CN114414543A - 一种测定荧光探针绝对浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用等温延伸测定荧光探针绝对浓度的方法，由于常用的荧光探针的波长范围在360～760nm之间，所以可以利用qPCR仪来进行精准定量，该方法利用等温延伸的原理，使用过量的DNase I，在低浓度下将荧光探针稀释成线性梯度比，在确保反应为零级反应时，根据反应产生的荧光信号值确定荧光探针的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及生物探针技术领域，具体为一种测定荧光探针绝对浓度的方法。
背景技术
荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理，化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法，该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测，这种技术的基本特点，是具备高度灵敏性和极宽的动态时间响Chemicalbook应范围，随着科学发展，荧光分子在信息传递过程中，由于受到不同的环境刺激如异构体互变、离子配位、氧化还原、光电控制的电子能量转移，弱键的形成与断裂等而发生荧光变化，可以实现荧光的开关转换，更适合于生物微观结构的识别和标记，因而近年来荧光分子作为探针在生命科学、环境科学、材料科学、信息科学等领域得到了广泛的应用。
现有的荧光探针都是探针合成公司在荧光探针合成后，利用Qubit测定其在液体状态下的浓度，然后再在真空下抽干成粉末。在抽成干粉的过程中可能会导致有部分粉末飘散出离心管，导致最终浓度不准确、批间差大。而下游公司在拿到探针后往往根据合成公司标定的OD值直接稀释利用，或仅仅做粗略的测定，这就导致在qPCR实验中，由于荧光探针浓度的不精确造成实验结果的不稳定。所以在下游的使用过程中，知道荧光探针的精确浓度就变得尤其重要。
发明内容
基于上述情况，我们公开了一种测定荧光探针绝对浓度的方法，解决上述技术问题。本发明建立了一套测量荧光探针绝对浓度的方法。该方法测定的荧光探针的浓度精确度高、适用范围广、操作难度低。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
(1)根据OD值稀释荧光探针；
(2)将荧光探针稀释至能产生零级反应的范围；
(3)在零级反应浓度的基础上将荧光探针稀释多个梯度；
(4)根据荧光探针的激发光和发射光的范围选择合适的滤光片；
(5)根据酶标仪上的荧光信号值做出标准曲线，算出荧光探针的准确浓度；
优选的，步骤(2)所述的探针浓度应低于50pmol/uL,高于5pmol/uL；
优选的，步骤(3)所述的稀释梯度应不少于6个，不高于10个；
优选的，步骤(4)中酶标仪的滤光片可选择的波长在340～850nm之间，需根据探针的波长选择合适的滤光片；
优选的，步骤(4)中的酶标仪也可以用7500、LC480等qPCR仪来检测，具体可检测波长由探针的激发和发射波长，以及仪器能检测的波长共同决定；
优选的，步骤(5)中酶标仪的检测时长应该确保探针到达平台期后一段时间，保证探针完全消耗，能够取到足够多的点计算平均值，理论上信号点应该大于3个；
优选的，步骤(5)中为提高探针检测的精准度，所做曲线的信号值应为荧光探针的信号值-背景荧光的信号值，且曲线的R2≥0.98；
本发明的技术原理如下：本发明提供一种测定荧光探针精确浓度的方法，由于常用的荧光探针的波长范围在360～760nm之间，所以可以利用qPCR仪来进行精准定量，该方法利用等温延伸的原理，使用过量的DNase I，在低浓度下将荧光探针稀释成线性梯度比，在确保反应为零级反应时，根据反应产生的荧光信号值确定荧光探针的浓度。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
本发明测定的荧光探针浓度准确度高，适用的荧光探针波长范围广，操作难度低。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是390探针/FAM探针的荧光图一；
图2是390探针/FAM探针的荧光图二；
图3是390探针/FAM探针的标准曲线图一；
图4是390探针/FAM探针的标准曲线图二。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
1.实验设备：
| 设备名称 | 品牌 | 型号 |
| Mini离心机 | 天根 | OSE-MC8 |
| 涡旋仪 | Kylin-Bell | Vortex-5 |
| Biotek酶标仪 | Biotek | Cyation1 |
2.实验试剂：
3.实验步骤：
DNase I为2U/ul，待用；将探针稀释为10pmol/ul，待用。
(1)稀释探针梯度
(2)反应液配置
取384孔板，每个孔加入23.5uL的反应液；
对应孔中分别加入1.5uL不同梯度的探针，做3组重复；
封口膜封住384黑色孔板，设置程序，37摄氏度，反应120min，每5min取一个点。
结论：
本发明测定的荧光探针浓度准确度高，适用的荧光探针波长范围广，操作难度低。
表1：390荧光信号值一览表
表2：FAM荧光信号值一览表
图1、图2为390探针/FAM探针的荧光图，从图上可以看出探针已经消耗殆尽，能够取到3个信号点，做出标准曲线，其中为减少实验时间，所用的激发波长/发射波长为485/528，非390最佳波长；
表1、表2为390探针/FAM探针的信号值一览表，探针浓度为0～5pmol/uL，探针总量为0～7.5pmol/uL，信号值取50min到60min平均值-背景0min的值；
图3、图4为390探针/FAM探针的标准曲线图，要求R2≥0.98。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种测定荧光探针绝对浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据OD值稀释荧光探针；
(2)将荧光探针稀释至能产生零级反应的范围；
(3)在零级反应浓度的基础上将荧光探针稀释多个梯度；
(4)根据荧光探针的激发光和发射光的范围选择滤光片；
(5)根据酶标仪上的荧光信号值做出标准曲线，算出荧光探针的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种测定荧光探针绝对浓度的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光探针稀释至能产生零级反应的范围为：50pmol/uL～5pmol/uL。
3.根据权利要求1所述的一种测定荧光探针绝对浓度的方法，其特征在于，所述步骤(3)中稀释梯度范围为：不少于6个，不高于10个。
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