4。
表4.相思子毒素单克隆抗体株902 重链可变区序列
Figure BDA0003488752600000112
Figure BDA0003488752600000121
(4)相思子毒素单克隆抗体株902 可变区轻链测序结果氨基酸序列：
DIQLTQSPSSLSAFLGGKVTITCNATQDTNQYIAWYQLRPGKG PRLLIHDTYTLLPGIPSRFSGSGSGRNYSFSISALEPEDIATYYCLQY HYAQTFGGGTKLEIKGGLASQAGFCREGHVIVLTVAHVRCWDQA GDLT(SEQ ID NO:16)
核苷酸序列(共417bp)：
GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATT TCTGGGAGGCAAAGTCACCATCACTTGCAACGCAACTCAAGAC ACTAACCAGTATATAGCTTGGTACCAACTCAGGCCTGGAAAAGG TCCTAGGCTGCTCATACACGACACATATACATTACTACCAGGCAT CCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGGTCTGGGAGAAATTATTCCTTCAGCATCAGCGCCCTGGAGCCTGAAGATATTGCGACTTATTATT GTCTTCAGTATCATTATGCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAA CTGGAAATCAAAGGTGGACTGGCTTCACAGGCAGGATTTTGTA GAGAGGGGCATGTCATAGTCCTCACTGTGGCTCACGTTCGGTGC TGGGACCAAGCTGGAGATCTAACA(SEQ ID NO:17)
相思子毒素单克隆抗体株902 轻链可变区CDR1-3序列见表5。
表5.相思子毒素单克隆抗体株902 轻链可变区序列
Figure BDA0003488752600000122
实施例7.相思子胶体金免疫侧向层析检测试剂盒
胶体金免疫层析试验(immunochromatographie assay)是以微孔膜为固相载体，借助毛细管虹吸引力(层析作用)使液体样品在条状膜上泳动。本发明将从杂交瘤细胞株503对应腹水中纯化出的抗体，与粒径40nm的胶体金偶联，溶于复溶液中，使用金标三维划膜喷点仪喷于预处理好的结合垫上；将杂交瘤细胞株902对应腹水中纯化出的抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素(NC)膜的TEST线(T线)上；将外购的羊抗鼠 IgG抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素膜的CONTROL线(C线)上；将喷金处理的结合垫、包被处理的NC膜、预处理的结合垫组装于背板上，制成大版。使用切条机将上一步制作的大版裁成宽度为4mm的裸条，组装于配套的卡壳中，制备成可用于检测相思子毒素的胶体金检测试剂。
配制不同浓度的相思子毒素样品液(溶剂为pH7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液)，用移液器分别移取不同浓度的相思子样品液80μL，平行滴加于胶体金检测试剂的加样孔，观察10min时，T线和C线的显色情况，如果T线与C线均显色，为阳性；C线显色，T线不显色为阴性；C线不显色，检测试剂失效。如图1所示，其中，1.阴性； 2.浓度为20ng/mL的相思子毒素样品液；3.浓度为1μg/mL的相思子毒素样品液。
经测定，该相思子胶体金检测试剂检测限为20ng/mL。
本发明列举的实施例仅是本发明优选的技术方案，本发明的保护范围不仅限于上述实施例，如是在本发明的原理条件下进行任何改造及变形，理应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京弘进久安生物科技有限公司
<120> 特异性结合相思子毒素的单克隆抗体及其应用
<130> CP11560JA
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Thr Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro
1 5 10 15
Ser Cys Val Leu Ser Gln Val Gln Val Asn Gln Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
35 40 45
Ser Leu Thr Thr Ser Ala Thr Tyr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Ala Ile Thr Ser Gly Ala Arg Thr Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Ala Pro Tyr Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Asn
85 90 95
Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Ala Cys Ser Thr Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Val Cys Gly Asp
145 150 155
<210> 2
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcaccatgg ctgtcttggg gctgctcttc tgcctggtga cattcccaag ctgtgtccta 60
tcccaggtgc aggtgaatca gtcaggacct ggcctagtgc agccctcaca gagcctgtcc 120
atcacctgca cagtctctgg tttctcatta actacatctg ctacatactg ggttcgccag 180
cctccaggaa agggtctgga gtggctggga gcaataacga gtggtgctag gacatcctat 240
aatgcacctt acatgtccag actgagcatc agcaaggaca actccaacag ccaagttttc 300
tttaaaatga acagtctaca agctgatgac acagccatat actactgtgc cagaaatctc 360
tacgcctgta gcactgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 420
acgacacccc catctgtcta tccactggtc cctgtgtgtg gagat 465
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Ser Ala Thr Tyr
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Ile Thr Ser Gly Ala Arg Thr Ser Tyr Asn Ala Pro Tyr Met Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asn Leu Tyr Ala Cys Ser Thr Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asp Tyr Arg Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Thr
85 90 95
Asp Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Ser Asn Gly Leu
100 105 110
Met Leu His Gln Leu Tyr Pro
115
<210> 7
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatattgtgc tgacccaaac tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcact acatctgact atagatatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc tactatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acataacgga ccttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctg gaaatcaaac gggctgatgc tgcaccaact gtatcca 357
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Lys Ser Val Thr Thr Ser Asp Tyr Arg Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Leu Ser
1
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln His Ile Thr Asp Leu Thr Arg
1 5
<210> 11
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Leu Thr Met Asp Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Leu Val Leu
1 5 10 15
Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Asp Ser Asn Met Ile Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys
50 55 60
Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asn Gly Ala Ser Tyr Thr Ser
65 70 75 80
Cys Gly Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Gly Leu Ser Thr Thr Tyr Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Thr Leu Thr Val Ser Ala Ala Lys
130 135 140
<210> 12
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcaccatgg acttcgggtt gagctgggtt ttccttgtcc ttgttttaaa aggtgtccag 60
tgtgaagtgc agctggtgga gtctggggga ggcttagtga agcctggagg gtccctgaaa 120
ctctcctgtg cagcctctgg atttactttc agtgactcta acatgatttg gattcgccag 180
actccggaaa agaggctgga atgggtcgca accatcagta atggtgctag ttacacgtcc 240
tgtggagaca ctgtgaaggg gcgattcacc atttccagag acaatgccaa aaacaacctg 300
tacctgcaaa tgaacagtct gaagtctgag gacacagcca tgtattactg tgtgagagcg 360
ggactatcta caacatacct tgactactgg ggccaaggcg ccactctcac cgtctctgca 420
gccaaa 426
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ser Asn Met Ile
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Thr Ile Ser Asn Gly Ala Ser Tyr Thr Ser Cys Gly Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Gly Leu Ser Thr Thr Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Phe Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Asn Ala Thr Gln Asp Thr Asn Gln Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Leu Arg Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Asp Thr Tyr Thr Leu Leu Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asn Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Ala Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr His Tyr Ala Gln Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Leu Ala Ser Gln
100 105 110
Ala Gly Phe Cys Arg Glu Gly His Val Ile Val Leu Thr Val Ala His
115 120 125
Val Arg Cys Trp Asp Gln Ala Gly Asp Leu Thr
130 135
<210> 17
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gacattcagc tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ttctgggagg caaagtcacc 60
atcacttgca acgcaactca agacactaac cagtatatag cttggtacca actcaggcct 120
ggaaaaggtc ctaggctgct catacacgac acatatacat tactaccagg catcccatca 180
aggttcagtg gaagtgggtc tgggagaaat tattccttca gcatcagcgc cctggagcct 240
gaagatattg cgacttatta ttgtcttcag tatcattatg ctcagacgtt cggtggaggc 300
accaaactgg aaatcaaagg tggactggct tcacaggcag gattttgtag agaggggcat 360
gtcatagtcc tcactgtggc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggaga tctaaca 417
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asn Ala Thr Gln Asp Thr Asn Gln Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Thr Tyr Thr Leu Leu Pro
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Leu Gln Tyr His Tyr Ala Gln Thr
1 5
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctcaccatgg agacagacac actcctgcta t 31
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agcccgtttk atttccarct t 21
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctcaccatgg ratgsagctg kgtmats 27
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gttttggctg mrgagacdgt ga 22

Claims (11)

1.特异性结合相思子毒素的抗体及其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含如下的重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区具有SEQ ID NO: 3所示的CDR1，SEQ ID NO: 4所示的CDR2和SEQ IDNO: 5所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQ ID NO: 8所示的CDR1，SEQ ID NO: 9所示的CDR2和SEQ ID NO: 10所示的CDR3；或者，
所述重链可变区具有SEQ ID NO: 13所示的CDR1，SEQ ID NO: 14所示的CDR2和SEQ IDNO: 15所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQ ID NO: 18所示的CDR1，SEQ ID NO: 19所示的CDR2和SEQ ID NO: 20所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1~3任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、scFv、dsFv或dAb。
5.编码权利要求1~4任一项所述抗体或抗原结合片段的核酸。
6.一种检测相思子毒素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测试纸，所述试纸上含有权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸为胶体金免疫层析检测试纸。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试纸包含结合垫、检测线和控制线；所述结合垫上包被有所述抗体或抗原结合片段与胶体金的偶联物，所述检测线上包被有所述抗体或抗原结合片段，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
9.权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测相思子毒素的试剂中的应用。
10.权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测在样品中的相思子毒素的试纸或试剂盒中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述检测的方法包括以下步骤：将待检样品的溶液滴加到胶体金免疫层析检测试纸上，或滴加到内部装配有所述试纸的试剂盒的加样孔中，静置，观察试纸上的检测线和控制线的显色情况；
如果检测线与控制线均显色，则样品中含有浓度大于或等于20ng/mL的相思子毒素；如果控制线显色，检测线不显色，则样品中含有浓度小于20ng/mL的相思子毒素或不含有相思子毒素；如果控制线不显色，检测试剂失效。
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