CN114425047A - 一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，包括以下步骤：S1、将单分散二氧化硅纳米粒子沉积在载玻片上，在所述载玻片上滴加聚(乳酸‑乙醇酸)，待聚(乳酸‑乙醇酸)固化后蚀刻单分散二氧化硅纳米粒子，获得柔性的反蛋白石膜；S2、将琼脂糖溶解在磷酸缓冲盐溶液中形成溶液A，将明胶和透明质酸溶解在磷酸缓冲盐溶液中形成溶液B，溶液A和溶液B混合后形成预凝胶溶液，接着把成纤维细胞生长因子10、磷酸氯喹、黑磷量子点加入预凝胶溶液中，混合后形成载药预凝胶溶液；S3、将步骤S2制备的载药预凝胶溶液滴加到步骤S1制备的反蛋白石膜中，待载药预凝胶溶液成胶后，得到载药反蛋白石膜。

Description

一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法。
背景技术
脊髓损伤是一种严重的神经系统性创伤，可导致四肢和肌肉无力、运动控制能力减弱甚至瘫痪。脊髓损伤分为直接机械性损伤和继发性损伤，直接机机械性损伤后血脊髓屏障破坏、炎症细胞趋化浸润、轴突萎缩、神经元凋亡等继发性损伤是阻碍脊髓再生修复的主要因素。为了能有效修复脊髓损伤，已经探索了多种药物和治疗方法，但治疗效果并不理想，还有待进一步提高。生长因子，如成纤维细胞生长因子10(FGF10)，据报道可以保护神经元、稳定微管和促进轴突生长。此外，磷酸氯喹(CQ)通过下调肿瘤坏死因子，在脊髓损伤早期抑制炎症中发挥关键作用。因此，FGF10和CQ的给药可能对治疗脊髓损伤起到协同作用。
然而，将两种药物有效地封装并输送到脊髓损伤部位，并继续控制它们在损伤部位的释放仍然是一个挑战。已经有研究使用各种生物相容性生物材料，包括仿生水凝胶、脂质体、可注射纳米粒等，来包载多种药物。尽管取得了很大进展，但现有的用于治疗脊髓损伤的生物材料结构仍然相对简单，难以实现损伤部位特异性药物释放。
因此，迫切需要一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体来有效修复脊髓损伤。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提供一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、反蛋白石膜的制备：
将单分散二氧化硅纳米粒子沉积在载玻片上，在所述载玻片上滴加聚(乳酸-乙醇酸)，待聚(乳酸-乙醇酸)固化后蚀刻单分散二氧化硅纳米粒子，获得柔性的反蛋白石膜；
S2、载药预凝胶溶液的制备：
将琼脂糖溶解在磷酸缓冲盐溶液中形成溶液A，将明胶和透明质酸溶解在磷酸缓冲盐溶液中形成溶液B，溶液A和溶液B混合后形成预凝胶溶液，接着把成纤维细胞生长因子10、磷酸氯喹、黑磷量子点加入预凝胶溶液中，混合后形成载药预凝胶溶液；
S3、载药反蛋白石膜的制备：
将步骤S2制备的载药预凝胶溶液滴加到步骤S1制备的反蛋白石膜中，待载药预凝胶溶液成胶后，得到载药反蛋白石膜。
为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
进一步地，步骤S1中，将所述反蛋白石膜进行拉伸，制备得到拉伸反蛋白石膜。
进一步地，步骤S1中，所述单分散二氧化硅纳米粒子通过垂直沉积法沉积在载玻片上。
进一步地，步骤S1中，所述单分散二氧化硅纳米粒子直径为300nm，沉积在载玻片上煅烧形成二氧化硅胶体晶体阵列。
进一步地，所述单分散二氧化硅纳米粒子的煅烧温度为400℃。
进一步地，步骤S1中，所述聚(乳酸-乙醇酸)的分子量为100KDa、150KDa、200KDa中的一种。
进一步地，步骤S2中，琼脂糖使用100℃加热溶解，明胶和透明质酸使用60℃加热溶解；成纤维细胞生长因子10、磷酸氯喹、黑磷量子点在预凝胶溶液温度下降到37℃时加入。
进一步地，步骤S2中，在载药预凝胶溶液中，琼脂糖、明胶和透明质酸的浓度分别为0.8％w/v，5％w/v和0.2％w/v；成纤维细胞生长因子10、磷酸氯喹和黑磷量子点的浓度分别为1mg/mL、50mM、0.05mg/mL。
本发明的有益效果是：
1)本发明提供了一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体(载药反蛋白石膜)，载药反蛋白石膜具有紧密相连的多孔结构以及极大的比表面积，这可以增加功能性药物的装载量；包含药物(FGF10、CQ)的载药预凝胶溶液被加到反蛋白石膜中，载药预凝胶溶液成胶后将药物封闭在反蛋白石膜孔洞中，延缓药物释放，延长作用时间，同时有效避免CQ的突释，从而避免高浓度CQ的毒性，提高治疗效果；
2)本发明提供了一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体，反蛋白石膜按一定倍数拉伸后，生长在拉伸反蛋白石膜上的神经细胞会被诱导，并以高度有序的方式排列，促进神经细胞轴突定向生长，有助于断裂神经的重新连接；
3)本发明提供一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体，其中FGF10、CQ和BPQDs被一起加到预凝胶溶液中，制备形成的载药预凝胶溶液(Drugs-Gel)再浸入拉伸反蛋白石膜孔洞中，载药预凝胶溶液(Drugs-Gel)成胶后，FGF10、CQ和BPQDs被封锁在拉伸反蛋白石膜孔洞中，形成载药反蛋白石拉伸膜(Drugs-Gel@SIOF)，Drugs-Gel@SIOF在近红外照射下，孔洞中的凝胶温度升高，缓慢融化，药物得以释放，近红外照射调控药物从载药反蛋白石拉伸膜中释放，从而提高药物疗效，促进脊髓损伤修复。
本发明通过制备拉伸反蛋白石膜，利用反蛋白石膜中精细互连的纳米孔，将包含FGF10、CQ和BPQDs的载药预凝胶溶液渗透到拉伸反蛋白石膜的孔洞中，形成载药反蛋白石拉伸膜(Drugs-Gel@SIOF)，利用BPQDs优异的光热效应，通过控制近红外照射来调控药物从Drugs-Gel@SIOF中释放。本设计发明的Drugs-Gel@SIOF是一种理想的智能递送系统，在神经修复方面具有较大潜力。
附图说明
图1为用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备流程图；
图2为CQ对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆细胞株(PC12细胞)活力的影响图；
图3为CQ和FGF10药物累积释放曲线图；
图4为不同分子量的PLGA制备的拉伸反蛋白石膜图；
图5为PC12细胞在拉伸不同倍数的拉伸反蛋白石膜上的生长情况图；
图6为近红外控制下CQ和FGF10释放图；
图7为促脊髓损伤运动功能修复图；
其中的附图标记为：1、二氧化硅胶体晶体阵列，2、载玻片，3、聚(乳酸-乙醇酸)溶液，4、反蛋白石膜，5、拉伸反蛋白石膜，6、载药预凝胶溶液。
具体实施方式
本发明提供一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，如图1所示，具体包括以下步骤：
S1、拉伸反蛋白石膜的制备
将直径为300nm的二氧化硅纳米粒子分散在乙醇溶液中，形成2％w/v的单分散二氧化硅纳米粒子乙醇溶液，将单分散二氧化硅纳米粒子乙醇溶液倒入烧杯中，准备干净的载玻片，将载玻片垂直插入单分散二氧化硅纳米粒子乙醇溶液中，然后将烧杯放置于恒温恒湿培养箱中，直到乙醇挥发完打开培养箱，单分散二氧化硅纳米粒子自组装沉积于载玻片上，然后将载玻片置于马弗炉中在400℃下煅烧2小时以形成紧密相连的二氧化硅胶体晶体阵列。配制15％w/v的PLGA乙酸乙酯溶液，其中PLGA分子量为100KDa，将PLGA乙酸乙酯溶液滴加到沉积有二氧化硅胶体晶体阵列的载玻片上，然后放置于低温密闭空间中以减少薄膜气泡的产生，等乙酸乙酯挥发后PLGA固化成膜，然后用4％氢氟酸蚀刻二氧化硅胶体晶体阵列，得到反蛋白石膜，用游标卡在37℃水浴锅中将反蛋白石膜按照3倍、6倍进行拉伸。
在本实施例中，PLGA的分子量还可以为150KDa、200KDa中的一种。
S2、载药预凝胶溶液(Drugs-Gel)的制备
将0.8％w/v的琼脂糖添加到磷酸缓冲盐溶液中在100℃下高温加热溶解形成溶液A，将5％w/v的明胶和0.2％w/v的透明质酸添加到磷酸缓冲盐溶液中在60℃下加热溶解形成溶液B，当琼脂糖磷酸缓冲盐溶液的温度降到60℃左右时，将溶液A和溶液B按1:1的体积比混合在一起，形成预凝胶溶液；当预凝胶溶液的温度下降至37℃左右时，分别将FGF10、CQ和BPQDs加入到预凝胶溶液中，制备得到载药预凝胶溶液，FGF10、CQ和BPQDs对应的浓度分别为1mg/mL、50mM和0.05mg/mL。
S3、载药反蛋白石拉伸膜(Drugs-Gel@SIOF)的制备
取步骤S2制备得到的载药预凝胶溶液，滴加到步骤S1制备的拉伸反蛋白石膜中，滴加量为10μL/cm2，载药预凝胶溶液浸入拉伸反蛋白石膜孔洞中，置于4℃的环境中过夜，使载药预凝胶溶液成胶，制得载药反蛋白石拉伸膜。
药物缓释实验
高浓度的磷酸氯喹(CQ)严重影响细胞活力，为了避免毒性，CQ的浓度尤为重要。反蛋白石膜可以将药物包裹在孔洞中，有效避免CQ的突释，从而避免高浓度CQ的毒性。如图2所示，纯的CQ溶液或包含CQ的载药预凝胶溶液(Drugs-Gel)都会导致PC12细胞活力显著降低，而包含CQ的载药预凝胶溶液加到反蛋白石膜中(Drugs-Gel@IOF)以后，细胞的活力跟对照组(Control)无明显区别，将包含CQ的载药预凝胶溶液加到拉伸反蛋白石膜(Drugs-Gel@SIOF)后对细胞活力仍然无明显影响。
药物缓释性能测试：为验证反蛋白石膜的缓释效果，将实验分成三组，第一组将CQ和FGF10加到载药预凝胶溶液中(Drugs-Gel)，第二组将CQ和FGF10加到载药预凝胶溶液后填充到反蛋白石膜中(Drugs-Gel@IOF)，第三组将CQ和FGF10加到载药预凝胶溶液后填充到拉伸反蛋白石膜中(Drugs-Gel@SIOF)，载药预凝胶溶液成胶后将三组分别放置于12孔板孔中，每个孔加磷酸缓冲盐溶液1mL，放置于37℃环境下，分别在第1、2、3、5、7、10、14天取样本溶液进行检测，检测样本溶液中的CQ和FGF10含量。检测结果如图3所示，第一组的药物释放持续约5天，而第二组和第三组药物释放则长达两周，并且释放曲线比较平缓，此外反蛋白石膜的拉伸对药物的缓释性能影响不明显。
拉伸反蛋白石薄膜诱导细胞方向性生长实验
拉伸后的反蛋白石膜在调整细胞方向方面表现出优异的性能，这将有助于断裂神经的重新连接，为了获得具有优异拉伸性能的拉伸反蛋白石膜，选择了多种分子量的PLGA(100-200KDa)对拉伸反蛋白石膜的拉伸性能进行优化。如图4所示，用分子量为150KDa和200KDa的PLGA制备得到的拉伸反蛋白石膜拉伸后容易回缩，而用分子量为100KDa的PLGA制备得到的拉伸反蛋白石膜拉伸后不容易回缩。
细胞生长形态检测：为了检测拉伸后拉伸反蛋白石膜对细胞生长形态的影响，将PC12细胞种植在拉伸反蛋白石膜上，培养2天后用钙黄绿素染料(Calcein-AM)对拉伸反蛋白石膜上细胞进行活细胞染色。如图5所示，PC12细胞在未拉伸的反蛋白石膜上的生长呈现无序状态，在拉伸3倍的拉伸反蛋白石膜上的生长表现出些许方向性，而在拉伸6倍的拉伸反蛋白石膜上的细胞方向性几乎和拉伸的方向一致，这表明拉伸反蛋白石膜可以有效诱导PC12细胞的方向性生长。
近红外调控载药反蛋白石拉伸膜药物释放实验
为了能可控的释放药物，100μg的FGF10和100μg的CQ被一起添加到包含浓度为0.05mg/mL BPQDs的预凝胶溶液中制备获得载药预凝胶溶液，然后再将载药预凝胶溶液滴加到拉伸反蛋白石膜中，待载药预凝胶溶液成胶后，将载药反蛋白石拉伸膜放入12孔板中，加入1mL磷酸缓冲盐溶液，近红外照射10分钟，取500μL样本溶液，补充新鲜的磷酸缓冲盐溶液500μL，近红外暂停照射10分钟后再取样本溶液，循环5次，用紫外分光光度计检测CQ的浓度，用FGF10酶联免疫分析试剂盒检测FGF10的浓度。实验结果如图6所示，载药反蛋白石拉伸膜对药物的释放可以通过近红外的照射进行调控，当近红外开的时候，两种药物释放较多，当近红外关的时候药物释放很少。
载药反蛋白石膜促进脊髓损伤修复实验
将载药反蛋白石膜应用到脊髓损伤修复中。首先制作大鼠脊髓损伤模型，大鼠麻醉后切开皮肤和脊柱两边肌肉，暴露T9段脊髓进行打击，将制备的薄膜材料放置于损伤处脊髓上，缝合肌肉和皮肤，于1，3，7，14，28天评价大鼠后肢运动功能(BBB评分)。实验分成六组，分别为假手术(Sham)组、脊髓损伤(SCI)组、载药预凝胶溶液(Drugs-Gel)组、载药反蛋白石膜(Drugs-Gel@IOF)组、载药反蛋白石拉伸膜(Drugs-Gel@SIOF)组以及近红外照射载药反蛋白石拉伸膜(Drugs-Gel@SIOF+NIR)组。如图7所示，假手术(Sham)组大鼠后肢运动功能健全，脊髓损伤(SCI)组大鼠的后肢表现出弛缓性麻痹和缓慢的时间依赖性恢复，与脊髓损伤(SCI)组相比，载药预凝胶溶液(Drugs-Gel)组大鼠在受伤后28天后BBB评分略有增加，载药反蛋白石膜(Drugs-Gel@IOF)组以及载药反蛋白石拉伸膜(Drugs-Gel@SIOF)组的大鼠后肢运动功能的修复情况较脊髓损伤(SCI)组明显提高，而近红外照射载药反蛋白石拉伸膜(Drugs-Gel@SIOF+NIR)组大鼠的后肢运动功能表现最佳。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、反蛋白石膜的制备：
将单分散二氧化硅纳米粒子沉积在载玻片上，在所述载玻片上滴加聚(乳酸-乙醇酸)，待聚(乳酸-乙醇酸)固化后蚀刻单分散二氧化硅纳米粒子，获得柔性的反蛋白石膜；
S2、载药预凝胶溶液的制备：
将琼脂糖溶解在磷酸缓冲盐溶液中形成溶液A，将明胶和透明质酸溶解在磷酸缓冲盐溶液中形成溶液B，溶液A和溶液B混合后形成预凝胶溶液，接着把成纤维细胞生长因子10、磷酸氯喹、黑磷量子点加入预凝胶溶液中，混合后形成载药预凝胶溶液；
S3、载药反蛋白石膜的制备：
将步骤S2制备的载药预凝胶溶液滴加到步骤S1制备的反蛋白石膜中，待载药预凝胶溶液成胶后，得到载药反蛋白石膜。
2.根据权利要求1所述的一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，其特征在于：
步骤S1中，将所述反蛋白石膜进行拉伸，制备得到拉伸反蛋白石膜。
3.根据权利要求1所述的一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，其特征在于：
步骤S1中，所述单分散二氧化硅纳米粒子通过垂直沉积法沉积在载玻片上。
4.根据权利要求1所述的一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，其特征在于：
步骤S1中，所述单分散二氧化硅纳米粒子直径为300nm，沉积在载玻片上煅烧形成二氧化硅胶体晶体阵列。
5.根据权利要求4所述的一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，其特征在于：
所述单分散二氧化硅纳米粒子的煅烧温度为400℃。
6.根据权利要求1所述的一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，其特征在于：
步骤S1中，所述聚(乳酸-乙醇酸)的分子量为100KDa、150KDa、200KDa中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，其特征在于：
步骤S2中，琼脂糖使用100℃加热溶解，明胶和透明质酸使用60℃加热溶解；成纤维细胞生长因子10、磷酸氯喹、黑磷量子点在预凝胶溶液温度下降到37℃时加入。
8.根据权利要求1所述的一种用于脊髓损伤修复的响应性药物载体的制备方法，其特征在于：
步骤S2中，在载药预凝胶溶液中，琼脂糖、明胶和透明质酸的浓度分别为0.8％w/v，5％w/v和0.2％w/v；成纤维细胞生长因子10、磷酸氯喹和黑磷量子点的浓度分别为1mg/mL、50mM、0.05mg/mL。
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CN112843220A (zh) * 2021-01-20 2021-05-28 温州医科大学附属第一医院 一种用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜及其制备方法
CN113262322A (zh) * 2021-01-20 2021-08-17 温州医科大学附属第一医院 一种用于创面修复的可监控给药敷料及其制备方法

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