CN112843220A - 一种用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜及其制备方法,该方法利用二氧化硅粒子与聚乳酸‑羟基乙酸共聚物通过负复制方法,制备得到具有规则且相互连通多孔结构的反蛋白石膜;在聚乳酸‑羟基乙酸共聚物的玻璃化温度下进行拉伸得到具有可调节图案的拉伸反蛋白石膜,通过真空负压的方法装载甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽。本发明制备的反蛋白石膜具有良好的生物相容性,具有指导细胞方向性生长和整齐排列的功能,抑制伤口部位的疤痕形成,其多孔结构内装载的抗菌肽可以缓慢释放达到强效的抗菌功能,从而加速伤口的愈合,功能多样,制备简单。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,尤其涉及一种用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜及其制备方法。
背景技术
疤痕组织的形成常发生在严重烧伤、皮肤外伤,或者是手术干预后的并发症之一。增生性疤痕主要由持续的真皮纤维化、不规则的胶原沉积和过度增生的增生性瘢痕成纤维细胞引起。疤痕组织的生成不仅影响美观,过多的疤痕组织还会影响关节的灵活运动。增生性疤痕的常规治疗可分为非侵入性治疗(如局部硅胶片和压力敷料)和侵入性治疗(如手术切除和激光切除)。但这些治疗方法存在疗效低、复发率高、疼痛过程等不良反应。如何有效防止疤痕的形成一直是临床医生和研究人员关注的问题。创面频繁地发生于日常生活和外科手术等,创面修复是全世界医疗卫生领域一个备受关注的问题。
为了抑制疤痕形成,不同药物对疤痕的抑制效果被大量研究,但通过特殊的物理结构诱导伤口部位细胞生长以减少疤痕生成还未被研究过。之前已经证明,细胞可以在具有拉伸反蛋白石图案的薄膜和具有特殊表面形貌(如沟槽、脊线或排列整齐的纤维)的基底上以特定方向生长。然而,这些膜往往只是简单的用于细胞诱导,其对细胞生长和迁移的影响,特别是在抑制疤痕形成过程的应用尚未被研究
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足,提供一种用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜及其制备方法,本发明通过可调节的反蛋白石图案,促进皮肤细胞的方向性生长和整齐排列,以减少创面部位的疤痕形成。
为实现上述技术目的,本发明采取的技术方案为:
一种用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,包括如下步骤:
1)制备反蛋白石膜:采用负复制方法,利用二氧化硅粒子与聚乳酸-羟基乙酸共聚物制备反蛋白石膜;
2)制备抑制疤痕生成的反蛋白石膜:利用步骤1)得到的反蛋白石膜,进行均匀拉伸后进行干燥,得到拉伸反蛋白石膜后在拉伸的纳米孔洞内装载甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽混合物;
其中,步骤1)所述负复制方法具体制备步骤为:
①利用二氧化硅粒子制备胶体晶体模板;
②利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液渗透胶体晶体模板内部,充分干燥后得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物和胶体晶体模板复合物;
③腐蚀胶体晶体模板,得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物反蛋白石膜。
进一步的,步骤①所述的二氧化硅粒子直径为100-500nm。
步骤②所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液为聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮溶液中的一种,其浓度为10-20%,需密封避光保存。
步骤②所述的充分干燥具体为在通风橱内静止4天,使乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的有机溶剂充分挥发。
步骤③所述腐蚀胶体晶体模板为采用氢氟酸或氢氧化钠进行腐蚀。
步骤2)所述进行均匀拉伸方法是在聚乳酸-羟基乙酸共聚物的玻璃化温度40-50摄氏度水浴中进行拉伸。
步骤2)所述拉伸反蛋白石膜为拉伸至3至6倍原长度的反蛋白石膜。
步骤2)所述装载甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽是通过负压真空的方法使混合溶液充分浸润到拉伸的纳米孔洞内,并通过紫外光照的方法使甲基丙烯酸酐化明胶聚合。
本发明保护采用权利要求所述的方法制备得到的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜。
本发明还保护所述的反蛋白石膜在制备用于抑制疤痕生成的药物中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1)本发明提供的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜,反蛋白石膜内部具有规则且相互连通的多孔结构,可用于药物的装载与局部药物缓慢释放,有利于维持伤口部位的药物浓度。
2)本发明提供的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜,反蛋白石膜经过拉伸后得到的可调节的反蛋白石图案,其特殊的拓扑结构具有促进细胞方向性生长和稳定排列生长的作用,可以抑制伤口部位的疤痕生成。
3)本发明提供的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜,装载有甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽,随着甲基丙烯酸酐化明胶的缓慢降解,抗菌肽子持续释放,可以达到强效的抗菌功能,有效地加速伤口愈合和修复。
附图说明
图1为抑制疤痕生成的反蛋白石膜制备流程图。
图2为实施例2中NIH-3T3细胞生长在玻璃细胞爬片,未拉伸反蛋白石膜,三倍拉伸原长度的反蛋白石膜,六倍拉伸原长度的反蛋白石膜上的荧光染色图。
图3为实施例3中不同组的HE染色图,其中A为PBS处理组创面HE染色结果,B为未拉伸的反蛋白石膜处理组创面HE染色结果,C为六倍拉伸原长度的反蛋白石膜处理组创面HE染色图,D为装载了甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽混合物的六倍拉伸原长度的反蛋白石膜处理组HE染色图。
图4为实施例3中不同组的Masson染色图,其中A为PBS处理组创面Masson染色结果,B为未拉伸的反蛋白石膜处理组创面Masson染色结果,C为六倍拉伸原长度的反蛋白石膜处理组创面Masson染色图,D为装载了甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽混合物的六倍拉伸原长度的反蛋白石膜处理组Masson染色图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所用的试剂、方法和设备,如无特殊说明,均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明提供了用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,包括如下步骤:
1)制备反蛋白石膜:采用负复制方法,利用二氧化硅粒子与聚乳酸-羟基乙酸共聚物制备反蛋白石膜;
2)制备抑制疤痕生成的反蛋白石膜:利用步骤1)得到的反蛋白石膜,进行均匀拉伸后进行干燥,得到拉伸反蛋白石膜后在拉伸的纳米孔洞(附图)内装载甲基丙烯酸酐化明胶,抗菌肽和血管内皮生长因子混合物。
进一步地,步骤1)所述负复制方法具体制备步骤为:
①利用二氧化硅粒子制备胶体晶体模板;
②利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液渗透胶体晶体模板内部,充分干燥后得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物和胶体晶体模板复合物;
③腐蚀胶体晶体模板,得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物反蛋白石膜。
步骤①所述的二氧化硅粒子直径为100-500nm。
步骤②所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液为聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮溶液中的一种,其浓度为10-20%,需密封避光保存。
步骤②所述的充分干燥具体为在低温,低湿度环境下,在通风橱内静止4天,使乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的有机溶剂充分挥发。
步骤③所述腐蚀胶体晶体模板为采用氢氟酸或氢氧化钠进行腐蚀。
步骤2)所述进行均匀拉伸方法是在40-50℃水浴中进行拉伸;拉伸的反蛋白石膜为拉伸至3至6倍原长度的反蛋白石膜。
步骤2)所述装载甲基丙烯酸酐化明胶,抗菌肽和血管内皮生长因子是通过负压真空的方法使混合溶液充分浸润到拉伸的纳米孔洞内,并通过紫外光照的方法使甲基丙烯酸酐化明胶聚合。
以下为具体实施例:
实施例1
一种拉伸的反蛋白石薄膜,制备流程如图1所示,步骤如下:
(1)制备二氧化硅胶体晶体模板:
选取直径为400纳米的二氧化硅粒子,悬浮于无水乙醇内,通过涡旋和超声使其充分分散于无水乙醇内,配置浓度为2%的二氧化硅溶液。将玻璃片垂直插入二氧化硅溶液内,静置于恒温恒湿箱内,调节箱内温度30摄氏度,湿度40%。随无水乙醇蒸发,二氧化硅粒子整齐排布于玻璃片表面,形成二氧化硅胶体晶体模板。
(2)制备反蛋白石薄膜
首相,配置15%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物乙酸乙酯溶液,密封避光放置。在通风橱内放置泡沫箱,内置吸水二氧化硅球和冰块,将二氧化硅胶体晶体模板水平放置于泡沫向内,将15%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物乙酸乙酯溶液滴加在二氧化硅胶体晶体模板上,使其充分渗透二氧化硅粒子间隙,静止干燥4天。经过干燥后,手动将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与二氧化硅胶体晶体模板复合物从玻璃片上玻璃,滴加10%氢氟酸于复合物表面,15分钟后充分腐蚀二氧化硅胶体晶体模板,用纯水反复冲洗聚乳酸-羟基乙酸共聚物反蛋白石膜后干燥备用。
(3)制备拉伸的反蛋白石膜
调节水浴锅温度为40摄氏度,将干燥备用的反蛋白石膜固定于游标卡尺的活动量爪后,将反蛋白石膜浸泡于40摄氏度温水中,根据原长度进行匀速拉伸,拉伸至原长度的三倍和六倍长度后,干燥后备用。
实施例2
拉伸的反蛋白石膜用于指导细胞方向性生长和整齐排列:
取实施例1中制备的未拉伸反蛋白石膜,三倍拉伸原长度的反蛋白石膜,六倍拉伸原长度的反蛋白石膜和玻璃细胞爬片,浸泡于75%浓度的乙醇溶液中,放置在紫外灯下照射消毒1小时,用无菌PBS缓冲液反复冲洗3次,后分别平铺于六孔板内,加入小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3细胞悬液2ml(4*104个/ml),于温度37摄氏度,二氧化碳浓度5%的细胞培养下内培养48小时。用无菌PBS缓冲液反复冲洗2遍去除死细胞,用2uM的钙黄绿素溶液对细胞进行染色,30分钟后吸去多余染料,无菌PBS缓冲液冲洗一遍后用荧光倒置显微镜观察NIH-3T3细胞生长于不同基板上的细胞形态与排列状态。如图2所示,在不同基板上的细胞数量基本相同,生长在玻璃细胞爬片和未拉伸反蛋白石膜上的细胞细胞排列紊乱,而在三倍拉伸原长度的反蛋白石膜和六倍拉伸原长度的反蛋白石膜上生长的细胞排列较为有序,且延膜拉伸方向生长。值得注意的是,相较于三倍拉伸原长度的反蛋白石膜,在六倍拉伸原长度的反蛋白石膜上的细胞更为整齐,呈现明显的方向性生长。这个结果说明,拉伸的反蛋白石膜具有指导细胞方向性生长和整齐排列的功能。
实施例3
用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜作用兔耳朵疤痕模型:
取实施例1中制备干燥备用的六倍拉伸原长度的反蛋白石膜,将甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽混合物通过真空负压的方法装载入孔洞内,并利用紫外光照使甲基丙烯酸酐化明胶聚合。另外准备未拉伸的反蛋白石膜和六倍拉伸原长度的反蛋白石膜备用。将12只健康新西兰白公兔,体重2.5kg,随机分为4组,利用20%浓度的乌拉坦,按照5ml/kg耳缘静脉注射麻醉,在兔耳朵腹侧制造直径为1厘米的圆形创面,每只兔子制造6-8个伤口,去除全层皮肤,保留软骨膜,术中避开大血管。对4组兔子分别处以不同的治疗方法:PBS缓冲液,未拉伸的反蛋白石膜,六倍拉伸原长度的反蛋白石膜,装载了甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽混合物的六倍拉伸原长度的反蛋白石膜。35天后,对伤口进行拍照,耳缘静脉麻醉后,对兔子进行处死,并切取疤痕组织,进行HE染色和Masson染色。如图3HE染色结果所示,PBS缓冲液处理组和未拉伸的反蛋白石膜处理组的伤口形成了明显突起即疤痕组织,而六倍拉伸原长度的反蛋白石膜处理组,装载了甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽混合物的六倍拉伸原长度的反蛋白石膜处理组的伤口疤痕组织少,未看到明显突起。如图4Masson染色结果所示,PBS缓冲液处理组和未拉伸的反蛋白石膜处理组胶原明显增多,而六倍拉伸原长度的反蛋白石膜处理组的胶原明显减少这说明可调节的反蛋白石结构促使伤口部位细胞方向性生长和整齐排列,进一步减少了胶原的生成,装载了甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽混合物的六倍拉伸原长度的反蛋白石膜处理组的胶原最少,这说明抗菌肽强有效的抗菌性能减少了局部炎症情况,进一步减少了胶原的生成。兔耳朵疤痕模型实验说明,抑制疤痕生成的反蛋白石膜具有促进细胞方向性生长和整齐排列的作用,其强有力的抗菌作用也进一步减少了疤痕生成。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何形式上的限制,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,依据本发明的技术实质,对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等,均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)制备反蛋白石膜:采用负复制方法,利用二氧化硅粒子与聚乳酸-羟基乙酸共聚物制备反蛋白石膜;
2)制备抑制疤痕生成的反蛋白石膜:利用步骤1)得到的反蛋白石膜,进行均匀拉伸后进行干燥,得到拉伸反蛋白石膜后在拉伸的纳米孔洞内装载甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽混合物;
其中,步骤1)所述负复制方法具体制备步骤为:
①利用二氧化硅粒子制备胶体晶体模板;
②利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液渗透胶体晶体模板内部,充分干燥后得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物和胶体晶体模板复合物;
③腐蚀胶体晶体模板,得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物反蛋白石膜。
2.根据权利要求1所述的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,其特征在于:步骤①所述的二氧化硅粒子直径为100-500nm。
3.根据权利要求1所述的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,其特征在于:步骤②所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液为聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮溶液中的一种,其浓度为10-20%,需密封避光保存。
4.根据权利要求1所述的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,其特征在于:步骤②所述的充分干燥具体为在通风橱内静止4天,使乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的有机溶剂充分挥发。
5.根据权利要求1所述的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,其特征在于:步骤③所述腐蚀胶体晶体模板为采用氢氟酸或氢氧化钠进行腐蚀。
6.根据权利要求1所述的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,其特征在于:步骤2)所述进行均匀拉伸方法是在聚乳酸-羟基乙酸共聚物的玻璃化温度40-50摄氏度水浴中进行拉伸。
7.根据权利要求1所述的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,其特征在于:步骤2)所述拉伸反蛋白石膜为拉伸至3至6倍原长度的反蛋白石膜。
8.根据权利要求1所述的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜的制备方法,其特征在于:步骤2)所述装载甲基丙烯酸酐化明胶和抗菌肽是通过负压真空的方法使混合溶液充分浸润到拉伸的纳米孔洞内,并通过紫外光照的方法使甲基丙烯酸酐化明胶聚合。
9.采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的用于抑制疤痕生成的反蛋白石膜。
10.权利要求9所述的反蛋白石膜在制备用于抑制疤痕生成的药物中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
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