CN114381548A - 黄瓜强单性结实性状多位点选择的分子标记辅助选择育种方法 - Google Patents

黄瓜强单性结实性状多位点选择的分子标记辅助选择育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了黄瓜强单性结实性状多位点选择的分子标记辅助选择育种方法。本发明通过进一步构建BC3S1等具有单性结实性状的次级分离群体，完成了关键微效位点Parth3.1和Parth7.1的精细定位，开发出了4个紧密连锁的分子标记，并在自然群体中对这4个分子标记进行了选择效率的验证，建立了强单性结实性状多位点选择(Parth2.1、Parth3.1和Parth7.1)的分子标记辅助选择育种技术体系，并利用该技术育成了具有强单性结实性的新品种，该强单性结实的黄瓜新品种是华北型黄瓜自交系品种，有较高的产量和优良的果实品质，可直接作为改良其他品种单性结实性的骨干亲本。

Description

黄瓜强单性结实性状多位点选择的分子标记辅助选择育种 方法
技术领域
本发明公开了黄瓜强单性结实性状多位点选择的分子标记辅助选择育种方法，属于蔬菜分子遗传育种技术领域，可用于黄瓜强单性结实性状分子标记辅助育种。
背景技术
黄瓜是我国大面积栽培的主要蔬菜之一，年产量占世界黄瓜产量的80％以上，带来了显著的经济效益。单性结实是指子房不经过授粉受精或别的刺激而发育成果实的现象。单性结实能力强的黄瓜品种，具有显著的增产潜力，尤其是在缺乏传粉媒虫的设施栽培条件下，具有单性结实性的品种一般可提高产量20％以上。同时，单性结实的果实因无籽、瓜瓤少、果肉厚，且货架期长，在一定程度上也提高了黄瓜的商品性。因此，单性结实性逐渐成为黄瓜品种改良的目标性状之一，具有重要的价值。
大量研究表明黄瓜单性结实性状是由多基因控制的数量性状，遗传机制极其复杂。目前，黄瓜单性结实材料或品种的选育主要依靠田间束花隔离进行表型鉴定，该方法不仅耗时长，需要大量的人力和物力，且单性结实容易受外界条件的影响，表型选择效率不高，选育难度大，育成的黄瓜品种存在单性结实性不稳定，易受栽培环境影响等弊端。近年来，随着分子标记技术的发展，许多研究者利用与目标性状QTL连锁的分子标记对种质进行辅助选择，这一方法不受基因表达和环境因素的影响，很大程度上提高了选择的速度和准确性。发明人团队在前期研究中，对黄瓜强单性结实性状的遗传位点进行了解析，鉴定出7个黄瓜强单性结实QTL位点，并确定了黄瓜强单性结实的主效QTL位点Parth2.1(Zhe Wu,Ting Zhan g,Lei Li,Jian Xu,Xiaodong Qin,Tinglin Zhang,Li Cui,Qunfeng Lou,JiLi and J infeng Chen.Identification of a stable major-effect QTL(Parth 2.1)controlling parthenocarpy in cucumber and associated candidate gene analysisvia whole genome re-sequencing[J].BMC plant biology,2016,16,182).在此基础上，发明人团队经过进一步的基因组重测序研究，开发了Parth2.1的连锁分子标记Indel-16Y-46(李季,陈劲枫,朱拼玉,等.黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的连锁分子标记及其应用.CN110195125B[P].2020.)。在育种实践中证明，Indel-16Y-46对Parth2.1的选择效率达到了100％。但同时也发现，仅采用单一标记Indel-16Y-46选择转育parth2.1可以将缺乏该遗传位点的弱单性结实品种改良成为强单性结实品种，但对于无单性结实能力以及部分弱单性结实品种的改良，达不到预期的效果。基因组发现由于无单性结实能力的品种缺乏所有的单性结实遗传位点，包括主效位点和微效位点，而弱单性结实的品种已经携带了Parth2.1主效位点，但缺乏其他的关键微效位点，因此我们认为黄瓜强单性结实性状的改良必须同时转育parth2.1和其他的关键微效位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法。
基于上述目的，本发明通过进一步构建BC3S1等具有单性结实性状的次级分离群体，完成了关键微效位点Parth3.1和Parth7.1的精细定位，开发出了4个紧密连锁的分子标记，并在自然群体中对这4个分子标记进行了选择效率的验证，建立了强单性结实性状多位点选择(Parth2.1、Parth3.1和Parth7.1)的分子标记辅助选择育种技术体系，并利用该技术育成了具有强单性结实性的新品种。
本发明的目的通过以下方案实现：
黄瓜强单性结实性状关键位点Parth3.1的连锁分子标记,选自Indel-20Y-28、Indel-21Y-3中的任意一种或多种；Indel-20Y-28的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，Indel-21Y-3的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明所述的黄瓜强单性结实性状关键位点Parth3.1的连锁分子标记的引物组合物，选自Indel-20Y-28、Indel-21Y-3中的任意一种或多种的引物，分子标记Indel-20Y-28的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，分子标记Indel-21Y-3的引物序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
黄瓜强单性结实性状关键位点Parth7.1的连锁分子标记，选自Indel-20Y-3和Indel-20Y-9中的任意一种或多种；Indel-20Y-3的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，Indel-20Y-9的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明所述的黄瓜强单性结实性状关键位点Parth7.1的连锁分子标记引物组合物，选自Indel-20Y-3和Indel-20Y-9中的任意一种或多种的引物；Indel-20Y-3的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，Indel-20Y-9的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。
一种引物组合物，由与单性结实主效位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46的引物、所述的黄瓜强单性结实性状关键位点Parth3.1的连锁分子标记的引物组合物和所述的黄瓜强单性结实性状关键位点Parth7.1的连锁分子标记引物组合物组成；所述的分子标记Indel-16Y-46的引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明所述的连锁分子标记、所述的引物组合物在强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种中的应用。
一种强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法，包括以下步骤：
(1)以具有强单性结实性的高代自交系EC1为母本(武喆,李蕾,张婷,张停林,李季,&娄群峰等.(2015).黄瓜单性结实性状的QTL定位.中国农业科学,48(1),112-119.)，以无单性结实能力的高代自交系21514F为父本，进行杂交得F1，杂种F1回交获得BC1，并继续回交3代后自交2代，最终获得BC3S2。通过对开花当天的雌花进行套花处理，在处理10天后观察子房是否膨大，如果子房膨大即认定为单性结实果实，统计单性结实果实的数量，单性结实果实的数量/品种套花的总体数量＝单性结实率，单性结实率超过90％即被认定为具有强单性结实能力；通过该方法从回交群体中筛选出强单性结实性的单株；
(2)回交及分子标记辅助选择
分别利用与强单性结实性状关键位点Parth3.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28、Indel-21Y-3，与强单性结实性状关键位点Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-3、Indel-20Y-9，以及与单性结实主效位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46，从上述筛选出的高单性结实率的单株中进行基因型筛选，选取Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株，具体方法如下：
1)提取品种材料叶片的DNA作为模板，用Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46分子标记引物对进行PCR扩增；
2)PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色；
3)结果判断：Indel-20Y-28标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出122bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出112bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出122bp和112bp的两条带；Indel-21Y-3标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出106bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出112bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出106bp和112bp的两条带；Indel-20Y-3标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出96bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出92bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出96bp和92bp的两条带；Indel-20Y-9标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出161bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出155bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出155bp和161bp的两条带；Indel-16Y-46标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出134bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出105bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出105bp和134bp的两条带。
所述的Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株能同时扩增112bp和122bp、112bp和106bp、92bp和96bp、155bp和161bp、105bp和134bp条带；
所述的与强单性结实性状关键位点Parth3.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28，其上游引物:AGAATTTTGCAACAGAGAGGTAAAGG,下游引物:TGTGGACTTTTCAATGCAGTCCTA；分子标记Indel-21Y-3，其上游引物:CATACATGGGAAGGTACTTGAATGG,下游引物:TCTCCTGCTTCTTGTCACACTCAAA；与强单性结实性状关键位点Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-3，其上游引物:GAATGTGGCTCAAGGGGAATAGTA,下游引物:TCCATCAGGATCTCATCAATCAAA；分子标记Indel-20Y-9，其上游引物:AAGATTTGAAATGGATGGACCAAA,下游引物:CAAAGTCTAAGCCTATGTGGAAATCA；与强单性结实性状关键位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46,其上游引物:AGTGCACTTCGTTTTGAACATCAT,下游引物:AGGCAGGACAACCATGAATAAAAA。
(3)选择步骤(2)筛选到的Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株中单性结实率超过90％的单株与21514F进行回交，在回交1代中继续选择Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株，与21514F进行回交；在回交3代后，继续选择Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株进行自交，在自交2代后，选择Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46基因型与EC1带型一致，而其他染色体区段为21514F带型的品种即为强单性结实的黄瓜新品种。
所述的强单性结实的黄瓜新品种基本具有华北型黄瓜21514F的性状，并单性结实率>90％。
所述的强单性结实的黄瓜新品种，植株长势强，节间长10-12厘米，茎粗0.7-0.8厘米，叶片绿色，平均最大叶片面积为23×22厘米，第一雌花节位在2-3节，每节均为一朵雌花，无雄花，商品瓜为线形，绿色，瓜刺白色，数量较多，平均瓜长15-20厘米，粗5-6厘米，主侧蔓均可结瓜。
有益效果：
(1)本发明通过进一步的回交群体构建，利用BC3S1群体完成了Parth3.1和Parth7.1的精细定位，同时结合双亲重测序结果的分析，开发并筛选与强单性结实性状关键位点Parth3.1和Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9，这些标记引物序列是根据双亲基因组重测序的结果设计而成，利用本发明中与强单性结实性状关键位点Parth3.1和Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9，在自然群体中17个强单性结实品种和14个弱单性结实或无单性结实品种中的Parth3.1和Parth7.1关键位点选择效率均大于70％，这些分子标记可作为鉴定基于EC1强单性结实品种的连锁标记，提高育种效率。
(2)本发明基于与黄瓜强单性结实性状关键位点Parth3.1和Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9，以及与黄瓜强单性结实性状关键位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46，开发了一种强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法，按照该方法获得的强单性结实的黄瓜新品种是华北型黄瓜自交系品种，有较高的产量和优良的果实品质，可直接作为改良其他品种单性结实性的骨干亲本。
附图说明
图1：强单性结实关键位点Parth3.1和Parth7.1的精细定位
图2：Parth3.1连锁标记Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Parth7.1连锁标记Indel-20Y-3、Indel-20Y-9及Parth2.1连锁标记Indel-16Y-46在17份强单性结实黄瓜材料和14份弱单性结实或非单性结实黄瓜材料中的验证
图释：泳道1为marker，泳道2为强单性参考亲本EC1,泳道3为非单性结实参考亲本8419，泳道4-20为强单性结实品种，泳道21-34是弱单性结实或非单性结实品种。分子标记Indel-20Y-28在EC1(泳道2)和部分强单性结实品种(泳道4-6，10，13-20)中扩增出112bp的单条带，而在8419(泳道3)和弱单性结实或非单性结实品种(泳道21-34)中均扩增出122bp的单条带；分子标记Indel-21Y-3在EC1(泳道2)和强单性结实品种(泳道4-20)中均扩增出112bp的单条带，而在8419(泳道3)和部分弱单性结实或非单性结实品种(泳道21，25，26，27，29，30)中扩增出106bp的单条带；分子标记Indel-20Y-3在EC1(泳道2)和部分强单性结实品种(泳道5，11-13，16，17，19，20)中扩增出92bp的单条带，而在8419(泳道3)和弱单性结实或非单性结实品种(泳道21-34)中均扩增出96bp的单条带；分子标记Indel-20Y-9在EC1(泳道2)和部分强单性结实品种(泳道5，6，12，13，16，17，19，20)中扩增出155bp的单条带，而在8419(泳道3)和弱单性结实或非单性结实品种(泳道21-34)中均扩增出161bp的单条带；分子标记Indel-16Y-46在EC1(泳道2)和部分强单性结实品种(泳道4-7，9-20)中扩增出105bp的单条带，而在8419(泳道3)和弱单性结实或非单性结实品种(泳道21-34)中均扩增出134bp的单条带。
图3：分子标记辅助选择Parth2.1、Parth3.1和Parth7.1等3个单性结实遗传位点所改良出的强单性结实新品种PE250
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
举例说明本发明的具体实施过程，使本领域技术人员按照其不需要创造性劳动就能完成该发明即可，实施例的限定不能作为限定发明人保护范围的局限。
实施例1：Parth3.1和Parth7.1连锁分子标记开发及其在回交群体中的分子检测
1、强单性结实性状关键位点Parth3.1和Parth7.1的精细定位及连锁标记开发
以强单性结实自交系‘EC1’为母本，非单性结实自交系‘407 Beit alpha’为父本构建了F2分离群体，完成了单性结实增强位点QTL Parth3.1和Parth7.1的初步定位，在此基础上，从F2群体中选择携带Parth3.1和Parth7.1且单性结实率大于90％的单株作为供体亲本，以非单性结实材料407 Beit alpha为轮回亲本进行回交，每代回交均以初定位标记为选择标记对Parth3.1和Parth7.1位点进行选择，回交三代后在BC3群体中筛选单性结实率大于90％的单株进行自交，构建BC3S1群体，对群体中每个品种开花当天的雌花进行套花处理，在处理7天后观察子房是否膨大，如果子房膨大即认定为单性结实果实，统计BC3S1群体中每个品种的单性结实果实数量，计算单性结实率(单性结实果实的数量/品种套花的总体数量)；通过基因组重测序在Parth3.1和Parth7.1初定位区间内分别开发了9对、5对Indel分子标记，利用这些标记和群体单性结实率统计结果，在BC3S1群体上完成了Parth3.1和Parth7.1的精细定位，将定位区间缩小至物理距离为512.45kb和409.96kb，其中Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9为精细定位区间的标记(图1)。
实施例2：自然群体中的标记验证
1.用Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9、Indel-16Y-46进行标记筛选
以强单性结实品种EC1和非单性结实品种“8419”为对照品种，用Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9、Indel-16Y-46标记对17个强单性结实品种和14个弱单性结实或非单性结实品种进行标记筛选。
2.筛选结果
利用与Parth3.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28对17个强单性结实品种和14个弱单性结实或非单性结实品种进行筛选，对强单性结实品种的筛选效率为71％，对弱单性结实或非单性结实品种的筛选效率为100％，对全部品种的筛选效率为84％；利用与Parth3.1紧密连锁的分子标记Indel-21Y-3对17个强单性结实品种和14个弱单性结实或非单性结实品种进行筛选，对强单性结实品种的筛选效率为100％，对弱单性结实或非单性结实品种的筛选效率为43％，对全部品种的筛选效率为74％；利用与Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-3对17个强单性结实品种和14个弱单性结实或非单性结实品种进行筛选，对强单性结实品种的筛选效率为47％，对弱单性结实或非单性结实品种的筛选效率为100％，对全部品种的筛选效率为71％；利用与Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-9对17个强单性结实品种和14个弱单性结实或非单性结实品种进行筛选，对强单性结实品种的筛选效率为47％，对弱单性结实或非单性结实品种的筛选效率为100％，对全部品种的筛选效率为71％；利用与Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46对17个强单性结实品种和14个弱单性结实或非单性结实品种进行筛选，对强单性结实品种的筛选效率为94％，对弱单性结实或非单性结实品种的筛选效率为100％，对全部品种的筛选效率为97％。Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9四对引物对整体的筛选效率均大于70％。
实施例3：强单性结实黄瓜品种的培育及应用，包括：
1、亲本性状
(1)强单性结实性状供体亲本EC1
EC1(武喆,李蕾,张婷,张停林,李季,&娄群峰等.(2015).黄瓜单性结实性状的QTL定位.中国农业科学,48(1),112-119.)是强单性结实欧洲温室型黄瓜自交系材料，其植株长势强，侧枝发达，主侧枝结果，商品果形状为短棒形，单性结实率超过90％。
(2)非单性结实亲本21514F
21514F是无单性结实能力的华北型黄瓜自交系材料，其植株长势强，侧枝发达，主蔓结果，商品果为长果形，果色油绿。
2、强单性结实性选择与转育过程：
(1)性状转育
将EC1和21514F同时进行浸种、催芽、播种、定植及正常的植株管理。
在EC1长到3叶1心是用300mg/L的硝酸银溶液诱雄1次，隔一周再诱雄1次。
在开花期，以21514F为母本，以EC1为父本，进行杂交得F1，具体操作为：在授粉前一天下午，选择花瓣全黄但花蕾未张开的21514F雌花花蕾和EC1雄花花蕾进行夹花，防止串粉；开花当天上午当大棚温度升至25℃，植株叶缘逐渐出现吐水时，将EC1的雄花花粉授到21514F的雌花柱头上，3朵雄花授一朵雌花，并继续对授粉后的雌花夹花隔离三天。
杂种F1回交获得BC1，并继续回交3代后自交2代，最终获得BC3S2。通过对开花当天的雌花进行套花处理，在处理10天后观察子房是否膨大，如果子房膨大即认定为单性结实果实，统计单性结实果实的数量，单性结实果实的数量/品种套花的总体数量＝单性结实率，单性结实率超过90％即被认定为具有强单性结实能力。通过该方法从回交群体中筛选出单性结实率高的单株。
(2)回交及分子标记辅助选择
分别利用与强单性结实性状关键位点Parth3.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28、Indel-21Y-3，与强单性结实性状关键位点Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-3、Indel-20Y-9，以及与单性结实主效位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46，从上述筛选出的单性结实率超过90％的单株中进行基因型筛选，选取Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株，具体实验步骤如下：
1)提取品种材料叶片的DNA作为模板，用Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46分子标记引物对分别进行PCR扩增；
2)PCR扩增反应体系组成为：正、反向引物各0.5μL，Taq酶(5U·μL-1)5μL、DNA(100ng)1.0μL，ddH2O，3μL，反应总体积为10μL。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30S，72℃延伸30s，28个循环；72℃延伸10min，16℃保存。
3)PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。
分子标记Indel-20Y-28在无单性结实性的黄瓜材料中，例如21514F或群体中无单性结实性单株，扩增出相同的122bp大小的单一条带，而在强单性结实EC1中扩增出112bp大小的单一条带，在EC1与21514F杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出122bp和112bp的两条带。Indel-21Y-3在无单性结实性的黄瓜材料中，例如21514F或群体中无单性结实性单株，扩增出相同的106bp大小的单一条带，而在强单性结实EC1中扩增出112bp大小的单一条带，在EC1与21514F杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出106bp和112bp的两条带。Indel-20Y-3在无单性结实性的黄瓜材料中，例如21514F或群体中无单性结实性单株，扩增出相同的96bp大小的单一条带，而在强单性结实EC1中扩增出92bp大小的单一条带，在EC1与21514F杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出96bp和92bp的两条带。Indel-20Y-9在无单性结实性的黄瓜材料中，例如21514F或群体中无单性结实性单株，扩增出相同的161bp大小的单一条带，而在强单性结实EC1中扩增出155bp大小的单一条带，在EC1与21514F杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出161bp和155bp的两条带。Indel-16Y-46在无单性结实性的黄瓜材料中，例如21514F或群体中无单性结实性单株，扩增出相同的134bp大小的单一条带，而在强单性结实EC1中扩增出105bp大小的单一条带，在EC1与21514F杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出134bp和105bp的两条带。
所述的与强单性结实性状关键位点Parth3.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28，其上游引物序列为：AGAATTTTGCAACAGAGAGGTAAAGG(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为：TGTGGACTTTTCAATGCAGTCCTA(SEQ ID NO.2)，分子标记Indel-21Y-3，其上游引物序列为：CATACATGGGAAGGTACTTGAATGG(SEQ ID NO.3)，下游引物序列为：TCTCCTGCTTCTTGTCACACTCAAA(SEQ ID NO.4)；与强单性结实性状关键位点Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-3，其上游引物序列为：GAATGTGGCTCAAGGGGAATAGTA(SEQ IDNO.5)，下游引物序列为：TCCATCAGGATCTCATCAATCAAA(SEQ ID NO.6)，分子标记Indel-20Y-9，其上游引物序列为：AAGATTTGAAATGGATGGACCAAA(SEQ ID NO.7)，下游引物序列为：CAAAGTCTAAGCCTATGTGGAAATCA(SEQ ID NO.8)；与强单性结实性状关键位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46,其上游引物序列为：AGTGCACTTCGTTTTGAACATCAT(SEQ IDNO.9),下游引物序列为：AGGCAGGACAACCATGAATAAAAA(SEQ ID NO.10)。
(3)选择步骤(2)筛选到的Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株中单性结实率超过90％的单株与21514F进行回交，在回交1代中继续选择Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株，与21514F进行回交；在回交2代后，继续选择Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株进行自交，自交2代后，获得Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46基因型与EC1带型一致，而其他染色体区段为21514F带型的单株即为强单性结实的黄瓜新品种。
3、目标单株的单性结实表型鉴定
开花期对目标单株上花瓣全黄但花蕾未张开的雌花进行夹花处理，在处理10天后观察子房是否膨大，如果子房膨大即认定为单性结实果实，统计单性结实果实的数量，单性结实果实的数量/品种套花的总体数量＝单性结实率，单性结实率超过90％即被认定为具有强单性结实能力。
4、强单性结实的黄瓜新品种具有以下特性：
新品种基本具有华北型黄瓜21514F性状，并具有强单性结实能力；
所述的强单性结实的黄瓜新品种，植株长势强，节间长10-12厘米，茎粗0.7-0.8厘米，叶片绿色，平均最大叶片面积为23×22厘米，第一雌花节位在2-3节，每节均为一朵雌花，无雄花，商品瓜为线形，绿色，瓜刺白色，数量较多，平均瓜长15-20厘米，粗5-6厘米，主侧蔓均可结瓜。
5、强单性结实的黄瓜新品种应用：
将新品种与配合力高的普通栽培黄瓜按3：1种植，并进行正常的植株管理。在开花期进行隔离，然后以新品种为母本，普通栽培黄瓜为父本进行人工授粉。采收新品种植株上的成熟果实，剖瓜洗种，将种子晾晒烘干，即得到全雌强单性结实的杂种一代种子。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 黄瓜强单性结实性状多位点选择的分子标记辅助选择育种方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaattttgc aacagagagg taaagg 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtggacttt tcaatgcagt ccta 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catacatggg aaggtacttg aatgg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctcctgctt cttgtcacac tcaaa 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaatgtggct caaggggaat agta 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccatcagga tctcatcaat caaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagatttgaa atggatggac caaa 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaagtctaa gcctatgtgg aaatca 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtgcacttc gttttgaaca tcat 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggcaggaca accatgaata aaaa 24

Claims (10)

1.黄瓜强单性结实性状关键位点Parth3.1的连锁分子标记,其特征在于选自Indel-20Y-28、Indel-21Y-3中的任意一种或多种；Indel-20Y-28的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，Indel-21Y-3的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的黄瓜强单性结实性状关键位点Parth3.1的连锁分子标记的引物组合物，其特征在于选自Indel-20Y-28、Indel-21Y-3中的任意一种或多种的引物，分子标记Indel-20Y-28的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，分子标记Indel-21Y-3的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.黄瓜强单性结实性状关键位点Parth7.1的连锁分子标记，其特征在于选自Indel-20Y-3和Indel-20Y-9中的任意一种或多种；Indel-20Y-3的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示，Indel-20Y-9的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
4.权利要求2所述的黄瓜强单性结实性状关键位点Parth7.1的连锁分子标记引物组合物，其特征在于选自Indel-20Y-3和Indel-20Y-9中的任意一种或多种的引物；Indel-20Y-3的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，Indel-20Y-9的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
5.一种引物组合物，其特征在于由与单性结实主效位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46的引物、权利要求2所述的黄瓜强单性结实性状关键位点Parth3.1的连锁分子标记的引物组合物和权利要求4所述的黄瓜强单性结实性状关键位点Parth7.1的连锁分子标记引物组合物组成；所述的分子标记Indel-16Y-46的引物如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示。
6.权利要求1和2所述的连锁分子标记、权利要求5所述的引物组合物在强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种中的应用。
7.一种黄瓜强单性结实性状关键位点Parth2.1、Parth3.1和Parth7.1的分子标记方法，其特征在于，所述的分子标记方法包括：以待选择材料的DNA作为模板，用与Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46的引物、权利要求2中所述的分子标记Indel-20Y-28、Indel-21Y-3的引物，以及权利要求4中所述的分子标记Indel-20Y-3、Indel-20Y-9的引物分别进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析；能分别扩增出105bp、112bp、112bp、92bp、155bp特异条带的植株为含有黄瓜强单性结实性状关键位点Parth2.1、Parth3.1和Parth7.1的植株。
8.一种强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法，其特征在于，所述的分子标记辅助育种方法包括以下步骤：
(1)以具有强单性结实性的高代自交系EC1为母本，以无单性结实能力的高代自交系21514F为父本，进行杂交得F1，杂种F1回交获得BC1，并继续回交3代后自交2代，最终获得BC3S2。通过套雌花统计单性结实率，从回交群体中筛选出单性结实率超过90％的单株；
(2)回交及分子标记辅助选择
分别利用与强单性结实性状关键位点Parth3.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28、Indel-21Y-3，与强单性结实性状关键位点Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-3、Indel-20Y-9，以及与单性结实主效位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46，从上述筛选出的单性结实率超过90％的单株中进行基因型筛选，选取Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株；
(3)选择步骤(2)筛选到的Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株中单性结实率超过90％的单株与21514F进行回交，在回交1代中继续选择Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株，与21514F进行回交；在回交2代后，继续选择Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株进行自交，最后获得Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46基因型与EC1带型一致，而其他染色体区段为21514F带型的单株即为强单性结实的黄瓜新品种；
其中，所述的与强单性结实性状关键位点Parth3.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-28，其上游引物如SEQ ID NO.1所示,下游引物如SEQ ID NO.2所示；分子标记Indel-21Y-3，其上游引物如SEQ ID NO.3所示,下游引物如SEQ ID NO.4所示；与强单性结实性状关键位点Parth7.1紧密连锁的分子标记Indel-20Y-3，其上游引物如SEQ ID NO.5所示,下游引物如SEQ ID NO.6所示；分子标记Indel-20Y-9，其上游引物如SEQ ID NO.7所示,下游引物如SEQ ID NO.8所示；与强单性结实性状关键位点Parth2.1紧密连锁的分子标记Indel-16Y-46,其上游引物如SEQ ID NO.9所示,下游引物如SEQ ID NO.10所示；所述的Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株能同时扩增出112bp和122bp、112bp和106bp、92bp和96bp、155bp和161bp、105bp和134bp条带。
9.根据权利要求8所述的强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法，其特征在于，筛选Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株的方法为：
1)提取品种材料叶片的DNA作为模板，用Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46分子标记引物对进行PCR扩增；
2)PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色；
3)结果判断：Indel-20Y-28标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出122bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出112bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出122bp和112bp的两条带；Indel-21Y-3标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出106bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出112bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出106bp和112bp的两条带；Indel-20Y-3标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出96bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出92bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出96bp和92bp的两条带；Indel-20Y-9标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出161bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出155bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出155bp和161bp的两条带；Indel-16Y-46标记在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出134bp大小的单一条带，而在单性结实率超过90％的黄瓜材料中扩增出105bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出105bp和134bp的两条带。
所述的Indel-20Y-28、Indel-21Y-3、Indel-20Y-3、Indel-20Y-9和Indel-16Y-46均为杂合的单株能同时扩增112bp和122bp、112bp和106bp、92bp和96bp、155bp和161bp、105bp和134bp条带。
10.根据权利要求9所述的分子标记辅助育种方法，其特征在于，所述的强单性结实的黄瓜新品种，植株长势强，节间长10-12厘米，茎粗0.7-0.8厘米，叶片绿色，平均最大叶片面积为23×22厘米，第一雌花节位在2-3节，每节均为一朵雌花，无雄花，商品瓜为线形，绿色，瓜刺白色，数量较多，平均瓜长15-20厘米，粗5-6厘米，主侧蔓均可结瓜。
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LIETZOW CD, ET AL.: "QTL mapping of parthenocarpic fruit set in North American processing cucumber.", 《THEOR APPL GENET》 *
WU Z, ET AL: "Identification of a stable major-effect QTL (Parth 2.1) controlling parthenocarpy in cucumber and associated candidate gene analysis via whole genome re-sequencing", 《BMC PLANT BIOL》 *
武喆等: "黄瓜单性结实性状的QTL定位", 《中国农业科学》 *
牛志红等: "黄瓜单性结实性状遗传与QTL定位", 《中国农业科学》 *
黄亚莉等: "黄瓜单性结实研究进展", 《湖南农业科学》 *

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CN114381548B (zh) 2023-09-26

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