CN114397438A - 基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器及其制备方法和应用，制备方法使用金纳米花作为荧光受体分子，结合三氯杀螨醇单克隆抗体通过金硫键共价作用制备免疫探针，金‑银双金属纳米团簇作为荧光供体分子，组装基于荧光共振能量转移的纸基免疫传感器；稀释三氯杀螨醇标准品母液配置不同浓度的标准溶液，测定其浓度与荧光信号的标准曲线。将实际待测样品经前处理，滴加至纸基免疫传感器上，通过测定荧光信号强度并根据线性模型，测定三氯杀螨醇浓度；金纳米花‑抗体偶联物的紫外吸收峰与纳米团簇的荧光发射光谱有效重合，可以发生基于荧光共振能量转移的荧光淬灭，提高检测的灵敏度，实现三氯杀螨醇含量的快速检测。

Description

基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于三氯杀螨醇的快速检测技术领域，具体涉及一种基于纳米团簇的荧光共振能量转移(FRET)纸基免疫传感器及其制备方法和应用，即利用基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器检测食品中三氯杀螨醇的应用。
背景技术
三氯杀螨醇作为一种广谱、高效的有机氯杀螨剂，可广泛用于防治棉花、果树和蔬菜等农作物上的病虫害，是现代农牧业生产中常用的有机氯杀虫剂之一。研究表明，该农药对人畜具有较高的毒性，主要症状有头晕头痛、多汗胸闷、瞳孔散大、视物不清、恶心呕吐、腹泻等。此外，三氯杀螨醇的残留会对环境和生物造成不良影响。我国已全面禁止了三氯杀螨醇的销售、使用。目前，三氯杀螨醇的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱-质谱串联法等，均需在实验室条件下操作，检测步骤复杂，对于样品处理要求高，耗时长，且需要专业的仪器和操作人员。相比之下，快速免疫分析法具有简单方便和特异性强等优点。
鉴于优异的吸收能力、生物降解性和便携性，纸基材料已被用作各种即时检测传感器的载体，包括层析试纸条和微流控设备。其中，免疫荧光传感器表现出优异的特异性、较高的灵敏度的特性。通过FRET原理构建荧光免疫传感器可有效提高检测体系的灵敏度。金属纳米团簇具有独特的原子和电子结构、优异的光学性能，可作为理想的荧光信号供体分子。此外，金属纳米粒子-蛋白偶联物具有免疫学和生物学特性。目前，未见基于金-银双金属纳米团簇和金纳米花的FRET纸基免疫传感器检测三氯杀螨醇的相关研究。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的第一方面，提供了一种基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器的制备方法。即设计原理主要以金-银双金属纳米团簇为荧光信号供体分子、金纳米花与抗体偶联制备的免疫探针可作为荧光信号受体分子，以聚酯膜为基底，基于FRET原理构建纸基免疫传感器。
本发明的第二方面，提供了上述基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
本发明的第三方面，提供了上述基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器的应用。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
本发明的第一方面，提供了一种基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器的制备方法，其包括如下步骤：
(1)、制备金纳米花作为荧光受体分子；
(2)、制备11-巯基十一烷酸的金-银双金属纳米团簇作为荧光供体分子；
(3)、利用金纳米花与三氯杀螨醇单克隆抗体(MC-44-CT，北京勤邦生物技术有限公司)通过金硫键进行共价偶联，离心，得到免疫探针，然后滴至聚酯膜上，干燥后接着在聚酯膜上滴加金-银双金属纳米团簇，干燥后得到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
作为本发明的优选实施例，步骤(1)中，金纳米花的制备方法包括：
将氯金酸溶液加热搅拌至沸腾，然后滴加柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌，停止加热，搅拌冷却至室温，得到紫外吸收峰为518nm处的金纳米粒子溶胶；将金纳米粒子溶胶加至双蒸水中，然后加入氯金酸溶液和柠檬酸钠水溶液，混合均匀后立即加入对苯二酚溶液，进行摇晃反应，离心，除去上清液浓缩，避光保存。
作为本发明的优选实施例，摇晃反应的温度为40-60℃，摇晃反应的时间为10-30min。
作为本发明的优选实施例，离心的转速为7000-9000rpm，离心的时间为10-15min。
作为本发明的优选实施例，浓缩的倍数为8-12倍。
作为本发明的优选实施例，步骤(1)中，金纳米花的粒径为60-80nm。
作为本发明的优选实施例，步骤(2)中，11-巯基十一烷酸的金-银双金属纳米团簇的制备方法包括：
将11-巯基十一烷酸溶于氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上边搅拌边加入氯金酸溶液和硝酸银溶液，混合均匀后加入氢氧化钠和硼氢化钠溶液，搅拌反应，反应结束后冻干，避光存放。
作为本发明的优选实施例，在磁力搅拌器上搅拌的温度为20-30℃，搅拌的速率为100-200rpm。
作为本发明的优选实施例，搅拌反应的时间为24-48h。
作为本发明的优选实施例，步骤(1)中，金-银双金属纳米团簇的粒径为1.5-2.5nm。
作为本发明的优选实施例，步骤(3)中，离心的转速为4000-6000rpm，离心的时间为5-8min。
作为本发明的优选实施例，步骤(3)中，干燥的温度为30-39℃，干燥的时间为20-40min。
作为本发明的优选实施例，步骤(3)中，免疫探针的滴加量为9-12μL，金-银双金属纳米团簇的滴加量为8-10μL。
本发明的第二方面，提供了一种基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器，其由上述的制备方法得到。
本发明的第三方面，提供了一种上述的基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器在检测食品三氯杀螨醇中的应用。
作为本发明的优选实施例，基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(a)、配置不同浓度梯度的三氯杀螨醇标准溶液，滴在基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，测定其荧光数值，拟合标准曲线；
(b)、将茶叶经前处理，滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，根据线性模型，测定三氯杀螨醇的浓度。
作为本发明的优选实施例，步骤(a)中，三氯杀螨醇的标准曲线拟合的方法：将三氯杀螨醇固体标准品(QCX-508，国家标准物质网)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成母液，通过三羟甲基氨基甲烷盐酸盐将母液稀释至不同浓度，将不同浓度的母液滴加到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在30-40℃下放置10-20min后检测荧光信号，荧光强度值为F1(即F1为加入三氯杀螨醇固体标准品反应后体系的荧光强度值)，不含三氯杀螨醇的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的荧光强度值为F0(即F0为阴性对照组的荧光强度值)，通过(F1-F0)/F0值进行标准曲线的拟合。
作为本发明的优选实施例，母液的不同浓度为0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。
作为本发明的优选实施例，步骤(b)中，将粉碎的茶叶粉末和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐混合，离心，稀释上清液作为检测所需的茶汤，取茶汤滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在30-40℃下放置10-20min后检测荧光信号，荧光强度值为F2，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的荧光强度值为F0，通过(F2-F0)/F0值和步骤(a)的标准曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明的金-银双金属纳米团簇自身具有优异的水溶性、生物相容性以及强的内源性荧光；另外，金纳米花的制备方法简单，具有500-750nm较宽的表面等离子体共振峰，可与金-银双金属纳米团簇荧光发射光谱有效重合，从而产生荧光共振能量转移效应，其中金-银双金属纳米团簇作为能量供体，金纳米花作为能量受体，当该检测原理与待测靶标的抗体相结合，可实现食品中靶标物质的特异性识别。即当金-银双金属纳米团簇被吸附在金纳米花-抗体偶联物表面时，发生荧光淬灭，当加入待测物时，待测物优先与金纳米花-抗体偶联物发生免疫反应，荧光共振能量转移作用被打断，金-银双金属纳米团簇的荧光恢复，因此可通过检测体系的荧光强度变化判定待测物的浓度。
第二、本发明合成的金-银双金属纳米团簇，银原子与金原子之间的相互作用可以改变合金团簇的电子结构和表面成分，从而提高化学和光学性能；金纳米花-抗体偶联物的紫外吸收峰与金-银双金属纳米团簇的荧光发射光谱有效重合，可以发生基于FRET的荧光淬灭；故本发明的基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器可通过荧光信号的变化实现食品中三氯杀螨醇的检测，具有制备简单、便携、检测快速等优点。
第三、本发明为高灵敏度、高特异性、基于FRET纸基免疫传感器的制备提供了新的方法，且制备方法新颖，制备过程简单，可应用于食品检测行业，具体可以快速检测茶叶样品中三氯杀螨醇的含量，在茶叶安全检测中具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明的基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器的制备原理示意图。
图2为本发明的实施例1中金-银纳米团簇的荧光光谱图。
图3为本发明的实施例1中金-银纳米团簇在紫外光下的示意图。
图4为本发明的实施例1中金-银纳米团簇的透射电镜图。
图5为本发明的实施例1中金纳米花的粒径和透射电镜图。
图6为本发明的实施例1中金纳米花的紫外吸收光谱和纳米团簇的荧光光谱图。
图7为本发明的实施例1中聚酯膜纸基的扫描电镜图。
图8为本发明的实施例1中免疫探针修饰后的纸基扫描电镜图。
图9为本发明的实施例1中检测三氯杀螨醇的纸基荧光情况图
图10为本发明的实施例1中检测三氯杀螨醇的荧光标准曲线示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器及其制备方法和应用。
如图1所示，本发明的基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器的制备方法包括如下步骤：
(1)、制备金纳米花作为荧光受体分子；
(2)、制备11-巯基十一烷酸稳定的金-银双金属纳米团簇作为荧光供体分子；
(3)、利用金纳米花与三氯杀螨醇单克隆抗体通过金硫键进行共价偶联，离心，得到免疫探针，然后滴至聚酯膜上，干燥后接着在聚酯膜上滴加金-银双金属纳米团簇，干燥后得到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
其中，在步骤(1)中，金纳米花的制备方法包括：将1％(w/v)氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加2mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到紫外吸收峰为518nm处的金纳米粒子溶胶；将2.5-3.0mL金纳米粒子溶胶加至100mL双蒸水中，然后加入1.2mL氯金酸溶液和2.64mL柠檬酸钠水溶液，混合均匀后立即加入20-25mL、30mmol/L对苯二酚溶液，在摇床中进行摇晃反应，反应结束后，离心，除去上清液浓缩，存放在4℃避光环境中。
具体地，摇晃反应的温度可以为40-60℃，优选为50℃；摇晃反应的时间可以为10-30min，优选为10min。
离心的转速可以为7000-9000rpm，优选为8000rpm；离心的时间可以为10-15min，优选为10min。
浓缩的倍数可以为8-12倍，优选为10倍。
在步骤(1)中，金纳米花的粒径可以为60-80nm，优选为72nm。
在步骤(2)中，11-巯基十一烷酸的金-银双金属纳米团簇的制备方法包括：将13.3mg的11-巯基十一烷酸溶于10mL、15mmol/L氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上边搅拌边加入4mL、3.25mmol/L氯金酸溶液和1mL、3.25mmol/L硝酸银溶液，混合均匀后加入40μL、0.15mmol/L氢氧化钠和67μL、26.4mmol/L硼氢化钠溶液，搅拌反应，反应结束后冻干，存放在4℃的避光环境中。
具体地，在磁力搅拌器上搅拌的温度可以为20-30℃，优选为25℃；搅拌的速率可以为100-200rpm，优选为150rpm。
搅拌反应的时间可以为24-48h，优选为24h。
在步骤(1)中，金-银双金属纳米团簇的粒径可以为1.5-2.5nm，优选为2.3nm。该金-银双金属纳米团簇在紫外光的照射下具有橙红色荧光，激发波长为260nm，发射波长为646nm。
在步骤(3)中，基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器的制备方法包括：将1mL浓缩10倍的金纳米花用K2CO3(0.1mol/L)调至pH为8.5后，与1.5μL、11.64mg/mL三氯杀螨醇单克隆抗体充分混合，在37℃下静置反应12h，反应结束后离心洗涤三次，得到免疫探针，紫外吸收峰为640-650nm；将免疫探针滴至聚酯膜上，干燥后滴加金-银双金属纳米团簇，干燥后得到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
离心的转速可以为4000-6000rpm，优选为6000rpm；离心的时间可以为5-8min，优选为8min。
干燥的温度可以为30-39℃，优选为37℃；干燥的时间可以为20-40min，优选为30min。
免疫探针的滴加量可以为9-12μL，优选为10μL；金-银双金属纳米团簇的滴加量可以为8-10μL，优选为10μL。
本发明还提供了由上述的制备方法得到的基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
本发明最后提供了上述的基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器在检测食品三氯杀螨醇中的应用。用金纳米花和抗体偶联制备免疫探针，结合金-银双金属纳米团簇构建纸基免疫传感器，可实现茶叶样品中三氯杀螨醇快速、高灵敏度的检测。
金属纳米团簇因具有独特的性能而引起了广泛的关注，例如超小的尺寸(通常小于2nm)、离散能级和优异的荧光特性。此外，金属纳米团簇具有制备简单、水溶性好和生物相容性好的优点。金属纳米团簇粒径位于原子和纳米颗粒之间，其与电子费米波长相当的尺寸和物理化学性质使其成为应用于生物医学和环境科学的理想纳米材料。此外，超小的金属纳米团簇由于其高的比表面积和强烈的荧光已被广泛应用于多个领域。利用元素的混合物生成合金，由于协同作用，可以增强合金的特定性能，而金属合金的成分、结构和性能的多样化扩展了金属系统的性能范围。银原子的掺杂可以显著增强金纳米团簇的荧光。总之，具有优异发光和光转换性能的荧光纳米材料被广泛用来制备生物传感器，与传统的比色传感体系相比，基于荧光信号的生物传感器具有更高的灵敏度。
其中，基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(a)、配置不同浓度梯度的三氯杀螨醇标准溶液，滴在基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，测定其荧光数值，拟合标准曲线；
(b)、将茶叶经前处理，滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，根据线性模型，测定三氯杀螨醇的浓度。
实际上，在步骤(a)中，三氯杀螨醇的标准曲线拟合的方法：将三氯杀螨醇固体标准品(QCX-508，国家标准物质网)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)溶液(pH为8.5，0.05mol/L)将母液稀释至不同浓度，将10μL不同浓度(0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL)的母液(三氯杀螨醇标准溶液)滴加到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置10-20min后检测荧光信号，荧光强度值为F1(即F1为加入三氯杀螨醇固体标准品反应后体系的荧光强度值)，不含三氯杀螨醇的Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0(即F0为阴性对照组的荧光强度值)，通过(F1-F0)/F0值进行标准曲线的拟合。
在步骤(b)中，将茶叶样品进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与4-5mL的Tris-HCl(pH为8.5，0.05mol/L)充分混合5min后，在4000rpm条件下离心10min，用Tris-HCl将上层无茶渣溶液稀释40-50倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取10μL茶汤滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置10-20min后检测荧光信号，荧光强度值为F2，Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0，通过(F2-F0)/F0值和步骤(a)的标准曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
本实施例利用基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金纳米花作为荧光受体分子：
将1％(w/v)氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加2mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到紫外吸收峰为518nm处的金纳米粒子溶胶；将2.7mL金纳米粒子溶胶加至100mL双蒸水中，然后加入1.2mL氯金酸溶液和2.64mL柠檬酸钠水溶液，混合均匀后立即加入24mL、30mmol/L对苯二酚溶液，在50℃摇床中摇晃反应10min，反应结束后，离心(8000rpm，10min)，除去上清液浓缩10倍，存放在4℃避光环境中。该金纳米花的粒径为72nm。
(2)、制备11-巯基十一烷酸稳定的金-银双金属纳米团簇作为荧光供体分子：
将13.3mg的11-巯基十一烷酸溶于10mL、15mmol/L氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上边搅拌边加入4mL、3.25mmol/L氯金酸溶液和1mL、3.25mmol/L硝酸银溶液，混合均匀后加入40μL、0.15mmol/L氢氧化钠和67μL、26.4mmol/L硼氢化钠溶液，在25℃下150rpm搅拌反应24h，反应结束后冻干，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇的粒径为2.3nm。
(3)、制备基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器：
将1mL浓缩10倍的金纳米花用K2CO3(0.1mol/L)调至pH为8.5后，与1.5μL、11.64mg/mL三氯杀螨醇单克隆抗体充分混合，在37℃下静置反应12h，反应结束后离心(6000rpm，离心的时间为8min)洗涤三次，得到免疫探针，紫外吸收峰为645nm；将10μL免疫探针滴至聚酯膜上，在37℃下干燥30min后滴加10μL金-银双金属纳米团簇，干燥(37℃，30min)后得到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
(4)、拟合三氯杀螨醇标准曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tris-HCl溶液(pH为8.5，0.05mol/L)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL)，将10μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置20min后检测荧光信号，荧光强度值为F1(即F1为加入三氯杀螨醇固体标准品反应后体系的荧光强度值)，不含三氯杀螨醇的Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0(即F0为阴性对照组的荧光强度值)，通过(F1-F0)/F0值进行标准曲线的拟合。
(5)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与5mL的Tris-HCl(pH为8.5，0.05mol/L)充分混合5min后，在4000rpm条件下离心10min，用Tris-HCl将上层无茶渣溶液稀释40倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取10μL茶汤滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置20min后检测荧光信号，荧光强度值为F2，Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0，通过(F2-F0)/F0值和步骤(4)的标准曲线进行计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
从图2和图3可以看出，本实施例中当双金属纳米团簇中金和银的摩尔比为4:1时，团簇具有最强的荧光，激发波长为260nm，发射波长为646nm处。由于最高占据分子轨道和最低未占据分子轨道之间的间隙缩小。Ag+的大小与硫代环的空腔相匹配，轨道排列良好，形成了新的最低未占据分子轨道。添加的Ag(I)可连接到金纳米团簇上的Au(I)-硫醇基基序，形成大的Au(I)/Ag(I)-硫醇基基序，从而通过聚集诱导发光(AIE)聚集诱导产生强烈的红色发射。
由图4可知，金-银双金属纳米团簇的粒径为2.3nm，观察到的晶格距离为0.204nm对应的是Ag(200)晶面。
从图5可以看出，金纳米花的平均粒径为72nm，呈单峰分布。根据透射电镜图可以看出，金纳米花呈现出明显的三维结构，表面有多个尖锐的分枝。从图6可以看出，金纳米花-抗体偶联物的紫外吸收峰位于645nm，与纳米团簇的荧光光谱重合。
从图7和图8可以看出，聚酯膜具有分布均匀的纤维结构，纤维表面光滑，经金纳米花-抗体偶联物修饰后，表面变得粗糙，表明被纳米粒子覆盖。
从图9可以看出，在三氯杀螨醇浓度从0ng/mL增加至1000ng/mL时，纸基免疫传感器上的荧光由弱变强。从图10可以看出，所测得结果的线性范围为5-200ng/mL，检出限为2.61ng/mL，表明相该法具有较高的灵敏度。
实施例2：
本实施例利用基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金纳米花作为荧光受体分子：
将1％(w/v)氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加2mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到紫外吸收峰为518nm处的金纳米粒子溶胶；将3.0mL金纳米粒子溶胶加至100mL双蒸水中，然后加入1.2mL氯金酸溶液和2.64mL柠檬酸钠水溶液，混合均匀后立即加入20mL、30mmol/L对苯二酚溶液，在50℃摇床中摇晃反应10min，反应结束后，离心(8000rpm，12min)，除去上清液浓缩10倍，存放在4℃避光环境中。该金纳米花的粒径为80nm。
(2)、制备11-巯基十一烷酸稳定的金-银双金属纳米团簇作为荧光供体分子：
将13.3mg的11-巯基十一烷酸溶于10mL、15mmol/L氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上边搅拌边加入4mL、3.25mmol/L氯金酸溶液和1mL、3.25mmol/L硝酸银溶液，混合均匀后加入40μL、0.15mmol/L氢氧化钠和67μL、26.4mmol/L硼氢化钠溶液，在25℃下100rpm搅拌反应30h，反应结束后冻干，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇的粒径为2.4nm。
(3)、制备基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器：
将1mL浓缩10倍的金纳米花用K2CO3(0.1mol/L)调至pH为8.5后，与1.5μL、11.64mg/mL三氯杀螨醇单克隆抗体充分混合，在37℃下静置反应12h，反应结束后离心(4500rpm，离心的时间为5min)洗涤三次，得到免疫探针，紫外吸收峰为650nm；将10μL免疫探针滴至聚酯膜上，在37℃下干燥20min后滴加8μL金-银双金属纳米团簇，干燥(37℃，20min)后得到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
(4)、拟合三氯杀螨醇标准曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tris-HCl溶液(pH为8.5，0.05mol/L)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL)，将10μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置10min后检测荧光信号，荧光强度值为F1(即F1为加入三氯杀螨醇固体标准品反应后体系的荧光强度值)，不含三氯杀螨醇的Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0(即F0为阴性对照组的荧光强度值)，通过(F1-F0)/F0值进行标准曲线的拟合。
(5)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与5mL的Tris-HCl(pH为8.5，0.05mol/L)充分混合5min后，在4000rpm条件下离心10min，用Tris-HCl将上层无茶渣溶液稀释40倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取10μL茶汤滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置10min后检测荧光信号，荧光强度值为F2，Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0，通过(F2-F0)/F0值和步骤(4)的标准曲线进行计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
实施例3：
本实施例利用基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金纳米花作为荧光受体分子：
将1％(w/v)氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加2mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到紫外吸收峰为518nm处的金纳米粒子溶胶；将2.5mL金纳米粒子溶胶加至100mL双蒸水中，然后加入1.2mL氯金酸溶液和2.64mL柠檬酸钠水溶液，混合均匀后立即加入25mL、30mmol/L对苯二酚溶液，在50℃摇床中摇晃反应15min，反应结束后，离心(8000rpm，15min)，除去上清液浓缩10倍，存放在4℃避光环境中。该金纳米花的粒径为60nm。
(2)、制备11-巯基十一烷酸稳定的金-银双金属纳米团簇作为荧光供体分子：
将13.3mg的11-巯基十一烷酸溶于10mL、15mmol/L氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上边搅拌边加入4mL、3.25mmol/L氯金酸溶液和1mL、3.25mmol/L硝酸银溶液，混合均匀后加入40μL、0.15mmol/L氢氧化钠和67μL、26.4mmol/L硼氢化钠溶液，在25℃下150rpm搅拌反应48h，反应结束后冻干，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇的粒径为2.5nm。
(3)、制备基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器：
将1mL浓缩10倍的金纳米花用K2CO3(0.1mol/L)调至pH为8.5后，与1.5μL、11.64mg/mL三氯杀螨醇单克隆抗体充分混合，在37℃下静置反应12h，反应结束后离心(4000rpm，离心的时间为6min)洗涤三次，得到免疫探针，紫外吸收峰为640nm；将10μL免疫探针滴至聚酯膜上，在37℃下干燥25min后滴加8μL金-银双金属纳米团簇，干燥(37℃，25min)后得到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
(4)、拟合三氯杀螨醇标准曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tris-HCl溶液(pH为8.5，0.05mol/L)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL)，将10μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置15min后检测荧光信号，荧光强度值为F1(即F1为加入三氯杀螨醇固体标准品反应后体系的荧光强度值)，不含三氯杀螨醇的Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0(即F0为阴性对照组的荧光强度值)，通过(F1-F0)/F0值进行标准曲线的拟合。
(5)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与5mL的Tris-HCl(pH为8.5，0.05mol/L)充分混合5min后，在4000rpm条件下离心10min，用Tris-HCl将上层无茶渣溶液稀释40倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取10μL茶汤滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置15min后检测荧光信号，荧光强度值为F2，Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0，通过(F2-F0)/F0值和步骤(4)的标准曲线进行计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
实施例4：
本实施例利用基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金纳米花作为荧光受体分子：
将1％(w/v)氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加2mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到紫外吸收峰为518nm处的金纳米粒子溶胶；将2.6mL金纳米粒子溶胶加至100mL双蒸水中，然后加入1.2mL氯金酸溶液和2.64mL柠檬酸钠水溶液，混合均匀后立即加入22mL、30mmol/L对苯二酚溶液，在50℃摇床中摇晃反应30min，反应结束后，离心(8000rpm，10min)，除去上清液浓缩10倍，存放在4℃避光环境中。该金纳米花的粒径为75nm。
(2)、制备11-巯基十一烷酸稳定的金-银双金属纳米团簇作为荧光供体分子：
将13.3mg的11-巯基十一烷酸溶于10mL、15mmol/L氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上边搅拌边加入4mL、3.25mmol/L氯金酸溶液和1mL、3.25mmol/L硝酸银溶液，混合均匀后加入40μL、0.15mmol/L氢氧化钠和67μL、26.4mmol/L硼氢化钠溶液，在25℃下200rpm搅拌反应24h，反应结束后冻干，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇的粒径为1.5nm。
(3)、制备基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器：
将1mL浓缩10倍的金纳米花用K2CO3(0.1mol/L)调至pH为8.5后，与1.5μL、11.64mg/mL三氯杀螨醇单克隆抗体充分混合，在37℃下静置反应12h，反应结束后离心(5000rpm，离心的时间为8min)洗涤三次，得到免疫探针，紫外吸收峰为648nm；将10μL免疫探针滴至聚酯膜上，在37℃下干燥40min后滴加10μL金-银双金属纳米团簇，干燥(37℃，40min)后得到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
(4)、拟合三氯杀螨醇标准曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tris-HCl溶液(pH为8.5，0.05mol/L)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL)，将10μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置15min后检测荧光信号，荧光强度值为F1(即F1为加入三氯杀螨醇固体标准品反应后体系的荧光强度值)，不含三氯杀螨醇的Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0(即F0为阴性对照组的荧光强度值)，通过(F1-F0)/F0值进行标准曲线的拟合。
(5)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与5mL的Tris-HCl(pH为8.5，0.05mol/L)充分混合5min后，在4000rpm条件下离心10min，用Tris-HCl将上层无茶渣溶液稀释40倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取10μL茶汤滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置15min后检测荧光信号，荧光强度值为F2，Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0，通过(F2-F0)/F0值和步骤(4)的标准曲线进行计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
实施例5：
本实施例利用基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金纳米花作为荧光受体分子：
将1％(w/v)氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加2mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到紫外吸收峰为518nm处的金纳米粒子溶胶；将2.6mL金纳米粒子溶胶加至100mL双蒸水中，然后加入1.2mL氯金酸溶液和2.64mL柠檬酸钠水溶液，混合均匀后立即加入25mL、30mmol/L对苯二酚溶液，在50℃摇床中摇晃反应20min，反应结束后，离心(8000rpm，15min)，除去上清液浓缩10倍，存放在4℃避光环境中。该金纳米花的粒径为65nm。
(2)、制备11-巯基十一烷酸稳定的金-银双金属纳米团簇作为荧光供体分子：
将13.3mg的11-巯基十一烷酸溶于10mL、15mmol/L氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上边搅拌边加入4mL、3.25mmol/L氯金酸溶液和1mL、3.25mmol/L硝酸银溶液，混合均匀后加入40μL、0.15mmol/L氢氧化钠和67μL、26.4mmol/L硼氢化钠溶液，在25℃下150rpm搅拌反应36h，反应结束后冻干，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇的粒径为2.0nm。
(3)、制备基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器：
将1mL浓缩10倍的金纳米花用K2CO3(0.1mol/L)调至pH为8.5后，与1.5μL、11.64mg/mL三氯杀螨醇单克隆抗体充分混合，在37℃下静置反应12h，反应结束后离心(5000rpm，离心的时间为5min)洗涤三次，得到免疫探针，紫外吸收峰为642nm；将10μL免疫探针滴至聚酯膜上，在37℃下干燥35min后滴加8μL金-银双金属纳米团簇，干燥(37℃，35min)后得到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器。
(4)、拟合三氯杀螨醇标准曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tris-HCl溶液(pH为8.5，0.05mol/L)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL)，将10μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置20min后检测荧光信号，荧光强度值为F1(即F1为加入三氯杀螨醇固体标准品反应后体系的荧光强度值)，不含三氯杀螨醇的Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0(即F0为阴性对照组的荧光强度值)，通过(F1-F0)/F0值进行标准曲线的拟合。
(5)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与5mL的Tris-HCl(pH为8.5，0.05mol/L)充分混合5min后，在4000rpm条件下离心10min，用Tris-HCl将上层无茶渣溶液稀释40倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取10μL茶汤滴加至基于纳米团簇的FRET纸基免疫传感器上，在37℃下放置20min后检测荧光信号，荧光强度值为F2，Tris-HCl溶液的荧光强度值为F0，通过(F2-F0)/F0值和步骤(4)的标准曲线进行计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、制备金纳米花作为荧光受体分子；
(2)、制备11-巯基十一烷酸的金-银双金属纳米团簇作为荧光供体分子；
(3)、将所述金纳米花与三氯杀螨醇单克隆抗体通过金硫键进行共价偶联，离心，得到免疫探针，然后滴至聚酯膜上，干燥后接着在聚酯膜上滴加金-银双金属纳米团簇，干燥后得到基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述金纳米花的制备方法包括：
将氯金酸溶液加热搅拌至沸腾，然后滴加柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌，停止加热，搅拌冷却至室温，得到金纳米粒子溶胶；将所述金纳米粒子溶胶加至双蒸水中，然后加入氯金酸溶液和柠檬酸钠水溶液，混合均匀后加入对苯二酚溶液，进行摇晃反应，离心，除去上清液浓缩，避光保存；和/或，
所述摇晃反应的温度为40-60℃，摇晃反应的时间为10-30min；和/或，
所述离心的转速为7000-9000rpm，离心的时间为10-15min；和/或，
所述浓缩的倍数为8-12倍；和/或，
步骤(1)中，所述金纳米花的粒径为60-80nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述11-巯基十一烷酸的金-银双金属纳米团簇的制备方法包括：
将11-巯基十一烷酸溶于氢氧化钠溶液中，在磁力搅拌器上边搅拌边加入氯金酸溶液和硝酸银溶液，混合均匀后加入氢氧化钠和硼氢化钠溶液，搅拌反应，反应结束后冻干，避光存放；和/或，
所述在磁力搅拌器上搅拌的温度为20-30℃，搅拌的速率为100-200rpm；和/或，
所述搅拌反应的时间为24-48h；和/或，
步骤(1)中，所述金-银双金属纳米团簇的粒径为1.5-2.5nm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述离心的转速为4000-6000rpm，离心的时间为5-8min；和/或，
步骤(3)中，所述干燥的温度为30-39℃，所述干燥的时间为20-40min；和/或，
步骤(3)中，所述免疫探针的滴加量为9-12μL，所述金-银双金属纳米团簇的滴加量为8-10μL。
5.一种基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器，其特征在于：其由权利要求1-4任一项所述的制备方法得到。
6.一种如权利要求5所述的基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器在检测食品三氯杀螨醇中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(a)、配置不同浓度梯度的三氯杀螨醇标准溶液，滴在所述基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器上，测定其荧光数值，拟合标准曲线；
(b)、将茶叶经前处理，滴加至基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器上，根据线性模型，测定三氯杀螨醇的浓度。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(a)中，所述三氯杀螨醇的标准曲线拟合的方法：将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成母液，通过三羟甲基氨基甲烷盐酸盐将母液稀释至不同浓度，将不同浓度的母液滴加到基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器上，检测荧光信号，荧光强度值为F1，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的荧光强度值为F0，通过(F1-F0)/F0值进行标准曲线的拟合；和/或，
所述母液的不同浓度为0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(b)中，将粉碎的茶叶粉末和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐混合，离心，稀释上清液作为检测所需的茶汤，取茶汤滴加至基于纳米团簇的荧光共振能量转移纸基免疫传感器上，检测荧光信号，荧光强度值为F2，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的荧光强度值为F0，通过(F2-F0)/F0值和步骤(a)的标准曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
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