CN114384189B - 一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法及其产品和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种(1,3)‑β‑D‑葡聚糖标准物质的制备方法及其产品和应用，所述(1,3)‑β‑D‑葡聚糖标准物质的制备方法包括如下步骤：采用半制备高效液相色谱仪对(1,3)‑β‑D‑葡聚糖溶液进行纯化，得到所述(1,3)‑β‑D‑葡聚糖标准物质。所述(1,3)‑β‑D‑葡聚糖标准物质的纯度为80%以上；所述(1,3)‑β‑D‑葡聚糖标准物质的均匀性和稳定性结果均符合标准物质的要求，在临床真菌感染的检测中，所述(1,3)‑β‑D‑葡聚糖标准物质可以用于(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于计量技术领域，涉及一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法及其产品和应用。
背景技术
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，(1,3)-β-D-葡聚糖占真菌细胞壁成分的50%以上，(1,3)-β-D-葡聚糖是一种以β-(1,3)-葡萄糖苷键聚合而成的高分子化合物，是真菌细胞壁上的特有成分。
(1,3)-β-D-葡聚糖的外观形态为白色絮状物，溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂。(1,3)-β-D-葡聚糖的提取方法包括碱法和酶法。碱法是将真菌茯苓粉末脱脂，加碱反应粗制，再加入二甲亚砜精制。酶法则是以酵母(1,3)-β-D-葡聚糖为原料，通过碱-酶解法制备水溶性酵母(1,3)-β-D-葡聚糖。
当人体的血液或深部组织发生真菌感染时，真菌经吞噬细胞的吞噬和消化后，真菌细胞壁中的(1,3)-β-D-葡聚糖释放出来，使血液及其他体液中的(1,3)-β-D-葡聚糖的含量增加。因此，临床上通过对血液或非血液标本中的(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测，判断机体是否感染侵袭性真菌。目前，(1,3)-β-D-葡聚糖的检测方法包括免疫动态比浊法和ELISA法。
CN112625145A公开了一种1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物及其制备方法，通过将1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物与生物素或酶间接地连接，制备了一种1,3-β-D葡聚糖的磁微粒酶促化学发光免疫检测试剂盒，利用所述试剂盒能够对(1,3)-β-D-葡聚糖进行检测。
CN102866255A公开了一种人体液真菌(1,3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用方法。所述试剂盒的反应主剂含有东方鲎血细胞G因子、凝固酶原和促活剂。所述试剂盒能够简便、快速和安全地完成(1,3)-β-D-葡聚糖的检测，且检测的特异性好、准确度高。
但是，目前的(1,3)-β-D-葡聚糖的检测方法只能实现定性检测和半定量。随着临床真菌感染病例的增多，越来越多临床真菌感染检测需要用到(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质，但是目前没有(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质。因此，开发一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质对于临床真菌感染检测具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法及其产品和应用。所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度为80%以上；所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的均匀性和稳定性结果均符合标准物质的要求，在临床真菌感染检测中，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质可以用于(1,3)-β-D-葡聚糖的定量检测。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法包括如下步骤：
采用半制备高效液相色谱仪对(1,3)-β-D-葡聚糖溶液进行纯化，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质；
所述纯化中采用的色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl；
所述纯化中流动相的流速为0.5-1 mL/min；
所述纯化中收集保留时间为15-25 min的馏分。
在本发明中，所述纯化中流动相的流速为0.5-1 mL/min，例如可以是0.5 mL/min、0.6 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min或1.0 mL/min等。
在本发明中，所述纯化中收集保留时间为15-25 min的馏分，例如可以是15 min、18 min、20 min、22 min或25 min等。
优选地，所述纯化中(1,3)-β-D-葡聚糖溶液的进样量为98-102 μL，例如可以是98μL、99 μL、100 μL、101 μL或102 μL等。
优选地，所述纯化中色谱柱的柱温为75-82℃，例如可以是75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃或82℃等。
优选地，所述纯化中采用的流动相为细菌内毒素检查用水。
优选地，所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液的浓度不高于1 mg/mL，例如可以是1 mg/mL、0.95 mg/mL、0.9 mg/mL、0.85 mg/mL、0.8 mg/mL、0.75 mg/mL或0.7 mg/mL等。
优选地，所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液由以下方法配制得到：将(1,3)-β-D-葡聚糖样品与细菌内毒素检查用水混合，加热后离心，收集上清液，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液。
优选地，所述(1,3)-β-D-葡聚糖样品的纯度为70-78%，例如可以是70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%或78%等。
优选地，所述加热采用水浴进行，所述水浴的温度为95-100℃，例如可以是95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃等，水浴的时间为2.5-3.5 h，例如可以是2.5 h、2.8 h、3.0h、3.2 h或3.5 h等。
优选地，所述加热过程中需间隔进行振荡，所述振荡的具体操作为：间隔20-25min振荡一次，例如可以是20 min、21 min、22 min、23 min、24 min或25 min等，每次振荡的转速各自独立地为100-200 rpm，例如可以是100 rpm、120 rpm、140 rpm、150 rpm、160rpm、180 rpm或200 rpm等，所述振荡持续的时间各自独立地为2-5 min，例如可以是2 min、3 min、4 min或5 min等。
优选地，所述离心前需将加热后的混合液冷却至20-25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
优选地，所述离心的转速为2500-3500 rpm，例如可以是2500 rpm、2800 rpm、3000rpm、3200 rpm或3500 rpm等，离心的时间为5-15 min，例如可以是5 min、8 min、10 min、12min或15 min等。
优选地，纯化后将收集的馏分冻干，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质。
优选地，所述冻干的参数为：-80~-20℃冷冻，例如可以是-80℃或-20℃等，5-10Pa的压力下真空冷冻干燥20~30 h，真空干燥的压力例如可以是5 Pa、6 Pa、7 Pa、8 Pa、9Pa或10 Pa等，真空干燥的时间例如可以是20 h、21 h、23 h、25 h、27 h、29 h或30 h等。
本发明中，所述(1,3)-β-D-葡聚糖的保留时间为15-25 min，经过半制备高效液相的纯化后，所述(1,3)-β-D-葡聚糖的纯度提高到80%以上。
优选地，对(1,3)-β-D-葡聚糖溶液进行纯化前，还包括采用核磁氢谱仪、红外光谱仪和HPLC-GPC-激光光散射仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析。
本发明中，经过核磁氢谱仪、红外光谱仪和HPLC-GPC-激光光散射仪的检测，结果表明所述未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品是以β-(1,3)-D-糖苷键为主链的D-葡聚糖结构；红外光谱的结果也与(1,3)-β-D-葡聚糖的特征峰一致；HPLC-GPC-激光光散射仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行了分子量分布表征，结果表明其数均分子量Mn为4.483×107g/mol。
作为本发明的优选技术方案，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法包括如下步骤：
采用核磁氢谱仪、红外光谱仪和HPLC-GPC-激光光散射仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析。
将(1,3)-β-D-葡聚糖样品与细菌内毒素检查用水混合，95-100℃水浴加热2.5-3.5 h，加热过程中需间隔进行振荡，间隔20-25 min振荡一次，每次振荡的转速各自独立地为100-200 rpm，所述振荡持续的时间各自独立地为2-5 min，将加热后的混合液冷却至20-25℃，2500-3500 rpm离心5-15 min，收集上清液，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液，所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液按质量百分含量计包括：(1,3)-β-D-葡聚糖样品40-60%和细菌内毒素检查用水40-60%。采用半制备高效液相色谱仪对(1,3)-β-D-葡聚糖溶液进行纯化，所述纯化中采用的色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl；流动相为细菌内毒素检查用水；流速为0.5-1 mL/min；进样量为98-102 μL；柱温为75-82℃；所述纯化中收集保留时间为15-25min的馏分，纯化后将收集的馏分冻干，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质；所述冻干的参数为：-80~-20℃冷冻，5-10 Pa的压力下真空冷冻干燥20~30 h。
第二方面，本发明提供一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质由第一方面所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法制备得到。
优选地，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度为80%以上，例如可以是80%、82%、84%、85%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、98%或99%等。
第三方面，本发明提供一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法包括如下步骤：
步骤1：采用卡尔费休水分测定仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量；采用高效液相色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量；采用电感耦合等离子体质谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量；采用离子色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量；
步骤2：采用质量平衡法计算所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度；
步骤1中，采用高效液相色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量包括如下步骤：
分别采用高效液相色谱-示差折光检测器和高效液相色谱-电喷雾检测器检测(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液中的有机物的质量百分含量；
所述高效液相色谱仪采用的色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl；
所述流动相的流速为0.5-1 mL/min，例如可以是0.5 mL/min、0.6 mL/min、0.7mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min或1.0 mL/min等。
优选地，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的进样量为50-55 μL，例如可以是50 μL、51 μL、52 μL、53 μL、54 μL或55 μL等。
优选地，所述色谱柱的柱温为75-82℃；，例如可以是75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃或82℃等。
优选地，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的浓度不高于1 mg/mL，例如可以是1 mg/mL、0.95 mg/mL、0.9 mg/mL、0.85 mg/mL、0.8 mg/mL、0.75 mg/mL或0.7 mg/mL等。
优选地，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的溶剂为细菌内毒素检查用水。
在本发明中，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的质量百分含量例如可以是40%、45%、50%、55%或60%等；所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液中细菌内毒素检查用水的质量百分含量例如可以是40%、45%、50%、55%或60%等。
优选地，步骤1中，所述电感耦合等离子体质谱仪测定的元素包括Li、Be、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、Cs、Ba、Tl、Pb或U中任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤1中，所述离子色谱仪测定的阴离子包括F-、Cl-、SO4 2-、NO3 -和H2PO4 -中任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤2中，采用质量平衡法计算所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度的公式包括：
公式1中，
P 1代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-示差折光检测器的检测结果；
P 2代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-电喷雾检测器的检测结果；
X m代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量；
X a代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量；
X w代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量。
在本发明中，(1,3)-β-D-葡聚糖为不同聚合度的(1,3)-β-D-葡聚糖的混合物，无法用定量核磁法进行纯度定值。因此，本发明以质量平衡法对纯化的目标分子量区段的(1,3)-β-D-葡聚糖进行了质量百分含量测定，用于计算纯化冻干的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中的(1,3)-β-D-葡聚糖的质量百分含量，以进一步计算复溶溶液的配制值。
在本发明中，对纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖固体采用质量平衡法测定目标分子量区段的(1,3)-β-D-葡聚糖的质量百分含量。其原理是待测标准物质的主成分的质量百分含量与标准物质中所含有的水分、残留溶剂、无机物阳离子、无机阴离子和有机物等杂质的质量百分含量之和应为100%。对纯化冻干的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质，采用卡尔费休滴定法测定水分的质量百分含量、采用质谱法测定无机阳离子杂质的质量百分含量、采用离子色谱测定无机阴离子杂质的质量百分含量、采用HPLC-RID法和HPLC-CAD法测定有机物杂质的质量百分含量，最后利用质量平衡法可以计算出(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中的(1,3)-β-D-葡聚糖的质量百分含量。
作为本发明的优选技术方案，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法包括如下步骤：
步骤1：采用卡尔费休水分测定仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量；采用高效液相色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量；采用电感耦合等离子体质谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量；采用离子色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量。
采用高效液相色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量包括如下步骤：
配制(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液，所述所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液按质量百分含量计包括：(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质40-60%和细菌内毒素检查用水40-60%；分别采用高效液相色谱-示差折光检测器和高效液相色谱-电喷雾检测器检测(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液中的有机物的质量百分含量；所述高效液相色谱仪采用的色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl；柱温为75-82℃；流动相为细菌内毒素检查用水；流速为0.5-1mL/min；进样量为50-55 μL。
所述电感耦合等离子体质谱仪测定的元素包括Li、Be、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、Cs、Ba、Tl、Pb或U中任意一种或至少两种的组合。
所述离子色谱仪测定的阴离子包括F-、Cl-、SO4 2-、NO3 -和H2PO4 -中任意一种或至少两种的组合。
步骤2：采用质量平衡法计算所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度。
采用质量平衡法计算所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度的公式包括：
公式1中，
P 1代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-示差折光检测器的检测结果；
P 2代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-电喷雾检测器的检测结果；
X m代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量；
X a代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量；
X w代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量。
第四方面，本发明提供第二方面所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质在真菌(1,3)-β-D-葡聚糖检测中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供了一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度为80%以上。
（2）所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的均匀性和稳定性结果均符合标准物质的要求，在临床真菌感染检测中，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质可以用于(1,3)-β-D-葡聚糖的定量检测。
附图说明
图1为实施例1中未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品的核磁氢谱图。
图2为实施例1中未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品的红外光谱图。
图3为实施例4中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的HPLC-RID谱图。
图4为实施例4中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的HPLC-CAD谱图。
图5为测试例2中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的短期稳定性检验曲线。
图6为测试例3中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的长期稳定性检验曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例和测试例中所使用的试剂和仪器的来源如下所示：
实施例1
本实施例提供一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法包括如下步骤：
采用核磁氢谱仪、红外光谱仪和HPLC-GPC-激光光散射仪（HPLC：岛津20A；GPC-激光光散射仪：怀雅特DAWN）对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析，所述未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品的纯度为79.8%，所述未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品为购自Megazyme公司的茯苓(1,3)-β-D-葡聚糖。
采用核磁氢谱仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析：
样品处理：将样品5 mg溶于0.5 mL重水中，溶解后转移至核磁管中，磁场强度为800 MHz，进行核磁氢谱分析。
核磁氢谱分析的参数设置：激发脉冲角度30°，时间域数据点32 k，扫描宽度16025.6 Hz，弛豫延迟32 s，累计采样32次，探头温度296 K。
所述未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品的核磁氢谱图如图1所示。从图1可知，(1,3)-β-D-葡聚糖样品的多糖环上质子的化学位移δ为3.2~3.9 ppm，-CH2COOH上质子的化学位移δ为4.0~4.1 ppm，各质子的化学位移都小于5 ppm，说明只存在β-糖苷键构型。核磁氢谱的化学位移归属与文献报道一致，证明其是以β-(1,3)-D-糖苷键为主链的D-葡聚糖结构。
采用红外光谱仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析：
所述未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品的红外光谱图如图2所示。从图2可知，在3300~3600 cm-1有羟基（-OH）的强烈缔合峰，2920 cm-1附近的峰是糖类C-H的伸缩振动，这两个峰是糖类的特征吸收峰。在1400~l200 cm-1附近的峰是糖类C-H的变角振动，l200~l000cm-1为环上C-OH的吸收峰。在890 cm-1处有β-D-吡喃糖特征吸收峰。在1640 cm-1和l420 cm-1附近有弱的吸收峰，1620~l580 cm-1和l430~1400 cm-1处的吸收峰为羧甲基。以上所述特征吸收峰与文献报道的(1,3)-β-D-葡聚糖的特征吸收峰一致。
采用HPLC-GPC-激光光散射仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析：
所述未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品经过HPLC-GPC-激光光散射仪分析，结果表明，所述未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品的数均分子量Mn=4.483×107 g/mol。
将(1,3)-β-D-葡聚糖样品与细菌内毒素检查用水混合，98℃水浴加热3 h，加热过程中需间隔进行振荡，间隔23 min振荡一次，每次振荡的转速各自独立地为150 rpm，所述振荡持续的时间各自独立地为3 min，将加热后的混合液冷却至23℃，3000 rpm离心10min，收集上清液，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液，所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液按质量百分含量计包括：(1,3)-β-D-葡聚糖样品50%和细菌内毒素检查用水50%。采用半制备高效液相色谱仪对(1,3)-β-D-葡聚糖溶液进行纯化，所述纯化中采用的色谱柱为凝胶柱TSKgelG2500PWxl（7.8 mm×300 mm，7 μm），保护柱为TSKgel PWxl（6.0 mm×40 mm，12 μm）；流动相为细菌内毒素检查用水；流速为0.5 mL/min；进样量为100 μL；柱温为79℃；所述纯化中收集保留时间为20-25 min的馏分；将收集的馏分混合，混合后按每瓶1.5 mL分装到西林瓶中，-80℃冷冻，10 Pa的压力下真空冷冻干燥20 h，得到(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质。
实施例2
本实施例提供一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法包括如下步骤：
采用核磁氢谱仪、红外光谱仪和HPLC-GPC-激光光散射仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析。
将(1,3)-β-D-葡聚糖样品与细菌内毒素检查用水混合，95℃水浴加热3.5 h，加热过程中需间隔进行振荡，间隔20 min振荡一次，每次振荡的转速各自独立地为200 rpm，所述振荡持续的时间各自独立地为5 min，将加热后的混合液冷却至25℃，2500 rpm离心15min，收集上清液，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液，所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液按质量百分含量计包括：(1,3)-β-D-葡聚糖样品40%和细菌内毒素检查用水60%。采用半制备高效液相色谱仪对(1,3)-β-D-葡聚糖溶液进行纯化，所述纯化中采用的色谱柱为凝胶柱TSKgelG2500PWxl（7.8 mm×300 mm，7 μm），保护柱为TSKgel PWxl（6.0 mm×40 mm，12 μm）；流动相为细菌内毒素检查用水；流速为0.5 mL/min；进样量为100 μL；柱温为75℃；所述纯化中收集保留时间为20-25 min的馏分；将收集的馏分混合，混合后按每瓶1.5 mL分装到西林瓶中，-80℃冷冻，5 Pa的压力下真空冷冻干燥30 h，得到(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质。
实施例3
本实施例提供一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法包括如下步骤：
采用核磁氢谱仪、红外光谱仪和HPLC-GPC-激光光散射仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析。
将(1,3)-β-D-葡聚糖样品与细菌内毒素检查用水混合，100℃水浴加热2.5 h，加热过程中需间隔进行振荡，间隔25 min振荡一次，每次振荡的转速各自独立地为100 rpm，所述振荡持续的时间各自独立地为2 min，将加热后的混合液冷却至20℃，3500 rpm离心5min，收集上清液，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液，所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液按质量百分含量计包括：(1,3)-β-D-葡聚糖样品60%和细菌内毒素检查用水40%。采用半制备高效液相色谱仪对(1,3)-β-D-葡聚糖溶液进行纯化，所述纯化中采用的色谱柱为凝胶柱TSKgelG2500PWxl（7.8 mm×300 mm，7 μm），保护柱为TSKgel PWxl（6.0 mm×40 mm，12 μm）；流动相为细菌内毒素检查用水；流速为0.5 mL/min；进样量为100 μL；柱温为82℃；所述纯化中收集保留时间为15-25 min的馏分；将收集的馏分混合，混合后按每瓶1.5 mL分装到西林瓶中，-80℃冷冻，8 Pa的压力下真空冷冻干燥25 h，得到(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质。
实施例4
本实施例对实施例1中所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的进行纯度测定，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法包括如下步骤：
（1）采用卡尔费休水分测定仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量；采用高效液相色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量；采用电感耦合等离子体质谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量；采用离子色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量。
（a）采用卡尔费休水分测定仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量：
试剂与仪器：卡尔费休库仑滴定阳极液，卡尔费休库仑滴定仪。
仪器准备：对各接口处进行密封，加入未使用的阳极电解液。打开氮气瓶，打开手套箱真空泵及循环系统。打开卡尔费休仪，设置仪器参数如下：
漂移“测定”；电解速率“正常”；搅拌时间200 s；极化电流2 μA；终点电压100 mV；最大滴定时间180 s；漂移终止为“相对”模式，即终点漂移值比起始漂移值高1-2 μg/min时停止测量。
样品称量：精确称量(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质1.5 mg。
样品测量：待仪器漂移值降低至1 μg/min后，打开进样口塞，迅速将样品倒入滴定池，盖上进样口塞，开始滴定。
样品中水分的质量百分含量的计算：滴定结束后，取出小瓶并称量滴定后小瓶质量。根据样品小瓶前后的质量差和卡尔费休滴定仪测得的绝对含水量，计算样品水分的质量百分含量。所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量如表1所示：
表1
（b）高效液相色谱-示差折光检测器检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量：
高效液相色谱仪：Agilent 1200高效液相色谱仪；
色谱条件：色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl（7.8 mm×300 mm，7 μm），保护柱为TSKgel PWxl（6.0 mm×40 mm，12 μm），柱温设置为79℃，流动相为细菌内毒素检查用水，流速为0.5 mL/min，进样量为50 μL，检测器为示差折光检测器，检测器的内部温度设为30℃。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的配制：称量0.5 mg (1,3)-β-D-葡聚糖标准物质，加0.5 mL细菌内毒素检查用水，涡旋，充分溶解后，进行检测。
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的HPLC-RID谱图如图3所示，其中谱图中43.8 min的峰来自空白溶剂，(1,3)-β-D-葡聚糖的保留时间为18.3 min，有机杂质1的保留时间为21.9 min，有机杂质2的保留时间为35.8min。所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中有机成分的HPLC-RID法面积归一化结果如表2所示。
表2
从表2的结果可知，(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的HPLC-RID法面积归一化百分含量为93.3%。
（c）高效液相色谱-电喷雾检测器检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量：
高效液相色谱仪：热电Ultimate 3000高效液相色谱仪；
色谱条件：色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl（7.8 mm×300 mm，7 μm），保护柱为TSKgel PWxl（6.0 mm×40 mm，12 μm），柱温为79℃，流动相为细菌内毒素检查用水，流速为0.5 mL/min，进样量为50 μL，检测器为Corona Ultra电喷雾检测器，雾化器温度为25℃，数据采集频率为30 Hz。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的配制：称量约0.5 mg (1,3)-β-D-葡聚糖标准物质，加0.5 mL细菌内毒素检查用水，涡旋，充分溶解后，进行检测。
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的HPLC-CAD谱图如图4所示，从图中可以看出(1,3)-β-D-葡聚糖的保留时间为16.7 min，有机杂质1的保留时间为21.4 min，有机杂质2的保留时间为34.9 min。所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液中有机物的HPLC-CAD法面积归一化结果如表3所示。
表3
从表4的结果可知，(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中有机物的HPLC-CAD法面积归一化百分含量为93.9%。
对HPLC-RID法和HPLC-CAD法的测定结果进行分析，HPLC-RID和HPLC-CAD的面积归一化测定结果汇总如表4所示。
表4
经过t检验，结果表明两种定值方法的结果不存在显著性差异。经过F检验，结果表明两种定值方法为等精度方法。因此，采用算术平均的方法计算(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中有机物的质量百分含量P 0，P 0的计算公式如下所示：
公式2中，
P 1代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-示差折光检测器的检测结果；
P 2代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-电喷雾检测器的检测结果。
经过计算，(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中有机物的质量百分含量P 0为93.6%。
（d）采用电感耦合等离子体质谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量：
仪器：电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液配制：精确称取(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质1.8mg，溶于2 mL超纯水中，采用ICP-MS半定量法进行定量。
元素混合标准溶液：浓度为10 mg/L的Li、Be、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、Cs、Ba、Tl、Pb和U。
平行测定三份样品，电感耦合等离子体质谱仪的检测结果如表5所示。
表5
从表5的结果中可知，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中的无机阳离子杂质的质量百分含量为36.9 μg/mg，RSD为10.8%，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中的无机阳离子杂质的质量百分含量为3.69%。
（e）采用离子色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量。
离子色谱仪的色谱条件：色谱柱为IonPac AS11（4 mm×250 mm，4 µm），淋洗液为30 mmol/L的KOH，抑制器为ASRS 4 mm，检测器为电导检测器，流速为1.5 mL/min，进样体积为25 µL。
无机阴离子杂质的标准溶液包括：
F-溶液标准物质GBW(E)080549，证书值（1000±10）mg/L；
Cl-溶液标准物质GBW(E)080268，证书值（1000±7）mg/L；
SO4 2-溶液标准物质GBW(E)080266，证书值（1000±7）mg/L；
NO3 -溶液标准物质GBW(E)080265，证书值（100±1）mg/L；
H2PO4 -溶液标准物质GBW(E)080435，证书值（1000±13）mg/L。
将上述5种阴离子的标准溶液用超纯水配制成系列混合标准溶液，F-和Cl-的浓度分别为0.015 µg/mL、0.03 µg/mL、0.06 µg/mL、0.12 µg/mL、0.18 µg/mL和0.30 µg/mL；SO4 2-、NO3 -和PO4 3-的浓度分别为0.075 µg/mL、0.15 µg/mL、0.30 µg/mL、0.60 µg/mL、0.90 µg/mL和1.5 µg/mL。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液配制：准确称取(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质1.5mg，用超纯水0.2 mL溶解，进行离子色谱分析。
离子色谱分析的结果：其中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中的5种阴离子杂质的质量百分含量与溶剂空白基本一致，低于检出限，可忽略，阴离子杂质质量百分含量总量为0。(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中的阴离子杂质的质量百分含量测定结果汇总如表6所示。
表6
注：ND=未检出。
（2）采用质量平衡法计算所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度。
计算所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度的公式包括：
公式1中，
P 1代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-示差折光检测器的检测结果；
P 2代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-电喷雾检测器的检测结果；
X m代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量；
X a代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量；
X w代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中的各部分的质量百分含量测定结果如表7所示。
表7
将表7中的数据代入公式1，计算得到(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质中(1,3)-β-D-葡聚糖的纯度为88.8%。
测试例1
本测试例依照均匀性检验程序对实施例1中所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质进行瓶间均匀性检验。
采用高效液相色谱-示差折光检测器检验(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的瓶间均匀性（采用外标法计算）。随机选择15瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品瓶，在每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品瓶中，加200 μL细菌内毒素检查用水，涡旋，充分溶解后，装于内插管中，分装成3瓶，进行瓶间均匀性检验。
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪
色谱条件：色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl（7.8 mm×300 mm，7 μm），保护柱为TSKgel PWxl（6.0 mm×40 mm，12 μm），柱温为79℃，流动相为细菌内毒素检查用水，流速为0.5 mL/min，进样量为50 μL，检测器为示差折光检测器，检测器的内部温度设为30℃。
精确称取实施例1中的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质0.268 mg，溶于1.34 mL细菌内毒素检查用水中，用称重法配制一系列的(1,3)-β-D-葡聚糖标准溶液，采用HPLC-RID法测定，绘制浓度-峰面积标准曲线，得到线性回归方程。将瓶间均匀性检测的峰面积测定结果代入线性回归方程中，计算得到每瓶中(1,3)-β-D-葡聚糖溶于1 mL细菌内毒素检查用水后的质量百分含量。采用方差分析法进行均匀性的统计检验，通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统误差。
计算每瓶中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶于1 mL细菌内毒素检查用水后的质量百分含量，作为瓶间均匀性检验数据，计算结果如表8所示。
表8
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质瓶间均匀性的统计结果如表9所示。
表9
经过F检验，结果表明(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的瓶间均匀性良好。
均匀性产生的标准偏差的计算公式：
公式3中，s 1 2代表组间方差；s 2 2代表组内方差；
当s H >s 2时，则认为样品很不均匀，需重新混匀或对样品逐个定值；
当s H <s 2时，则认为样品均匀；
当s H =s 2±0.05时，则应将s H 的值合成到标准物质定值的不确定度中。
按公式3计算均匀性产生的标准偏差，均匀性产生的标准偏差s H =1.09，s 2=1.99，s H <s 2，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的样品均匀。
由(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质瓶间不均匀性引入的标准不确定度s H 为1.09 ng/L。标准物质瓶间不均匀性产生的不确定度u H =s H =1.09 ng/L。
测试例2
本测试例采用高效液相色谱-示差折光检测器测定实施例1中所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的短期稳定性。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质为多糖类成分，化学性质稳定，常温贮存于干燥器中。考虑运输过程中可能存在的高温情况，选取40℃储存，考察其短期稳定性。将分装后的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质在40℃下保存，依稳定性检验程序进行检验，随机抽取样品5瓶，放置0天（2019年10月14日）、1天（2019年10月15日）、3天（2019年10月17日）、7天（2019年10月21日）和14天（2019年10月28日）后分别取出，放回常温，贮存于干燥器中。采用HPLC-RID法进行短期稳定性检验（采用外标法计算），所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的短期稳定性检测结果如表10所示。
表10
以x代表时间，以y代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的质量百分含量（ng/L），将表10中短期稳定性检验结果拟合成一条直线，所述直线的方程为y=0.0825x+24.874，R²=0.1284，(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的短期稳定性检验曲线如图5所示。从表10的统计结果中可知斜率不显著，即(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质在40℃温度下的短期稳定性无显著性变化，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质可以在常温条件下运输储存。
测试例3
本测试例采用高效液相色谱-示差折光检测器测定实施例1中所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的长期稳定性。
将分装后的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质在常温干燥条件下置于干燥器中保存。依测试例1所述的均匀性检验方法，采用高效液相色谱-示差折光检测器（外标法），依稳定性检验程序进行稳定性检验，每个时间点随机抽取样品3瓶，在放置0个月（2019年8月）、第1个月（2019年9月）、第3个月（2019年11月）和第8个月（2020年4月）后，采用HPLC-RID法（外标法）进行检测，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的长期稳定性检测结果如表11所示。
表11
以x代表时间，以y代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的质量百分含量（ng/L），将表11中长期稳定性检验结果拟合成一条直线，所述直线的方程为y=0.0347x+25.11，R²=0.3904，(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的长期稳定性检验曲线如图6所示。从表11的统计结果可知斜率不显著，即(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质在25℃下的8个月长期稳定性无显著性变化。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质由长期稳定性产生的标准不确定度的计算公式：
公式4中，
s(b 1 )的值为0.0307，t的值为8，计算可得，标准物质特性量值的长期稳定性所引起的不确定度为0.24 ng/L。
测试例4
本测试例对实施例1中纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质进行标准物质定值和不确定度评定。
（1）标准物质定值
实施例1纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度为0.888 g/g；采用HPLC-RID法和HPLC-CAD法，以外标法对分装的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质进行质量百分含量测定。分别绘制各自的浓度-峰面积标准曲线，得到线性回归方程。
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质按照《一级标准物质技术规范》（JJG1006-1994）进行研制，临床上使用的(1,3)-β-D-葡聚糖定量校准物为pg量级，因此所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的每瓶分装量应在μg量级。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质分装：称取实施例1纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质11.340 mg，加入50 mL细菌内毒素检查用水复溶，加入的水的质量为49.983622 g（分装温度：25.3℃）。经HPLC-RID法进行均匀性初步检验合格后，按每瓶100 μL的分装量分装于无色透明的西林瓶中，分装400瓶，真空冷冻干燥，得到固体状态的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品。
在每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品中，加200 μL超纯水，涡旋，充分溶解后，测定溶液中(1,3)-β-D-葡聚糖的峰面积，代入线性回归方程，计算得到每瓶中(1,3)-β-D-葡聚糖的质量体积浓度，进而计算得到每瓶中(1,3)-β-D-葡聚糖的质量（μg）。
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质在使用时，在每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品中加入1 mL细菌内毒素检查用水复溶，量值为质量浓度（ng/L）。
标准物质的质量浓度按下式计算：
公式5中，
c代表每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品的质量浓度，μg/mL；
m p 代表每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品的质量，mg；
mw代表复溶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品的水的质量，g；
P代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度，g/g；
ρ代表水的密度，g/mL；
V 1代表每瓶分装的(1,3)-β-D-葡聚糖溶液的体积，V 1为0.1 mL；
V 2代表每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质复溶时加的水的体积，V 2为1 mL。
分装时的温度为25.3℃，此时水的密度为0.996966 g/mL。复溶时加入的水的质量为49.983622 g，则体积为50.136 mL。(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的质量为11.340 mg，纯度为0.888 g/g。根据公式5计算得到，每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的质量浓度为20.1μg/mL，即20.1 ng/L。
（2）不确定度评定
根据ISO Guide 35，标准物质特性量值的不确定度包括三个部分：配制值定值的不确定度；标准物质瓶间不均匀性产生的不确定度；标准物质特性量值的长期稳定性所引起的不确定度。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质质量浓度量值的标准不确定度为：
公式6中，
u CRM 标准物质质量浓度量值的标准不确定度；
u 2 char 代表配制值定值的不确定度；
u 2 bb 代表标准物质瓶间不均匀性产生的不确定度；
u 2 lst 代表标准物质特性量值的长期稳定性所引起的不确定度。
(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的质量浓度定值的相对标准不确定度为0.020，标准不确定度为0.4 ng/L；标准物质瓶间不均匀性产生的不确定度为1.09 ng/L；标准物质特性量值的长期稳定性所引起的不确定度为0.24 ng/L。将上述不确定度带入公式计算可知，u CRM 结果为1.19 ng/L。
在95%的置信概率下取包含因子k=2，将标准不确定度乘以包含因子，计算得到定值结果的扩展不确定度（U），计算公式如公式7所示：
定值结果的扩展不确定度U为2.4 ng/L。
综上所述，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质在使用时，在每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品中加入1 mL细菌内毒素检查用水复溶后，(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的质量浓度的标称值为20.1 ng/L，定值结果的扩展不确定度为2.4 ng/L，表示为：20.1±2.4ng/L（k=2）。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法，其特征在于，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法包括如下步骤：
采用半制备高效液相色谱仪对(1,3)-β-D-葡聚糖溶液进行纯化，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质；
所述纯化中采用的色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl；
所述纯化中流动相的流速为0.5-1 mL/min；
所述纯化中收集保留时间为15-25 min的馏分；
所述纯化中色谱柱的柱温为75-82℃；
所述纯化中采用的流动相为细菌内毒素检查用水；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液的浓度不高于1 mg/mL；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液由以下方法配制得到：将(1,3)-β-D-葡聚糖样品与细菌内毒素检查用水混合，加热后离心，收集上清液，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖溶液；所述加热过程中需间隔进行振荡，所述振荡的具体操作为：间隔20-25 min振荡一次，每次振荡的转速各自独立地为100-200 rpm，所述振荡持续的时间各自独立地为2-5 min；
所述离心前需将加热后的混合液冷却至20-25℃；
所述离心的转速为2500-3500 rpm，离心的时间为5-15 min；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖样品的纯度为70-78%；
所述加热采用水浴进行，所述水浴的温度为95-100℃，水浴的时间为2.5-3.5 h；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖样品为茯苓(1,3)-β-D-葡聚糖；所述(1,3)-β-D-葡聚糖样品的数均分子量Mn为4.483×107g/mol；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度为80%以上；所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质采用如下方法配制成标准物质溶液：
将11.340 mg (1,3)-β-D-葡聚糖标准物质用50 mL细菌内毒素检查用水复溶，温度为25.3℃；按每瓶100 μL的分装量分装，冻干，得到固体状态的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品，在每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品中，加200 μL超纯水溶解，测定溶液中(1,3)-β-D-葡聚糖的质量体积浓度，进而计算得到每瓶中(1,3)-β-D-葡聚糖的质量，每瓶中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品的质量为20.1 μg；每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品中用1mL细菌内毒素检查用水复溶，得到标准物质溶液，标准物质溶液的质量浓度为20.1 ng/L，标准物质溶液的质量浓度定值结果的扩展不确定度为2.4 ng/L，表示为：20.1±2.4 ng/L，k=2，k为包含因子。
2.根据权利要求1所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法，其特征在于，所述纯化中(1,3)-β-D-葡聚糖溶液的进样量为98-102 μL。
3.根据权利要求1所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法，其特征在于，纯化后将收集的馏分冻干，得到所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质；
所述冻干的参数为：-80~-20℃冷冻，5-10 Pa的压力下真空冷冻干燥20~30 h。
4.根据权利要求1所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法，其特征在于，对(1,3)-β-D-葡聚糖溶液进行纯化前，还包括采用核磁氢谱仪、红外光谱仪和HPLC-GPC-激光光散射仪对未纯化的(1,3)-β-D-葡聚糖样品进行定性分析。
5.一种(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质，其特征在于，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质由权利要求1-4中任一项所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的制备方法制备得到；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度为80%以上；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质采用如下方法配制成标准物质溶液：
将11.340 mg (1,3)-β-D-葡聚糖标准物质用50 mL细菌内毒素检查用水复溶，温度为25.3℃；按每瓶100 μL的分装量分装，冻干，得到固体状态的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品，在每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品中，加200 μL超纯水溶解，测定溶液中(1,3)-β-D-葡聚糖的质量体积浓度，进而计算得到每瓶中(1,3)-β-D-葡聚糖的质量，每瓶中(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品的质量为20.1 μg；每瓶(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质样品中用1mL细菌内毒素检查用水复溶，得到标准物质溶液，标准物质溶液的质量浓度为20.1 ng/L，标准物质溶液的质量浓度定值结果的扩展不确定度为2.4 ng/L，表示为：20.1±2.4 ng/L，k=2，k为包含因子。
6.一种权利要求5所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法，其特征在于，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法包括如下步骤：
步骤1：采用卡尔费休水分测定仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量；采用高效液相色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量；采用电感耦合等离子体质谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量；采用离子色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量；
步骤2：采用质量平衡法计算所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度；
步骤1中，采用高效液相色谱仪检测所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量包括如下步骤：
分别采用高效液相色谱-示差折光检测器和高效液相色谱-电喷雾检测器检测(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液中的有机物的质量百分含量；
所述高效液相色谱仪采用的色谱柱为凝胶柱TSKgel G2500PWxl；
所述高效液相色谱仪采用的流动相的流速为0.5-1 mL/min。
7.根据权利要求6所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法，其特征在于，所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的进样量为50-55 μL；
所述色谱柱的柱温为75-82℃；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的浓度不高于1 mg/mL；
所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质溶液的溶剂为细菌内毒素检查用水。
8.根据权利要求6所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法，其特征在于，步骤1中，所述电感耦合等离子体质谱仪测定的元素包括Li、Be、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、Cs、Ba、Tl、Pb或U中任意一种或至少两种的组合；
步骤1中，所述离子色谱仪测定的阴离子包括F-、Cl-、SO4 2-、NO3 -和H2PO4 -中任意一种或至少两种的组合。
9. 根据权利要求6所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度测定方法，其特征在于，步骤2中，采用质量平衡法计算所述(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的纯度的公式包括：
公式1中，
P 1代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-示差折光检测器的检测结果；
P 2代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的有机物的质量百分含量，采用高效液相色谱-电喷雾检测器的检测结果；
X m代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阳离子杂质的质量百分含量；
X a代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的无机阴离子杂质的质量百分含量；
X w代表(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质的水分的质量百分含量。
10.权利要求5所述的(1,3)-β-D-葡聚糖标准物质在真菌(1,3)-β-D-葡聚糖检测中的应用。
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