CN114414810A - β-咔啉生物碱harmine在诊断阿尔兹海默症中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及β‑咔啉生物碱harmine在诊断阿尔兹海默症中的用途。本发明通过检测不同生长状态大鼠和不同人群血浆中harmine等生物碱的含量,证实了harmine天然存在于体内,含量随年龄增加而逐渐降低,阿尔兹海默症患者和健康者血浆中harmane水平存在显著差异,表明harmine是一种有生理活性的内源性小分子,可作为阿尔兹海默症的诊断标志物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,具体地说,涉及β-咔啉生物碱harmine在诊断阿尔兹海默症中的用途。
背景技术
骆驼蓬Peganum harmala L.是蒺藜科骆驼蓬属多年生草本植物,其地上部分和种子是维吾尔族、蒙古族、哈萨克族的一种传统草药,常被用于治疗神经、心血管、胃肠、呼吸和内分泌疾病。骆驼蓬子被应用至中成药复方木尼孜其颗粒中,在临床上被广泛应用于调节内分泌、增强免疫功能,治疗肝胆炎症、皮肤疾病、排除体内毒素等。课题组前期对骆驼蓬进行了深入的研究,其中主要的药效成分是β-咔啉生物碱,即harmine,harmaline,harmane,norharman等。
Harmine,harmaline,harmane和norharmane不仅在植物Peganum harmala L.中存在,其他植物,例如Banisteriopsis caapi,Passiflora incarnate L.也有这些生物碱。因其在植物中的广泛分布,一些植物衍生的食品中,也发现了他们的踪迹,例如咖啡、烟草、葡萄干等。通过检测不同品牌、不同加工方式的食品,发现发酵食品、烟熏食品以及烤肉中,也检测到这些生物碱。因此,不难推测在哺乳动物体内,也可能存在着harmine等生物碱。课题组前期试验过程中发现,harmine、harmaline等生物碱,在大鼠的空白血浆中即可检测到。通过查阅文献,发现harmane和norharmane在人及动物的多种组织与体液内,如脑、肝、肾上腺、血液及尿液中均有分布。
人和动物体内的harmine,harmaline,harmane和norharmane是内源性合成还是外源性摄入?他们只存在于特定的生长阶段还是一直存在于体内?他们的含量是否与疾病相关?这些都需要进一步解答。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供β-咔啉生物碱harmine的一种新用途。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
检测β-咔啉生物碱harmine含量的试剂在制备阿尔兹海默症的诊断试剂或试剂盒中的应用。
作为本发明的一种实施方式,检测样本为血浆。
作为本发明的另一种实施方式,所述检测β-咔啉生物碱harmine含量采用的方法为酸性染料比色法、薄层色谱法、近红外光谱法、气质联用法、高效液相色谱法或UPLC-MS/MS法。
作为本发明的另一种实施方式,所述试剂盒还包含harmine标准品。
本发明优点在于:
首先,为解决harmine等生物碱是否为内源性合成,实验以刚出生的大鼠为研究对象,检测了新出生大鼠的血浆和各组织中harmine等生物碱的含量。同时,检测大鼠饲料和垫料中是否含有harmine,harmaline,harmane和norharmane。随后,我们检测了大鼠出生29天以来,血浆和各组织中各生物碱的含量,考察其含量是否有变化趋势。其次,因阿尔兹海默症的发病机制复杂,有多种影响因素,年龄是其中一个重要因素。有研究表示西方阿尔兹海默症患者在65岁时达到2%,随年龄增长每五年多出一倍,约有75%-90%的百岁老人患有AD。可见随着年龄增长,患病的概率逐渐增加。故本发明检测了大鼠生长16个月的过程中血浆里harmine等生物碱的含量,考察其含量是否与年龄相关。最后,本发明以不同种族、性别、年龄的人群为研究对象,通过检测血浆中harmine,harmaline,harmane和norharmane含量,以研究其是否存在种族、性别、年龄等差异。
研究结果表明,harmine天然存在于体内,含量随年龄增加而逐渐降低,阿尔兹海默症患者和健康者血浆中harmane水平存在显著差异,因此harmine是一种有生理活性的内源性小分子,可作为阿尔兹海默症的诊断标志物。
附图说明
图1:各生物碱和IS的MRM色谱图。A:标准样品;B:空白基质;C:实验样品。
图2:新出生大鼠一个月内血浆和组织中harmine含量动态变化规律。
图3:幼鼠生长过程中各组织中harmine的含量。折线表示不同组织中harmine的总量;柱状图显示了幼鼠脏器的重量。
图4:血浆中harmine随时间变化趋势。
图5:8种神经递质随时间的变化趋势。
图6:不同性别、种族等人血浆中各生物碱含量的比较。A:60岁以下和60及60岁以上人群中各生物碱水平的比较;B:不同性别的比较;C:不同民族的比较;D:日常喝酒和不喝酒的人群比较;E:日常抽烟和不抽烟的人群比较;F:健康受试者和阿尔兹海默症患者比较。
图7:ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
第一节harmine等β-咔啉生物碱UPLC-MS/MS检测方法建立
本小节为检测大鼠和人血浆中harmine,harmaline,harmane和norharmane的含量,建立符合定量需求的色谱质谱检测方法。
一、实验材料与方法
1.仪器与试剂
1.1仪器
AB Sciex6500三重四级杆(SCIEX,USA)与岛津LC-30AD液相串联质谱仪;VORTEX MIXER涡旋振荡器(Labnet Inernational,Inc.USA);Milli-Q纯水仪(Millipore,MA,USA);5415R小型台式冷冻离心机(Eppendorf,Germany);赛多利斯BP211D精密电子天平(Sartorius,Germany);移液枪(Eppendorf Research,1-10,10-100,10-200,100-1000μL);SANYO MDF-U73V ULTRA LOW超低温冰箱(Sanyo Electric Co.,Ltd.,Japan);海尔医用4℃冷藏箱(青岛海尔股份有限公司,山东);海尔BC/BD-429H-20℃电冰柜(青岛海尔股份有限公司,山东)。
1.2试剂
Harmaline,harmane购买于TCI(东京化成工业株式会社,Tokyo chemicalindustry Co.,Ltd.,Japan);norharmane,9-氨基吖啶(tacrine,IS)购买于Sigma AldrichCo.(St.Louis,MO,United States);harmine由本实验室从骆驼蓬种子提取物中分离获得,通过MS与NMR鉴定,经鉴定纯度大于98%;高氯酸和氢氧化钠购买于Biotech,Co.Ltd.(Dalian,China);牛血清白蛋白购买于YEASEN Biotechnology,Co.Ltd.(Shanghai,China)。色谱级乙腈、甲醇、甲酸购于Fisher Co.Ltd.,(Thermo FisherScientific,NJ,USA)。超纯水由Milli-Q Academic System(Millipore,Billerica,MA)获得。
2.实验方法
2.1质谱参数
本实验采用AB Sciex6500三重四级杆(SCIEX,USA),使用ESI作为离子源,采用多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)正离子检测模式。雾化气与干燥气均由氮气发生器提供;其它各离子源参数如下:气帘气(Curtain gas),30psi;碰撞气(Collision gas),medium;离子源电压(Ionspray voltage),5500V;离子源温度(Sourcetemperature),500℃;离子源气体1(Ion source gas 1),50psi;离子源气体2(Ionsource gas 2),50psi。优化后的质谱参数如表1所示。
表1:待测物和内标的质谱参数
2.2液相参数
本实验采用岛津LC-30AD液相,选用UPLC BEH C18色谱柱(50×2.1mm,1.7μm,waters,USA);流动相为0.1%甲酸-乙腈,洗脱梯度:0min-2.5min 9%-13%乙腈;2.51min-3min 14%-14.5%乙腈;3min-4min14.5%-15.5%乙腈;4min-5min 15.5%-90%乙腈;5min-6min 90%-90%乙腈;6min-7min 90%-9%乙腈;7min-8min 9%乙腈。柱温45℃,样品室温度4℃,流速0.4ml/min,进样体积20μl。
2.3溶液配制
2.3.1储备液配制
于称量纸上分别精密称取harmaline、harmine、harmane、Norharmane各5mg,用甲醇溶解后,于5ml容量瓶中用甲醇定容,得1mg/ml储备液。
2.3.2工作液配制
精密移取harmaline、harmine、harmane、norharmane储备液,按照下列浓度配制系列梯度:0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml。内标tacrine配制成7ng/ml的6%高氯酸水溶液。
2.3.3标准曲线及质控样品配制
以替代血浆(0.9%NaCl和4%牛血清白蛋白)为空白基质与上述各生物碱系列浓度工作液配制标准曲线样品,浓度依次为0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml,内标浓度为7ng/ml。质控样品(Quality Control,QC)按相同方法制得,包括定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ)、LOQ、MOQ、HOQ四个浓度,浓度分别为0.05ng/ml、0.2ng/ml、5ng/ml、20ng/ml。
2.4方法学验证
2.4.1专属性
比较不同空白基质、标准品和实验样品的色谱图。要求能区分待测分析物、内标与基质等内源性组分。
2.4.2残留效应
进最高浓度的样品后,连续进三针空白样品,空白样品中待测分析物的峰面积不能超过定量下限峰面积的20%。
2.4.3定量下限
LLOQ是标准曲线的最低点,其响应值应是空白生物基质干扰物响应值的10倍以上,即S/N≥10,且精密度应不超过20%,准确度应在±20%的范围之内,要能够满足实验样品浓度检测的要求。
2.4.4标准曲线
标准曲线的范围要能够覆盖所预期样品的浓度范围。系列浓度:0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20ng/ml混合标准品的溶液进样分析,以各待测分析物浓度x为横坐标,待测物与内标峰面积比值y为纵坐标,采用1/x2加权最小二乘法进行线性回归,线性回归方程的相关系数(R2)要大于0.99。
2.4.5精密度
精密度通过测定LLOQ、LQC、MQC、HQC四个浓度的QC样品溶液(n=6)获得,代入方程计算其精密度,表示为相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD),RSD%=SD/Mean×100%,SD为6次测得浓度的标准偏差,Mean为6次测得浓度的平均值。一般RSD不超过±15%,定量下限不超过±20%。
2.4.6准确度
准确度为待测分析物的计算值与真实值的符合程度。LLOQ、LQC、MQC、HQC四个浓度的QC样品溶液(n=6)分别进样测定,通过标准曲线计算得到待测分析物的浓度,随后计算相应的准确度,准确度表示为测得浓度/真实浓度。准确度要求在±15%,定量下限不超过±20%。
2.4.7基质效应
基质效应是考察内源性基质对不同浓度待测分析物的影响。基质效应包括两个部分:用空白基质(预处理的基质)配制各待测分析物QC样品(LLOQ、LQC、MQC、HQC四个浓度)的响应测定值;用初始流动相配制不含基质的相应浓度各待测分析物样品的响应测定值。代入标准曲线计算得到含基质与不含基质的测定浓度,两者测定浓度的比值即为该待测分析物的基质效应。一般基质效应要求不超过±15%,定量下限不能够超过±20%。
2.4.8提取回收率
提取回收率是指分析样品处理的提取效率,表示为样品处理前后待测分析物的含量。提取回收率包括空白基质中加入待测分析物(LLOQ、LQC、MQC、HQC四个浓度,n=6)经提取后测得的峰面积和空白基质提取后加入待测分析物和内标测得的峰面积,两者的比值即为提取回收率。
2.4.9稳定性
稳定性是考察不同储存方式下,待测分析物在样品中的稳定性。稳定性试验要求测定LLOQ、LQC、MQC、HQC四个浓度的样品,每个样品重复6次。本次稳定性考察常温放置4小时的稳定性、冻存16个月稳定性、反复冻融三次以及4度冷藏24小时的稳定性,以RSD表示。
二、实验结果
1.专属性和残留效应
为满足实验后期对人、大鼠血浆以及大鼠组织的检测,本实验采用的基质为替代血浆(4%牛血清白蛋白和0.9%生理盐水)。通过比较空白基质样品、标准样品及实验样品的色谱图,发现该基质中含有harmine和harmaline两种生物碱,结果如图1所示。通过连续进三针最高浓度标准样品后,进一针空白基质,空白基质样品中待测分析物的峰面积扣除本底值后,没有明显的系统残留,不影响后续检测。
2.定量下限和标准曲线
以各待测分析物浓度x为横坐标,待测物与内标峰面积比值y为纵坐标,采用1/x2加权最小二乘法进行线性回归,各生物碱的标曲和定量下限如表2所示。结果显示,各分析物线性良好,相关系数符合生物样品定量分析方法验证指导原则要求和检测要求。
表2:Harmaline,harmine,harmane和norharmane的标准方程
3.精密度和准确度
精密度和准确度采用LLOQ、LOQ、MOQ和HOQ四个浓度进行分析,各生物碱的精密度和准确度如表3所示,四种生物碱的准确度分别在90.25%-104.60%,85.48%-104.62%,88.17%-103.40%,86.65%-104.55%之间,精密度在2.74%-4.77%,1.98%-4.53%,3.18%-5.61%,5.18%-9.03%之间。符合生物样品定量分析方法验证指导原则要求。
表3:Harmaline,harmine,harmane和norharmane的精密度和准确度(n=6)
4.基质效应和回收率
基质效应和回收率用LLOQ、LOQ、MOQ和HOQ四个浓度进行分析,各生物碱的精密度和准确度如表4所示。结果显示,harmine等生物碱的提取回收率分别在88.07%-119.83%,86.52%-100.78%,89.21%-97.37%,84.52%-98.24%之间,基质效应在85.76%-118.52%,88.11%-101.21%,89.21%-96.27%,84.57%-104.35%之间,均符合生物样品定量分析方法验证指导原则要求。
表4:各β-咔啉类生物碱基质效应和提取回收率(n=6)
5.稳定性
稳定性用LLOQ、LOQ、MOQ和HOQ四个浓度进行分析,考察了样品室温保存4h、-80℃冷藏16个月、反复冻融3次和4℃冷藏24h的稳定性,结果如表5所示。结果显示,各存储条件下,harmaline的RSD分别为3.20%-9.10%,2.17%-8.97%,3.62%-4.29%,0.62%-4.30%;harmine的RSD分别为1.56%-4.42%,3.47%-9.86%,2.63%-7.96%,2.65%-4.24%;harmane的RSD分别为1.19%-3.18%,1.09%-2.95%,3.20%-6.51%,0.30%-5.00%;norharmane的RSD分别为1.36%-5.35%,3.01%-8.92%,5.65%-7.65%,0.49%-1.97%。均符合生物样品定量分析方法验证指导原则要求。
表5:各β-咔啉类生物碱稳定性(n=6)
三、小结与讨论
在这一小节中,我们建立了内源性harmine、harmaline、harmane和nor-harmane的UPLC-MS/MS检测方法,专属性、残留效应、标准曲线、精密度、准确度、基质效应、提取回收率等均符合生物样品定量分析方法验证指导原则要求。
第二节harmine等β-咔啉生物碱在不同生长阶段大鼠体内的分布研究
本小节为了明确harmine,harmaline,harmane和norharmane是否为内源性化合物,对刚出生的大鼠进行了检测,为了排除外源性干扰,对实验动物的垫料和饲料也进行了检测。为考察harmine,harmaline,harmane和norharmane是否长期存在于动物体内,本小节还对大鼠生长16个月的血浆进行了检测。
一、实验材料与方法
1.仪器与试剂
1.1仪器
AB Sciex6500三重四级杆(SCIEX,USA)与岛津LC-30AD液相串联质谱仪;VORTEX MIXER涡旋振荡器(Labnet Inernational,Inc.USA);Milli-Q纯水仪(Millipore,MA,USA);5415R小型台式冷冻离心机(Eppendorf,Germany);高通量组织研磨仪(上海万柏生物,上海);赛多利斯BP211D精密电子天平(Sartorius,Germany);移液枪(EppendorfResearch,1-10,10-100,10-200,100-1000μL);SANYO MDF-U73V ULTRA LOW超低温冰箱(Sanyo Electric Co.,Ltd.,Japan);海尔医用4℃冷藏箱(青岛海尔股份有限公司,山东);海尔BC/BD-429H-20℃电冰柜(青岛海尔股份有限公司,山东)。
1.2试剂
Harmaline,harmane购买于TCI(东京化成工业株式会社,Tokyo chemicalindustry Co.,Ltd.,Japan);norharmane,9-氨基吖啶(tacrine,IS)购买于Sigma AldrichCo.(St.Louis,MO,United States);harmine由本实验室从骆驼蓬种子提取物中分离获得,通过MS与NMR鉴定,经鉴定纯度大于98%;高氯酸和氢氧化钠购买于Biotech,Co.Ltd.(Dalian,China);牛血清白蛋白购买于YEASEN Biotechnology,Co.Ltd.(Shanghai,China)。L-Trp、5-HT、5-HIAA、ACh、Ch、L-Glu、L-Phe、L-Tyr、茶碱(theophylline,Theo)和肝素钠购自Sigma Aldrich Co.(St.Louis,MO,United States)。色谱级乙腈、甲醇、甲酸购于Fisher Co.Ltd.,(Thermo Fisher Scientific,NJ,USA)。超纯水由Milli-Q Academic System(Millipore,Billerica,MA)获得。
2.实验方法
2.1大鼠出生一个月内血浆和组织中生物碱的暴露规律研究
2.1.1溶液配制
2.1.1.1储备液配制
于称量纸上分别精密称取harmaline、harmine、harmane、norharmane各5mg,用甲醇溶解后,于5ml容量瓶中用甲醇定容,得1mg/ml储备液。
2.1.1.2标准曲线配制
以替代血浆(0.9%NaCl和4%牛血清白蛋白)为空白基质与上述各生物碱系列浓度工作液配制标准曲线样品,浓度依次为0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml,内标浓度为7ng/ml。
2.1.2血浆和组织样品采集
本实验采用11只孕鼠,动物被安置在标准环境条件下光照充足的空调房间(室温和相对湿度分别保持在25℃±1℃和60%-65%),并在研究前自由获得动物饲料和自来水。所有动物使用程序均按照1988年11月14日中华人民共和国国家科学技术委员会颁布并经上海中医药大学动物伦理委员会批准的《动物实验规程》(NO.PZSHUTCM190912018;批准日期:2019年9月12日)。
实验周期共29天,孕鼠在环境控制室中饲养,在整个实验过程中都可以自由获得食物和水。分娩后,幼鼠按母鼠分为11组。每个采样点包含从10只不同母鼠获得的10只幼鼠,分别于出生后第1(P1)、3(P3)、5(P5)、7(P7)、9(P9)、12(P12)、15(P15)、18(P18)、21(P21)、25(P25)、29(P29)天处死幼鼠进行采样,共采集11个采样点。
每只怀孕大鼠可产下约10只幼鼠,每只幼鼠在固定时间处死,以确保每个时间点有10个样本(雌雄各半)。幼鼠的性别由肛门生殖器距离决定。幼鼠在指定时间麻醉采集标本,分组和采样时间见表6。幼鼠在指定时间麻醉采集标本,取血浆和各脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、白色脂肪、棕色脂肪、生殖器)。从每只大鼠眼静脉丛采血约0.5mL,转入1.5mL肝素化管。将血液4℃3000×g离心10分钟,再将上清100μL转移到另一个1.5毫升离心管。同时收集大鼠的组织,即心、肝、脾、肺、肾、生殖器官、肌肉、白色脂肪、棕色脂肪。将各种组织称重并储存在合适的试管中。所有血浆和组织样品在-80℃保存至分析。
表6:幼鼠采样时间及性别
注:每次采样至少10只大鼠(雌雄各半)。5号鼠1只幼鼠死亡。/:没有抽样。
2.1.3饲料和垫料检测
检测饲料和垫料中的harmine,harmaline,harmane和norharmane的浓度。从11只以上怀孕大鼠及其幼鼠的笼子中获取饲料和垫料样品。检测方法参照Yang等制定的质量规范。饲料和垫料准确地粉化和称重。将粉末加入25倍于其体积的甲醇中,超声处理25min,功率250W,频率30kHz。然后将上清液(5ml)转移到另一管中,在37℃氮吹干。用100μL的9%乙腈复溶,旋涡2min,在4℃、13000×g离心10min后,上清液20μL注入UPLC-ESI-MS/MS体系中分析生物碱(杨雅迪,程雪梅,王长虹,郑立明,李岩,李晓静,张磊,温方方,and王峥涛,维药骆驼蓬子药材质量标准研究,中国药学杂志,2014,49,106-112.)。
2.1.4样品检测
取100μL血浆,加入80μL含IS 2ng/ml的6%高氯酸,置于1.5ml离心管中漩涡混合2min。4℃,13000×g离心10min。将上清转移至另一管,加入适量氢氧化钠溶液。上述溶液在4℃下旋转2min,在13000×g离心10min。取20μL上清液注入UPLC-ESI-MS/MS系统进行分析。质谱液相方法如第一节所示。
动物组织解冻后,精密称重,加入9倍量的PBS溶液,采用组织匀浆机匀浆,功率60Hz,时间60s。随后,13000×g离心10min,取上清100μL,制备方法同血浆。
2.1.5数据处理
采用SPSS version 18.0软件进行统计分析,数据以均数±标准差表示。
2.2自然衰老过程中大鼠血浆中β-咔啉类生物碱的暴露规律研究
2.2.1溶液配制
2.3.1.1储备液配制
于称量纸上分别精密称取harmaline、harmine、harmane、norharmane各5mg,用甲醇溶解后,于5ml容量瓶中用甲醇定容,得1mg/ml储备液。
分别精密称取L-Trp、5-HT、5-HIAA、ACh、Ch、γ-GABA、L-Glu、Theo和L-Phe 5mg于称量纸,超纯水溶解后,置5mL容量瓶定容,得浓度为1mg/mL的储备液;精密称取L-Tyr 5mg于称量纸,用超纯水溶解,并加50μL 36%浓盐酸助溶后,转移至5mL容量瓶中,制得浓度为1mg/mL的储备液。
2.3.1.2工作液配制
精密移取harmaline、harmine、harmane、norharmane储备液,按照下列浓度配制系列梯度:0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL。内标tacrine配制成7ng/mL的6%高氯酸水溶液。
分别精密移取各储备液适量,按照下列浓度配制系列梯度:L-Trp、5-HT、5-HIAA、γ-GABA、L-Glu、L-Tyr、ACh、Ch、L-Phe:100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000ng/mL。内标Theo配制成60ng/mL的乙腈溶液。
2.3.1.3标准曲线及质控样品配制
以替代血浆(0.9%NaCl和4%牛血清白蛋白)为空白基质与上述各生物碱系列浓度工作液配制标准曲线样品,浓度依次为0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml,内标浓度为7ng/ml。
以含4%牛血清白蛋白的0.9%NaCl作为空白基质,与上述各神经递质工作溶液配制标准曲线样品,浓度依次为10、20、40、80、100、200、400、800、1000ng/mL;内标Theo在体系中的浓度为20ng/mL。
2.2.2样品采集
本实验采用SD大鼠20只(200~220g),雌雄各10只,动物被安置在标准环境条件下光照充足的空调房间(室温和相对湿度分别保持在25℃±1℃和60%-65%),并在研究前自由获得动物饲料和自来水。所有动物使用程序均按照1988年11月14日中华人民共和国国家科学技术委员会颁布并经上海中医药大学动物伦理委员会批准的《动物实验规程》(NO.PZSHUTCM190912018;批准日期:2019年9月12日)。
这些大鼠饲养在环境控制室中,在整个实验过程中都可以自由获得食物和水。实验持续了16个月。每个月采集一次血样,大约在上午9点到11点抽血。异氟烷麻醉后眼眶静脉丛取血于肝素化的离心管中,3000×g离心10分钟,取上清于另一1.5mL离心管中,并-80℃冰箱中保存。共饲养16个月,共获得16批血浆。
2.2.2样品检测
采用AB Sciex6500三重四级杆(SCIEX,USA)与岛津LC-30AD液相串联质谱仪测定各生物碱浓度。液相质谱方法如第一节所示。从-80℃冰箱中取出血浆,4℃冰箱解冻,取100μl于1.5ml离心管中,加入80μl含内标的6%高氯酸,置于1.5ml离心管中漩涡混合2min。4℃,13000×g离心10min。将上清转移至另一管,加入适量氢氧化钠溶液。上述溶液在4℃下旋转2min,在13000×g离心10min。取20μL上清液注入UPLC-ESI-MS/MS系统进行分析。
采用AB Sciex6500三重四级杆(SCIEX,USA)与岛津LC-30AD液相串联质谱仪测定神经递质浓度。采用ZIC-cHILIC色谱柱(150mm×2.1mm,3μm)和SeQuant ZIC-cHILIC保护柱(20mm×2.1mm,5μm,Merck-Sequant,Germany)进行色谱分离。流动相为乙腈(A)-水混合物,含0.1%甲酸(B),梯度洗脱如下:0-8min,65%A。本实验使用ESI离子源,采用MRM正离子检测模式。雾化气与干燥气均由氮气发生器提供;其它各离子源参数如下:气帘气(Curtain gas),30psi;碰撞气(Collision gas),medium;离子源电压(Ionsprayvoltage),5500V;离子源温度(Source temperature),500℃;离子源气体1(Ion sourcegas 1),50psi;离子源气体2(Ion source gas 2),50psi。方法验证良好,成功应用于神经递质浓度的测定。
质谱参数如表7所示。
表7:各神经递质的质谱参数
样品处理方法如下:采用蛋白沉淀法对血浆及脑匀浆样品进行前处理。取100μL血浆样品置于1.5mL离心管内,再加入200μL含内标(Theo:60ng/mL)的乙腈溶液进行蛋白沉淀,涡旋1min,15,000×g,4℃高速离心10min,离心后移取上清100μL至液相小瓶中,吸取5μL进行UPLC-ESI-MS/MS分析。
2.2.3数据处理
采用SPSS version 18.0软件进行统计分析,数据以均数±标准差表示。用直方图和Q-Q图对数据分布进行图形化评估。本研究采用参数检验。采用T检验比较各组间生物碱浓度。统计学意义如下,P<0.05表示有差异,P<0.01表示有显著性差异,P<0.001表示有极显著性统计学差异。
二、实验结果
1.大鼠出生一个月内血浆和组织中生物碱的暴露规律研究
将上述获得的数据,代入标曲计算得最终浓度。以时间为横坐标,含量为纵坐标作图,如图2所示。在血浆(0.16±0.03ng/ml)、脑(0.33±0.14ng/g)、白色脂肪(0.33±0.07ng/g)、生殖器(0.39±0.12ng/g)中,harmine含量随着大鼠生长发育逐渐降低,其他组织(心(0.34±0.15ng/g)、肝(0.26±0.11ng/g)、脾(0.37±0.12ng/g)、肺(0.46±0.11ng/g)、肾(0.44±0.13ng/g)、肌肉(0.31±0.18ng/g)、棕色脂肪(0.36±0.17ng/g))中harmine含量没有随时间显著降低的趋势,基本趋于稳定。
随后,计算各组织中harmine的含量,绘制量-时间曲线(图3)。随着幼鼠的成长,其脑、心、肝、脾、肺、肾等组织中的harmine总量增加。在心脏、肺和肾脏的组织中,harmine的总量随着器官的发育而增加,直到出生后第三周。值得注意的是,在出生后的第二周,大脑中harmine的增加速度快于体重的增长速度。
同时,饲料和垫料中均未发现harmine,harmaline,harmane和norharmane。在同一出峰时间检测到微弱信号响应,上清液浓缩50倍后,所有响应均低于定量下限,响应值如表8所示。
表8:饲料和垫料中harmine等生物碱的分析物峰面积
2.自然衰老过程中大鼠血浆中β-咔啉类生物碱的暴露规律研究
2.1自然衰老大鼠血浆内生物碱含量变化
本实验共检测4个β-咔啉类生物碱,其中有多数样品未检测到harmaline、harmane、norharmane,故以下只有harmine的统计结果。以harmine含量为纵坐标,时间为横坐标,以取血的时间点为横坐标作图,如图4所示。随着年龄的增长,血浆中harmine的浓度逐渐降低。在第1个月,harmine含量达到1.80±1.51ng/mL,第16个月降至0.35±0.04ng/mL。第1个月harmine浓度极显著高于第6~16个月(P<0.01)。在第2~5个月,harmine的含量呈下降趋势,但有轻微的波动。在第6个月浓度趋于稳定,并维持在低浓度(P>0.05)。
2.2自然衰老大鼠血浆神经递质含量变化
同时,测定了大鼠衰老过程中血浆中神经递质浓度。如图5所示,各种神经递质表现出不同的变化趋势(浓度范围,均值±SD):5-HIAA(154.7–691.0ng/mL,384.3±151.3ng/mL),5-HT(45.4–9850.2ng/mL,2653.0±2644.0ng/mL),ACh(30.1–137.7ng/mL,63.4±25.4ng/mL),Ch(112.1–1526.1ng/mL,613.0±295.1ng/mL),Glu(778.2–5998.6ng/mL,1878.9±914.8ng/mL),L-Trp(11006.5–44853.4ng/mL,21091.9±5915.5ng/mL),Phe(5734.4–16919.3ng/mL,9169.1±1703.7ng/mL),和Tyr(10098.0–32219.6ng/mL,20339.2±4809.8ng/mL)。5-HT、ACh、Glu、L-Trp和Phe的暴露水平随年龄增长而降低,而5-HIAA、Ch和Tyr的暴露水平随时间变化不显著。
三、小结与讨论
对新生大鼠和自然衰老大鼠血浆和组织中的harmine、harmaline、harmane和norharmane进行了检测。发现harmine天然地存在于大鼠体内,且含量随年龄增加而逐渐降低,进一步证明了其是内源性的存在于大鼠,且与AD存在一定的关联。
第三节harmine等β-咔啉生物碱在不同年龄、性别等受试者体内的分布研究
为了进一步证明harmine是内源性的,收集了不同年龄、不同性别、不同健康状态等的志愿者,采集血浆检测其中各生物碱的暴露水平,并进一步分析其暴露规律。
一、实验材料与方法
1.仪器与试剂
1.1仪器
AB Sciex6500三重四级杆(SCIEX,USA)与岛津LC-30AD液相串联质谱仪;VORTEX MIXER涡旋振荡器(Labnet Inernational,Inc.USA);Milli-Q纯水仪(Millipore,MA,USA);5415R小型台式冷冻离心机(Eppendorf,Germany);赛多利斯BP211D精密电子天平(Sartorius,Germany);移液枪(Eppendorf Research,1-10,10-100,10-200,100-1000μL);SANYO MDF-U73V ULTRA LOW超低温冰箱(Sanyo Electric Co.,Ltd.,Japan);海尔医用4℃冷藏箱(青岛海尔股份有限公司,山东);海尔BC/BD-429H-20℃电冰柜(青岛海尔股份有限公司,山东)。
1.2试剂
Harmaline,harmane购买于TCI(东京化成工业株式会社,Tokyo chemicalindustry Co.,Ltd.,Japan);norharmane,9-氨基吖啶(tacrine,IS)购买于Sigma AldrichCo.(St.Louis,MO,United States);harmine由本实验室从骆驼蓬种子提取物中分离获得,通过MS与NMR鉴定,经鉴定纯度大于98%;高氯酸和氢氧化钠购买于Biotech,Co.Ltd.(Dalian,China);牛血清白蛋白购买于YEASEN Biotechnology,Co.Ltd.(Shanghai,China)。色谱级乙腈、甲醇、甲酸购于Fisher Co.Ltd.,(Thermo FisherScientific,NJ,USA)。超纯水由Milli-Q Academic System(Millipore,Billerica,MA)获得。
2.实验方法
2.1溶液配制
2.1.1储备液配制
于称量纸上分别精密称取harmaline、harmine、harmane、Norharmane各5mg,用甲醇溶解后,于5ml容量瓶中用甲醇定容,得1mg/ml储备液。
2.1.2工作液配制
精密移取harmaline、harmine、harmane、norharmane储备液,按照下列浓度配制系列梯度:0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL。内标tacrine配制成7ng/mL的6%高氯酸水溶液。
2.1.3标准曲线及质控样品配制
以替代血浆(0.9%NaCl和4%牛血清白蛋白)为空白基质与上述各生物碱系列浓度工作液配制标准曲线样品,浓度依次为0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml,内标浓度为7ng/ml。
2.2取样
健康受试者者来自两个地方:上海中医药大学和中国新疆喀什地区第一人民医院。所有的参与者都没有任何神经退化。从上海中医药大学中总共招募了131名参与者。其中大部分是24-30岁的学生,15名志愿者是31-55岁的工作人员。其他419名参与者来自中国新疆喀什地区第一人民医院。所有人都到喀什市第一人民医院进行了体检。419名健康志愿者参与了实验。
首先,每个参与者采血之前都要填写知情同意书。实验开始前,需要进行健康检查和问卷调查。如果受试者无法自行回答问题,则由监护人代替。其中问卷调查包括姓名、性别、籍贯、种族、生活习惯和联系方式。健康检查包括了认知水平检查、肝功能、肾功能、血脂、心肌和血糖检查。健康受试者认知水平均为正常。具体信息如表9所示。
表9:健康受试者和AD患者信息
-:无相关数据。
受试者空腹12小时后,静脉采血约1mL。血样于4℃条件下,3000×g离心10min。用移液枪吸取上清于干净的离心管中,-80℃保存。
2.3检测
于-80℃冰箱中取出样品,4℃冰箱融化。用移液枪精密移取100μL血浆于1.5mL离心管中,加入含内标的6%高氯酸80μL,涡旋2min后,13000×g,4℃离心10min。移取上清后加入1M NaOH。涡旋混匀后离心,取100μL于液相小瓶中,进样检测。
2.4数据处理
采用SPSS version 18.0软件进行统计分析,数据以均数±标准差表示。采用独立样本T检验分析不同性别、不同民族、不同生活习惯的差异,采用秩和检验分析不同生理状态和不同年龄的受试者血浆中生物碱的含量差异。
二、实验结果
本实验共检测了550位健康受试者和11位阿尔兹海默症患者的血浆,以不同年龄、不同性别、不同民族、不同生活习惯和不同健康状态分组,以浓度为纵坐标,分别作图,如图6所示。60岁以下健康受试者的血浆中harmine(1.90±3.27ng/ml)、harmaline(0.36±0.90ng/ml)显著高于60及60岁以上的健康受试者(harmine:0.99±0.54ng/ml;harmaline:0.13±0.07ng/ml)(P<0.001)。女性健康受试者血浆中harmine和harmaline的含量显著高于男性(P<0.05)。具体信息如下:harmine(female:2.03±3.07ng/ml;male:1.57±2.16ng/ml),harmaline(female:0.57±1.32ng/ml;male:0.24±0.53ng/ml)。在不同民族人群的血浆中,汉族健康受试者血浆中harmine和harmaline(harmine:1.82±2.74ng/ml;harmaline:0.42±1.00ng/ml)显著高于维吾尔族(harmine:1.47±1.72ng/ml;harmaline:0.17±0.38ng/ml)(P<0.05)。日常不饮酒的健康受试者血浆中harmaline含量(0.42±1.02ng/ml)显著高于日常饮酒的人群(0.22±0.57ng/ml)(P<0.05)。但是harmine没有受到影响(P>0.05)。吸烟与否不会影响受试者中任何生物碱的含量(P>0.05)。Harmane的含量在不同年龄、不同性别、不同民族和不同生活习惯的受试者血浆中均无显著差异(P>0.05)。
阿尔兹海默症患者血浆中harmine(0.88±0.41ng/ml)显著低于健康受试者(1.72±2.50ng/ml)(P<0.05)。Harmane的结果正相反(P<0.001)。患者血浆中harmane(0.41±0.07ng/ml)显著高于健康受试者(0.20±0.13ng/ml)。健康受试者血浆中harmaline(0.28±0.49ng/ml)显著低于患者(0.36±0.14ng/ml)(P<0.001)。
分别以血浆中harmine,harmaline和harmane浓度为检验变量,患病组标记为1,对照组标记为2,作为状态变量,于IBM SPSS Statistics 23.0绘制ROC曲线,如图7和表10所示。其中harmine的曲线下面积为0.628,有一定的诊断真实性,诊断截点为0.99ng/mL,敏感度为54%,特异性为91%,而harmaline和harmane的曲线下面积分别为0.145和0.049,不具有诊断作用。
表10:ROC曲线下方的区域
三、小结与讨论
人血浆中没有检测到norharmane,而有harmine,harmane和harmaline,且存在性别、年龄等差异。AD患者和健康者血浆中harmane、harmaline和harmane水平存在显著差异。harmine在人血浆中的分布差异以及对AD的诊断作用表明其作为AD的生物标志物的潜力。
除了harmaline,这些生物碱在吸烟者和饮酒者中没有发现显著差异。烟草中含有harmine等生物碱,而抽烟和非抽烟受试者血浆中,harmine,harman和harmaline的含量没有显著性差异,表明动物体内的harmine等生物碱相对于外源性摄取,内源性合成可能是更重要的来源。
harmine是一种广泛存在于哺乳动物体内的β-咔啉生物碱,在大鼠、小鼠和人类的血浆中均有发现。在新生大鼠的血浆和许多组织中发现了harmine,且之前并没有相关的摄取。此外,harmine与生长过程(年龄)、性别、种族和生理状态高度相关。这些结果表明,harmine是一种具有生理活性的内源性小分子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.检测β-咔啉生物碱harmine含量的试剂在制备阿尔兹海默症的诊断试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,检测样本为血浆。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述检测β-咔啉生物碱harmine含量采用的方法为酸性染料比色法、薄层色谱法、近红外光谱法、气质联用法、高效液相色谱法或UPLC-MS/MS法。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包含harmine标准品。
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