CN114402196A

CN114402196A - 用于检测猪脂肪组织样本中粪臭素的方法

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Publication number: CN114402196A
Application number: CN202080063976.7A
Authority: CN
Inventors: E·斯科松; M·哈默尔
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2022-04-26
Also published as: JP2022540228A; EP3983783A1; FR3098597B1; WO2021009438A1; FR3098597A1; ES2953617T3; DK3983783T3; EP3983783B1; US20220178833A1

Abstract

本发明涉及一种用于检测猪脂肪组织样本中粪臭素的存在的方法，所述方法的特征在于它至少包括以下步骤：a)使所述脂肪组织样本的有机提取物进行电化学发光反应；b)在步骤a)期间测量发光强度，并且如果测量的发光强度超过阈值，则推断所述脂肪组织样本中存在粪臭素。所述方法还可以在所述有机提取物中存在粪臭素的情况下测定其含量。应用：在屠宰场对完整公猪胴体进行分拣，以便剔除其肉带有公猪异味的部分以免进行消费；研究工具，特别是用于研究影响完整公猪胴体的脂肪组织中产生粪臭素的因素以便开发用于预防或减少公猪异味的方法。

Description

用于检测猪脂肪组织样本中粪臭素的方法

技术领域

本发明涉及农业食品领域，并且特别地涉及猪肉的生产和分销。

更具体地说，本发明涉及一种用于检测猪脂肪组织(tissus adipeux)样本中粪臭素或3-甲基吲哚(3-MIH)的存在的方法，如果存在粪臭素或3-甲基吲哚(3-MIH)，则相对于可能也存在于猪脂肪组织中的其他化合物以非常高的灵敏度和非常高的特异性来测定其含量。

由于粪臭素和雄甾酮一起产生强烈且令人不愉快的气味，称为公猪异味，当烹饪完整公猪的肉时会释放出这种气味，因此本发明主要适用于屠宰场，用于分拣完整公猪的胴体(carcasses)，目的是隔离那些其肉带有公猪异味的完整公猪的胴体，并将它们引导到合适的加工回路。

本发明也适合用作研究工具，特别是用于研究影响完整公猪的脂肪组织中产生粪臭素的因素，目的是开发能够预防或减少公猪异味的方法，例如通过遗传选择或通过改变畜牧业条件(饲料、圈舍条件、动物群体在年龄、性别等方面的组成)。

背景技术

公猪异味主要是由完整公猪(即未阉割的猪)的脂肪组织(或脂肪组织(tissusgras))中的粪臭素和雄甾酮以及较少程度的吲哚的积累引起的。

这种味道在烹饪猪肉时释放出来，通常被消费者认为是令人作呕的。

历史上，为了防止公猪异味，公猪在性成熟年龄之前被阉割。

然而，在过去的十年里，出于伦理和动物福利的原因，也出于经济原因，在欧盟的支持下，许多畜牧业者已经停止阉割公猪。

因此，有必要有一种用于在屠宰线上可靠地检测其肉带有公猪异味的完整公猪的胴体的方法。

通过检测屠宰场中的粪臭素对胴体进行分拣带来很多问题。

出现这些问题的原因有很多。

首先，检测猪脂肪组织中的粪臭素需要极其灵敏的检测方法。事实上，消费者排斥猪肉的阈值设定为每克脂肪组织约0.2μg粪臭素。在分析方面，这意味着，在例如完全提取存在于1g脂肪组织中并浓缩在1mL合适溶剂中的粪臭素的情况下，目标是能够检测这1mL溶液中1.53μmol/L的粪臭素浓度阈值。同样地，在加热脂肪组织并挥发粪臭素分子后，蒸汽相中粪臭素的浓度约为几十ppb，这使得在这种相中测量粪臭素并不容易。

另一个问题涉及粪臭素检测的选择性。事实上，由于粪臭素是一种吲哚化合物，其来源于肠道细菌对色氨酸的降解，因此它与其他吲哚化合物诸如吲哚一起存在于猪肉脂肪中，所述其他吲哚化合物可能会通过产生假阳性来干扰粪臭素的检测。

最后，除此之外，还有：

-时间限制，对大多数屠宰场来说，粪臭素的检测必须能够每天对数百个胴体进行；

-与屠宰场内部条件有关的限制，屠宰场是不受控制的环境，全年温度变化大，且湿度高；

-成本限制，检测粪臭素不应对猪肉的最终销售价格产生重大影响；

-取自胴体的脂肪组织的组成(含水量、血液含量等)的可变性；和

-屠宰场中分析的样本的可追溯性问题。

检测粪臭素的方法是已知的。

最常见的方法采用高效液相色谱或气相色谱(例如参见K.Verplanken等，Journalof Chromatography A 2016，1462，124-133)。然而，这些方法不适合在屠宰场使用，因为它们需要较长的分析时间、高度合格的操作员、昂贵的设备和耗材以及高水平的维护。此外，考虑到脂肪基质的复杂性，这些方法的选择性通常不足。

最近，丹麦宣布了一种在对样本进行适当处理后基于质谱的自动化方法。然而，这种方法也很昂贵，而且可能不太适合屠宰场的使用条件。在光谱仪中连续分析的样本的可追溯性存在不止一个问题。

已经研究了免疫学方法，特别是基于使用铕(III)作为荧光标记的氟免疫剂量的免疫学方法(例如，参见M.P.Aguilar-Caballos等，Analytica Chimica Acta 2002，460，271-277)，但是这些研究仍然是边缘性的，因为没有特异性抗体可用。

已经提出了一种使用埃利希(Ehrlich)试剂来比色检测粪臭素的方法(参见国际申请WO 83/00928)。这种方法使用简单，价格低廉，于20世纪90年代在丹麦屠宰场使用。不幸的是，由于埃利希试剂缺乏选择性，特别是在吲哚方面，并且由于结果的不可靠性，它不得不被放弃。

电化学方法也已经被提出用于检测粪臭素(例如，参见欧洲专利申请2 966 441)。这些方法包括测量电极(通常是碳(金刚石或玻璃碳))表面上的粪臭素的氧化电流。这些方法非常敏感，但它们在选择性方面存在一个主要问题，同样是由于脂肪基质的复杂性。

最近，已经提出了使用拉曼光谱的方法(例如，参见X.Liu等，Meat Science 2016，116，133–139)。这些方法具有包括同时分析脂肪组织中的雄甾烯酮和粪臭素的全局途径。然而，到目前为止呈现的结果突显不可接受数量的假阳性和假阴性。

最后，电子鼻已经被开发出来(例如，参见J.S.Vestergaard等，Meat Science2006，74，564-577)。这些电子鼻的功能是基于使用交叉反应传感器网络，其提供待分析样本的全局“化学指纹”。尽管电子鼻可能适合在屠宰场进行测量，但这些电子鼻在选择性方面仍然存在重大问题。此外，电子鼻中使用的传感器通常对湿度敏感，因此湿度成为主要障碍。

由于缺乏一种同时具有敏感性、选择性且适合在屠宰场使用的用于检测粪臭素的物理化学方法，因此目前大多数针对完整公猪的屠宰场生产线使用一组“人鼻”。该方案包括使用烙铁或等效装置加热脂肪组织样本，通常直接在胴体上加热，然后为这项任务经过专门培训的操作员闻到由此释放的气味化合物。这种检测方法昂贵且受限，令操作员不愉快，并且仅在需要分拣少量胴体时有效，因为操作者的嗅觉受体很快变得饱和。此外，这种方法产生高度可变的结果，这些结果依赖于操作员且只有70％的真实阳性率。

鉴于以上所述，本发明人的目标是提供一种物理化学方法，该物理化学方法能够以高灵敏度和高特异性检测猪脂肪组织样本中粪臭素的存在，从而得到极其可靠的结果。

他们还有一个目标，即如果脂肪组织样本中存在粪臭素，如果需要，这种方法也允许给粪臭素量化。

他们还有一个目标，即无论现有的温度和湿度条件如何，都可以在屠宰场实施这种方法，并且这种实施将足够简单且快速，以符合屠宰场经受的胴体分拣的时间限制。

他们还为自己设定了目标，即实施这种方法的成本不会对猪肉的最终销售价格产生重大影响。

他们还为自己设定了一个目标，即这种方法将允许所分析的猪的脂肪组织样本的可追溯性。

发明内容

所有这些目的都是通过本发明来实现的，本发明首先提出了一种用于检测猪脂肪组织样本中粪臭素的存在的方法，方法的特征在于它至少包括以下步骤：

a)使脂肪组织样本的有机提取物进行电化学发光反应；

b)在步骤a)期间测量发光强度，并且如果测量的发光强度超过预定阈值，则推断脂肪组织样本中存在粪臭素。

因此，通过本发明的方法检测粪臭素是基于电化学发光技术的。

应当注意的是，电化学发光(或ECL)，也称为电致化学发光，是一种包括通过直接发生在工作电极表面的电子转移来引发发光过程的技术。

有不同的ECL机制。

在本发明的上下文中，优选地，发光过程通过向浸入有机提取物中的工作电极施加阴极电位来引发，以通过还原溶解在该提取物中的双氧来诱导超氧离子

的形成。

在这种情况下，如果有机提取物中存在粪臭素，则氧还原为超氧离子，随后：

-根据以下反应形成粪臭素的共轭碱：

然后

-根据以下反应形成氢过氧化物自由基：

随后对工作电极施加阳极电位，从而允许粪臭素的共轭碱的氧化，一旦氧化，将与氢过氧化物自由基反应，形成激发态的N-(2-乙酰基苯基)-甲酰胺，通过去激发(或者换句话说，通过回到其基本状态)，发射可测量的发光。

应该注意的是，T.Okajima和T.Ohsaka已经研究并描述了粪臭素的这种ECL机制(参见Journal of Electroanalytical Chemistry 2002，523，34-39)。然而，这项研究是在纯粹的理论背景下进行的，旨在了解乙腈溶液中的粪臭素的ECL所涉及的化学过程，但没有考虑这些过程的任何实际应用，特别是用于检测猪脂肪组织中的粪臭素。

鉴于以上情况，优选的是有机提取物满足以下条件：

-包括非质子有机溶剂；

-是无水的，即包括至多1wt.％的水；并且

-是导电的，这是通过在这种提取物中存在研磨盐来实现的。

为了实现这一点，本发明提出通过以下步骤预先制备有机提取物：

i)将脂肪组织样本中存在的脂肪与脂肪组织样本中也存在的非脂肪要素诸如皮肤残留物、肌肉纤维等分离；

ii)将脂肪组织样本中存在的脂肪脱水，已知猪组织天然包括大约15wt.％的水；

iii)将步骤ii)结束时获得的脂肪溶解在非质子有机溶剂中以获得有机溶液，并且将有机溶液加热足够长的时间以能够提取粪臭素(如果粪臭素存在的话)；

iv)将步骤iii)结束时获得的有机溶液脱脂；以及

v)向步骤iv)结束时获得的有机溶液中加入无水研磨盐；

并且其中步骤i)和ii)可以连续或同时进行。

根据本发明，步骤i)和ii)优选同时进行。

为了实现这一点，例如可以将脂肪组织样本加热到至少等于100℃并且优选在100℃至150℃之间的温度，并且在敞口容器中加热，使得脂肪组织样本中存在的水可以以水蒸气的形式逸出。这使得可以液化脂肪组织样本中存在的脂肪，从而促进其随后与同样存在于这个样本中的将保持固态的非脂肪要素分离，同时使脂肪脱水。这也可以使得脂肪组织样本中存在的蛋白质变性，蛋白质随后将在步骤iii)期间沉淀，这有助于减少有机提取物中存在的电活性物质的量。

可替换地，也可以通过真空抽吸在低于100℃的温度加热脂肪组织样本。

加热的持续时间特别是根据脂肪组织样本的质量、其呈现的形式(是否预切割，以及如果预切割则样本块的尺寸)、进行加热的容器的构造、加热模式(例如有或没有微波)、是否使用真空抽吸以及进行加热所选择的温度来选择。

在步骤iii)中，将在前一步骤或前两个步骤(如果这些步骤同时进行)结束时获得的脂肪溶解在非质子有机溶剂中，并加热所得有机溶液。

在上文中并且在下文中，当应用于有机溶剂时，术语“非质子”以其可接受的形式使用，即它表示其分子不含酸性氢原子，即键合到杂原子(诸如氮、氧或硫原子)的有机溶剂。

根据本发明，非质子溶剂有利地是极性非质子溶剂，即具有非零偶极矩，诸如乙腈、二甲基亚砜、碳酸丙烯酯或γ-丁内酯，优选乙腈。

步骤iii)的加热有利地在搅拌下在50℃至80℃的温度进行1分钟至10分钟，并且这是在封闭的容器中进行的，以防止非质子有机溶剂蒸发。

步骤iv)有利地通过对在步骤iii)结束时获得的有机溶液进行离心来进行，以便由于搅拌而破坏在步骤iii)期间形成的乳液，然后将这种有机溶液保持在低于或等于4℃但高于非质子有机溶剂的固化温度的温度，从而固定有机溶液的脂肪部分，但不使有机溶剂固化，然后除去已经固定的脂肪部分。

加入到在步骤iv)结束时获得的有机溶液中的研磨盐可以从非常大量的盐中选择，其一方面必须可溶于非质子有机溶剂，另一方面在化学和电化学上是惰性的，以便不干扰ECL反应，也不引起与粪臭素的不良反应。正如电化学家所熟知的，这种盐特别地可以是四氟硼酸四烷基铵、六氟磷酸四烷基铵或高氯酸四烷基铵，其中烷基包括1至6个碳原子，诸如四氟硼酸四丁基铵或六氟磷酸四丁基铵，这种类型的盐在有机介质中实际上具有显著的稳定性。

此外，向步骤iv)结束时获得的有机溶液中加入的研磨盐的量使得其在有机提取物中的浓度通常在0.01mol/L至1mol/L之间，优选在0.05mol/L至0.5mol/L之间，更优选等于0.1mol/L。

根据本发明，可以在步骤iii)、步骤iv)和/或步骤v)结束时，向获得的有机溶液中加入干燥剂，诸如无水钠或镁类型的吸湿盐，或分子筛(3或4埃)，以完成步骤ii)中进行的脱水。

在本发明方法的优选实施方案中，有机提取物进一步包括强碱，在这种情况下，这种强碱优选加入到步骤v)结束时获得的有机溶液中。

有机提取物中强碱的存在可以首先使这种提取物中存在的有机酸去质子化。事实上，如下文所示，粪臭素在ECL反应的几个阶段变成质子受体。然而，从猪脂肪组织样本制备的任何有机提取物都含有一定数量的质子供体化合物，特别是有机酸，有机酸本质上是可溶于有机溶剂的脂肪酸，因此在步骤iv)中进行的脱脂操作不可能消除有机酸。因此，希望中和这些化合物，这可以通过有机提取物中强碱的存在来实现。

有机提取物中强碱的存在也可以确保有机提取物中任何残留水分的消失。

在本发明的含义中，强碱被定义为能够使水去质子化的碱。

这种碱尤其可以是有机碱(诸如三乙胺、咪唑、组氨酸或任何其他叔胺)、碱金属的醇盐或酰胺(诸如醇钠或酰胺钠)、碱金属或碱土金属的氢化物(诸如氢化钠、氢化锂、氢化钾或氢化铷)、碱金属或碱土金属的氮化物(诸如氮化钠)。

优先考虑具有最高可能pKa的强碱。

一种特别优选的强碱是氢化钠，它除了具有高pKa的共轭酸之外，还具有便宜、容易获得的优点，并且对于它，与酸类物质的反应产生它们的钠等效物——其沉淀并因此可以被消除——同时以气态形式释放出存在于有机提取物中的氢。例如，氢化钠与可能仍存在于有机提取物中的水的反应如下：

H₂O+NaH→NaOH(其沉淀)+H₂(气体)。

如本身已知的，ECL反应优选在电化学电池中进行，术语“电化学电池”在此表示由比色皿型容器等形成的组件，其中放置用于ECL反应的有机提取物，还有至少两个电极，即工作电极和对电极。

如上，在本发明的上下文中优选的ECL反应包括向电化学电池的工作电极施加阴极电位以诱导超氧离子的形成，随后向同一电极施加阳极电位以诱导粪臭素的共轭碱的氧化，如果粪臭素存在于有机提取物中的话。

这可以根据不同的电化学方案来实现，特别是通过：

-电位扫描，在这种情况下，向工作电极施加向负电位的扫描，随后向正电位的扫描；

-电位阶跃，在这种情况下，向工作电极施加恒定的负电位，持续足以使这个电极的表面被超氧离子饱和的时间，随后施加恒定的正电位，也持续足以使工作电极的表面在氧化的粪臭素中饱和的时间；或者

-通过一系列交替的阴极电位脉冲和阳极电位脉冲。

不言而喻，电化学参数必须特别根据所使用的电化学电池的构造、所使用的工作电极和对电极的性质(即构成这些电极的电极材料)、制备有机提取物的方式以及因此其组成和粘度进行调整。如果使用参比电极或伪参比电极，则电化学参数也必须根据这个电极的性质进行调整。

例如，对于如上制备的有机提取物和设置有工作电极和掺硼金刚石对电极以及由铂制成的伪参比电极的电化学电池，通过将下列施加到工作电极已经获得了优异的结果：

-在电位扫描的情况下：从0V扫描到-1.5V至-2.5V(vs Pt)之间的负电位，例如等于-2V(vs Pt)，然后从这个负电位扫描到大于或等于+0.5V(vs Pt)的正电位，例如等于+0.8V(vs Pt)，扫描速度恒定在10mV/s至100mV/s之间，例如50mv/s；

-在电位阶跃的情况下：小于-1.5V(vs Pt)的恒定负电位，例如等于-2V(vs Pt)，持续0.1秒至45秒，然后大于0.5V(vs Pt)的恒定正电位，例如等于+1V(vs Pt)，持续10秒至30秒；并且

-在交替的阴极电位脉冲和阳极电位脉冲的情况下：小于-1.5V(vs Pt)的负电位，例如等于-2V(vs Pt)，随后是大于0.5V(vs Pt)的正电位，例如等于+1V(vs Pt)，频率范围从0.5赫兹到5赫兹，例如等于1赫兹。

电化学电池容器的选择本身并不关键。

然而，希望这个容器由耐有机溶剂、耐盐介质并且如果使用强碱的话耐碱性介质的材料制成。

此外，建议这个容器由发光发射波长范围内的光学透明材料制成，或者其具有由具有这种透明度的材料制成的至少一个壁，如果对发射的光子的检测是由位于面向其壁之一的光学检测器执行的话。

电解池电极的选择也不是关键的。

如果ECL反应基于超氧离子的形成，则工作电极可以由允许形成这样的离子的任何电极材料制成，诸如碳(石墨、玻璃碳、掺杂的金刚石，例如硼或氮等)、贵金属(金、铂、钯、铱等)或贵金属合金。

对电极可以由不同的电极材料或与形成工作电极的电极材料相同的电极材料形成。

在本发明的上下文中，优选的是工作电极和对电极由掺杂的金刚石制成，金刚石特别是掺杂硼，因为这种材料是高导电性的，具有非常高的稳定性，由于金刚石的高原子密度而具有对污垢的天然抵抗力。鉴于有机提取物可能包括来自猪脂肪组织的一定数量的化合物，包括脂肪酸，这些化合物会快速使电极表面结垢，这种对污垢的抵抗力是特别令人感兴趣的。此外，在结垢的情况下，这种类型的电极可以容易地进行电化学清洗，例如通过US9,121,107中描述的方法。最后，这种类型的电极具有大的电位窗口，这使得可以在不电解有机提取物中存在的溶剂的情况下施加高电位。

如果使用参比电极，则这尤其可以是饱和甘汞电极(SCE)或氯化银电极(Ag/AgCl)，可选地具有双结，如在电化学中传统使用的那样。然而，在本发明的上下文中，优选的是使用由贵金属诸如铂制成的伪参比电极，因为这种类型的电极也可以容易地清洁，例如通过穿过火焰来清洁。

有利的是，电化学电池(即容器和电极)由低成本材料(塑料容器、碳糊电极等)制成以便一次性使用，这使得一方面可以克服电极结垢的问题，另一方面可以确保所分析的脂肪组织样本的可追溯性，例如通过参照与猪胴体相关的每个电化学电池。

关于光学检测器，后者可以是耦合到双碱性光电阴极、超级双碱性光电阴极或超双碱性光电阴极的光电倍增器、雪崩光电二极管、硅光电阴极光电倍增器、光谱仪特别是荧光光谱仪、CCD(电荷耦合器件)传感器检测器、CMOS(互补金属氧化物半导体)传感器检测器等。

根据本发明，阈值优选地至少等于对应于光学检测器的背景噪声的发光强度平均值的150％。

如上，如果有机提取物中存在粪臭素，则本发明的方法还可以测定后者的含量。

因此，如果在步骤b)中已经推断出了粪臭素的存在，则方法还有利地包括通过将步骤b)中测量的最大发光强度与校准曲线进行比较来量化有机提取物中存在的粪臭素，这个量化在步骤b)期间或步骤b)之后进行。

本发明的方法使得可以以高灵敏度检测猪脂肪组织中粪臭素的存在，因为能够获得大约20nmol/L粪臭素的检测限。

消费者排斥猪肉的阈值设定为每克脂肪组织或生脂肪约0.2μg粪臭素，这对应于假设在1mL有机溶剂中完全提取1g脂肪组织中存在的粪臭素的话，1.53μmol/L的粪臭素浓度。

结果，通过本发明的方法对粪臭素的检测限比待检测的粪臭素浓度低约3个数量级。

此外，如下文报道的实验所证明的，通过本发明的方法检测粪臭素是高度特异性的，因为存在于猪脂肪组织中的其他吲哚化合物诸如吲哚没有通过这种方法检测到。

电解池中没有光子激发(通过紫外线、过滤的白光等)防止潜在干扰物的任何自发荧光，从而有可能获得非常高的信噪比。

此外，本发明的方法在所需设备和其实施方面都是稳健的，简单、快速且廉价。

因此，它特别适合在屠宰场使用。

因此，本发明还涉及一种分拣完整公猪的胴体的方法，其特征在于它包括实施如上定义的检测粪臭素的方法。

本发明的其他特征和优点在以下与实验相关的描述中给出，该描述使得验证本发明成为可能，并且参考附图给出。

然而，不言而喻的是，本附加描述仅作为本发明主题的说明给出，并且不应被解释为对该主题的限制。

附图说明

图1以横截面示意性地表示已经在上述实验中使用的第一电化学电池。

图2示意性地表示已经用于下述实验的第二电化学电池，其为3/4视图。

图3示出了通过电位扫描使未被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的有机提取物(其中添加了合成粪臭素)进行ECL反应而获得的伏安图。

图4示出了在记录图3所示伏安图的同时测量的发光。

图5示出了通过电位阶跃使未被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的有机提取物(其中添加了合成粪臭素)进行ECL反应而获得的计时电流图。

图6示了在记录图5所示的计时电流图的同时测量的发光。

图7示出了通过施加重复的交替阴极电压脉冲和阳极电压脉冲使包括合成粪臭素和六氟磷酸四丁基铵的乙腈溶液进行ECL反应而获得的电流响应。

图8示出了在记录图7所示电流响应的同时测量的发光。

图9示出了通过电位扫描使包括合成粪臭素和六氟磷酸四丁基铵的乙腈溶液进行ECL反应而测量的发光。

图10示出了通过电位扫描使包括吲哚和六氟磷酸四丁基铵的乙腈溶液进行ECL反应而测量的发光。

图11示出了通过电位阶跃使被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的有机提取物进行ECL反应而测量的发光。

图12示出了通过电位阶跃使未被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的有机提取物进行ECL反应而测量的发光。

图13示出了两条标准曲线，这两条标准曲线是通过电位阶跃使未被粪臭素污染但合成粪臭素的添加量为0.1μmol/L至5μmol/L的猪脂肪组织样本的有机提取物(曲线1)和包括0.1μmol/L至5μmol/L的合成粪臭素和六氟磷酸四丁基铵的乙腈溶液(曲线2)进行ECL反应而产生的。

在图3中，y轴对应于在工作电极处测量的电流强度，用I表示并用单位微安(μA)表示，而x轴对应于施加到工作电极的电位，用V表示并用相对于参比电极电位的单位伏特(V)表示。

在图5和图7中，y轴对应于在工作电极处测量的电流强度，用I表示并在图5中用单位毫安(mA)表示，而在图7中用微安(μA)表示，而x轴对应于时间，用t表示并用单位秒(s)表示。

在图4、图6、图8至图12中，y轴对应于发射的计数数量，表示为N_C并以任意单位(u.a.)表示，而x轴对应于时间，表示为t并以单位秒(s)表示。

在图13中，y轴对应于发射的计数数量，表示为N_C并以任意单位(u.a.)表示，而x轴对应于粪臭素的浓度，表示为[C]并以单位微摩尔/L(μmol/L)表示。

具体实施方式

下面描述的实验是使用如下材料进行的：

-猪脂肪组织样本的有机提取物，这些样本或者被粪臭素污染或者未被粪臭素污染；

-或在下文中称为“标准溶液”并包括乙腈中的合成粪臭素的溶液。

一、猪脂肪组织样本的有机提取物和标准溶液的制备

一.1–有机提取物：

根据以下操作方案为每种提取物制备猪脂肪组织样本的有机提取物，这些样本或者被粪臭素污染或者未被粪臭素污染。

将切得很细的猪脂肪组织样本放入玻璃烧杯中，并在120℃的温度放置1小时。在该加热过程中，烧杯没有被盖住以允许水蒸气逸出。选择脂肪组织样本的大小，以便在这个步骤结束时收集至少5mL的融化脂肪。

然后，将5mL这种融化脂肪转移到试管中，在试管中加入5mL乙腈(纯度：99.8％)。关闭试管，然后将混合物置于70℃的温度10分钟。获得溶液，溶液用涡流搅拌器搅拌5分钟，然后以4000rpm离心15分钟，得到脂肪相和溶剂相。

然后将试管置于-18℃的冰箱中至少2小时，以冷冻脂肪相。溶剂相被回收并转移到新的试管中。

向这种相中加入100mg硫酸镁以完成干燥，然后加入0.385mg六氟磷酸四丁基铵(TBAHFF)以使其研磨盐浓度为0.1mol/L。

将用这种方法制备的提取物保存在冰箱里直到使用。

一.2–标准溶液：

标准溶液的制备方法是，在搅拌下，将合成粪臭素以范围为0.1μmol/L至5μmol/L的浓度溶解在乙腈中，然后向所得溶液中加入TBAHFF，使其研磨盐浓度为0.1mol/L。

二–粪臭素的检测

二.1–实验仪器：

ECL反应通过使用两个电化学电池(分别表示为10和20，在图1和图2中示意性示出)和PalmSens4^TM恒电位仪(PALMSENS)进行。

电池10包括由聚苯乙烯制成的一次性UV/可见光谱比色皿，其下部具有四边形横截面，并且其中分别用作工作电极和对电极的由掺硼金刚石制成的两个电极11和12定位在这个下部的两个相对壁上，使得这些电极彼此面对。电极11和12具有1cm²的表面积。

电池20本身包括平行六面体形状的比色皿，其中分别用作工作电极和对电极的两个掺硼金刚石电极21和22定位在这个比色皿的两个相对的壁上，这两个壁具有最大的表面积但彼此偏移，使得这些电极彼此平行但不相互面对。电极21和22具有4cm²的表面积。

电池10和20还设有铂丝，分别为13和23，用作伪参比电极。

在ECL反应过程中发射的光子的检测是通过Flowmax^TM 4或4P荧光分光光度计(HORIBA JOBIN YVON)在450nm到550nm的波长范围内进行的，这使得可以通过集成软件实时监控发光的演变。

在ECL反应期间，电化学电池被置于绝对黑暗中，以限制荧光分光光度计的背景噪声。

二.2-有机酸的去质子化：

有机提取物中粪臭素的测量是在这些提取物中存在的有机酸去质子化后进行的。

这种去质子化是通过以60％NaH在矿物油中的分散体(CAS:7646-69-7)的形式将氢化钠(NaH)添加到每个提取物中而获得的，对于5mL提取物，加入的量为60mg这种分散体。在添加过程中，观察到起泡，对应于二氢的释放。然后将提取物静置15分钟，在此期间形成沉淀，对应于提取物中存在的有机酸的皂化。将这种沉淀物除去。

二.3–根据不同的电化学方案验证进行ECL反应的可能性：

如前所述，在本发明的上下文中优选的粪臭素的ECL反应是通过向电化学电池的工作电极施加阴极电位而引起的反应，以在从猪脂肪组织样本获得的有机提取物中通过还原溶解在这个提取物中的双氧诱导超氧离子的形成。

这一反应可分为以下几个步骤：

-阴极电位的施加：

(1)通过还原溶解的双氧形成超氧离子；

(2)在超氧离子存在下形成粪臭素的共轭碱；

(3)氢过氧自由基的形成：

-阳极电位的施加：

(4)粪臭素的氧化：

3-MI^--e^-→3-MBI^*

其中：

(5)氧化的粪臭素与

的自由基偶联，其涉及形成包括1,2-二氧杂环丁烷基团的中间体化合物，随后形成处于激发态的N-(2-乙酰基苯基)甲酰胺：

为了获得这个反应，测试了三种电化学方案：

-电位扫描(循环伏安法)；

-电位阶跃(计时电流法)；和

-重复施加交替的阴极电压脉冲和阳极电压脉冲。

*电位扫描：

对于电位扫描，使用如下：

-未被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的有机提取物，其中添加了浓度为5μmol/L的合成粪臭素，和

-图1所示的电化学电池10。

在将有机提取物引入电化学电池后，以50mV/s的扫描速度向这个电池的工作电极11施加从0到-2V的电位扫描，随后再施加从-2V到+0.8V的电位扫描(相对于参比电极13)。

发光测量从开始电位扫描时开始。

由此获得的伏安图和由此测量的发光分别在图3和图4中示出。

如图4所示，在阳极电位扫描区观察到发光峰，其可能与有机提取物中粪臭素的存在有关，并且其幅度可能与该提取物中存在的粪臭素的量有关。

*电位阶跃：

对于电位阶跃，使用如下：

-图2所示的电化学电池20。

将有机提取物引入电化学电池后，向这个电池的工作电极21施加-2V的电位(相对于参比电极23)30秒，随后再施加+1V的电位(相对于参比电极23)30秒。

这里，发光测量也从开始向工作电极施加电位时开始。

图5和图6分别示出了由此获得的计时电流图和由此测量的发光。

如图6所示，在从第一电位到第二电位的过程中观察到强发光峰，这个峰也可能与有机提取物中粪臭素的存在有关，其幅度可能与这个提取物中存在的粪臭素的量有关。

*脉冲方案：

包括向工作电极重复施加交替的阴极电压脉冲和阳极电压脉冲的试验是使用以下进行的：

-5μmol/L粪臭素标准溶液，和

-图2中所示的电化学电池20。

在将标准溶液引入到电化学电池中后，以1Hz的频率以重复的方式向这个电池的工作电极21施加-2V的电位(相对于参比电极23)，随后再施加+1V的电位(相对于参比电极23)。

这里，发光的测量也是从开始向工作电极施加电位时开始的。

这样记录的工作电极的电流响应和这样测量的发光分别在图7和图8中示出。

如图8所示，在施加脉冲方案的整个持续时间内，观察到可变发光信号的发射，但平均强度为约14000个计数。

除了使用5Hz的频率代替1Hz之外，在相同的实验条件下进行另一个试验。获得了类似的ECL响应，但平均发光强度为约8000个计数，也就是说比前一个要弱。

二.4–验证粪臭素检测的具体性质：

进行了两个实验，即：

-第一个实验，其包括对来自未被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的一系列具有统计学意义的有机提取物(这些提取物中不存在粪臭素已通过气相色谱结合质谱或GC/MS得到验证，这使得可以将粪臭素的剂量设定为0.03μg/g脂肪的浓度)进行ECL反应，并测量这个反应期间发射的发光；

-第二个实验，其包括在相同的操作条件下进行ECL反应，一方面是5μmol/L粪臭素的标准溶液，另一方面是包括5μmol/L吲哚和0.1mol/LTBAHFF的乙腈溶液，并测量这个反应期间发射的发光。

在这方面，应该注意的是，粪臭素和吲哚彼此在结构上的区别仅在于粪臭素的吡咯环带有甲基，这与吲哚的吡咯环相反。

第一个实验是在图1所示的电化学电池10中并通过施加如上文第二.3点所述的电位阶跃进行的。

第二个实验是在图2所示的电化学电池20中并通过施加也如上文第二.3点所述的电位扫描进行。

在第一次实验中没有检测到明显的发光信号，测量的发光是图12所示的类型。

如图9和图10所示，这两个图分别代表了在第二次实验中对粪臭素标准溶液和吲哚溶液测量的发光的示例，对于粪臭素标准溶液观察到强烈的发光信号，而对于吲哚溶液没有观察到明显的发光信号，因此证实了通过本发明的方法检测粪臭素的非常特殊的性质。

二.5–盲法粪臭素检测试验：

通过使被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的有机提取物(0.27μg粪臭素/g脂肪组织)和未被粪臭素污染的猪脂肪组织的有机提取物在图2所示的电化学电池20中进行ECL反应，通过施加如上文第二.3点所述的电位阶跃，并通过测量在这个反应期间发射的发光，来进行粪臭素检测试验。

通过GC/MS预先检查有机提取物被污染还是未被污染。

这些试验是盲法进行的，即实验者不知道当提取物进行ECL反应时，这个提取物是否被粪臭素污染。

图11示出了典型地在被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的有机提取物中观察到的发光信号，而图12示出了在未被粪臭素污染的猪脂肪组织样本的有机提取物中观察到的不存在显著的发光信号。

二.6–校准曲线：

为了验证量化猪脂肪组织的有机提取物中存在的粪臭素的可能性，通过使如下：

-一方面，包括0.1μmol/L至5μmol/L粪臭素的粪臭素标准溶液；和

-另一方面，未被粪臭素污染但添加了0.1μmol/L至5μmol/L的合成粪臭素的猪脂肪组织样本的有机提取物；

进行ECL反应并测量在这个反应期间发射的发光的最大强度来制作校准曲线。

ECL反应在图1所示的电化学电池10中进行，并且通过向这个电池的工作电极11施加-2V的电位(相对于参比电极13)30秒，然后再施加+1V的电位(相对于参比电极13)30秒。

以这种方式获得的校准曲线如图13所示，曲线1对应于添加了合成粪臭素的有机提取物，而曲线2对应于粪臭素标准溶液。

这个附图示出，对于两条曲线，发光峰值的幅度与粪臭素的浓度之间几乎呈线性关系。

曲线1的斜率大约是曲线2的一半，这意味着在添加了合成粪臭素的有机提取物的情况下粪臭素的检测灵敏度大约是粪臭素标准溶液情况下的一半。

首先，这可以通过实验来解释，因为添加了合成粪臭素的有机提取物会再吸收30％的发射光子(通过UV/可见光谱进行测量)。剩余20％信号的丢失可能是由于添加了合成粪臭素的有机提取物比合成粪臭素的标准溶液具有更高的粘度，因此具有更低的离子迁移率，这减慢了控制电化学过程的扩散过程。

然而，这两种现象(光子的再吸收和粘度的增加)可以很容易地通过下列来校正：一方面在感兴趣的波长下分析的有机提取物的吸收系数(使用不太可能在不同有机提取物之间显著变化的平均值，或者在必要时对每个有机提取物并行进行的测量)，和另一方面先前已经评估的分析的有机提取物中所涉及的离子物质的扩散系数。

引用的参考文献

K.Verplanken等，Journal of Chromatography A 2016，1462，124-133M.P.Aguilar-Caballos等，Analytica Chimica Acta 2002，460，271-277WO-A-83/00928

EP-A-2 966 441

X.Liu等，Meat Science 2016，116，133-139

T.Okajima和T.Ohsaka，Journal of Electroanalytical Chemistry 2002，523，34-39

US-A-9,121,107

Claims

1.用于检测猪脂肪组织样本中粪臭素的存在的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：

a)使所述脂肪组织样本的有机提取物进行电化学发光反应；

b)在步骤a)期间测量发光强度，并且如果测量的发光强度超过预定阈值，则推断所述脂肪组织样本中存在粪臭素。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机提取物包括：(1)非质子有机溶剂、小于1wt.％的水和(3)研磨盐。

3.根据权利要求2所述的方法，其包括在步骤a)之前制备所述有机提取物，所述制备包括以下步骤：

i)将所述脂肪组织样本中存在的脂肪与所述脂肪组织样本中也存在的非脂肪要素分离；

ii)将所述脂肪组织样本中存在的所述脂肪脱水；

iii)将步骤ii)结束时获得的所述脂肪溶解在非质子有机溶剂中以获得有机溶液，并加热所述有机溶液；

iv)将步骤iii)结束时获得的所述有机溶液脱脂；以及

v)向步骤iv)结束时获得的所述有机溶液中加入无水研磨盐；

并且其中步骤i)和ii)可以连续或同时进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤i)和ii)同时进行。

5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤i)和ii)包括在敞口容器中将所述脂肪组织样本加热至100℃至150℃的温度，或者通过真空抽吸加热至低于100℃的温度。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂是乙腈、二甲基亚砜、碳酸丙烯酯或γ-丁内酯，优选乙腈。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中步骤iii)的加热在密闭容器中在50℃至80℃的温度并且在搅拌下进行10分钟至30分钟。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中步骤iv)包括离心在步骤iii)结束时获得的所述有机溶液，然后通过将所述有机溶液保持在低于或等于4℃但高于所述非质子有机溶剂的固化温度的温度来固定所述有机溶液的脂肪部分，并且除去已经被固定的所述脂肪部分。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述研磨盐是四氟硼酸四烷基铵、六氟磷酸四烷基铵或高氯酸四烷基铵，其中烷基包括1至4个碳原子，所述研磨盐优选四氟硼酸四丁基铵或六氟磷酸四丁基铵。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述有机提取物包括0.01mol/L至1mol/L，优选0.05mol/L至0.5mol/L，更优选0.1mol/L的所述研磨盐。

11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中所述有机提取物进一步包括强碱。

12.根据权利要求11所述的方法，其中有机提取物的制备进一步包括步骤vi)，步骤vi)包括向步骤v)结束时获得的所述有机溶液中加入强碱。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤a)在包括至少一个工作电极和一个对电极的电化学电池中进行，并且所述电化学发光反应包括向所述工作电极施加阴极电位，随后施加阳极电位。

14.根据权利要求13所述的方法，其中通过电位扫描、电位阶跃或通过一系列交替的阴极电位脉冲和阳极电位脉冲，向所述工作电极施加阴极电位，随后施加阳极电位。

15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述工作电极和所述对电极由掺杂的金刚石制成，所述金刚石优选掺杂硼。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述电化学电池是一次性的。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，如果在步骤b)中已经推断出了粪臭素的存在，则通过将在步骤b)期间测量的最大发光强度与校准曲线进行比较来进一步进行所述有机提取物中存在的粪臭素的量化，所述量化在步骤b)期间或步骤b)之后进行。

18.用于分拣完整公猪的胴体的方法，其特征在于所述方法包括实施根据权利要求1至17中任一项所述的方法。