CN114404396B

CN114404396B - 一种化合物在制备抗血栓药物方面的应用

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Publication number: CN114404396B
Application number: CN202210004969.0A
Authority: CN
Inventors: 刘竞丽; 吴双; 梁程伟; 李劲频; 谢晓云; 黄海萍; 傅金凤; 王辞岚; 邓梦雨
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2042-01-04
Also published as: CN114404396A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种化合物在制备抗血栓药物方面的应用。目前在新的抗血小板药物临床前研究中，在抑制血栓形成的同时也越来越强调止血。在tMCAO中，阻断血小板激活早期发挥作用的受体GPIb或GPVI能减轻小鼠的缺血性脑损伤，且不会增加出血并发症，表明在血小板激活早期阶段进行干预有效且更安全。本申请中的化合物Col003，由天然化合物分子AK778在培养基或缓冲液中降解得到，且能在血小板激活早期发挥抗血小板作用，能抑制血栓的形成，不会对凝血功能造成影响，细胞毒性较弱，有望成为对于缺血性脑卒中有效、安全的治疗药物。

Description

一种化合物在制备抗血栓药物方面的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是一种化合物在制备抗血栓药物方面的应用。

背景技术

“脑卒中”(cerebral stroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，CVA)。是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致脑部血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中的发病率高于出血性卒中，占脑卒中总数的60％～70％，其发病年龄多在40岁以上，男性较女性多，严重者可引起死亡。

目前临床上常用的缺血性卒中治疗药物包括超早期的溶栓药物、抑制血小板凝聚的药物、抗凝的药物、神经保护的药物、改善血液循环的药物、调脂稳定斑块的药物等等。

抗血小板治疗是目前缺血性脑卒中主要的治疗措施，但临床上仍有不少患者尽管进行了规范的抗血小板治疗，仍然发生缺血性血管事件。受到众多指南推荐的阿司匹林及氯吡格雷也存在“阿司匹林抵抗”及“氯吡格雷抵抗”现象，此外，现有的抗血小板药物还存在出血等副作用。

因此，需要开发新的毒副作用小、药效强、选择性好的新型抗血小板药物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种化合物在制备抗血栓药物方面的应用，所述化合物的结构式如下所示：

进一步的，所述制备抗血栓药物，是直接用该化合物作为抗血栓药物

进一步的，所述抗血栓药物，是抗血小板药物。

进一步的，所述抗血小板药物，是抑制血小板凝聚的药物。血小板的凝聚往往是脑血栓形成的开端，如果能有效地阻断血小板的凝聚，能防止血栓进一步形成。

进一步的，所述抗血栓药物，是治疗缺血性脑卒中的药物。

缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足引起局部脑组织缺血、坏死或软化，导致相应的神经功能缺失症状和体征。缺血性脑卒中是导致残疾和死亡的严重疾病，因此其治疗显得尤为重要。

抗血小板治疗是缺血性脑卒中的主要治疗方法，然而即使是规范用药仍存在增加出血发生率和卒中复发的风险。缺血性脑卒中的高复发率说明我们二级预防中的关键抗血小板治疗存在不足，需要寻找新型抗血小板药物以解决临床难题。

2017年有研究者利用表面等离子共振技术结合天狼星红染料法和脉冲追踪实验从52560种化学和天然化合物中发现了分子AK778。进一步发现研究AK-778在培养基或缓冲液中可以降解为两个片段，暂定名为Col002和Col003(附图1)。目前Col003尚无用于活体动物和临床治疗的报道。

本申请的申请人通过研究发现，本申请中的小分子化合物Col003具有抗血小板作用，Col003可以成为对于缺血性脑卒中有效、安全的治疗药物。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

目前在新的抗血小板药物临床前研究中，在抑制血栓形成的同时也越来越强调止血。文献报道在tMCAO中，阻断血小板激活早期发挥作用的受体GPIb或GPVI能减轻小鼠的缺血性脑损伤，且不会增加出血并发症，表明在血小板激活早期阶段进行干预有效且更安全。本申请中的化合物Col003，具有如下优点：①Col003能抑制血小板与胶原的粘附，在血小板激活早期发挥抗血小板作用，抑制血栓的形成；②Col003对大鼠鼠尾出血时间、凝血功能无明显影响，很可能不发生现有抗血小板药物存在的出血等副作用；③本申请的化合物Col003在大鼠tMCAO中的效果与阿司匹林及氯吡格雷类似，有可能部分解决“阿司匹林抵抗”及“氯吡格雷抵抗”的问题；④Col003细胞毒性较弱，使用较为安全。综上，本申请中的化合物Col003可以成为对于缺血性脑卒中有效、安全的治疗药物。

附图说明

图1是分子AK778及其两个降解产物的分子结构图；

图2是生物素标记法纯化大鼠对照组和大脑中动脉栓塞模型的血小板膜蛋白，证实了正常和大脑中动脉栓塞模型大鼠的外周血血小板膜上都存在HSP47的表达的实验结果图；

图3是Col003对FeCl₃诱导的大鼠的颈总动脉血栓闭塞时间的影响的实验结果图；

图4是大鼠鼠尾出血实验结果图；

图5是Col003的CCK8实验细胞存活率结果图；

图6是氯吡格雷的CCK8实验细胞存活率结果图；

图7是阿司匹林的CCK8实验细胞存活率结果图；

图8是大鼠注射不同浓度药物后的活化部分凝血活酶时间结果图；

图9是大鼠注射不同浓度药物后的凝血酶原时间结果图；

图10是大鼠注射不同浓度药物后的凝血酶时间结果图；

图11是大鼠注射不同浓度药物后MCAO模型鼠脑梗死面积及神经运动功能评分结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式对本发明的技术方案做进一步的解释，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例

实验材料：

我们使用的Col003购买于MCE(MedChemExpress)公司，货号为HY-124817。使用20％磺丁基-β-环糊精(SBE-β-CD)助溶剂，货号为HY-17031。

采用大鼠MCAO模型：健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级(体重280至320克)，由广西医科大学实验动物中心提供。

实验一证实大鼠的外周血血小板膜上存在HSP47表达

大鼠用10％的水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，取颈部正中切口，钝性分离甲状腺，分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。线栓经颈总动脉分叉处进入颈内动脉，入颅至大脑中动脉起始处，阻断大脑中动脉的血流。MCA阻塞2h后选择经神经功能缺陷评分确定有脑缺血症状的大鼠，麻醉后拔出线栓进行脑再灌注，确保无出血，逐层缝合伤口，把动物放回笼子24h后开腹，下腔静脉采血后制备血小板。

利用生物素标记法纯化大鼠对照组和MCAO模型的血小板膜蛋白，使用赛默飞Pierce^TM Cell Surface Protein Biotinylation and Isolation Kit(A44390)，将一瓶Sulfo-NHS-SS-Biotin的内容物溶解在24ml的环境PBS中。向试管中加入10毫升生物素溶液轻轻混匀血小板，室温下培养10分钟后1000×g离心3分钟，弃上清。在15毫升冰冷的TBS中重悬血小板。1000×g离心3分钟，弃洗。重复TBS清洗一次。加入Lysis Buffer裂解血小板，在室温下，与利用NeutrAvidinTM琼脂糖混匀培养30分钟分离标记蛋白，最终加入加200ulprepared ElutionBuffer洗脱蛋白进行Westernblot检测。

最终结果证实了正常和MCAO模型大鼠的外周血血小板膜上都存在HSP47的表达(附图2)

实验二 Col003能有效延长大鼠的颈总动脉血栓闭塞时间

采用大鼠三氯化铁诱导颈总动脉血栓形成模型，麻醉后仰卧固定于操作台，对大鼠颈部进行备皮，使用手术剪刀沿大鼠颈部正中线做约3cm纵行切口，再钝性分离出右侧颈总动脉。使用35％三氯化铁溶液浸透的0.5cm*0.3cm规格的滤纸条包裹分离出的颈总动脉，并在滤纸条下垫好1.5cm*0.5cm规格的无菌手术巾以防止三氯化铁溶液伤其他组织结构。1min后移去滤纸条，选择合适的超声探头，将已经连上检测设备的工作探头检测端深入待测血流的颈总动脉下缘，将颈总动脉小心套入检测凹槽内。吸取少量超声耦合剂涂布在超声探头与血管链接的缝隙处，使超声探头卡槽与颈总动脉之间的缝隙。点击软件的“开始”键，记录小鼠的血流量变化情况，直至血流显著降低不再改变，若未见血流明显下降，则记录45min血流变化情况后停止记录。

所得结果发现Col003能抑制大鼠三氯化铁诱导的颈总动脉血栓形成(附图3)，与正常组(381.8±14.94S，N＝5)和Vehicle组(426.3±16.70S，N＝3)相比，在25uM血药浓度下，Col003对颈总动脉血栓闭塞时间(TTO,375.0±25.03S，P>0.05)无明显改变。但是当血药浓度达到50uM和100uM，颈总动脉血栓闭塞时间分别为689.3±45.41S(P＝0.0056)和562.7±28.42S(P＝0.0144)，显著延长了血栓闭塞时间，表明Col003能抑制血栓的形成。

实验三 Col003对肝脏细胞L02的细胞毒性小

应用CCK8实验检测药物的对肝脏细胞L02的细胞毒性，取对数期L02细胞，向96孔培养板每孔加入100ul细胞悬液(每孔5000个细胞)，置于5％CO2，37℃培养箱培养约24h至细胞长至单层。吸弃孔中上清液，用磷酸缓冲液(PBS)洗1-2遍，加入用培养基稀释得到的一系列浓度药液。每个浓度设6个复孔，将细胞板继续置于培养箱中孵育24h。更换新鲜培养基以去除药物颜色的影响，向每孔加入10ul CCK-8溶液(注意不要产生气泡)。置于培养箱内孵育1-4h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％。

结果显示Col003对肝脏细胞L02的细胞毒性与阿司匹林和氯吡格雷相似，细胞毒性较弱(附图5、附图6、附图7)。

实验四 Col003对大鼠的鼠尾出血时间和凝血功能无影响

采用鼠尾出血模型：采用Gustafsson等人所述的小鼠尾部切口出血模型，选取Sprague Dawly大鼠(体重280至320克)，将鼠尾消毒。使用弹簧加载的刀片装置(

(Loxo，多森海姆，德国)，纵向在鼠尾表面距离尾根2-3cm(离鼠尾尖端9cm)处切开一10mm长、1.5mm深的切口，避免伤及大血管。启动秒表，并将一干净滤纸滤纸放在切口下方，但不接触伤口。每15秒挪动一次滤纸的位置，直到滤纸不再变红(出血结束)，出血时间定义为出血开始至停止的时间。同时采血检测凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。

采用鼠尾出血实验对大鼠出血时间进行检测，25uM(4.811±0.3587min，N＝7)，50uM(4.640±0.5750min，N＝6)，100uM(3.866±0.1781min，N＝5)浓度与对照组(4.152±0.3282min，N＝6)和Vehicle组(4.277±0.1468min，N＝3)相比均无统计学差异(附图4)

同时尾静脉注射不同浓度药物后，凝血参数(附图8、附图9、附图10)，表明Col003对大鼠的鼠尾出血时间和凝血功能均无明显影响。

实验五Col003对大鼠脑缺血再灌注结局的影响

激光多普勒组织血流仪及HE、TTC染色法，确定脑缺血大鼠模型的成功建立。采用尾静脉注射，在脑缺血2h前、后Vehicle，50uM血药浓度的Col003，再次麻醉后拔出线栓再灌注24h。采用TTC染色测定脑梗死体积，采用Bederson test观察大鼠的神经功能，Griptest观察大鼠的运动功能。同时以阿司匹林(50uM)和氯吡格雷(50uM)为对照。

采用TTC染色测定脑梗死体积，Vehicle组梗死面积占比为33.52±1.262％(N＝7)，Col00350uMbefore的梗死面积比为15.66±2.341％(N＝7)，梗死面积减少了53.28％(P＜0.0001)。阿司匹林50uMbefore的梗死面积比为15.81±1.167％(N＝6)，氯吡格雷50uMbefore组的梗死面积比为17.95±2.516％(N＝7)，Col00350uM after组的梗死面积比为14.53±3.089％(N＝6)，与阿司匹林、氯吡格雷组之间均无统计学差异。TTC染色的结果证实无论是在大脑中动脉堵塞前或后注射Col003都能有效减少MCAO模型鼠的脑梗死面积，同时也能很好的改善MCAO模型鼠的神经运动功能，其效果与阿司匹林和氯吡格雷相近(附图11)。

综上所述，Col003能抑制血栓的形成，不会对凝血功能造成影响，并且细胞毒性较弱，药效与目前常用的阿司匹林和氯吡格雷相近，可以成为对于缺血性脑卒中有效、安全的治疗药物。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种化合物在制备治疗缺血性脑卒中的药物方面的应用，其特征在于，所述化合物的结构式如下所示：

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2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗缺血性脑卒中的药物，是抗血小板药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗血小板药物，是抑制血小板聚集的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物，是通过如下分子降解得到：

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