CN114423777A - 血小板促进的治疗性化合物递送 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了包含负载有剂的血小板的组合物和方法。负载至血小板中的剂通常被保护免受降解，并且受试者被保护免受所述剂的毒性，如果有的话。这些益处，与血小板归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位的天然能力结合，有助于确保将治疗有效量的所述剂递送至靶部位。

Description

血小板促进的治疗性化合物递送
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月23日提交的美国临时专利申请序列号62/877,459的权益。上述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式通过EFS-Web提交并且特此以引用的方式整体并入。创建于2020年7月23日的所述ASCII副本被命名为58533-701.601_ST25.txt并且大小为3,152个字节。
背景技术
全身施用的治疗性化合物可在到达其靶部位之前降解；因此，如果它们全部到达，则它们的剂量可能太低而无法实现治疗效果。血小板天然归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位，并且已知将天然货物转运至这些部位。如果可将外源性治疗剂负载至到血小板中，则所述剂应被保护免受在剂全身施用后可能发生的降解。然而，尚未描述将外源性治疗剂负载至血小板的α颗粒中的机制。因此，对于能够将外源性治疗剂递送至损伤、炎症和/或血管生成部位的负载血小板存在尚未满足的需求。
发明内容
在各个方面，本公开提供负载有剂的血小板，所述剂可以治疗有效剂量被递送至损伤、炎症和/或血管生成的靶部位。部分地，本发明涉及包含至少剂和糖胺聚糖(GAG)结合肽的化合物，其中所述GAG结合肽可用于将化合物负载至血小板的α颗粒中。由于剂被负载至血小板中，因此它们通常在全身施用后被保护免受降解。此外，某些剂对受试者有毒；当负载至血小板中时，毒性剂对受试者的伤害能力较小。这些益处，与血小板归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位的天然能力结合，有助于确保将治疗有效量的剂递送至靶部位。因此，本公开通过以治疗有效量向损伤部位(例如，用于治疗慢性伤口)、病理性炎症部位(例如，用于治疗关节或肺损伤)和/或血管生成部位(例如，用于治疗癌症)提供定向治疗剂来克服当前治疗剂的缺陷。
本公开的一个方面是包含第一剂和第一多肽的化合物。所述第一多肽包含糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽可结合血小板的α颗粒中的GAG。
在实施方案中，所述GAG结合肽结合至硫酸软骨素(CS)和/或结合至硫酸乙酰肝素(HS)。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至CS。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
在实施方案中，所述GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖(serglycin)、串珠蛋白聚糖(perlecan)、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约1N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约2N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约3N NaCl时不结合至含CS的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性、与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7或位置9的带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少10个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽包含11个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述第一多肽由GAG结合肽组成。可替代地，所述第一多肽可包含除GAG结合肽以外的氨基酸；在一些实施方案中，所述多肽中的额外氨基酸不会增加GAG结合肽对GAG的亲和力。
在实施方案中，所述第一多肽的N端直接或间接地连接至第一剂。在实施方案中，所述第一多肽的C端直接或间接地连接至第一剂。在实施方案中，所述第一剂通过至少一个接头间接地连接至第一多肽。在实施方案中，所述至少一个接头包含一个或多个原子。在实施方案中，所述至少一个接头包含重复单元的聚合物。在实施方案中，所述至少一个接头包含氨基酸链。
在实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽。
在实施方案中，所述第一剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽。
在实施方案中，所述第一剂包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。在实施方案中，所述第一剂包含抗体。在实施方案中，所述第一剂包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一剂对哺乳动物细胞有害和/或对受试者有毒。
在实施方案中，当直接施用至受试者的血流中时，所述第一剂易于降解。
在实施方案中，所述化合物还包含荧光部分。
本公开的另一方面是一种分离的血小板，所述分离的血小板包含任何本文公开的化合物的至少一个拷贝。
在实施方案中，所述血小板是合成的、同种异体的、自体的或经修饰的异源血小板。在实施方案中，所述血小板是自体血小板。在实施方案中，所述血小板是同种异体血小板。在实施方案中，所述血小板从富含血小板的血浆获得。
在实施方案中，所述血小板包含所述化合物的1至1000个拷贝。在实施方案中，所述化合物的1至1000个拷贝被负载至所述血小板的α颗粒中。
在实施方案中，所述分离的血小板还包含至少第二化合物，其中所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，并且所述至少第二多肽包含能够结合血小板的α颗粒中的GAG的至少第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％、至少约80％或至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含10个氨基酸或11个氨基酸或由其组成。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性的氨基酸序列，并且所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二剂包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在实施方案中，所述第一剂不同于所述至少第二剂。可替代地，所述第一剂与所述至少第二剂相同。
在实施方案中，所述至少第二剂通过至少一个接头间接地连接至所述至少第二多肽。在实施方案中，所述至少第二剂直接连接至所述至少第二多肽。
在实施方案中，所述血小板包含所述至少第二化合物的1至1000个拷贝，例如在血小板的α颗粒中。
在实施方案中，所述化合物被负载至所述血小板中的第一α颗粒中，并且所述至少第二化合物被负载至所述血小板中的至少第二α颗粒中。
在实施方案中，所述化合物和所述至少第二化合物两者均被负载至同一α颗粒中。
本公开的又一方面是一种药物组合物，所述药物组合物包含含有任何本文公开的化合物的至少一个拷贝的分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含含有任何本文公开的第一化合物的至少一个拷贝的分离的血小板、任何本文公开的第二化合物的至少一个拷贝和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含第一分离的血小板、至少第二分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。所述第一分离的血小板包含第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合所述血小板的α颗粒中的第一GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽。所述至少第二分离的血小板包含至少第二化合物，所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，其中所述至少第二多肽包含能够结合所述血小板的α颗粒中的至少第二GAG的至少第二GAG结合肽。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约1NNaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约2N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约3N NaCl时不结合至含CS的柱。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性、与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的带电氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少10个氨基酸。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含11个氨基酸。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述第一多肽和/或所述至少第二多肽分别由所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽组成。
在实施方案中，所述第一多肽和/或所述至少第二多肽的N端分别直接或间接地连接至所述第一剂和/或所述至少第二剂。在实施方案中，所述第一多肽和/或所述至少第二多肽的C端分别直接或间接地连接至所述第一剂和/或所述至少第二剂。在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂分别通过至少一个接头间接地连接至所述第一多肽和/或所述至少第二多肽。在实施方案中，所述至少一个接头包含一个或多个原子。在实施方案中，所述至少一个接头包含重复单元的聚合物。在实施方案中，所述至少一个接头包含氨基酸链。在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂分别直接连接至所述第一多肽和/或所述至少第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽。
在实施方案中，所述至少第二剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述至少第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂独立地选自有以下组成的组：抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)以及抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂包含抗体。在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂对哺乳动物细胞有害和/或对受试者有毒。
在实施方案中，当直接施用至受试者的血流中时，所述第一剂和/或所述至少第二剂易于降解。
在实施方案中，所述第一化合物和/或所述至少第二化合物还包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一多肽和所述至少第二多肽是不同的。在实施方案中，所述第一多肽和所述至少第二多肽是相同的。
在实施方案中，所述第一剂和所述至少第二剂是不同的。在实施方案中，所述第一剂和所述至少第二剂是相同的。
在实施方案中，所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板独立地选自合成的、同种异体的、自体的和经修饰的异源血小板。在实施方案中，所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板是自体血小板。在实施方案中，所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板是同种异体血小板。在实施方案中，所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板从富含血小板的血浆获得。
在实施方案中，所述第一分离的血小板包含所述第一化合物的1至1000个拷贝。在实施方案中，所述至少第二分离的血小板包含所述至少第二化合物的1至1000个拷贝。在实施方案中，所述第一化合物和/或所述至少第二化合物的1至1000个拷贝被负载至所述血小板的α颗粒中。
本公开的一个方面是任何本文公开的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
本公开的另一个方面是任何本文公开的药物组合物在制造用于治疗疾病或病症的药剂中的用途。在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
本公开的又一方面是一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何本文公开的药物组合物的步骤。
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物的步骤，其中所述药物组合物包含任何本文公开的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用第二药物组合物的步骤，所述第二药物组合物包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
在实施方案中，所述第二药物组合物促进化合物从血小板释放。
在实施方案中，在施用所述药物组合物之后施用所述第二药物组合物。在实施方案中，在施用所述第二药物组合物之前施用所述药物组合物至少两次。
在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在实施方案中，所述疾病或病症是损伤。在实施方案中，所述疾病或病症是炎症。在实施方案中，所述疾病或病症是植入物、移植物、支架或假体的副作用。在实施方案中，所述疾病或病症由缺陷型基因引起。
在另一个方面，本公开提供了一种用于制造经负载的血小板的方法。所述方法包括以下步骤：获得血小板；使所述血小板在体外或离体与任何本文公开的化合物接触；以及使所述血小板与所述化合物之间的接触进行直到所述化合物被所述血小板的α颗粒内化，从而产生经负载的血小板。
在实施方案中，所述方法还包括使所述血小板在体外或离体与至少第二化合物接触的步骤，其中所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，并且所述至少第二多肽包含能够结合血小板的α颗粒中的GAG的至少第二糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及使所述血小板与所述至少第二化合物之间的接触进行直到所述至少第二化合物被所述血小板的α颗粒内化的步骤。
在实施方案中，使所述血小板在体外或离体与所述化合物接触的步骤和使所述血小板在体外或离体与所述至少第二化合物接触的步骤是依序的。在实施方案中，使所述血小板在体外或离体与所述化合物接触的步骤和使所述血小板在体外或离体与所述至少第二化合物接触的步骤是同时发生的。
本公开的一个方面是一种用于治疗疾病或病症的药盒。所述药盒包括任何本文公开的分离的血小板和使用说明书。
本公开的另一方面是一种用于治疗疾病或病症的药盒。所述药盒包括任何本文公开的药物组合物和使用说明书。
在实施方案中，所述药盒还包括至少第二药物组合物，所述第二药物组合物包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
本公开的又一方面是一种用于制造经负载的血小板的药盒。所述药盒包括任何本文公开的化合物和使用说明书。
本文公开的任何方面或实施方案可与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述和附图(在本文中也为“图(figure)”和“图(FIG.)”)获得对本公开的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施方案中利用本发明的原理，其中：
图1A和图1B是示出说明性糖胺聚糖(GAG)结合肽将附接的货物螯合(sequester)至血小板中的能力的图。
图2A是免疫荧光图像，并且图2B是展示说明性糖胺聚糖(GAG)结合肽将附接的货物螯合至血小板的α颗粒中的能力的图。
图3A是描绘等温滴定量热法(ITC)实验的示意图。滴定至含有说明性GAG结合肽的池(cell)中的硫酸软骨素A(CSA)的ITC解离动力学的图形表示显示在图3B(对于SEQ IDNO:1的GAG结合肽)、图3C(对于SEQ ID NO:2的GAG结合肽)和图3D(对于无电荷配体)中。图3B的数据列于图3E中，并且图3C的数据列于图3F中。
图4示出尽管在与硫酸乙酰肝素(HS)结合时的先前图中的三种说明性GAG结合肽的亲和色谱数据。
图5是展示包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的说明性化合物负载至血小板中的图。
图6A是免疫荧光图像，并且图6B是展示包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的说明性化合物负载至血小板的α颗粒中的能力的图。
图7A至图7C包括滴定至池中的硫酸软骨素A(CSA)的ITC解离动力学的图形表示，所述池含有包含PAL1的说明性化合物(图7A)、包含PAL2的说明性化合物(图7B)和包含CFL的对照化合物(图7C)。图7A的数据列于图7D中，图7B的数据列于图7E中，并且图7C的数据列于图7F中。
图8示出尽管在与硫酸乙酰肝素(HS)结合时的先前图中的三种说明性化合物的亲和色谱数据。
图9A包括滴定至含有另外的说明性化合物的池中的硫酸软骨素A(CSA)的ITC解离动力学的图形表示。这些另外的说明性化合物被标识为PAL1A至PAL11A，并且分别包含具有SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:13的氨基酸序列的GAG结合肽。图9A的数据列于图9B至图9L中。图9M是描绘另外的说明性化合物和阴性对照化合物的平均解离常数的图。
图10A是示出当形成本公开的化合物时将GAG结合肽缀合至剂的说明性步骤的图。图10B是免疫荧光图像，并且图10C是展示包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的说明性化合物负载至血小板的α颗粒中的能力的图。
具体实施方式
本发明部分地基于产生负载有向损伤、病理性炎症和/或血管生成部位提供定向治疗剂的剂的血小板。鳌合在血小板(例如血小板α颗粒)内的此类剂通常被保护免受降解，降解可在全身施用时发生。这种益处，与血小板归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位的天然能力结合，有助于确保将治疗有效量的剂递送至靶部位。另外，可用于本发明中的血小板可负载多种不同的剂；所述不同的剂可以空间和时间受控的方式从α颗粒中释放。因此，本发明向损伤部位(例如，用于治疗慢性伤口)、病理性炎症部位(例如，用于治疗关节或肺损伤)和/或血管生成部位(例如，用于治疗癌症)提供定向和受控治疗剂。
在本发明之前，剂可通过锚定至α颗粒中的特定糖胺聚糖(GAG)而被内化至血小板中并且可使用特定GAG结合肽来促进内化过程是违反直觉的。实际上，以前没有已知的方法用于将剂负载至血小板α颗粒中。此外，不知道α颗粒的亚群可负载不同的剂，从而允许不同剂的空间和/或时间受控释放。这种受控释放允许不同剂的顺序递送，这可产生在同时施用不同剂时可能观察不到的协同治疗效果。
本发明提供了许多益处，包括但不限于：
(1)将剂靶向递送至原发性肿瘤或转移生长部位，这避免了对高剂量的剂的全身施用的需要；因此，需要较低剂量的剂来在靶部位实现所述剂的治疗有效浓度；
(2)鳌合在血小板α颗粒中的剂不能结合脱靶受体；因此，避免了与单独全身施用所述剂相关的副作用(例如毒性)；和
(3)鳌合在血小板α颗粒中的剂被保护免受自然过程(例如组织蛋白酶)降解；因此，所述剂的半衰期相对于在单独全身施用所述剂时延长。
血小板、血小板颗粒和糖胺聚糖
本发明提供用于治疗疾病、病症或损伤的化合物、药物组合物和方法，其中血小板是天然的第一响应者，并且其中血小板至少改善所述疾病、病症或损伤的初始症状。说明性的疾病、病症或损伤包括但不限于癌症、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、肥胖症、动脉粥样硬化、缺血性心脏病和肢体疾病、溃疡性结肠炎、中风、烧伤和其他伤口。在生理条件下，循环中血小板维持组织的健康和稳定。
关于血小板在伤口和肿瘤微环境中的作用的新信息已经出现；参见例如，Klement等人,“Platelets actively sequester angiogenesis regulators”,Blood.2009；113:2835-42和Klement等人,“The Role of Platelets in Angiogenesis.In:Michelson A,editor.Platelets.第三版Philadelphia,PA:Mosby Elsevier；2013.第487-503页。然而，对血小板/组织相互作用的复杂性以及血小板在调节组织生长和血管生成中的作用的理解进展缓慢。众所周知，血小板含有不同类型的颗粒，包括α颗粒、致密颗粒和溶酶体，它们执行不同的功能。通常含有生长因子的α颗粒是最普遍的颗粒类型。参见，Blair和Flaumenhaft,“Platelet alpha-granules:basic biology and clinical correlates”.Blood Reviews.2009,23(4):177–89以及Harrison和Cramer,“Platelet alpha-granules”.Blood Reviews.1993,7(1):52–62。通常，α颗粒的货物主要包含血管生成的抑制剂。参见例如，Peterson等人,“Normal ranges of angiogenesis regulatory proteinsin human plate-lets.”American journal of hematology.2010；85:487-93。然而，当受试者患有癌症时，血小板货物发生变化，并且α颗粒变得主要负载有刺激剂；参见Peterson等人,American journal of hematology.2010；85:487-93和Peterson等人,“VEGF,PF4and PDGF are elevated in platelets of colorectal cancer patients.”Angiogenesis.2012；15:265-73。
本发明部分地基于以下发现：货物可负载在α颗粒中并且这种负载不是受体介导的。相反，货物负载至血小板中、并且特别是负载至它们的α颗粒中依赖于与血小板的α颗粒中的糖胺聚糖(GAG)的结合。当血小板与非特异性GAG抑制剂(即Surfen)接触时，减少量的货物负载至血小板中。
本发明进一步部分地基于以下发现：血小板的货物是按功能组构的，其中血管生成的刺激剂和抑制剂被吸收到血小板α颗粒的不同亚群中；这种区别是基于货物与硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素的结合亲和力。此外，P-选择蛋白限定的α颗粒亚群吸引对GAG具有较弱亲和力(即较高Kd)的GAG结合化合物，而冯维勒布兰德因子(VWF)限定的α颗粒亚群包含与硫酸软骨素具有强亲和力(即较高Kd)相互作用的蛋白质。
此外，本发明部分地基于出人意料的发现，即α颗粒的货物在聚集和凝结时不会被大量释放。相反，血管生成生长刺激剂或抑制剂响应于特定刺激如凝血酶的局部水平以空间和时间受控的方式释放。为此，用P-选择蛋白标记的α颗粒的早期反应亚群在血管损伤(例如，低凝血酶条件)后和PAR1(高亲和力凝血酶受体)接合时立即释放其内容物；相比之下，用Vwf因子标记的α颗粒的晚期反应亚群在被PAR4(即低亲和力凝血酶受体)接合时释放其内容物。
因此，本发明利用血小板的天然能力来靶向血管内皮层中的裂口。在癌症的情况下，这允许将血小板的货物递送至肿瘤部位。重要的是，根据本公开，血小板的α颗粒预先负载有剂，并且这种剂以特异性递送至在肿瘤部位形成的临时基质。因此，本发明提供了由组织蛋白酶以细致的时间和空间受控的酶促作用从临时基质释放的血小板相关剂。
血小板中存在两种主要GAG：硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素。
硫酸乙酰肝素(HS)是与葡萄糖胺1→4连接的糖醛酸的线性共聚物，但具有高度可变的结构。D-葡萄糖醛酸在HS中占主导地位，尽管可存在大量的l-艾杜糖醛酸。与肝素相比，HS在磺基中的取代率要低得多。
肝素是高度异质的线性多分散多糖，由1→4-连接的吡喃糖醛酸和2-氨基-2-脱氧吡喃葡萄糖(葡糖胺)残基的重复单元组成。糖醛酸残基通常由90％的l-吡喃艾杜糖醛酸(l-艾杜糖醛酸)和10％的d-吡喃葡萄糖醛酸(d-葡萄糖醛酸)组成。葡糖胺残基的氨基可被乙酰基或磺基取代或未取代。葡糖胺残基的3位和6位可被O-磺基取代或未取代。糖醛酸，其可以是l-艾杜糖醛酸或d-葡萄糖醛酸，也可含有2-O-磺基
大多数肝素结合蛋白结合肝素和硫酸乙酰肝素两者。两者均是具有异质糖序列的多分散多糖，其可将大量蛋白质与多种可能的结合位点结合。肝素主要存在于细胞内，而HS蛋白聚糖(HSPG)定位于许多细胞表面并例如通过使生长因子和蛋白质配体稳定而有助于细胞外基质(ECM)的功能。
硫酸软骨素(CS)是以下重复二糖单元的随机序列的线性聚合物：2-乙酰氨基-2-脱氧-4-0-硫酸盐-3-0-～-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖；2-乙酰氨基-2-脱氧-6-0-硫酸盐-3-0-～-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖；2-乙酰氨基-2-脱氧-4,6-0-二硫酸盐-3-0-～-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖；和2-乙酰氨基-2-脱氧-6-0-硫酸盐-3-0-～-2'-0-硫酸盐-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖。每个单硫酸化二糖单元具有500-600g/mol的分子量，并且其总重量是5-50kDa。硫酸软骨素分子在溶液中的体积比在脱水固体中大得多，因为它具有大量负电荷；在溶液中，可变分支上的负电荷相互排斥并迫使分子进入延伸构象。因此，CS分子上存在许多配体结合位点。
新的非天然GAG结合肽可用于本公开的化合物和方法中，因为它们对于将货物负载至血小板的α颗粒中是必不可少的。本公开的GAG结合肽与剂化学或酶促连接(直接或间接)或遗传表达以产生含有所述剂和结合肽的融合蛋白。GAG结合肽和偶联剂在新的化合物或融合产物中保留其功能。因此，新的化合物或融合产物能够选择性地负载至血小板的α颗粒中。
糖胺聚糖(GAG)结合肽
本公开的糖胺聚糖(GAG)结合肽的特征在于存在带正电荷的碱性氨基酸，所述带正电荷的碱性氨基酸与GAG链上空间上限定的带负电荷的磺基或羧基形成离子对。例如，硫酸乙酰肝素(HS)具有由磺基和羧基提供的每个二糖平均两个负电荷；因此，HS与蛋白质之间最常见类型的相互作用是离子相互作用，尽管其他一些非静电相互作用如氢键合和疏水相互作用也可有助于复合物的稳定性。据信GAG的高阴离子性质导致非特异性结合。然而，在血小板的α颗粒中，GAG结合肽与特定α颗粒亚群中的HS或硫酸软骨素(CS)的结合以高特异性发生。通过匹配GAG结合亲和力和GAG结合肽可促进这种相互作用。GAG肽相互作用部分取决于沿聚合物中的多糖序列的磺基和羧基的限定模式和取向，以及GAG结合肽中碱性氨基酸的正确模式，以确保复合物的适当亲和力和特异性。
静电相互作用在GAG肽相互作用中起主要作用，并且GAG结合肽的结合序列内诸如精氨酸和赖氨酸的碱性氨基酸的位置是相关的。已经进行了许多研究以确定在GAG结合位点中是否存在以特定方式排列的碱性氨基酸的共有序列。例如，对来自四种蛋白质(载脂蛋白B、载脂蛋白E、玻连蛋白和血小板因子4)的肝素结合位点的比较表明，这些区域的特征在于两个氨基酸共有序列：XBBXBX和XBBBXXBX，其中B是碱性残基并且X是亲水性残基。分子建模研究表明，以β链构象建模的序列XBBXBX将碱性氨基酸定向在β链的一个面上，而亲水性残基则指向蛋白质核心。类似地，当序列XBBBXXBX折叠成α-螺旋时，碱性氨基酸展示在螺旋的一侧上。虽然一些肝素结合蛋白包含这种共有序列，但一些不包括。因此，其中碱性残基在空间上接近但在一级氨基酸序列中不一定接近的结构基序也可结合肝素。
肝素结合位点通常含有一个、两个或三个碱性氨基酸簇(XBnX，其中n＝1、2或3)。在天然蛋白质中观察到此类簇的具有一个或两个非碱性残基(BXmB，其中m＝1或2)的间距；这与肝素结合蛋白通常在生物系统中结合HS的观察结果一致。因为HS的电荷密度较低，所以最佳蛋白质结合可涉及间隔的碱性氨基酸簇。精氨酸和赖氨酸是肝素和HS结合蛋白中最常见的残基。尽管两种氨基酸在生理pH下均具有正电荷，但精氨酸约2.5倍更紧密地结合肝素。精氨酸与磺基形成更稳定的氢键以及更强的静电相互作用。非碱性残基也可在肝素-蛋白质相互作用中起重要作用。其中，已发现丝氨酸和甘氨酸是肝素结合肽中最常见的非碱性残基。两者均具有小的侧链，从而为肽与GAG的相互作用提供最小的空间约束和良好的柔性。
本发明部分地基于一种新的、非天然的糖胺聚糖(GAG)结合肽。本公开的GAG结合肽能够结合血小板α颗粒中的GAG。在实施方案中，GAG结合肽通过静电相互作用结合GAG。
在实施方案中，GAG结合肽结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至CS。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
在实施方案中，所述GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约1N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约2N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约3N NaCl时不结合至含CS的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
说明性GAG结合肽包含以下氨基酸序列之一：ERRIWFPYRRF(SEQ ID NO:1)；RFRWPYRIREF(SEQ ID NO:2)；ARRIWFPYRRF(SEQ ID NO:3)；EARIWFPYRRF(SEQ ID NO:4)；ERAIWFPYRRF(SEQ ID NO:5)；ERRAWFPYRRF(SEQ ID NO:6)；ERRIAFPYRRF(SEQ ID NO:7)；ERRIWAPYRRF(SEQ ID NO:8)；ERRIWFAYRRF(SEQ ID NO:9)；ERRIWFPARRF(SEQ ID NO:10)；ERRIWFPYARF(SEQ ID NO:11)；ERRIWFPYRAF(SEQ ID NO:12)；和ERRIWFPYRRA(SEQ ID NO:13)。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性、与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
不希望受制于理论，似乎碱性残基(例如，精氨酸)在定义GAG结合肽的性质方面是重要的，并且亲水性残基提供稳定化。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7或位置9的带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。作为实例，GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4和位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置7的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4以及位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；以及它们之间的任何组合。GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的精氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的异亮氨酸；GAG-结合肽可包含位置1的脯氨酸，以及位置4、位置7和位置9的精氨酸；GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸、位置4和位置7的精氨酸以及位置9的异亮氨酸；GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸、位置4的精氨酸和位置9的异亮氨酸；或者GAG结合肽可包含位置4的精氨酸和位置9的脯氨酸。在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸的任何组合都涵盖于本公开中。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少10个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽包含11个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
本发明提供了通过产生变体GAG结合肽，例如通过在本文公开的GAG结合肽的氨基酸序列中包含缺失、突变、插入或翻译后修饰来优化GAG结合肽的方法。
变体可在一个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在两个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在三个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在四个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在五个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
变体可在多于五个氨基酸位置不同于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13的GAG结合肽，只要变体GAG结合肽保留其功能即可。
在实施方案中，氨基酸差异可包括保守性和/或非保守性取代。“保守性取代”可例如基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。20种天然存在的氨基酸可分为以下六个标准氨基酸组：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；Asn、Gln；(3)酸性：Asp，Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。如本文所用，“保守性取代”定义为氨基酸被上面所示六个标准氨基酸组中的同一组中列出的另一种氨基酸交换。例如，Asp被Glu交换在这样修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，基于甘氨酸和脯氨酸破坏α-螺旋的能力，它们可彼此取代。如本文所用，“非保守性取代”定义为氨基酸被上面所示六个标准氨基酸组(1)至(6)中的不同组中列出的另一种氨基酸交换。可通过包括诸如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化的化学改变来修饰GAG结合肽。
因此，本公开提供了用于表征和优化(例如，增加亲和力)针对各种糖胺聚糖的GAG结合肽的方法。本公开所提供的优化的GAG结合肽可针对存在于血小板α颗粒中的糖胺聚糖。存在于血小板α颗粒中的说明性糖胺聚糖包括硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和GPIIb/IIIa。任何优化的GAG结合肽都可包含在本公开的组合物中；可将任何组合物负载至血小板中，例如，用于包含在药物组合物中和/或用于治疗疾病或病症。
化合物和剂
如本文所公开，血小板可选择性地且主动地(即，针对浓度梯度)鳌合血管生成、生长和炎症调控蛋白。本公开是基于以下发现：蛋白质被血小板吸收并基于它们对糖胺聚糖(GAG)的亲和力分离成α颗粒亚群：主要是硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸软骨素(CS)。这些GAG的长的线性、带负电荷的链不仅为α颗粒提供结构支持，而且解释α颗粒的功能亚群。血小板中存在的两种主要GAG(即HS和CS)的不同之处主要在于各个链中发现的二糖的数量。硫酸乙酰肝素较小(15-30个二糖/侧链)，而硫酸软骨素具有许多结合位点并且具有多达250个二糖/侧链。两者均不同于大的刚性的GAG，如透明质酸盐(高达50,000个双糖/GAG侧链)，其作用是维持软骨和骨骼的结构和完整性。血小板中GAG的多样性对其功能至关重要，其中硫酸乙酰肝素的侧链较短且结合较弱，从而允许P-选择蛋白颗粒的早期释放；然而，更紧密、更长的链结合允许vWF颗粒的延迟释放。这些特征在本发明中被用于化合物的顺序释放。
本发明包括新的、非天然存在的血小板锚定糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽至少以非常高的亲和力结合CS并且至少以中等亲和力结合HS。当与本公开的化合物中的剂连接时，GAG结合肽促进所述剂“负载”至血小板的α颗粒中。由于血小板持续循环并粘附至异常内皮的部位，所以本公开的化合物可广泛适用于多种病理性疾患。
本公开的一个方面是包含第一剂和第一多肽的化合物。所述第一多肽包含糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽能够结合血小板的α颗粒中的GAG。
在实施方案中，GAG结合肽结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至CS。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
在实施方案中，所述GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约1N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约2N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约3N NaCl时不结合至含CS的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性、与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7或位置9的带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。作为实例，GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4和位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置7的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4以及位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；以及它们之间的任何组合。GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的精氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的异亮氨酸；GAG-结合肽可包含位置1的脯氨酸，以及位置4、位置7和位置9的精氨酸；GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸、位置4和位置7的精氨酸以及位置9的异亮氨酸；GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸、位置4的精氨酸和位置9的异亮氨酸；或者GAG结合肽可包含位置4的精氨酸和位置9的脯氨酸。在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸的任何组合都涵盖于本公开中。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少10个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽包含11个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述第一多肽由GAG结合肽组成。可替代地，所述第一多肽包含除GAG结合肽以外的氨基酸；在一些实施方案中，所述多肽中的额外氨基酸不会增加GAG结合肽对GAG的亲和力。
在实施方案中，所述第一多肽的N端直接或间接地连接至第一剂。在实施方案中，所述第一多肽的C端直接或间接地连接至第一剂。在实施方案中，所述第一剂通过至少一个接头间接地连接至第一多肽。在实施方案中，所述至少一个接头包含一个或多个原子。在实施方案中，所述至少一个接头包含重复单元的聚合物。在实施方案中，所述至少一个接头包含氨基酸链。
在任何本文公开的方面或实施方案中，剂和GAG结合肽可直接连接，或者它们可通过称为接头的部分连接。接头是指包含将剂共价连接至GAG结合肽的共价键或原子链的化学部分。接头包括二价基团如亚烷基、亚芳基、杂亚芳基，部分如：—(CR2)nO(CR2)n—，烷氧基的重复单元的聚合物(例如，聚亚乙基氧基、聚乙二醇(PEG)、聚亚甲基氧基)和烷基氨基的重复单元的聚合物(例如，聚亚乙基氨基、JeffamineTM)；以及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。在实施方案中，接头包含氨基酸链。在实施方案中，氨基酸链接头小于约500个氨基酸长、约450个氨基酸长、约400个氨基酸长、约350个氨基酸长、约300个氨基酸长、约250个氨基酸长、约200个氨基酸长、约150个氨基酸长或约100个氨基酸长。例如，氨基酸链接头的长度可小于约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2个氨基酸。在实施方案中，氨基酸链接头介于约15个氨基酸与约3个氨基酸之间，例如介于约10与5个氨基酸之间。
在实施方案中，所述第一剂直接连接至所述第一多肽。
在实施方案中，所述第一剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽。
在实施方案中，所述第一剂包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。在实施方案中，所述第一剂包含抗体。在实施方案中，所述第一剂包含荧光部分。
可用于本发明中的说明性抗体(或其片段)包括3F8、8H9、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿比妥珠单抗(Abituzumab)、阿泽奇单抗(Abrezekimab)、阿利鲁单抗(Abrilumab)、阿克托舒单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿度努单抗(Aducanumab)、阿法库单抗(Afasevikumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、培化阿赛珠单抗(Alacizumab pegol)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)、马安那莫单抗(Anatumomab mafenatox)、安德利昔单抗(Andecaliximab)、雷星-阿奈妥单抗(Anetumab ravtansine)、阿尼鲁单抗(Anifrolumab)、安芦珠单抗(Anrukinzumab)(IMA-638)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、伊汀-阿普卢妥单抗(Aprutumab ixadotin)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿伐苏单抗(Ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、Atidortoxumab、阿替奴单抗(Atinumab)、阿托木单抗(Atorolimumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、阿妥昔珠单抗维多汀(Azintuxizumab vedotin)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、BCD-100、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝戈罗单抗(Begelomab)、贝兰他单抗莫福汀(Belantamab 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140、奎利珠单抗(Quilizumab)、雷妥莫单抗(Racotumomab)、雷曲妥单抗(Radretumab)、雷非韦卢单抗(Rafivirumab)、雷泮赛珠单抗(Ralpancizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷奈维单抗(Ranevetmab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、Ravagalimab、雷夫利珠单抗(Ravulizumab)、雷昔巴库单抗(Raxibacumab)、瑞法奈珠单抗(Refanezumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、Relatlimab、壬托鲁单抗(Remtolumab)、瑞司利珠单抗(Reslizumab)、瑞洛妥木单抗(Rilotumumab)、利努苏单抗(Rinucumab)、利散吉珠单抗(Risankizumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、培戈-利伐巴珠单抗(Rivabazumabpegol)、Rmab、洛巴妥木单抗(Robatumumab)、罗来度单抗(Roledumab)、若奇单抗(Romilkimab)、洛莫索珠单抗(Romosozumab)、隆他利珠单抗(Rontalizumab)、洛曼妥珠单抗(Rosmantuzumab)、特司林-洛伐妥珠单抗(Rovalpituzumab tesirine)、洛维利珠单抗(Rovelizumab)、洛利昔珠单抗(Rozanolixizumab)、卢普利珠单抗(Ruplizumab)、SA237、戈维替康-沙西妥珠单抗(Sacituzumab govitecan)、萨玛利珠单抗(Samalizumab)、维汀-沙马妥单抗(Samrotamab vedotin)、萨瑞鲁单抗(Sarilumab)、萨特利珠单抗(Satralizumab)、沙妥莫单抗喷他肽(Satumomab pendetide)、苏金单抗(Secukinumab)、塞鲁单抗(Selicrelumab)、瑟瑞妥单抗(Seribantumab)、瑟托萨昔单抗(Setoxaximab)、Setrusumab、司韦单抗(Sevirumab)、SGN-CD19A、SHP647、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、辛妥珠单抗(Simtuzumab)、西普利珠单抗(Siplizumab)、维汀-斯妥尤单抗(Sirtratumab vedotin)、司卢库单抗(Sirukumab)、维汀-索非妥珠单抗(Sofituzumab vedotin)、索拉奈珠单抗(Solanezumab)、索利托单抗(Solitomab)、索尼普西珠单抗(Sonepcizumab)、索土珠单抗(Sontuzumab)、Spartalizumab、司达鲁单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、舒他伏单抗(Suptavumab)、苏替莫单抗(Sutimlimab)、苏韦珠单抗(Suvizumab)、苏托舒单抗(Suvratoxumab)、他巴鲁单抗(Tabalumab)、他珠单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(Tadocizumab)、塔妥珠单抗(Talacotuzumab)、他利珠单抗(Talizumab)、坦妥维单抗(Tamtuvetmab)、他奈珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、他瑞妥单抗(Tarextumab)、他利昔珠单抗(Tavolimab)、特非巴珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、维汀-特立妥珠单抗(Telisotuzumab vedotin)、特那妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、特普利珠单抗(Teplizumab)、Tepoditamab、特普妥木单抗(Teprotumumab)、特度鲁单抗(Tesidolumab)、替妥罗单抗(Tetulomab)、特折鲁单抗(Tezepelumab)、TGN1412、替布利珠单抗(Tibulizumab)、替加妥珠单抗(Tigatuzumab)、替曲吉珠单抗(Tildrakizumab)、替米妥珠单抗(Timigutuzumab)、替莫鲁单抗(Timolumab)、Tiragotumab、替雷利珠单抗(Tislelizumab)、维汀-替索妥单抗(Tisotumab vedotin)、TNX-650、托珠单抗(Tocilizumab)、托木妥昔单抗(Tomuzotuximab)、托雷利珠单抗(Toralizumab)、托萨托舒单抗(Tosatoxumab)、托西莫单抗(Tositumomab)和131I-托西莫单抗、托维妥单抗(Tovetumab)、曲洛吉努单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、恩星-曲妥珠单抗(Trastuzumabemtansine)、TRBS07、曲加利珠单抗(Tregalizumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、曲戈卢单抗(Trevogrumab)、图考珠单抗西莫白介素(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌利妥昔单抗(Ublituximab)、乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、乌托鲁单抗(Utomilumab)、他立林-伐达妥昔单抗(Vadastuximab talirine)、Vanalimab、维汀-万多妥珠单抗(Vandortuzumab vedotin)、万替妥单抗(Vantictumab)、伐努赛珠单抗(Vanucizumab)、伐帕利昔单抗(Vapaliximab)、伐利苏单抗(Varisacumab)、伐立鲁单抗(Varlilumab)、伐特利珠单抗(Vatelizumab)、维多利珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕利莫单抗(Vepalimomab)、维森苏单抗(Vesencumab)、威司利珠单抗(Visilizumab)、沃巴利珠单抗(Vobarilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、珀伽利珠单抗(Vonlerolizumab)、Vopratelimab、玛汀-沃瑟妥珠单抗(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥莫单抗(Votumumab)、伏那吉珠单抗(Vunakizumab)、珍妥珠单抗(Xentuzumab)、XMAB-5574、扎鲁妥木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、泽妥珠单抗(Zenocutuzumab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)、Zolbetuximab(IMAB362、(Claudiximab))以及阿托-佐利莫单抗(Zolimomab aritox)。
已经达到或正在等待监管批准并且可用于本发明中的示例性抗体(或其片段)包括莫罗单抗-CD3(ORTHOCLONE OKT3)、依法利珠单抗(RAPTIVA)、托西莫单抗-I131(BEXXAR)、奈巴库单抗(CENTOXIN)、依决洛单抗(PANOREX)、卡妥索单抗(REMOVAB)、达利珠单抗(ZINBRYTA；ZENAPAX)、阿昔单抗(REOPRO)、利妥昔单抗(MABTHERA，RITUXAN)、巴利昔单抗(SIMULECT)、帕利珠单抗(SYNAGIS)、英夫利昔单抗(REMICADE)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、阿达木单抗(HUMIRA)、替伊莫单抗(ZEVALIN)、奥马珠单抗(XOLAIR)、西妥昔单抗(ERBITUX)、贝伐单抗(AVASTIN)、那他利珠单抗(TYSABRI)、帕尼单抗(VECTIBIX)、雷珠单抗(LUCENTIS)、依库利珠单抗(SOLIRIS)、培化塞妥珠单抗(CIMZIA)、乌司奴单抗(STELARA)、卡那单抗(ILARIS)、戈利木单抗(SIMPONI)、奥法木单抗(ARZERRA)、托珠单抗(ROACTEMRA，ACTEMRA)、地诺单抗(PROLIA)、贝利木单抗(BENLYSTA)、伊匹单抗(YERVOY)、维汀-本妥昔单抗(ADCETRIS)、帕妥珠单抗(PERJETA)、阿多-曲妥珠单抗恩他新(KADCYLA)、雷昔巴库单抗)、奥比妥珠单抗(GAZYVA，GAZYVARO)、司妥昔单抗(SYLVANT)、雷莫芦单抗(CYRAMZA)、维多利珠单抗(ENTYVIO)、纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、博纳吐单抗(BLINCYTO)、阿仑单抗(LEMTRADA；MABCAMPATH，CAMPATH-1H)、依沃苏单抗(REPATHA)、依达赛珠单抗(PRAXBIND)、耐昔妥珠单抗(PORTRAZZA)、地努妥昔单抗(UNITUXIN)、苏金单抗(COSENTYX)、美泊利单抗(NUCALA)、阿利库单抗(PRALUENT)、达雷木单抗(DARZALEX)、埃罗妥珠单抗(EMPLICITI)、艾塞吉珠单抗(TALTZ)、瑞司利珠单抗(CINQAERO，CINQAIR)、奥拉妥单抗(LARTRUVO)、贝洛托单抗(ZINPLAVA)、阿特珠单抗(TECENTRIQ)、奥托萨昔单抗(ANTHIM)、布罗达单抗(SILIQ，LUMICEF)、度匹鲁单抗(DUPIXENT)、奥英妥珠单抗(BESPONSA)、古赛库单抗(TREMFYA)、萨瑞鲁单抗(KEVZARA)、阿维鲁单抗(BAVENCIO)、依米赛珠单抗(HEMLIBRA)、奥瑞利珠单抗(OCREVUS)、贝那利珠单抗(FASENRA)、德瓦鲁单抗(IMFINZI)、吉妥珠单抗奥佐米星(MYLOTARG)、厄瑞努单抗、厄瑞努单抗-aooe(AIMOVIG)、伽奈珠单抗、伽奈珠单抗-gnlm(EMGALITY)、布洛舒单抗、布洛舒单抗-twza(CRYSVITA)、拉那芦单抗、拉那芦单抗-flyo(TAKHZYRO)、莫加利珠单抗、莫加利珠单抗-kpkc(POTELIGEO)、替曲吉珠单抗；替曲吉珠单抗-asmn(ILUMYA)、瑞玛奈珠单抗、瑞玛奈珠单抗-vfrm(AJOVY)、雷夫利珠单抗、雷夫利珠单抗-cwvz(ULTOMIRIS)、西米普利单抗、西米普利单抗-rwlc(LIBTAYO)、艾巴利珠单抗、艾巴利珠单抗-uiyk(TROGARZO)、依玛鲁单抗、依玛鲁单抗-lzsg(GAMIFANT)、帕舒托-莫塞妥莫单抗、帕舒托-莫塞妥莫单抗-tdfk(LUMOXITI)、卡普赛珠单抗、卡普赛珠单抗-yhdp(CABLIVI)、利散吉珠单抗、利散吉珠单抗-rzaa(SKYRIZI)、维汀-珀拉妥珠单抗、维汀-珀拉妥珠单抗-piiq(POLIVY)、洛莫索珠单抗、洛莫索珠单抗-aqqg(EVENITY)、布罗鲁珠单抗、布罗鲁珠单抗-dbll(BEOVU)、立赞利珠单抗；立赞利珠单抗-tmca(ADAKVEO)、维汀-恩弗妥单抗、维汀-恩弗妥单抗-ejfv(PADCEV)、[fam-]德卢替康-曲妥珠单抗、fam-德卢替康-曲妥珠单抗-nxki(ENHERTU)、特普妥木单抗、特普妥木单抗-trbw(TEPEZZA)、依普奈珠单抗、依普奈珠单抗-jjmr(VYEPTI)、艾萨妥昔单抗、艾萨妥昔单抗-irfc(SARCLISA)、戈维替康-沙西妥珠单抗；戈维替康-沙西妥珠单抗-hziy(TRODELVY)、英比利珠单抗；英比利珠单抗-cdon(UPLIZNA)、萨特利珠单抗(ENSPRYNG)、多塔利单抗(TSR-042)、苏替莫单抗(BIVV009)、Leronlimab、纳索利单抗(Narsoplimab)、Tafasitamab、REGNEB3、Naxitamab、蒙托-奥珀妥珠单抗、贝兰他单抗莫福汀、马吉妥昔单抗、他奈珠单抗、特普利珠单抗、阿度努单抗、依维苏单抗、曲洛吉努单抗以及Omburtamab。
抗体的片段将包含至少上述抗体的抗原结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域或骆驼科动物VHH结构域，例如人scFv、人Fv、人Fab、人(Fab')2、人单结构域抗体(SDAB)或人VH或VL结构域或人源化scFv、人源化Fv、人源化Fab、人源化(Fab')2、人源化单结构域抗体(SDAB)或人源化VH或VL结构域。
可用于本发明中的说明性化学治疗剂包括2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、3’,4’-二脱氢-4’-脱氧-8’-去甲长春质碱、5-FU(氟尿嘧啶)、阿贝西尼、醋酸阿比特龙、阿比曲特(甲氨蝶呤)、白蛋白结合型紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡卢替尼(Acalabrutinib)、AC-T、ADE、阿霉素(多柔比星)、二马来酸阿法替尼、Afinitor(依维莫司)、Afinitor Difsperz(依维莫司)、Akynzeo(奈妥吡坦和帕洛诺司琼)、艾特乐(咪喹莫特)、阿地白介素、Alecensa(阿雷替尼)、阿雷替尼、爱宁达(培美曲塞)、Aliqopa(盐酸考泮利司)、爱克兰(美法仑)、阿乐喜(盐酸帕洛诺司琼)、六甲蜜胺、Alunbrig(布加替尼)、氯氨布西(苯丁酸氮芥)、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、脱水长春碱、阿瑞匹坦、阿可达(帕米膦酸盐)、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、阿伦恩(奈拉滨)、三氧化二砷、天冬酰胺酶菊欧文氏菌、奥瑞斯他汀、西罗来塞-阿卡他近(Axicabtagene Ciloleucel)、阿西替尼、阿扎胞苷、BEACOPP、卡氮芥(卡莫司汀)、Beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、Blenoxane(博来霉素)、BMS184476、硼替佐米、Bosulif(博舒替尼)、博舒替尼、布加替尼、BuMel、白消安、白舒非(白消安)C、卡巴他赛、Cabometyx(卡博替尼)、S-苹果酸卡博替尼、CAF、Calquence(阿卡卢替尼)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、Caprelsa(凡德他尼)、Carac(氟尿嘧啶-局部)、卡铂、卡铂-紫杉酚、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、康士得(比卡鲁胺)、恶病质素(Cachectin)、CeeNU(洛莫司汀)、CEM、西马多丁、色瑞替尼、Cerubidine(道诺霉素)、希瑞适(重组HPV二价疫苗)、CEV、瘤可宁、瘤可宁-泼尼松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、Clafen(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、科罗拉(氯法拉滨)、CMF、考比替尼、Cometriq(卡博替尼)、盐酸考泮利司、COPDAC、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(更生霉素)、Cotellic(考比替尼)、念珠藻素、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、阿糖孢苷、阿糖胞苷脂质体、赛德萨-U(阿糖孢苷)、癌得星(环磷酰胺)、癌得星(癌得星)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(地西他滨)、更生霉素、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、DaunoXome(道诺霉素脂质体复合物)、Decadron(地塞米松)、地西他滨、去纤苷酸钠、Defitelio(去纤苷酸钠)、地加瑞克、地尼白介素-毒素连接物、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、地塞米松浓缩口服液(地塞米松)、Dexpak Taperpak(地塞米松)、盐酸右雷佐生、Docefrez(多西他赛)、多西他赛、多西紫杉醇(Docetaxol)、尾海兔素、多烯紫杉醇(Doxetaxel)、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、Droxia(羟基脲)、DTIC(达卡巴嗪)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、Efudex(氟尿嘧啶—局部)、Eligard(亮丙瑞林Leuprolide)、埃立特(拉布立酶)、Ellence(Ellence(表阿霉素))、乐沙定(奥沙利铂)、Elspar(天冬酰胺酶)、艾曲波帕乙醇胺、Emcyt(雌莫司汀)、Emend(阿瑞匹坦)、甲磺酸依那德尼、恩扎鲁胺、盐酸表阿霉素、EPOCH、甲磺酸艾日布林、Erivedge(维莫德吉)、盐酸埃罗替尼、Erwinaze(天冬酰胺酶菊欧文氏菌)、Ethyol(氨磷汀)、凡毕复(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Eulexin(氟他胺)、Evacet(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、易维特(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Firmagon(地加瑞克)、非那雄胺、FloPred(泼尼松龙)、福达华(氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRINOX、FOLFOX、弗洛泰(普拉曲沙)、FUDR(FUDR(氟尿苷))、FU-LV、氟维司群、加德西(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、健择(吉西他滨)、吉泰瑞(二马来酸阿法替尼)、吉泰瑞(阿法替尼)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、克瘤灵(六甲蜜胺)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、Hycamtin(盐酸拓扑替康)、Hycamtin(拓扑替康)、Hydrea(羟基脲)、羟基脲、羟基脲紫杉烷、Hyper-CVAD、Ibrance(帕博西尼)、依鲁替尼、ICE、Iclusig(帕纳替尼)、Idamycin PFS(伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯、Idhifa(依那德尼)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼)、咪喹莫特、Imlygic(拉他莫金冻干混悬剂)、Inlyta(阿西替尼)、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸伊立替康、盐酸伊立替康脂质体、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、柠檬酸艾沙佐米、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼)、Jakafi(鲁索替尼)、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Keoxifene(盐酸雷洛西芬)、Kepivance(帕利夫明)、Kisqali(瑞博西尼)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、Lanvima(乐伐替尼)、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、瘤可宁(苯丁酸氮芥)、Leukine(沙格司亭)、醋酸亮丙瑞林、Leustatin(克拉屈滨)、Levulan(氨基乙酰丙酸)、利阿唑、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸阿霉素脂质体)、洛莫司汀、氯尼达明、Lonsurf(曲氟尿苷和地匹福林)、利普安(亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕尼)、Lysodren(米托坦)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Marqibo药盒(长春新碱脂质体复合物)、甲基苄肼(丙卡巴肼)、盐酸氮芥、梅格施(甲地孕酮)、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、Mesnex(美司钠)、Metastron(氯化锶-89)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴化甲基纳曲酮、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、米伏布林羟乙基磺酸盐、MOPP、Mostarina(泼尼莫司汀)、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(氮芥)、Mutamycin(丝裂霉素)、马勒兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、纳米颗粒紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定化的纳米颗粒制剂)、诺维苯(长春瑞滨)、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸来那替尼、Nerlynx(来那替尼)、盐酸奈普坦和帕洛诺司琼、Neulasta(非格司亭)、Neulasta(培非格司亭)、优保津(非格司亭)、Nexavar(索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼罗替尼、尼鲁米特、Ninlaro(艾沙佐米)、Nipent(喷司他丁)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、(N,n-二甲基-l-缬氨酰-l-缬氨酰-n-甲基-l-缬氨酰-l-脯氨酰-1-l脯氨酸-t-丁酰胺)、诺瓦得士(他莫昔芬)、Novantrone(米托蒽醌)、Nplate(罗米司亭)、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、OFF、奥拉帕尼、高三尖杉酯碱、奥那司酮、Oncaspar(培门冬酶)、Oncovin(长春新碱)、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸伊立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素-毒素连接物)、Onxol(紫杉醇)、OPPA、Orapred(泼尼松龙)、奥希替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定化的纳米颗粒制剂、PAD、帕博西尼、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕比司他、Panretin(阿利维A酸)、Paraplat(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、Pediapred(泼尼松龙)、培门冬酶、培非格司亭、培美曲塞二钠、Platinol(顺铂)、PlatinolAQ(顺铂)、普乐沙福、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、普拉曲沙、泼尼氮芥、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素)、Promacta(艾曲波帕乙醇胺)、盐酸普萘洛尔、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、Reclast(唑来膦酸)、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、瑞戈非尼、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、根霉素、瑞博西尼、R-ICE、盐酸罗拉吡坦、罗米地辛、罗米司亭、Rpr109881、Rubex(阿霉素)、红比霉素(盐酸柔红霉素)、Rubraca(卢卡帕尼)、樟脑磺酸卢卡帕尼、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、善宁(奥曲肽)、善宁LAR储库(奥曲肽)、Sclerosol胸膜内气雾剂(滑石)、色替纳弗(Sertenef)、Soltamox(他莫苷芬)、索马杜林储库(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、Sterapred(泼尼松)、Sterapred DS(泼尼松)、无菌滑石粉末(滑石)、Steritalc(滑石)、Sterecyst(泼尼莫司汀)、Stivarga(瑞戈非尼)、磷酸雌莫司汀、链脲霉素、苹果酸舒尼替尼、Supprelin LA(组氨瑞林)、索坦(苹果酸舒尼替尼)、索坦(舒尼替尼)、Synribo(高三尖杉酯碱)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、TAC、Tafinlar(达拉菲尼)、Tagrisso(奥希替尼)、滑石、拉他莫金冻干混悬剂、柠檬酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖孢苷)、特罗凯(埃罗替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(达卡巴嗪)、Tasigna(尼罗替尼)、他索纳明、泰素(紫杉醇)、泰素帝(Docetaxel)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、西罗莫司、Tepadina(噻替派)、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、TheraCys BCG(BCG)、硫鸟嘌呤、Thioplex(噻替派)、噻替派、TICE BCG(BCG)、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶—局部)、Toposar(依托泊苷)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(西罗莫司)、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定、曲美替尼、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、Trelstar(曲普瑞林)、维甲酸、Trexall(甲氨蝶呤)、盐酸曲氟尿苷和地匹福林、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(拉帕替尼)、尿苷三乙酸酯、VAC、戊柔比星、Valstar(膀胱内戊柔比星)、Valstar(戊柔比星)、VAMP、凡德他尼、Vantas(组氨瑞林)、Varubi(罗拉吡坦)、VeIP、Velban(长春花碱)、万珂(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、威罗菲尼、Venclexta(维奈托克)、凡毕士(依托泊苷)、Verzenio(阿贝西尼)、Vesanoid(维甲酸)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、长春碱、Vincasar PFS(长春新碱)、Vincrex(长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、硫酸长春地辛、长春氟宁、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(尿苷三乙酸酯)、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(帕唑帕尼)、Vumon(替尼泊苷)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、W,Wellcovorin(亚叶酸钙)、Wellcovorin IV(亚叶酸)、Xalkori(克唑替尼)、XELIRI、希罗达(卡培他滨)、XELOX、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yescarta(西罗来塞-阿卡他近)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(Ziv-阿柏西普)、Zanosar(链脲菌素)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(尼拉帕尼)、Zelboraf(威罗菲尼)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Ziv-阿柏西普、枢复宁(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、择泰(唑来膦酸)、Zortress(依维莫司)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(色瑞替尼)、Zytiga(醋酸阿比特龙)以及Zytiga(阿比特龙)。化学治疗剂的其他实例可在VT Devita和S.Hellman(编辑)的Cancer Principles and Practice ofOncology,第6版(2001年2月15日),Lippincott Williams&Wilkins Publishers中找到，其内容以引用的方式整体并入本文。
在实施方案中，例如来自以上列表的化学治疗剂可作为剂包含在本公开的化合物中。可替代地或另外地，例如来自以上列表的化学治疗剂可与本公开的化合物结合使用，即在组合疗法中。作为实例，可向受试者施用负载有以下化合物中的一种或两种的血小板：包含作为剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物和包含作为剂的烟曲霉素的化合物，并且还施用化学治疗剂；这种组合可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。可向受试者施用负载有以下化合物中的一种或两种的血小板：包含作为剂的EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)的化合物和包含作为活性剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物，并且还施用化学治疗剂；这可用于治疗肺癌。此外，可向受试者施用负载有以下化合物中的一种或两种或所有三种的血小板：包含作为剂的EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)的化合物、包含作为剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物和包含作为剂的ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)的化合物，并且还施用化学治疗剂；这可用于治疗非小细胞肺癌。
可用于本发明中的说明性免疫检查点抑制剂包括A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD122、CD137、CD27、CD28、CD28、CD40、CTLA-4、GITR、ICOS、ICOS、IDO、KIR、KIR.、LAG3、NOX2、OX40、PD-1、SIGLEC7、SIGLEC9、TIM-3和VISTA的配体或受体的全长或片段。
可用于本发明中的说明性生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和血管生成素。
可用于本发明中的说明性生长抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、肿瘤抑素(tumstatin)、血小板反应蛋白-1(TSP1)、血小板因子4(PF4、CXCL4)和金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)。
可用于本发明中的说明性蛋白酶/蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)、凝血酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶和链激酶。
可用于本发明中的说明性凝血因子包括因子II(凝血酶)、抗凝血酶III(ATIII)、激肽释放酶、组织因子(TF)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII、因子XIII、纤维蛋白原、蛋白S、蛋白C、血栓调节蛋白、纤溶酶原和组织因子途径抑制剂(TFPI)。
可用于本发明中的说明性脂质或磷脂包括载脂蛋白E(ApoE)、血小板磷脂和鞘氨醇-1-磷酸(SIP)。
可用于本发明中的说明性细胞外基质蛋白包括整联蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、粘着斑蛋白(FAK)、纽蛋白(vinculin)、踝蛋白(talin)、肌动蛋白丝和胶原蛋白。
可用于本发明中的说明性激素包括胰岛素、类固醇(例如雌激素、孕酮和睾酮及其变体)、促红细胞生成素、血小板生成素和甲状腺激素。
可用于本发明中的说明性酶包括乙酰肝素酶或基质金属蛋白酶(MMP)。
可用于本发明中的说明性趋化因子/化学引诱物包括结缔组织生长因子(CTGF)、基质细胞源性因子-1(SDF-1)(CXCL12)、白细胞介素(IL1、2、6、8)和CD40配体(CD40L、CD154)。
可用于本发明中的说明性神经营养蛋白包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白4/5(NT-4/5)。
在实施方案中，剂选自以下非详尽列表，其包括各种类别的有用剂：3-4-(1-甲酰基哌嗪-4-基)-亚苄基-2-吲哚酮、阿巴西普、ABT-869、阿卡卢替尼、阿法替尼、阿法赛特、艾乐替尼、阿来西普、AMG 108、抗淋巴细胞免疫球蛋白(马)、抗胸腺细胞免疫球蛋白(兔)、阿普单抗、阿福他酶α(Asfotase alfa)、Asunercept、AVE9633、阿昔替尼、贝拉西普、贝伐单抗锆Zr-89、BIIB015、比伐单抗、博舒替尼、布加替尼、卡博替尼、卡奈替尼、卡马替尼、西地尼布、色瑞替尼、CR002、克瑞兰尼、克唑替尼、CT-011、达克替尼、达沙替尼、达妥昔单抗、多韦替尼、依屈肽、恩曲替尼、厄达替尼、埃罗替尼、依那西普、法米替尼、菲卓替尼、非拉司特、氟马替尼、弗瑞替尼、福他替尼、吉非替尼、格尔德霉素、染料木黄酮、吉特替尼、格来替尼、GMA-161、格瑞巴单抗(Gremubamab)、GS-5745、人巨细胞病毒免疫球蛋白、人免疫球蛋白G、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白、替伊莫单抗、依鲁替尼、埃克替尼、IGN311、伊马替尼、铟In-111沙妥莫单抗喷他肽、IPH 2101、拉贝妥珠单抗戈维替康、拉帕替尼、拉罗替尼(Larotrectinib)、Lecanemab、乐伐替尼、来他替尼、Lorukafuspα、米哚妥林、米妥昔单抗索他新、Mitazalimab、莫特塞尼、莫罗单抗、伊那图莫单抗、NAV 1800、来那替尼、尼罗替尼、尼达尼布、奥希替尼、帕利替尼、帕佐帕尼、PD173955、培达替尼、白皮杉醇、普纳替尼、根赤壳菌素、雷多替尼、瑞戈非尼、RI 624、特司林-洛伐妥珠单抗、Rozrolimupab、鲁索替尼、塞卡替尼、沙弗替尼、SB-1578、塞尔帕替尼、司美替尼、索拉非尼、舒尼替尼、Tafasitamab、坦度替尼、TB-402、锝Tc-99m阿西莫单抗、特伐替尼、TNX-901、托拉利单抗、托西莫单抗、德卢替康-曲妥珠单抗、妥卡替尼、他立林-伐达妥昔单抗、Valanafusp alfa、凡德他尼、伐他拉尼、威罗菲尼、VS-4718、XmAb 2513、XTL-001和佐贝妥昔单抗(Zolbetuximab)。
在实施方案中，所述剂是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)。
在实施方案中，所述剂是VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)。
在实施方案中，所述剂是PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)。
在实施方案中，所述剂是FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)。
在实施方案中，所述剂是多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)。
在实施方案中，所述剂是FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)。
在实施方案中，所述剂是凝血酶及其类似物。
在实施方案中，所述剂是CSF3R激动剂(例如，非格司亭)。
在实施方案中，所述剂是PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)。
在实施方案中，所述剂是烟曲霉素。
在实施方案中，所述剂是ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)。
在实施方案中，所述第一剂对哺乳动物细胞有害和/或对受试者有毒。
在实施方案中，当直接施用至受试者的血流中时，所述第一剂易于降解。
在实施方案中，所述化合物还包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一剂对人细胞有害和/或对受试者有毒。
任何上述剂都可用于至少第二化合物中。至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，并且所述至少第二多肽包含能够结合血小板的α颗粒中的GAG的至少第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。因此，任何本文公开的剂可以是第一剂或至少第二剂。
分离的血小板
通常，用于治疗疾病或病症的剂可对人细胞有害和/或对受试者有毒，并且尤其是当向受试者全身施用时。使血小板负载包含有害剂的化合物避免受试者中的意外和不期望的细胞、组织和/或器官损伤。此外，某些剂在直接施用至受试者的血流中时易于降解。使血小板负载包含可降解剂的化合物避免剂浓度的降低，所述降低在直接施用至受试者的血流中时会发生；因此，经负载的血小板在施用于受试者时避免剂量减少(例如，低于有效剂量)。一起，经负载的血小板以期望的剂量和较少的副作用提供定位于靶部位的剂的富集。
与其他靶向递送系统相比，血小板促进的剂递送的技术具有许多优点。与纳米颗粒促进递送不同，没有向受试者提供外来物质。类似地，虽然脂质体制剂由于网状内皮系统(RES)的吞噬作用而具有短保质期、差稳定性和短体内半衰期，但本公开的血小板递送系统延长体内半衰期并且不改变原始化合物的稳定性和制剂。此外，靶向异常血管系统的大多数合成归巢机制如RGD肽尚未达到天然血小板的特异性。最后，在本发明中使用自体血小板消除他人的感染因子的风险；这增加程序的安全性和血小板负载速度(数秒至数分钟)，而无需解冻和/或制备捐赠和储存的血小板。总之，本公开的血小板促进的剂递送可迅速地且容易地转化为临床。
本公开的另一方面是一种分离的血小板，所述分离的血小板包含任何本文公开的化合物的至少一个拷贝。
在实施方案中，所述血小板是合成的、同种异体的、自体的或经修饰的异源血小板。在实施方案中，所述血小板是自体血小板。在实施方案中，所述血小板是同种异体血小板。在实施方案中，所述血小板从富含血小板的血浆获得。
在实施方案中，所述血小板包含所述化合物的1至1000个拷贝。在实施方案中，所述化合物的1至1000个拷贝被负载至所述血小板的α颗粒中。
在实施方案中，所述化合物包含第一剂和第一多肽。所述第一多肽包含糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽能够结合血小板的α颗粒中的GAG。
在实施方案中，GAG结合肽结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至CS。在实施方案中，所述GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
在实施方案中，所述GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约1N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约2N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于约3N NaCl时不结合至含CS的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
在实施方案中，所述GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性、与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7或位置9的带电氨基酸。
在实施方案中，所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。作为实例，GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4和位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置7的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置4以及位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；GAG结合肽包含在位置1和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；以及它们之间的任何组合。GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的精氨酸；GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的异亮氨酸；GAG-结合肽可包含位置1的脯氨酸，以及位置4、位置7和位置9的精氨酸；GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸、位置4和位置7的精氨酸以及位置9的异亮氨酸；GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸、位置4的精氨酸和位置9的异亮氨酸；或者GAG结合肽可包含位置4的精氨酸和位置9的脯氨酸。在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸的任何组合都涵盖于本公开中。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含至少10个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽包含11个氨基酸。在实施方案中，所述GAG结合肽由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述第一多肽由GAG结合肽组成。可替代地，所述第一多肽包含除GAG结合肽以外的氨基酸；在一些实施方案中，所述多肽中的额外氨基酸不会增加GAG结合肽对GAG的亲和力。
在实施方案中，所述第一多肽的N端直接或间接地连接至第一剂。在实施方案中，所述第一多肽的C端直接或间接地连接至第一剂。在实施方案中，所述第一剂通过至少一个接头间接地连接至第一多肽。在实施方案中，所述至少一个接头包含一个或多个原子。在实施方案中，所述至少一个接头包含重复单元的聚合物。在实施方案中，所述至少一个接头包含氨基酸链。
在实施方案中，所述第一剂包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在实施方案中，所述分离的血小板还包含至少第二化合物，其中所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，并且所述至少第二多肽包含能够结合血小板的α颗粒中的GAG的至少第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％、至少约80％或至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含10个氨基酸或11个氨基酸或由其组成。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约90％同一性的氨基酸序列，并且所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述至少第二剂包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在实施方案中，所述第一剂不同于所述至少第二剂。可替代地，所述第一剂与所述至少第二剂相同。
在实施方案中，所述至少第二剂通过至少一个接头间接地连接至所述至少第二多肽。在实施方案中，所述至少第二剂直接连接至所述至少第二多肽。
在实施方案中，所述血小板包含所述至少第二化合物的1至1000个拷贝。
在实施方案中，所述化合物被负载至所述血小板中的第一α颗粒中，并且所述至少第二化合物被负载至所述血小板中的至少第二α颗粒中。
在实施方案中，所述化合物和所述至少第二化合物两者均被负载至同一α颗粒中。
药物组合物
本公开的经负载的血小板可被配制成至少一旦施用于受试者就增强血小板的稳定性和有效性的药物组合物。此外，此类药物组合物在施用于受试者之前增强血小板的稳定性。
本公开的又一方面是一种药物组合物，所述药物组合物包含含有任何本文公开的化合物的至少一个拷贝的分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含含有任何本文公开的第一化合物的至少一个拷贝的分离的血小板、任何本文公开的第二化合物的至少一个拷贝和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含第一分离的血小板、至少第二分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。所述第一分离的血小板包含第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合所述血小板的α颗粒中的第一GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽。所述至少第二分离的血小板包含至少第二化合物，所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，其中所述至少第二多肽包含能够结合所述血小板的α颗粒中的至少第二GAG的至少第二GAG结合肽。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约1NNaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约2N NaCl时保持结合至含CS的柱。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约3N NaCl时不结合至含CS的柱。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性、与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7或位置9的带电氨基酸。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
例如，所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽包含在位置1的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽包含在位置1和位置4的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽包含在位置1、位置4和位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽包含在位置1和位置7的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽包含在位置1和位置4以及位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽包含在位置1和位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸；以及它们之间的任何组合。所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的脯氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的精氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽可包含在位置1、位置4、位置7和位置9的异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸，以及位置4、位置7和位置9的精氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸、位置4和位置7的精氨酸以及位置9的异亮氨酸；所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽可包含位置1的脯氨酸、位置4的精氨酸和位置9的异亮氨酸；或者所述第一GAG结合肽和/或至少第二GAG结合肽可包含位置4的精氨酸和位置9的脯氨酸。在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸的任何组合都涵盖于本公开中。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少10个氨基酸。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含11个氨基酸。在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽由11个氨基酸组成。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
在实施方案中，所述第一多肽和/或所述至少第二多肽分别由所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽组成。
在实施方案中，所述第一多肽和/或所述至少第二多肽的N端分别直接或间接地连接至所述第一剂和/或所述至少第二剂。在实施方案中，所述第一多肽和/或所述至少第二多肽的C端分别直接或间接地连接至所述第一剂和/或所述至少第二剂。在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂分别通过至少一个接头间接地连接至所述第一多肽和/或所述至少第二多肽。在实施方案中，所述至少一个接头包含一个或多个原子。在实施方案中，所述至少一个接头包含重复单元的聚合物。在实施方案中，所述至少一个接头包含氨基酸链。在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂分别直接连接至所述第一多肽和/或所述至少第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽。
在实施方案中，所述至少第二剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述至少第二多肽。
在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂独立地选自有以下组成的组：抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)以及抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂包含抗体。在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一剂和/或所述至少第二剂对哺乳动物细胞有害和/或对受试者有毒。
在实施方案中，当直接施用至受试者的血流中时，所述第一剂和/或所述至少第二剂易于降解。
在实施方案中，所述第一化合物和/或所述至少第二化合物还包含荧光部分。
在实施方案中，所述第一多肽和所述至少第二多肽是不同的。在实施方案中，所述第一多肽和所述至少第二多肽是相同的。
在实施方案中，所述第一剂和所述至少第二剂是不同的。在实施方案中，所述第一剂和所述至少第二剂是相同的。
在实施方案中，所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板独立地选自合成的、同种异体的、自体的和经修饰的异源血小板。在实施方案中，所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板是自体血小板。在实施方案中，所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板是同种异体血小板。在实施方案中，所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板从富含血小板的血浆获得。
在实施方案中，所述第一分离的血小板包含所述第一化合物的1至1000个拷贝。在实施方案中，所述至少第二分离的血小板包含所述至少第二化合物的1至1000个拷贝。在实施方案中，所述第一化合物和/或所述至少第二化合物的1至1000个拷贝被负载至所述血小板的α颗粒中。
药物组合物包含药学上可接受的载剂或媒介物。此类药物组合物可任选地包含适合的量的药学上可接受的赋形剂以便提供用于适当施用的形式。药物赋形剂可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物赋形剂可例如是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、硅胶、尿素等。此外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在实施方案中，当施用给受试者时，药学上可接受的赋形剂是无菌的。当静脉内施用本文公开的任何剂时，水是有用的赋形剂。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体赋形剂，特别是对于可注射的溶液。适合的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖(即右旋糖)、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水，乙醇等。如果需要，本文公开的任何剂还可包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。合适的药用赋形剂的实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro编辑,第19版1995)(以引用的方式并入本文)中。
在实施方案中，本文公开的药物组合物包含盐水缓冲液(包括但不限于NaCl溶液、TBS、PBS、林格氏溶液等)。
在实施方案中，本文公开的药物组合物以适合于无菌注射的形式存在，其与血液近似等渗并且具有介于约7.3与7.5之间的pH(即，血液的pH)。
在实施方案中，本文公开的药物组合物根据常规程序配制为适用于本文公开的施用模式的药物组合物。
本公开的一个方面是任何本文公开的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
本公开的另一个方面是任何本文公开的药物组合物在制造用于治疗疾病或病症的药剂中的用途。在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
治疗方法
如前所述，负载有包含剂的化合物的血小板避免剂浓度的降低(例如，低于有效剂量)，所述降低在所述剂在不负载至血小板中的情况下施用于受试者时发生。此外，负载有包含有害(例如，有毒)剂的化合物的血小板避免受试者中的意外和不期望的细胞、组织和/或器官损伤。最后，血小板自然地归巢至损伤、炎症和/或血管生成部位。总之，经负载的血小板有助于确保将治疗有效量的一种或多种剂递送至靶部位并且副作用更少。
以组织炎症或组织损伤为特征并且以血小板为第一响应者为特征的疾病和病症都可根据所公开的方法进行治疗。这些疾病和病症包括但不限于瘤形成、血液系统恶性肿瘤、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、中风、缺血性心脏病、动脉粥样硬化、烧伤和移植物上皮形成。
本发明提供的一个优点是相对于直接施用于血流的剂，当负载至血小板中时剂(在受试者的血流中)的半衰期延长。本发明使剂的自然消除减慢，显著降低。通常，剂通过肾过滤、酶降解、网状内皮系统(RES)摄取以及在非靶向器官和组织中累积而从循环中消除。然而，在本发明中，剂在血小板的寿命(通常为4-7天)内或直到递送至靶部位都被保护在血小板内。此外，本发明通过避免剂广泛分布至非靶部位(例如，组织和器官)来限制剂的全身暴露。所述益处允许使用较低剂量的剂(相对于未负载至血小板中的剂的施用)。这种较低剂量的使用至少有助于减少不希望的副作用并降低经济成本。
此外，可用于本发明中的血小板可负载多种不同的剂；所述不同的剂可以空间和时间受控的方式从α颗粒中释放。因此，本发明向损伤部位(例如，用于治疗慢性伤口)、病理性炎症部位(例如，用于治疗关节或肺损伤)和/或血管生成部位(例如，用于治疗癌症)提供定向和受控治疗剂。
本公开的一个方面是一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的药物组合物的步骤。本文公开的药物组合物包含第一分离的血小板、至少第二分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。所述第一分离的血小板包含第一化合物，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合所述血小板的α颗粒中的第一GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽。所述至少第二分离的血小板包含至少第二化合物，所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，其中所述至少第二多肽包含能够结合所述血小板的α颗粒中的至少第二GAG的至少第二GAG结合肽。
在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物的步骤，其中所述药物组合物包含本文公开的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。本文公开的化合物包含第一剂和第一多肽。所述第一多肽包含糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽能够结合血小板的α颗粒中的GAG。
在实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用第二药物组合物的步骤，所述第二药物组合物包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
在实施方案中，所述第二药物组合物促进化合物从血小板释放。
在实施方案中，在施用所述药物组合物之后施用所述第二药物组合物。在实施方案中，在施用所述第二药物组合物之前施用所述药物组合物至少两次。
在实施方案中，所述疾病或病症是癌症。癌症通常是由不适当的高增殖率和/或不适当的低细胞凋亡率引起的疾病。
在实施方案中，癌症选自听神经瘤；急性红白血病；急性白血病；急性成淋巴细胞性白血病；急性淋巴细胞性白血病；急性单核细胞性白血病；急性成髓细胞性白血病；急性髓细胞性白血病；急性粒单核细胞白血病；急性早幼粒细胞白血病；腺癌；AIDS相关淋巴瘤；血管肉瘤；星形细胞瘤；基底细胞癌；B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤)；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；支气管癌；巨大肿块非霍奇金淋巴瘤；消化系统癌症；头颈癌；腹膜癌；呼吸系统癌症；泌尿系统癌症；宫颈癌；软骨肉瘤；脊索瘤；绒毛膜癌；慢性白血病；慢性淋巴细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；慢性髓细胞性白血病；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；颅咽管瘤；囊腺癌；胚胎癌；子宫内膜癌、内皮肉瘤、室管膜瘤；上皮癌、食道癌、尤文氏瘤；眼癌、纤维肉瘤、胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤、胶质瘤；毛细胞白血病；重链病；血管母细胞瘤、肝癌、肝细胞瘤、高级成免疫细胞性非霍奇金淋巴瘤；高级成淋巴细胞性非霍奇金淋巴瘤；高级小无裂细胞非霍奇金淋巴瘤；霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；中级弥漫性非霍奇金淋巴瘤；中级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤；上皮内肿瘤；肾癌或肾癌；喉癌；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；肺癌；淋巴管内皮肉瘤；淋巴管肉瘤；淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)；套细胞淋巴瘤；髓样癌；髓母细胞瘤；梅基综合征；黑素瘤；脑膜瘤；间皮瘤；骨髓瘤；粘液肉瘤；成神经细胞瘤；胆管癌；少突胶质细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)；成骨肉瘤；卵巢癌；胰腺癌；乳头状腺癌；乳头状癌；松果体瘤；真性红细胞增多症；移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)以及与瘢痣病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的)；前列腺癌；直肠癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤；神经鞘瘤；皮脂腺癌；精原细胞瘤；皮肤癌；小淋巴细胞(SL)非霍奇金淋巴瘤；鳞状细胞癌；胃癌；汗腺癌；滑膜瘤；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；和威尔姆氏肿瘤。
在实施方案中，所述疾病或病症癌症是增生性病症，例如淋巴增生性疾病。
在实施方案中，疾病是损伤，例如烧伤、脊柱损伤、整形外科损伤和伤口。
在实施方案中，疾病或病症是血友病关节积血。
在实施方案中，疾病或病症是炎症，例如急性或慢性炎症，包括关节炎症和肺部炎症。
在实施方案中，疾病或病症是糖尿病性溃疡。
在实施方案中，所述疾病或病症是植入物、移植物、支架或假体的副作用。
在实施方案中，通过本公开的方法治疗的疾病或病症由缺陷型基因引起。在这些实施方案中，剂可以是替代缺失或功能失调的蛋白质的重组多肽。可替代地或另外，重组蛋白可以是本文公开的基于多肽的剂中的任一者，即抗体(或其抗原结合片段)、化疗剂、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物或神经营养蛋白。
由基因中的缺陷引起的一些疾病可能影响GAG的合成。例如，染色体3长臂上的硫酸软骨素蛋白多糖5(CSPG5)中的缺陷可导致脑畸形发生，而DBQD1基因中的缺陷导致肢端纤细型侏儒症，也称为“伴手部异常的Desbuquois发育不良”，并且基因异常可影响血小板中GAG的合成。
本文公开的药物组合物的施用使得通过静脉内或动脉内注射或输注将经负载的血小板递送至血流中。可替代地，将本文公开的药物组合物直接再施用至活动性疾病部位。其他施用途径包括例如皮下、腹膜内、肌肉内或皮内注射。
包含本文公开的经负载的血小板的药物组合物的剂量以及给药方案可取决于各种参数，包括但不限于所治疗的疾病、受试者的一般健康状况和施用医生的判断。
剂量可取决于若干因素，所述因素包括疾患的严重程度、是要治疗还是预防所述疾患以及待治疗受试者的年龄、体重和健康状况。另外，关于特定受试者的药物基因组学(基因型对治疗剂的药物动力学、药效学或功效分布的影响)信息可影响所用剂量。此外，可根据多种因素稍微调整精确的单个剂量，所述因素包括所施用的剂的特定组合、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速率、所治疗的特定疾病、病症的严重程度以及病症的解剖学位置。可预期一些剂量的变化。
一般而言，包含特定量的负载至血小板中的剂的药物组合物的剂量将在当所述剂在没有负载至血小板中的情况下施用时的剂量范围内。在实施方案中，本文公开的药物组合物中剂的剂量将低于未负载至血小板中的剂的剂量，因为本发明在受试者中提供增加的靶特异性和对剂降解的抗性。
包含本文公开的经负载的血小板的任何药物组合物可以单次每日剂量施用，或者总每日剂量可每日两次、三次或四次的分次剂量施用。此外，包含本文公开的经负载血小板的任何药物组合物可在整个给药方案中连续而不是间歇地施用。
重组多肽表达
本发明进一步提供了包含重组多肽剂的氨基酸序列与包含糖胺聚糖(GAG)结合肽的多肽偶联(直接或间接)的融合蛋白。
包含GAG结合肽的重组多肽可作为单独的肽表达并连接在一起。可替代地，包含GAG结合肽的重组多肽被表达为单一融合蛋白，所述单一融合蛋白包含与GAG结合肽可操作地连接的多肽剂。
本发明的重组多肽实际上是使用本领域技术人员已知的任何方法产生的。通常，重组多肽是通过在合适的表达媒介物中用全部或部分编码多肽的核酸分子或其片段转化合适的宿主细胞而产生。
分子生物学领域的技术人员将理解，可使用多种表达系统中的任一种来表达重组多肽。所使用的精确宿主细胞对本发明来说不是关键的。本发明的重组多肽可在原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酿酒酵母)、昆虫细胞(例如Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如NIH 3T3、HeLa，或优选COS细胞)中产生。此类细胞可从多种来源获得(例如，美国典型培养物保藏中心Rockland,Md.；还参见例如，Ausubel等人,Current Protocol inMolecular Biology,New York:John Wiley and Sons,1997)。转化或转染的方法以及表达媒介物的选择将取决于所选择的宿主系统。转化和转染方法描述于例如，Ausubel等人中，表达媒介物可选自例如Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels等人.,1985,增刊1987)中所提供的那些。
一旦本发明的重组多肽被表达，它就可被分离、浓缩和/或纯化。
例如，可使用亲和色谱分离重组多肽。在一个实例中，针对重组多肽产生的抗体可连接至柱上并用于分离重组多肽。在亲和色谱之前裂解和分解分离携带多肽的细胞可通过标准方法进行(参见例如，Ausubel等人,)或者，使用与镍柱结合的序列标签，如六组氨酸标签来分离重组多肽。
一旦分离，如果需要，可进一步纯化重组蛋白，例如通过高效液相色谱法(参见例如，Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology,编辑,Work and Burdon,Elsevier,1980)。
本发明的多肽，特别是短肽片段，也可通过化学合成(例如，通过Solid PhasePeptide Synthesis,第2版,1984The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.中描述的方法)产生。
多肽表达和纯化的这些一般技术也可用于产生和分离有用的肽片段或类似物(本文描述的)。
组合疗法
在实施方案中，任何本文公开的药物组合物或治疗方法还可包含不与糖胺聚糖(GAG)结合肽连接和/或不负载至血小板中的另外剂。在组合疗法的一个实例中，药物组合物包含经负载的血小板和另外的剂。在组合疗法的另一个实例中，向受试者施用包含经负载的血小板的第一物组合物和包含另外的剂的第二药物组合物。组合疗法还可包括包含经负载的血小板和第一另外剂的第一药物组合物和包含第二另外剂的第二药物组合物；这里，第一另外剂和第二另外剂可以是相同的或者可以是不同的剂。任何本文公开的剂都可用作另外的剂。
在涉及多于一种药物组合物的组合疗法的实施方案中，第一药物组合物可在第二药物组合物之前施用，第一药物组合物可在第二药物组合物之后施用，或者第一药物组合物可与第二药物组合物同时施用。
此外，组合疗法可将本公开的药物组合物与另一种治疗方案组合。其他治疗方案的实例包括放射疗法、激素疗法、手术和冷冻手术。治疗疗法可包含本文所述的任何剂。
在组合疗法的实施方案中，化学治疗剂与本公开的化合物组合使用。作为实例，组合疗法可包括负载有以下化合物中的一种或两种的血小板：包含作为剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物、包含作为剂的烟曲霉素的化合物；和化学治疗剂；这种组合可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。组合疗法可包括负载有以下化合物中的一种或两种的血小板：包含作为剂的EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)的化合物、包含作为活性剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物；和化学治疗剂；这可用于治疗肺癌。组合疗法可包括负载有以下化合物中的一种或两种或所有三种的血小板：包含作为剂的EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)的化合物、包含作为剂的多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)的化合物、包含作为剂的ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)的化合物；和化学治疗剂；这可用于治疗非小细胞肺癌。
在另外的实施方案中，组合疗法包括负载有VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)和药物瑞德西韦的血小板；这可用于治疗可能与COVID相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
在组合疗法的实施方案中，药物组合物可在另一种治疗方案之前施用，药物组合物可在另一种治疗方案之后施用，或者药物组合物可与另一种治疗方案同时施用。
制造方法
本公开的另一方面是一种用于制造经负载的血小板的方法。所述方法包括以下步骤：获得血小板；使所述血小板在体外或离体与任何本文公开的化合物接触；以及使所述血小板与所述化合物之间的接触进行直到所述化合物被所述血小板的α颗粒内化，从而产生经负载的血小板。
将剂直接或间接连接至糖胺聚糖(GAG)结合肽或合成包含GAG结合肽和治疗性多肽的重组组合物以形成本公开的化合物。将化合物与来自血库的富含自体血小板的血浆或富含异体血小板的血浆在37℃下孵育至少约15分钟。将负载有化合物的血小板输注到患者体内，例如每周一次，因为血小板的半衰期是4至7天。当剂具有显著全身毒性时，使用合适的缓冲液洗涤血小板以防止输注尚未负载至血小板中的剂。
在实施方案中，所述方法还包括使所述血小板在体外或离体与至少第二化合物接触的步骤，其中所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，并且所述至少第二多肽包含能够结合血小板的α颗粒中的GAG的至少第二糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及使所述血小板与所述至少第二化合物之间的接触进行直到所述至少第二化合物被所述血小板的α颗粒内化的步骤。
在实施方案中，使所述血小板在体外或离体与所述化合物接触的步骤和使所述血小板在体外或离体与所述至少第二化合物接触的步骤是依序的。在实施方案中，使所述血小板在体外或离体与所述化合物接触的步骤和使所述血小板在体外或离体与所述至少第二化合物接触的步骤是同时发生的。
药盒
本公开的一个方面是一种用于治疗疾病或病症的药盒。所述药盒包括任何本文公开的分离的血小板和使用说明书。
本公开的另一方面是一种用于治疗疾病或病症的药盒。所述药盒包括任何本文公开的药物组合物和使用说明书。
在实施方案中，所述药盒还包括至少第二药物组合物，所述第二药物组合物包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
本公开的又一方面是一种用于制造经负载的血小板的药盒。所述药盒包括任何本文公开的化合物和使用说明书。
本发明提供了用于治疗或预防涉及损伤、炎症或肿瘤血管生成部位的疾病或病症的药盒。在一个实施方案中，所述药盒包括治疗性或预防性组合物，所述治疗性或预防性组合物含有有效量的负载有单位剂量形式的剂的血小板。在一些实施方案中，所述药盒包括容纳治疗性或预防性组合物的无菌容器；此类容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋子、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适于容纳药物的其他材料制成。
如果需要，包含本公开的分离的血小板的药物组合物连同用于将其施用于患有疾病或病症或有发展疾病或病症风险的受试者的说明书一起提供。说明书可包括关于使用药物组合物治疗或预防疾病或将分离的血小板递送至有需要的组织的信息。在其他实施方案中，说明书包括以下中的至少一者：剂的描述；用于治疗或预防疾病或其症状的剂量时间表和施用；预防措施；警告；适应症；禁忌症；过量用药信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可直接打印在容器(当存在时)上，或作为标记应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片或在容器中或与容器一起提供的文件夹。
本文公开的任何方面或实施方案可与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
等效案
尽管已经结合本发明具体的实施方案描述了本发明，但应理解本发明能够具有另外的修改，并且本申请意图涵盖通常遵循本发明原理的、包括虽然不属于本发明所公开内容范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于上文中阐述和所附权利要求的范围所列出的必要特征的任何变型、用途或者变更。
本领域技术人员仅使用常规实验将会认识到或将能够确定本文中确切描述的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图涵盖在所附权利要求书的范围中。
定义
本文所用的术语仅是出于描述特定情况的目的而并不旨在限制。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“一个/种(a/an)”和“所述”旨在包括复数形式以及单数形式，除非上下文另有明确说明。
本公开和/或权利要求书中使用的术语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”，“含有(contain)”、“含有(containing)”、“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“带有(with)”或其变体旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式包括在内。
术语“约”或“近似”意指由本领域普通技术人员测定的特定值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或测定方式，例如，测量系统的限制性。例如，“约”可表示大于或小于所陈述值10％。在另一个实例中，“约”可表示根据给定值的实践，在1个或超过1个标准偏差内。在申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应假定术语“约”表示特定值的可接受的误差范围。
术语“基本上”在很大程度上意味着在极大程度上；或本质上。换言之，术语基本上可意味着与所需属性几乎完全一样或与确切的属性略有不同。基本上可能与所需属性无法区分。基本上可与所需属性区分开来，但差异不重要或可忽略不计。
术语“至少第二”是指第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第二十、第三十、第十四、第五十、第六十、第七十、第八十、第九十、第一百或更多以及其间的任何迭代。术语“一个或多个”包括一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、二十、三十、四十、五十、六十、七十、八十、九十、一百或更多以及之间的任何数字。
术语“货物”是指可负载至血小板，例如血小板的α颗粒中的化合物或剂。这种负载通过化合物的糖胺聚糖(GAG)结合肽发生。在一些实施方案中，术语“剂”和“货物”可以是同义词。
以引用的方式并入
本文引用的所有专利和公布以引用的方式整体并入本文。
本文所论述的出版物仅仅出于其在本申请的提交日期之前公开而提供。本文中的任何内容均不应解释为承认由于先前发明而使本发明无权先于这些公布。
如本文所用的，所有标题仅用于组织，并不意图以任何方式限制本公开。任何单个部分的内容可同样适用于所有部分。
实施例
实施例1：糖胺聚糖(GAG)结合肽将附接的货物螯合至血小板的α颗粒中
在此实施例中，确定了说明性糖胺聚糖(GAG)结合肽引导货物直接负载至血小板的α颗粒中的能力。
测试了在图1A和图1B中标识为PAL1和PAL2的Alexa647标记的GAG结合肽和Alexa647标记的对照肽(充当阴性对照的无电荷配体(CFL))对糖胺聚糖(如硫酸软骨素)的结合亲和力，以及它们进入血小板的能力。PAL1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，PAL2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，CFL具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
Alexa647标记的肽(或作为阴性对照的单独Alexa647)的剂量反应曲线显示在图1A中。将Alexa647标记的肽或单独的Alexa647与分离的血小板在37℃下共孵育一小时以允许血小板负载。相应的血小板负载能力通过孵育后上清液中的荧光降低来指示。对于对照，在没有孵育期的情况下进行相同的实验(在图中标记为“完整”)。然后将共孵育后的血小板以800g离心10分钟以使血小板与上清液分离(在图中标记为“负载的”)。
如图1A所示，在完整测量值与负载测量值之间存在PAL1和PAL2的吸光度的降低。这种来自上清液的吸光度降低表明这些肽已经从上清液中隔离出来并负载至血小板中。相比之下，Alexa647标记的CFL条件的吸光度在与血小板共同孵育后没有变化。因此，CFL肽保留在上清液中并且没有负载至血小板中。
图1B表示针对每个肽实验归一化的图1A中的数据，即将负载条件以其完整条件作归一化。图1B示出说明性GAG结合肽PAL1和PAL2有助于将附接的货物负载至血小板中，而附接至无电荷配体的货物不能直接将货物负载至血小板中。
为了确认Alexa647标记的GAG结合肽被负载至血小板的α颗粒中，使用了共聚焦显微镜。将在图1A和图1B的实验中离心的血小板固定在2％多聚甲醛中并沉降到玻璃盖玻片上。透化后，针对PF4进行免疫荧光染色，PF4是血小板α颗粒的标志物。将血小板用Alexa568-第二抗体染色。通过配备有60x油物镜的Nikon-A1激光扫描显微镜收集图像。
图2A是以红色示出的PF4染色(左列)和以紫色示出的Alexa647信号(来自游离Alexa647、Alexa647标记的GAG结合肽或Alexa647标记的CFL；中间列)的代表性图像。将图像仅针对显示的亮度和对比度进行了调整。每个实验采集n>5个图像，并根据PF4强度选择感兴趣区域(ROI)。
合并后的图像(右列)展示只有当Alexa647是GAG结合肽的货物时α颗粒标志物PF4和Alexa647信号的共定位。对于游离Alexa647或当Alexa647是CFL的货物时，未观察到共定位。
使用ImageJ测量每个ROI的Alexa647强度，并使用Prism 8在盒须图中绘制。图2B示出说明性GAG结合肽PAL1和PAL2有助于将附接的货物负载至血小板的α颗粒中，而附接至无电荷配体的货物不负载至血小板中，更不用说负载至血小板的α颗粒中。
这些数据证明本公开的GAG结合肽有助于将任何附接的货物负载至血小板的α颗粒中。
实施例2：糖胺聚糖(GAG)结合肽以高亲和力结合糖胺聚糖
在此实施例中，测定了说明性糖胺聚糖(GAG)结合肽与各种糖胺聚糖的结合亲和力。
图3A是描绘在此实施例中进行的等温滴定量热法(ITC)实验的示意图。在此，硫酸软骨素A(CSA)用于测试说明性GAG结合肽对糖胺聚糖的亲和力。将3mM CSA负载至注射器中，并将CSA滴定至样品池中，所述样品池含有0.25mM的GAG结合肽或充当阴性对照的无电荷配体(CFL)的溶液。温度设定为22℃，缓冲液是5mM Tris-HCl(pH 7.35)和1％DMSO。进行了26次CSA注射，第一次的体积为0.1μl，并且随后的25次每次体积为1.5μl。在这些实验中，说明性GAG结合肽是分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的PAL1和PAL2，并且CFL具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
图3B至图3D示出滴定至含有PAL1(图3B)、PAL2(图3C)和CFL(图3D)的池中的CSA的ITC解离动力学的图形表示。
在图3B和图3C的实验期间获得的数据用于确定CSA和GAG结合肽相互作用的解离常数；这些是通过使用顺序结合模型的滴定曲线拟合确定的。这些数据示于图3E(对于PAL1)和图3F(对于PAL2)中。这些数据表明，两种说明性GAG结合肽对糖胺聚糖硫酸软骨素A具有高亲和力。
此外，使用亲和色谱测定了两种说明性GAG结合肽和CFL对硫酸乙酰肝素(HS)的结合亲和力。如图4所示，CFL不结合至HS，而两种说明性GAG结合肽均以高亲和力结合HS。令人感兴趣地，PAL2肽对HS的亲和力高于PAL1。
这些数据证明本公开的GAG结合肽对存在于血小板的α颗粒中的糖胺聚糖具有高亲和力。
实施例3：负载至血小板的α颗粒中的包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的化合物
在此实施例中，测定了包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的说明性化合物负载至血小板的α颗粒中的能力。
构建了本公开的两种说明性化合物和两种对照化合物。说明性化合物包括间接连接(通过九个氨基酸的接头)至糖胺聚糖(GAG)结合肽的剂(例如，mNeonGreen)。在这些实验中，说明性GAG结合肽是分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的PAL1和PAL2。阴性对照化合物包括与mNeonGreen间接连接(通过九个氨基酸的接头)的具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的无电荷配体(CFL)。阳性对照化合物包括与mNeonGreen间接连接(通过九个氨基酸的接头)的PF4(天然血小板因子)。在使用之前，这些化合物还包括用于纯化目的的His标签，以及TEV蛋白酶裂解位点，所述裂解位点有助于除去His标签。这些化合物被标识为mCFL(对于mNeon-L9-CFL)、mPAL1(对于mNeon-L9-PAL1)、mPAL2(对于mNeon-L9-PAL2)和PF4m(对于PF4-L9-mNeon)。
将血小板与四种化合物中的一种在37℃下共孵育一小时。孵育期后，将血小板以800g离心10分钟。然后，测量“负载”上清液(在505nm处)的荧光吸光度，并与“完整”负载对照进行比较，所述对照是血小板与化合物混合、然后立即离心而没有孵育期的每种条件的上清液。数据被进一步归一化并且将每组实验的负载百分比如图5中所示绘制。
图5示出两种说明性化合物具有比阴性对照更大的血小板负载能力和比阳性对照PF4稍大的负载能力。
为了确认包含GAG结合肽的化合物被负载至血小板的α颗粒中，使用了共聚焦显微镜。将在图5的实验中离心的血小板固定在2％多聚甲醛中并沉降到玻璃盖玻片上。透化后，针对PF4进行免疫荧光染色，PF4是血小板α颗粒的标志物。将血小板用Alexa568-第二抗体染色。通过配备有60x油物镜的Nikon-A1激光扫描显微镜收集图像。
图6A是以红色示出的PF4染色(左列)和以绿色标记的mNeon信号(中间列)的代表性图像。将图像仅针对显示的亮度和对比度进行了调整。每个实验采集n>5个图像，并根据PF4强度选择感兴趣区域(ROI)。
合并后的图像(右列)展示α颗粒标志物PF4和包含GAG结合肽的两种说明性化合物的mNeon信号的共定位。对于包含CFL的化合物，没有观察到共定位。
使用ImageJ测量每个ROI的mNeon强度并使用Prism 8在盒须图中绘制。图6B示出包含GAG结合肽的说明性化合物负载至血小板的α颗粒中，而包含无电荷配体的化合物不负载至血小板中，更不用说负载至血小板的α颗粒中。
这些数据证明包含GAG结合肽和剂的本公开的化合物负载至血小板的α颗粒中。
实施例4：包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的化合物以高亲和力结合糖胺聚糖
在此实施例中，测定了本公开的说明性化合物(其包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂)对各种糖胺聚糖的结合亲和力。
在此实施例中进行如图3A中描绘的和如实施例2中所述的等温滴定量热法(ITC)实验，但使用本公开的说明性化合物与阴性对照化合物。与实施例2的实验一样，此处滴定缓冲液是5mM Tris-HCl(pH7.35)，并且温度设定为22℃；然而，与实施例2的实验不同，缓冲液不含DMSO。
图7A至图7C示出滴定至池中的CSA的ITC解离动力学的图形表示，所述池含有包含PAL1的说明性化合物(图7A)、包含PAL2的说明性化合物(图7B)和包含CFL的阴性对照化合物(图7C)。这些化合物包含mNeonGreen作为其剂。
在图7B和图7C的实验期间获得的数据用于确定CSA和化合物相互作用的解离常数；这些是通过使用顺序结合模型的滴定曲线拟合确定的。这些数据示于图7C(对于包含PAL1的说明性化合物)、图7D(对于包含PAL2的说明性化合物)和图7E(对于包含CFL的阴性对照化合物)中。这些数据表明，两种说明性GAG结合肽对糖胺聚糖硫酸软骨素A具有高亲和力。
此外，使用亲和色谱测定了两种说明性含GAG结合肽的化合物和CFL对硫酸乙酰肝素(HS)的结合亲和力。如图8所示，包含任一GAG结合肽的化合物以高亲和力结合HS。值得注意的是，两种说明性GAG结合肽与HS的相对结合亲和力与先前实验中观察到的相似，在于mPAL2与HS的结合比mPAL1更紧密，PAL2与HS的结合比PAL1更紧密。包含对照肽(mCFL)的化合物具有一些残留的结合能力，并保留在HS柱上，将所述柱在相对低浓度的盐下洗脱，可能是由于化合物的剂(例如mNeonGreen)的带电特性。
这些数据证明，包含糖胺聚糖(GAG)结合肽和剂的本公开的说明性化合物对位于血小板的α颗粒中的糖胺聚糖具有高亲和力。
实施例5：鉴定对糖胺聚糖(GAG)结合肽结合糖胺聚糖的能力重要的序列特异性
在此实施例中，测定了包含糖胺聚糖(GAG)结合肽的另外说明性化合物与各种糖胺聚糖的结合亲和力。更具体地，GAG结合肽(SEQ ID NO:1)的丙氨酸扫描诱变产生了相差一个氨基酸的另外的说明性GAG结合肽，所述肽然后间接连接至剂(例如，mNeonGreen)，如实施例3中所描述。
在此实施例中进行如图3A中描绘的和如实施例4中所述的等温滴定量热法(ITC)实验，但使用本公开的说明性化合物。
在图9A中，化合物被标识为PAL1A至PAL11A。这些说明性化合物具有GAG结合肽，所述GAG结合肽具有SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:13的氨基酸序列。具体地，PAL1A的GAG结合肽与SEQ ID NO:1的不同之处在于在位置1具有丙氨酸；PAL2A的GAG结合肽与SEQ ID NO:1的不同之处在于在位置2具有丙氨酸；并且PAL3A的GAG结合肽与SEQ ID NO:1的不同之处在于在位置3具有丙氨酸。
图9A示出滴定至池中的CSA的ITC解离动力学的图形表示，所述池含有标识为PAL1A至PAL11A的说明性化合物之一。如通过CSA滴定至含有每种所列化合物的样品池中生成的代表性ITC曲线中可看出，电荷和序列对于与硫酸软骨素A的相互作用都很重要。
在图9A的实验期间获得的数据用于确定CSA和另外的说明性化合物相互作用的解离常数；这些是通过使用顺序结合模型的滴定曲线拟合确定的。这些数据示于图9B至图9L(分别对于PAL1A至PAL11A)中。这些数据表明，另外的说明性化合物对糖胺聚糖硫酸软骨素A具有可变亲和力。
图9M是描绘说明性化合物和对照化合物的平均解离常数的图。此图示出化合物之间不同程度的CSA结合亲和力。在图中，标识为“1A”的数据代表“PAL1A”化合物，标识为“2A”的数据代表“PAL2A”化合物，依此类推。
值得注意的是，在其位置1、4、7或9具有丙氨酸的那些说明性化合物具有最低、最差的亲和力。从而证明当GAG结合肽在这些位置具有脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸时结合能力的提高。
位置中的关键氨基酸如脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸影响结合的亲和力。令人感兴趣地，这些氨基酸包括预期的带正电荷的精氨酸以及还有可通过维持特殊构象起作用的不带电荷的脯氨酸和异亮氨酸。
这些数据表明，具有在带电荷氨基酸的位置中不同的GAG结合肽的另外化合物对糖胺聚糖具有可变亲和力。并且，关键残基(相对于SEQ ID NO:1的位置1、4、7和9)和特定氨基酸(如脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸)影响GAG结合肽与糖胺聚糖例如在血小板的α颗粒中的结合亲和力。
实施例6：当形成本公开的化合物时用于将糖胺聚糖(GAG)结合肽与剂缀合的说明性方法
在此实施例中，将剂与糖胺聚糖(GAG)结合肽缀合以形成本公开的说明性化合物。
如图10A所示，使用马来酰亚胺反应将剂与GAG结合肽缀合，从而形成本公开的化合物。可使用本领域已知的其他缀合反应，例如琥珀酰亚胺酯反应或酶促反应。在图10A中，GAG结合肽(在图10A中示出为“GAG-pep”)包含荧光部分；在本公开的某些实施方案中，荧光部分不包含于化合物中。
为了进一步证明本公开的化合物将其货物负载至血小板中的能力(如以上实施例中所述)，在此，产生了包含GAG结合肽和治疗性抗体(DC101，VEGFR2抑制剂)的说明性化合物。使用类似的方法，可使用除抗体以外的剂来产生本公开的化合物。作为实例，剂可以是化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
测定了(包含作为剂的抗体)并且还包含荧光部分的说明性化合物被负载至血小板的α颗粒中的能力。
制备了四种化合物：作为阴性对照的Alexa647标记的DC101(在图10B中标识为A-DC101)、包含SEQ ID NO:14的无电荷配体(CFL)和DC101抗体的Alexa647标记的化合物(在图10B中标识为A-CLF-DC101)、包含SEQ ID NO:1的GAG结合肽和DC101抗体的Alexa647标记的化合物(在图10B中标识为A-PAL1-DC101)以及包含SEQ ID NO:2的GAG结合肽和DC101抗体的Alexa647标记的化合物(在图10B中标识为A-PAL2-DC101)。
将血小板与每种化合物在37℃下共孵育1小时。然后将血小板以800g离心10分钟，固定在2％多聚甲醛中，然后沉降到玻璃盖玻片上。透化后，针对血小板中的PF4进行免疫荧光染色，并用Alexa568-第二抗体进一步染色。通过配备有60x油物镜的Nikon-A1激光扫描显微镜收集这些图像。
在图10B的代表性图像中，PF4染色显示为红色(左列)，并且Alexa647信号显示为紫色(中间列)。将图像仅针对显示的亮度和对比度进行了调整。每个实验采集n>5个图像，并根据PF4强度选择感兴趣区域(ROI)。
合并后的图像(右列)仅在Alexa647与GAG结合肽缔合时显示α颗粒标志物PF4和Alexa647信号的共定位，但当Alexa647与CFL缔合或仅与DC101抗体缔合时则不。不幸的是，对于与A-PAL2-DC101化合物共孵育的血小板，PF4免疫染色反应失败。因此，根据此组的Alexa647强度选择ROI。
使用ImageJ测量每个ROI的Alexa647强度，并使用Prism 8在盒须图中绘制。如图10C所示，本公开的两种说明性化合物负载至血小板的α颗粒中，而包含无电荷配体的化合物或包含抗体(没有GAG结合肽)的化合物不负载至血小板中，更不用说负载至血小板的α颗粒中。
这些数据证明包含GAG结合肽和剂的本公开的化合物负载至血小板的α颗粒中。
实施例7：用于制造负载有本公开化合物的分离的血小板的说明性方法
在此实施例中，分离的血小板负载有本公开的化合物。
获得分离的血小板。血小板可以是合成血小板、同种异体血小板、自体血小板或经修饰的异体血小板。在实施方案中，所述血小板从富含血小板的血浆获得。
使血小板在体外或离体与本公开的化合物接触。所述化合物包含第一剂和第一多肽。所述第一多肽包含糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽可结合血小板的α颗粒中的GAG。优选地，GAG结合肽至少优先结合至硫酸软骨素(CS)。
在合适的温度、培养基组成(包括盐浓度、pH、营养物质)和时间长度下继续接触，直到化合物被血小板的α颗粒内化。如此，获得了经负载的血小板。通常，温度是从其获得血小板或待向其施用血小板的体温，例如37℃。类似地，组合物的pH接近于从其获得血小板或待向其施用血小板的血液/血浆的pH，例如约7.4的pH。
本公开中列出的或本领域中已知的任何剂都可用于此实施例中。所述剂可以是抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在一些实施方案中，第一剂可以是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)、FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)、FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)、凝血酶及其类似物、CSF3R激动剂(例如，非格司亭)、PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)、烟曲霉素或ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)中的一者种。
在一些情况下，使经负载的血小板在体外或离体与第二化合物接触。第二化合物包含第二剂和第二多肽。所述第二多肽包含可结合血小板的α颗粒中的GAG的第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。在合适的温度、培养基组成和时间长度下继续接触，直到第二化合物被血小板的α颗粒内化。
第二剂可以是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)、FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)、FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)、凝血酶及其类似物、CSF3R激动剂(例如，非格司亭)、PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)、烟曲霉素或ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)中的一种。
所述剂和第二剂可相同或者可不同；所述第一多肽和第二多肽可相同或者可不同；和/或所述第一GAG结合肽和第二GAG结合肽可相同或者可不同。
例如，所述第一剂和第二剂可以是：VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)和PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)；或EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)；或烟曲霉素和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)。
可组合包含第三多肽和第三剂的第三化合物，所述第三剂是例如EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)以及ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)。
在实施方案中，所述化合物和第二化合物依序负载，如上所述。在替代实施方案中，所述化合物和第二化合物同时负载。
优选地，分离的血小板包含化合物的1至1000个拷贝和/或包含第二化合物的1至1000个拷贝。在实施方案中，将1至1000个拷贝负载至血小板的α颗粒中。
如此制造的经负载的血小板可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合以产生药物组合物。
此外，可通过将负载有本公开的第一化合物的第一分离的血小板、负载有本公开的第二(或第三)化合物的第二分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂组合来产生药物组合物。可使用上述任何第一剂和/或第二剂及其任何组合。
实施例8：通过向受试者施用负载有本公开的化合物的分离的血小板来治疗疾病或病症的说明性方法
在此实施例中，将负载有本公开化合物的分离的血小板施用于有需要的受试者，例如患有疾病或病症的受试者。
在此，向有需要的受试者施用(例如，通过输注或注射)治疗有效量的一种或多种药物组合物，每种药物组合物包含负载有一种或多种本公开的化合物的血小板。
本公开中列出的或本领域中已知的任何剂都可用于此实施例中。所述剂可以是抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在一些实施方案中，一种或多种化合物可包含选自以下的剂：EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)、FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)、FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)、凝血酶及其类似物、CSF3R激动剂(例如，非格司亭)、PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)、烟曲霉素和ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)。
血小板可负载有本公开的组合化合物。作为实例，第一剂和第二剂可以是VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)和PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)；这可用于治疗胰腺癌。此外，第一剂和第二剂可以是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)；这可用于治疗肺癌。第一剂和第二剂可以是多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)和烟曲霉素；这可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。
可替代地，可使用多于两种化合物，其中第一剂、第二剂和第三剂是EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)，以及ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)；这可用于治疗非小细胞肺癌。
可进一步向受试者施用包含以下中的一种或多种的第二药物组合物：乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、和/或金属蛋白酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶。第二药物组合物促进化合物从血小板中释放。
可在施用药物组合物之后施用第二药物组合物，例如在施用第二药物组合物之前施用至少两次。
可向受试者施用另外的治疗剂联合包含经负载的血小板的药物组合物。例如，可向受试者施用负载有VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)的血小板，并且还可施用瑞德西韦；这可用于治疗可能与COVID相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。可向受试者施用负载有多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)和烟曲霉素中的一种或两种的血小板，并且还施用低剂量化学疗法；这可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。可向受试者施用负载有EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)和多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)中的一种或两种的血小板并且还施用低剂量化学疗法；这可用于治疗肺癌。可向受试者施用负载有EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)和ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)中的一种或两种或全部三种的血小板，并且还施用低剂量化学疗法；这可用于治疗非小细胞肺癌。
血小板可负载有两种或更多种本公开的化合物的组合。例如，化合物可具有第一剂和第二剂，它们是VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)和PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)；这可用于治疗胰腺癌。此外，第一剂和第二剂可以是多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)和烟曲霉素；这可用于治疗胰腺癌、肺癌或结肠癌。
有需要的受试者可能患有选自癌症或损伤的疾病或病症。炎症可能是疾病或病症的症状。疾病或病症可以是植入物、移植物、支架或假体的副作用。疾病或病症可由缺陷型基因引起。
实施例9：通过向受试者施用本公开的化合物来治疗疾病或病症的说明性方法
在此实施例中，将本公开的化合物施用于有需要的受试者，例如患有疾病或病症的受试者。
在此，向有需要的受试者施用(例如，通过输注或注射)治疗有效量的包含本公开化合物的药物组合物。在这种方法中，将化合物在体内负载至血小板中。
本公开中列出的或本领域中已知的任何剂都可用于此实施例中。所述剂可以是抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
在一些实施方案中，化合物可包含选自以下的剂：EGFR抑制剂(例如，西妥昔单抗)、VEGF抑制剂(例如，贝伐单抗)、PDL1抑制剂(例如，派姆单抗)、FN1抑制剂(例如，奥克纤溶酶)、多激酶抑制剂(例如，瑞戈非尼)、FGFR2拮抗剂(例如，沙利度胺)、凝血酶及其类似物、CSF3R激动剂(例如，非格司亭)、PSMB5抑制剂(例如，硼替佐米)、烟曲霉素或ALK/ROS1/NTRK抑制剂(例如，克唑替尼)。可向受试者施用多于一种化合物；另外的化合物可具有选自以上列表或本领域已知的任何剂的剂，例如抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
可进一步向受试者施用包含以下中的一种或多种的第二药物组合物：乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、和/或金属蛋白酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶。第二药物组合物促进化合物从血小板中释放。
可在施用药物组合物之后施用第二药物组合物，例如在施用第二药物组合物之前施用至少两次。
可向受试者施用另外的治疗剂联合包含本公开化合物的药物组合物。另外的治疗剂可以是瑞德西韦和/或低剂量化学疗法。
有需要的受试者可能患有选自癌症或损伤的疾病或病症。炎症可能是疾病或病症的症状。疾病或病症可以是植入物、移植物、支架或假体的副作用。疾病或病症可由缺陷型基因引起。
序列表
<110> 希思特思医疗保健公司(CSTS Health Care Inc.)
<120> 血小板促进的治疗性化合物递送
<130> 58533-701.601
<150> US 62/877,459
<151> 2019-07-20
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Glu Arg Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Arg Phe Arg Trp Pro Tyr Arg Ile Arg Glu Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Ala Arg Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Glu Ala Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Glu Arg Ala Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
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1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
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<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
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<211> 11
<212> PRT
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<220>
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Glu Gly Gly Ile Trp Phe Pro Tyr Gly Gly Phe
1 5 10

Claims (147)

1.一种包含第一剂和第一多肽的化合物，其中所述第一多肽包含糖胺聚糖(GAG)结合肽，所述GAG结合肽能够结合血小板的α颗粒中的GAG。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述GAG结合肽结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。
3.如权利要求2所述的化合物，其中所述GAG结合肽优先结合至CS。
4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
6.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
7.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
8.如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽在暴露于约1N NaCl时保持结合至含CS的柱。
9.如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽在暴露于约2N NaCl时保持结合至含CS的柱。
10.如权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽在暴露于约3N NaCl时不结合至含CS的柱。
11.如权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
12.如权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
13.如权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
14.如权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
15.如权利要求14所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
16.如权利要求14或权利要求15所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
17.如权利要求14至16中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性的氨基酸序列。
18.如权利要求14至17中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
19.如权利要求14至18中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
20.如权利要求14至19中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7或位置9的带电氨基酸。
21.如权利要求14至20中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
22.如权利要求14至21中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含至少10个氨基酸。
23.如权利要求14至22中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含11个氨基酸。
24.如权利要求14至23中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽由11个氨基酸组成。
25.如权利要求14至24中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
26.如权利要求14至25中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
27.如权利要求14至26中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
28.如权利要求14至27中任一项所述的化合物，其中所述GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
29.如权利要求14至28中任一项所述的化合物，其中所述第一多肽由所述GAG结合肽组成。
30.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述第一多肽的N端直接或间接地连接至所述第一剂。
31.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中所述第一多肽的C端直接或间接地连接至所述第一剂。
32.如权利要求1至31中任一项所述的化合物，其中所述第一剂通过至少一个接头间接地连接至所述第一多肽。
33.如权利要求32所述的化合物，其中所述至少一个接头包含一个或多个原子。
34.如权利要求32或33所述的化合物，其中所述至少一个接头包含重复单元的聚合物。
35.如权利要求32至34中任一项所述的化合物，其中所述至少一个接头包含氨基酸链。
36.如权利要求1至35中任一项所述的化合物，其中所述第一剂直接连接至所述第一多肽。
37.如权利要求1至36中任一项所述的化合物，其中所述第一剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽。
38.如权利要求1至37中任一项所述的化合物，其中所述第一剂包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
39.如权利要求38所述的化合物，其中所述第一剂包含抗体。
40.如权利要求38所述的化合物，其中所述第一剂包含荧光部分。
41.如权利要求1至40中任一项所述的化合物，其中所述第一剂对哺乳动物细胞有害和/或对受试者有毒。
42.如权利要求1至41中任一项所述的化合物，其中所述第一剂在直接施用至受试者的血流中时易于降解。
43.如权利要求1至42中任一项所述的化合物，其中所述化合物还包含荧光部分。
44.一种分离的血小板，所述分离的血小板包含权利要求1至43中任一项所述的化合物的至少一个拷贝。
45.如权利要求44所述的分离的血小板，其中所述血小板是合成的、同种异体的、自体的或经修饰的异源血小板。
46.如权利要求45所述的分离的血小板，其中所述血小板是自体血小板。
47.如权利要求45所述的分离的血小板，其中所述血小板是同种异体血小板。
48.如权利要求46或权利要求47所述的分离的血小板，其中所述血小板从富含血小板的血浆获得。
49.如权利要求46至48中任一项所述的分离的血小板，其中所述血小板包含所述化合物的1至1000个拷贝。
50.如权利要求49所述的分离的血小板，其中所述化合物的所述1至1000个拷贝被负载至所述血小板的α颗粒中。
51.如权利要求46至50中任一项所述的分离的血小板，所述分离的血小板还包含至少第二化合物，其中所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，其中所述至少第二多肽包含能够结合血小板的α颗粒中的GAG的至少第二糖胺聚糖(GAG)结合肽。
52.如权利要求51所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)或硫酸乙酰肝素(HS)。
53.如权利要求51或权利要求52所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
54.如权利要求51至53中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％、至少约80％或至少约90％同一性的氨基酸序列。
55.如权利要求51至54中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
56.如权利要求51至55中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽包含10个氨基酸或11个氨基酸或由其组成。
57.如权利要求51至56中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
58.如权利要求51至57中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
59.如权利要求51至58中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
60.如权利要求51至59中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
61.如权利要求51至59中任一项所述的分离的血小板，其中所述GAG结合肽包含与SEQID NO:1具有至少约90％同一性的氨基酸序列，并且所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ IDNO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
62.如权利要求61所述的分离的血小板，其中所述GAG结合肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
63.如权利要求51至59中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二剂包含抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)或抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
64.如权利要求51至63中任一项所述的分离的血小板，其中所述第一剂不同于所述至少第二剂。
65.如权利要求51至64中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二剂通过至少一个接头间接地连接至所述至少第二多肽。
66.如权利要求51至64中任一项所述的分离的血小板，其中所述至少第二剂直接连接至所述至少第二多肽。
67.如权利要求51至66中任一项所述的分离的血小板，其中所述血小板包含所述至少第二化合物的1至1000个拷贝。
68.如权利要求51至67中任一项所述的分离的血小板，其中所述化合物被负载至所述血小板中的第一α颗粒中，并且所述至少第二化合物被负载至所述血小板中的至少第二α颗粒中。
69.如权利要求51至68中任一项所述的分离的血小板，其中所述化合物和所述至少第二化合物两者均被负载至同一α颗粒中。
70.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求44至50中任一项所述的分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
71.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求51至69中任一项所述的分离的血小板和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
72.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
包含第一化合物的第一分离的血小板，所述第一化合物包含第一剂和第一多肽，其中所述第一多肽包含能够结合所述血小板的α颗粒中的第一GAG的第一糖胺聚糖(GAG)结合肽；
包含至少第二化合物的至少第二分离的血小板，所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，其中所述至少第二多肽包含能够结合所述血小板的α颗粒中的至少第二GAG的至少第二GAG结合肽；以及
一种或多种药学上可接受的赋形剂。
73.如权利要求72所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素(CS)和/或硫酸乙酰肝素(HS)。
74.如权利要求73所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽优先结合至硫酸软骨素A(CSA)。
75.如权利要求72至74中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
76.如权利要求72至74中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽不优先结合至硫酸乙酰肝素(HS)、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
77.如权利要求72至74中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽不结合至、不会可检测地结合至、基本不结合至或以低亲和力结合至HS、丝甘蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、硫酸皮肤素、硫酸角质素和/或GPIIb/IIIa。
78.如权利要求72至77中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约1NNaCl时保持结合至含CS的柱。
79.如权利要求72至78中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约2NNaCl时保持结合至含CS的柱。
80.如权利要求72至79中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于约3NNaCl时不结合至含CS的柱。
81.如权利要求72至80中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于介于约0.001N与约0.01N之间的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
82.如权利要求72至81中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于至少约0.1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
83.如权利要求72至82中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽在暴露于至少约1N的NaCl时不结合至含HS的柱、含丝甘蛋白聚糖的柱、含串珠蛋白聚糖的柱、含硫酸皮肤素的柱、含硫酸角质素的柱和/或含GPIIb/IIIa的柱。
84.如权利要求72至83中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽的长度介于约8个氨基酸与约14个氨基酸之间。
85.如权利要求84所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少一个带电氨基酸。
86.如权利要求84或权利要求85所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少一个脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
87.如权利要求84至86中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约70％同一性的氨基酸序列。
88.如权利要求84至87中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
89.如权利要求84至88中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
90.如权利要求84至89中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7或位置9的带电氨基酸。
91.如权利要求84至90中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽相对于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任一个包含在位置1、位置4、位置7和/或位置9的脯氨酸、精氨酸和/或异亮氨酸。
92.如权利要求84至91中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含至少10个氨基酸。
93.如权利要求84至92中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含11个氨基酸。
94.如权利要求84至93中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽由11个氨基酸组成。
95.如权利要求84至94中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
96.如权利要求84至95中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列。
97.如权利要求84至96中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
98.如权利要求84至97中任一项所述的药物组合物，其中所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的一个的氨基酸序列组成。
99.如权利要求84至98中任一项所述的药物组合物，其中所述第一多肽和/或所述至少第二多肽分别由所述第一GAG结合肽和/或所述至少第二GAG结合肽组成。
100.如权利要求72至99中任一项所述的药物组合物，其中所述第一多肽和/或所述至少第二多肽的N端分别直接或间接地连接至所述第一剂和/或所述至少第二剂。
101.如权利要求72至99中任一项所述的药物组合物，其中所述第一多肽和/或所述至少第二多肽的C端分别直接或间接地连接至所述第一剂和/或所述至少第二剂。
102.如权利要求72至101中任一项所述的药物组合物，其中所述第一剂和/或所述至少第二剂分别通过至少一个接头间接地连接至所述第一多肽和/或所述至少第二多肽。
103.如权利要求102所述的药物组合物，其中所述至少一种接头包含一个或多个原子。
104.如权利要求102或103所述的药物组合物，其中所述至少一个接头包含重复单元的聚合物。
105.如权利要求102至104中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一个接头包含氨基酸链。
106.如权利要求72至105中任一项所述的药物组合物，其中第一剂和/或所述至少第二剂分别直接连接至所述第一多肽和/或所述至少第二多肽。
107.如权利要求72至106中任一项所述的药物组合物，其中第一剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述第一多肽。
108.如权利要求72至107中任一项所述的药物组合物，其中所述至少第二剂直接或使用马来酰亚胺反应、琥珀酰亚胺酯反应、酶促反应或不影响蛋白质结构或活性的另外缀合系统间接地连接至所述至少第二多肽。
109.如权利要求72至108中任一项所述的药物组合物，其中所述第一剂和/或所述至少第二剂独立地选自由以下组成的组：抗体、化学治疗剂、细胞毒性化合物、小分子、荧光部分、放射性元素、免疫检查点抑制剂、生长因子、生长抑制剂、蛋白酶/蛋白酶、凝血因子、脂质或磷脂、细胞外基质蛋白、激素、酶、趋化因子/化学引诱物、神经营养蛋白、酪氨酸激酶(激动剂或抑制剂)以及抑制细胞增殖、血管生成、炎症、免疫或由血小板介导或与血小板相关的另外生理过程的因子。
110.如权利要求109所述的药物组合物，其中所述第一剂和/或所述至少第二剂包含抗体。
111.如权利要求109所述的药物组合物，其中所述第一剂和/或所述至少第二剂包含荧光部分。
112.如权利要求72至111中任一项所述的药物组合物，其中所述第一剂和/或所述至少第二剂对哺乳动物细胞有害和/或对受试者有毒。
113.如权利要求72至112中任一项所述的药物组合物，其中所述第一剂和/或所述至少第二剂在直接施用至受试者的血流中时易于降解。
114.如权利要求72至113中任一项所述的药物组合物，其中所述第一化合物和/或所述至少第二化合物还包含荧光部分。
115.如权利要求72至114中任一项所述的药物组合物，其中所述第一多肽和所述至少第二多肽是不同的。
116.如权利要求72至114中任一项所述的药物组合物，其中所述第一多肽和所述至少第二多肽是相同的。
117.如权利要求72至116中任一项所述的药物组合物，其中所述第一剂和所述至少第二剂是不同的。
118.如权利要求72至116中任一项所述的药物组合物，其中所述第一剂和所述至少第二剂是相同的。
119.如权利要求72至118中任一项所述的药物组合物，其中所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板独立地选自合成的、同种异体的、自体的和经修饰的异源血小板。
120.如权利要求119所述的药物组合物，其中所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板是自体血小板。
121.如权利要求119所述的药物组合物，其中所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板是同种异体血小板。
122.如权利要求120或权利要求121所述的药物组合物，其中所述第一分离的血小板和/或所述至少第二分离的血小板从富含血小板的血浆获得。
123.如权利要求72至122中任一项所述的药物组合物，其中所述第一分离的血小板包含所述第一化合物的1至1000个拷贝。
124.如权利要求72至123中任一项所述的药物组合物，其中所述至少第二分离的血小板包含所述至少第二化合物的1至1000个拷贝。
125.如权利要求123或权利要求124所述的药物组合物，其中所述第一化合物和/或所述至少第二化合物的所述1至1000个拷贝被负载至所述血小板的α颗粒中。
126.权利要求70至125中任一项所述的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。
127.权利要求70至125中任一项所述的药物组合物在制造用于治疗疾病或病症的药剂中的用途。
128.如权利要求126或权利要求127所述的用途，其中所述疾病或病症是癌症。
129.一种用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求70至125中任一项所述的药物组合物的步骤。
130.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物的步骤，其中所述药物组合物包含权利要求1至43中任一项所述的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
131.如权利要求129或权利要求130所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用第二药物组合物的步骤，所述第二药物组合物包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述第二药物组合物促进化合物从血小板释放。
133.如权利要求131或权利要求132所述的方法，其中在施用所述药物组合物之后施用所述第二药物组合物。
134.如权利要求133所述的方法，其中在施用所述第二药物组合物之前施用所述药物组合物至少两次。
135.如权利要求129至134中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
136.如权利要求129至134中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是损伤。
137.如权利要求129至134中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是炎症。
138.如权利要求129至134中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是植入物、移植物、支架或假体的副作用。
139.如权利要求129至134中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症由缺陷型基因引起。
140.一种用于制造经负载的血小板的方法，所述方法包括以下步骤：
获得血小板，
使所述血小板在体外或离体与权利要求1至43中任一项所述的化合物接触，以及
使所述血小板与所述化合物之间的接触进行直到所述化合物被所述血小板的α颗粒内化，从而产生经负载的血小板。
141.如权利要求140所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
使所述血小板在体外或离体与至少第二化合物接触，其中所述至少第二化合物包含至少第二剂和至少第二多肽，其中所述至少第二多肽包含能够结合血小板的α颗粒中的GAG的至少第二糖胺聚糖(GAG)结合肽；以及
使所述血小板与所述至少第二化合物之间的接触进行直到所述至少第二化合物被所述血小板的α颗粒内化。
142.如权利要求141所述的方法，其中使所述血小板在体外或离体与所述化合物接触的步骤和使所述血小板在体外或离体与所述至少第二化合物接触的步骤是依序的。
143.如权利要求141所述的方法，其中使所述血小板在体外或离体与所述化合物接触的步骤和使所述血小板在体外或离体与所述至少第二化合物接触的步骤是同时发生的。
144.一种用于治疗疾病或病症的药盒，所述药盒包括权利要求44至69中任一项所述的分离的血小板和使用说明书。
145.一种用于治疗疾病或病症的药盒，所述药盒包括权利要求70至125中任一项所述的药物组合物和使用说明书。
146.如权利要求145所述的药盒，所述药盒还包括至少第二药物组合物，所述第二药物组合物包含乙酰肝素酶、凝血酶及其片段肽、蛋白酶激活受体1(PAR1)激动剂或拮抗剂肽、蛋白酶激活受体4(PAR4)激动剂或拮抗剂肽、纤溶酶及其片段、金属蛋白酶、过氧化物酶和/或磷酸水解酶中的一种或多种。
147.一种用于制造经负载的血小板的药盒，所述药盒包括权利要求1至43中任一项所述的化合物和使用说明书。
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