CN114375637A - 一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法 - Google Patents
一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,首先利用紫外—可见光谱、红外光谱和固态核磁共振光谱对不同来源的黄腐酸类物质的分子结构特征进行分析,在此基础上选择合适的黄腐酸类型用于小麦种子萌发和苗期调控实验。为了排除小麦品种差异对黄腐酸的影响的差异,分别选择了6种小麦品种和2种小麦品种进行发芽和苗期调控实验的配方研制。最终依据黄腐酸的分子结构特点和实验结果,给出适宜小麦种子萌发和苗期生长的最佳黄腐酸用量及其与化肥的配施比例。
Description
技术领域
本发明涉及小麦培育技术领域,尤其涉及一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法。
背景技术
土壤有机质是土壤的重要组成部分,大部分的土壤有机质源自于动、植物残体在微生物作用下的分解转化。土壤有机质的主要成分是腐植酸,按照腐植酸在酸碱溶液中的溶解度,可以分为胡敏酸(Humic acid,HA)、富里酸(Fulvic acid,FA)和胡敏素(Humin,HM)。其中富里酸既能溶于碱,又能溶于酸和水,因此具有较高的活性,也被称为黄腐酸。黄腐酸是腐植酸中分子量较小的高分子有机弱酸的混合物,稀溶液一般呈黄色或棕黄色,含有大量的酚羟基、羰基、芳香基、醌基和氨基等活性基团,具有较高的生物化学活性。
作为土壤腐殖质的重要组成部分,黄腐酸很早就被应用于在农业生产中。开始它主要以其所在原材料(如秸秆、植物残体)或混合物的形式直接被用于农田,近年来,随着黄腐酸制备工艺的发展和制备原材料的广泛性,不同原料来源和制备方法的黄腐酸逐渐被提纯、分离。
目前,市面上常用于农业生产的黄腐酸类产品因生产工艺的不同,大致分为3类:第一类是从泥炭、风化煤、褐煤等矿物源中提取的黄腐酸。由于其生产过程中需要加入酸、碱溶液,使得生产成本较高,售价也比偏高;第二类是利用生物化学的方法,以木屑、秸秆、植物残渣为原料,采用生物发酵或高温高压化学反应的方式制备的生化黄腐酸,有些也称为秸秆源黄腐酸;第三类是糖蜜类。它是制糖工业的副产品,组成常因制糖原料、生成工艺的不同而差异很大。此外,通过对糖蜜发酵液的13CNMR核磁共振图谱分析发现其主要成分为碳水化合物,含芳香基的酸类占比很低,从黄腐酸的物质组成和分子特性上来看,严格地说糖蜜类物质应该不能算做黄腐酸。
黄腐酸最典型的分子特性是具有芳香族、脂肪族等多种活性官能团。与腐植酸相比,其分析量小、渗透力高,更容易被作物吸收利用。由于其成分多样、活性基团种类丰富,生理活性和化学活性更强,因此常被作为土壤改良剂、植物生长调节剂、肥料增效剂、作物抗逆性和农药增效碱度剂等用于农业生产,具有广泛地应用前景。
用于农业生产的黄腐酸大多为小分子有机酸的混合物,化学组成十分复杂,其分子结构特征至今仍不清楚。此外,目前对于纯的黄腐酸没有一个统一的界定标准,使得市面上可应用于农业生长中的黄腐酸类产品种类繁多、质量参差不齐。同时,不同生产工艺制备的黄腐酸分子结构特征、黄腐酸有效成分的含量等具有显著差异,因此在将其与肥料配施作为作物生长调节剂或者改善肥料养分的利用效率时也没有统一的标准。大多数时候,黄腐酸与化肥配施时的施用量都是基于农田传统的应用经验而来,缺乏科学性和推广性。如何在保证作物产量和经济效益的前提下,选择合适的黄腐酸种类和用量,是黄腐酸类产品在农业生产中首先需要解决的问题。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题,本发明提出了一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法。
本发明提出的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,具体方法步骤如下:
步骤1、不同类型黄腐酸含量测定,采用重铬酸钾将黄腐酸中的碳氧化成二氧化碳,以邻菲罗啉作为指示剂,用硫酸亚铁铵标准溶液进行滴定,同时做空白试验,根据重铬酸钾消耗量和黄腐酸的碳系统计算黄腐酸的含量;
步骤2、不同类型黄腐酸光谱学性质的测定,具体包括:
步骤21、紫外分光光度计测定黄腐酸的紫外吸收特征;
步骤22、红外光谱分析不同类型黄腐酸的官能团;
步骤23、核磁共振仪测定不同类型黄腐酸官能团;
步骤3、元素分析仪测定黄腐酸的元素组成含量;
步骤4、种子发芽试验;
步骤5、小麦苗期调控配方研制。
优选地,所述步骤1不同类型黄腐酸含量测定具体步骤包括:
步骤11、称取0.5g黄腐酸样品放入300mL锥形瓶中,加入70mL浓度10g·L-1的氢氧化钠溶液;
步骤12、摇动锥形瓶使样品与溶液混合均匀,并在锥形瓶口加小漏斗,放于98-100℃的沸水中加热30min,加热期间摇动3-4次;
步骤13、加热结束后,取下锥形瓶,冷却至室温,用中速滤纸过滤,并用去离子水洗涤锥形瓶,直至沉淀洗涤滤液变为无色,将洗涤滤液一并过滤,合并滤液到另一个锥形瓶中;
步骤14、向滤液中加入硫酸溶液调节pH到1,搅拌均匀,沉淀腐殖酸;
步骤15、静置30min后用中速滤纸过滤,用约100ml水不少于5次洗涤沉淀,合并滤液,定容至250mL容量瓶;
步骤16、用磷酸三钠溶液去除重金属离子的干扰。准确吸取5mL过滤液,加入5mL浓度为0.4mol·L-1的重铬酸钾标准溶液,再缓慢加入15mL浓硫酸,置于98-100℃的沸水中加热30min,冷却至室温后,加入70mL水摇匀;
步骤17、向溶液中加入3滴邻菲罗啉—硫酸亚铁铵溶液作为指示剂,用浓度0.4mol·L-1的硫酸亚铁铵标准溶液滴定,直到溶液由橙色经绿色变成砖红色即为终点,记录硫酸亚铁铵的用量,测定过程中同时设定空白试验。
优选地,所述步骤21、紫外分光光度计测定黄腐酸的紫外吸收特征具体步骤包括:
用紫外-可见分光光度计进行扫描,选取波长范围为200-900nm进行吸光值An的连续测定(n为波长)。根据公式SUVAn=An/DOC计算选定波长下的特征值(DOC为可溶性有机质),并计算短波长275-295nm范围与长波长350-400nm范围的斜率比,用于表征黄腐酸分子量的大小。
优选地,所述步骤22、红外光谱分析不同类型黄腐酸的官能团采用溴化钾压片傅里叶红外光谱仪测定,具体步骤包括:称取2mg黄腐酸样品和100mg溴化钾,将其一起放入玛瑙研钵中研磨均匀,加压到20MPa压片,然后在采用傅里叶红外光谱仪进行测试,波数范围是400-4000cm-1,光谱仪分辨率4cm-1,信躁比是50000:1,扫描64次。
优选地,所述步骤23、核磁共振仪测定不同类型黄腐酸官能团具体步骤包括:选用4mm双共振魔角旋转探头,13C的频率为125.8Hz,应用13C CP实验转速为5kHz,循环延迟1s,交叉极化接触时间为1ms,将不同官能团划分为6个化学位移:0-45ppm,烷基碳AlkylC;45-90ppm,烷氧基碳O-AlkylC;90-110ppm,缩醛类碳(O-C-O)Acetal-C;110-140ppm,芳基碳(C-H/C-C)Aromatic-C;140-165ppm,酚基碳(C-O)Phenilic-C;165-220ppm,羧基碳CarbonylC。
优选地,所述步骤3、元素分析仪测定黄腐酸的元素组成含量,准确称取1-3mg黄腐酸样品,精确至0.001mg,按照样品测定程序连续测定两个以上的样品,直到结果达到分析误差的要求,具体步骤包括:
步骤31、样品中的碳、氢、氮及硫或氧元素,经催化氧化或裂解还原后分别转变成二氧化碳、水蒸气、氮气及二氧化硫或一氧化碳;
步骤32、然后随载气一起进入检测器,利用吸附分离—热导差检法依次测定各个组分,或采用色谱法将混合气体分离,用热导检测器或红外吸收检测器分别测定各组分的响应信号;
步骤33根据组分的信号值或色谱峰值和对应元素的灵敏度或校正因子K值,分别计算样品中各元素的含量。
优选地,所述种子发芽试验具体步骤包括:
步骤41、根据黄腐酸光谱学特性的差异,选取了3种矿源黄腐酸(MFA1、MFA3和MFA5)、1种秸秆源黄腐酸(BFA1)和1种糖蜜(M1),共5种黄腐酸;
步骤42、为了避免由于小麦品种的差异而导致黄腐酸测定效果的偏差,筛选了GY18204、中麦895、CA16098、农大212、济麦23和中麦895这6种冬小麦品种进行种子发芽比较实验;
步骤43、种子发芽试验在培养皿中进行,共设置了7个处理:(1)0mg·L-1黄腐酸(去离子水),作为对照;(2)20mg·L-1黄腐酸;(3)40mg·L-1黄腐酸;(4)80mg·L-1黄腐酸;(5)120mg·L-1黄腐酸;(6)160mg·L-1黄腐酸;(7)200mg·L-1黄腐酸,每个处理设置3个重复;
步骤44、将小麦种子在0.5%的次氯酸钠溶液中浸泡30min,清水冲洗,放入底部垫有滤纸的培养皿中;
步骤45、每个培养皿放入20粒大小均匀的小麦种子,先加入20ml不同浓度、不同类型的黄腐酸,置于25℃培养箱中黑暗培养,第三天再补充10ml同一处理浓度的黄腐酸,在培养第4天时对小麦种子的发芽率、根长和芽长进行测定。
优选地,所述步骤5、小麦苗期调控配方研制具体步骤如下:
步骤51、根据种子发芽实验的结果,进一步选择1种矿源黄腐酸(MFA1)和1种秸秆源黄腐酸(BFA1),2种小麦种子(GY18204、中麦895)进行小麦苗期调控实验;
步骤52、选用家用无孔塑料花盆作为栽培器具,每盆装土质量1kg,播种前,将黄腐酸、肥料与土壤混匀后装入盆中,加水至适宜田间持水率;
步骤53、试验期间,保持土壤含水率在最大田间持水率的60±5%,作物生长期间的管理均按照常规进行,常规化肥氮磷钾的施用量按照N 250kg·ha-2,P2O5 125kg·ha-2,K2O 125kg·ha-2添加,以尿素作为氮肥,过磷酸钙和氯化钾为磷肥和钾肥。黄腐酸的添加量选用高低两个浓度,分别为300kg·ha-2和150kg·ha-2;
步骤54、设计了9种处理方式,分别是:(1)对照CK;(2)常规施肥NPK;(3)黄腐酸(300kg·ha-2)替代部分氮肥,NPK总量不变,NPK+HFA;(4)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N减少15%,P、K不变,NPK+HFA-15N;(5)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N减少15%,P、K不变,NPK+LFA-15N;(6)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N减少30%,P、K不变,NPK+HFA-30N;(7)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N减少30%,P、K不变,NPK+LFA-30N;(8)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N、P、K均减15%,NPK+HFA-15NPK;(9)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N、P、K均减15%,NPK+LFA-15NPK,每个处理设置3次重复;
步骤55、实验开始每盆土壤中加入已经用次氯酸钠消毒处理过的10粒种子,出苗后留3株健壮植株。
优选的,所述种子发芽试验得出按照矿源黄腐酸MFA1、MFA3和MFA5的添加浓度为40mg·L-1或秸秆源黄腐酸BF1、糖蜜M1添加浓度为20mg·L-1时,5种小麦品种中的种子发芽率、根长和芽长的平均值均较高。
优选的,所述步骤5、小麦苗期调控配方是:按照N 175kg·ha-2,P2O5 125kg·ha-2,K2O 125kg·ha-2配施300kg ha-2矿源黄腐酸,促进小麦苗期生长。
与现有的技术相比,本发明的有益效果是:
1、首次从黄腐酸含量、黄腐酸类物质分子结构的光谱学特性、元素组成等多个角度比较了不同类型黄腐酸的分子结构特性,在此基础上筛选出不同制备工艺下黄腐酸样品用于小麦种子萌发和苗期调控。
2、首次确定了黄腐酸对小麦种子萌发和苗期调控的最佳合适配施比例,并结合光谱学特性进行分析。
3、依据黄腐酸的分子结构特征给出了不同类型黄腐酸提高小麦种子发芽率和苗期生长活性的参考浓度,较以前的经验结果更为科学、严谨。
附图说明
图1为不同来源黄腐酸红外光谱特征;
图2为不同来源黄腐酸13C核磁共振图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本发明选取了市面上常见的3种类型的黄腐酸,共11种,包括6种矿源黄腐酸(标号为MFA1、MFA2、MFA3、MFA4、MFA5和MFA6),3种生化或秸秆源黄腐酸(标号为BFA1、BFA2和BFA3)和2种糖蜜(标号为M1和M2)。利用紫外—可见光谱(UV-vis)、红外光谱(FTIR)和固态核磁共振碳谱技术(13C-NMR)对不同类型黄腐酸活性官能团进行定性和定量分析,结合黄腐酸的化学结构特性,研究不同类型黄腐酸用量及其与化肥配比对小麦种子发芽和苗期生长的影响,筛选并研发出适宜小麦生长的黄腐酸种类及其与肥料的最佳配施比例,为后续黄腐酸与化肥配施实现小麦增产和养分高效利用的田间研究提供支撑。
本发明提出的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,具体方法步骤如下:
步骤1、不同类型黄腐酸含量测定,采用重铬酸钾将黄腐酸中的碳氧化成二氧化碳,以邻菲罗啉作为指示剂,用硫酸亚铁铵标准溶液进行滴定,同时做空白试验,根据重铬酸钾消耗量和黄腐酸的碳系统计算黄腐酸的含量,具体步骤包括:
步骤11、称取0.5g黄腐酸样品放入300mL锥形瓶中,加入70mL浓度10g·L-1的氢氧化钠溶液;
步骤12、摇动锥形瓶使样品与溶液混合均匀,并在锥形瓶口加小漏斗,放于98-100℃的沸水中加热30min,加热期间摇动3-4次;
步骤13、加热结束后,取下锥形瓶,冷却至室温,用中速滤纸过滤,并用去离子水洗涤锥形瓶,直至沉淀洗涤滤液变为无色,将洗涤滤液一并过滤,合并滤液到另一个锥形瓶中;
步骤14、向滤液中加入硫酸溶液调节pH到1,搅拌均匀,沉淀腐殖酸;
步骤15、静置30min后用中速滤纸过滤,用约100ml水不少于5次洗涤沉淀,合并滤液,定容至250mL容量瓶;
步骤16、用磷酸三钠溶液去除重金属离子的干扰。准确吸取5mL过滤液,加入5mL浓度为0.4mol·L-1的重铬酸钾标准溶液,再缓慢加入15mL浓硫酸,置于98-100℃的沸水中加热30min,冷却至室温后,加入70mL水摇匀;
步骤17、向溶液中加入3滴邻菲罗啉—硫酸亚铁铵溶液作为指示剂,用浓度0.4mol·L-1的硫酸亚铁铵标准溶液滴定,直到溶液由橙色经绿色变成砖红色即为终点,记录硫酸亚铁铵的用量,测定过程中同时设定空白试验。
步骤2、不同类型黄腐酸光谱学性质的测定,具体包括:
步骤21、紫外分光光度计测定黄腐酸的紫外吸收特征,用紫外-可见分光光度计(北京,瑞利UV2100)进行扫描,测定波长范围为200-900nm。根据公式SUVAn=An/DOC计算选定波长下的特征值(DOC为可溶性有机质),并计算短波长275-295nm范围与长波长350-400nm范围的斜率比,用于表征黄腐酸分子量的大小。
步骤22、红外光谱分析不同类型黄腐酸的官能团,黄腐酸红外光谱采用溴化钾压片傅里叶红外光谱仪测定。具体步骤:称取2mg黄腐酸样品和100mg溴化钾,将其一起放入玛瑙研钵中研磨均匀,加压到20MPa压片,然后在采用傅里叶红外光谱仪(NicoletiS10 FT-IR,ThermoFisher,USA)进行测试。波数范围是400-4000cm-1,光谱仪分辨率4cm-1,信躁比是50000:1,扫描64次。
步骤23、核磁共振仪测定不同类型黄腐酸官能团,选用的是4mm双共振魔角旋转(MAS)探头,13C的频率为125.8Hz。应用13C CP实验转速为5kHz,循环延迟1s,交叉极化接触时间为1ms。根据前人研究,将不同官能团划分为6个化学位移:0-45ppm,烷基碳AlkylC;45-90ppm,烷氧基碳O-AlkylC;90-110ppm,缩醛类碳(O-C-O)Acetal-C;110-140ppm,芳基碳(C-H/C-C)Aromatic-C;140-165ppm,酚基碳(C-O)Phenilic-C;165-220ppm,羧基碳CarbonylC。
步骤3、元素分析仪测定黄腐酸的元素组成含量,准确称取1-3mg黄腐酸样品,精确至0.001mg,按照样品测定程序连续测定两个以上的样品,直到结果达到分析误差的要求。测定原理是:样品中的碳、氢、氮及硫或氧元素,经催化氧化(或裂解)还原后分别转变成二氧化碳、水蒸气、氮气及二氧化硫或一氧化碳。然后随载气一起进入检测器,利用吸附分离—热导差检法依次测定各个组分,或采用色谱法将混合气体分离,用热导检测器或红外吸收检测器分别测定各组分的响应信号。根据组分的信号值(或色谱峰值)和对应元素的灵敏度(或校正)因子K值,分别计算样品中各元素的含量。
步骤4、种子发芽试验,根据黄腐酸光谱学特性的差异,选取了3种矿源黄腐酸(MFA1、MFA3和MFA5)、1种秸秆源黄腐酸(BFA1)和1种糖蜜(M1),共5种黄腐酸。为了避免由于小麦品种的差异而导致黄腐酸测定效果的偏差,筛选了GY18204、中麦895、CA16098、农大212、济麦23和中麦895等6种冬小麦品种进行种子发芽比较实验。种子发芽试验在培养皿中进行,共设置了7个处理:(1)0mg·L-1黄腐酸(去离子水),作为对照;(2)20mg·L-1黄腐酸;(3)40mg·L-1黄腐酸;(4)80mg·L-1黄腐酸;(5)120mg·L-1黄腐酸;(6)160mg·L-1黄腐酸;(7)200mg·L-1黄腐酸,每个处理设置3个重复。
将小麦种子在0.5%的次氯酸钠溶液中浸泡30min,清水冲洗,放入底部垫有滤纸的培养皿中。每个培养皿放入20粒大小均匀的小麦种子,先加入20ml不同浓度、不同类型的黄腐酸,置于25℃培养箱中黑暗培养,第三天再补充10ml同一处理浓度的黄腐酸,在培养第4天时对小麦种子的发芽率、根长和芽长进行测定。
步骤5、小麦苗期调控配方研制,根据种子发芽实验的结果,进一步选择1种矿源黄腐酸(MFA1)和1种秸秆源黄腐酸(BFA1),2种小麦种子(GY18204、中麦895)进行小麦苗期调控实验。选用家用无孔塑料花盆(16cm口径,13cm底径,17.5cm盆高)作为栽培器具。每盆装土质量1kg,播种前,将黄腐酸、肥料与土壤混匀后装入盆中,加水至适宜田间持水率。试验期间,保持土壤含水率在最大田间持水率的60±5%,作物生长期间的管理均按照常规进行。常规化肥氮磷钾的施用量按照N 250kg·ha-2,P2O5 125kg·ha-2,K2O125kg·ha-2添加,以尿素作为氮肥,过磷酸钙和氯化钾为磷肥和钾肥。黄腐酸的添加量选用高低两个浓度,分别为300kg·ha-2和150kg·ha-2。
设计了9种处理方式,分别是:(1)对照CK;(2)常规施肥NPK;(3)黄腐酸(300kg·ha-2)替代部分氮肥,NPK总量不变,NPK+HFA;(4)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N减少15%,P、K不变,NPK+HFA-15N;(5)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N减少15%,P、K不变,NPK+LFA-15N;(6)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N减少30%,P、K不变,NPK+HFA-30N;(7)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N减少30%,P、K不变,NPK+LFA-30N;(8)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N、P、K均减15%,NPK+HFA-15NPK;(9)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N、P、K均减15%,NPK+LFA-15NPK,每个处理设置3次重复。实验开始每盆土壤中加入已经用次氯酸钠消毒处理过的10粒种子,出苗后留3株健壮植株。
通过上述方法,对不同类型黄腐酸有效含量比较,得出以下结论:
不同工艺流程制备的黄腐酸中其有效成分的含量有差异,矿源黄腐酸中有效含量在2.80%-25.94%,生化秸秆源黄腐酸有效含量在6.3%-30.33%,糖蜜的黄腐酸含量在20.01%-20.33%。其中,秸秆源BFA1的黄腐酸含量最高,为30.33%,其次是矿源MFA5,含有25.94%,最低的是矿源MFA4,黄腐酸的含量仅为2.8%。矿源和秸秆源中均存在黄腐酸有效含量较高的样品,也都存在黄腐酸有效成分比较低的样品,所以并不能仅依据黄腐酸的生产工艺流程来判断黄腐酸样品含量的高低,还要考虑黄腐酸生产制备所选用的原材料和生产厂家等因素。
表1不同来源黄腐酸样品编号及有效黄腐酸含量
通过上述方法,对不同来源黄腐酸的紫外光谱特征,得出以下结论:
UV-vis光谱分析方法可用于黄腐酸的半定量分析,用来揭示黄腐酸的结构组成与性质。SUVA254和SUVA272可以表征黄腐酸的芳香性和腐殖化程度强弱,值越大,芳香性越高、腐殖质类物质含量越高;SUVA260用于表征黄腐酸疏水性组分,值越大,疏水组分含量越高;SUVA280与黄腐酸的分子量大小呈正相关;光谱斜率之比SR与黄腐酸的平均分子量大小呈负相关。分析结果可知,矿源黄腐酸普遍具有较高的芳香性和疏水性,但其平均分子量较高。除MFA6外,矿源黄腐酸的芳香性、腐殖质化程度和疏水性均显著高于秸秆源黄腐酸和糖蜜,其中MFA1的芳香性、腐殖质化程度和疏水性最高,MFA4的平均分子量最大。秸秆源黄腐酸的芳香性、腐殖质化程度和疏水性较矿源黄腐酸(除MFA6)低,但其平均分子量较小,因此更有利于作物的吸收利用。两种糖蜜的平均分子量接近,但两者的芳香性、腐殖质化程度和疏水性差异显著。黄腐酸样品的芳香性和疏水性具有一致的变化规律,两者呈显著正相关。综合来看,3种秸秆源黄腐酸的芳香性、腐殖质化程度、疏水性和平均分子量都较为接近,而矿源黄腐酸和糖蜜不同样品之间差异较大。
表2不同来源黄腐酸的紫外—可见特征分析
通过上述方法,对不同来源黄腐酸的红外光谱特征,得出以下结论:
FTIR红外光谱可以定性和半定量的分析出黄腐酸样品的结构组成。红外光谱区可分为4000—1300cm-1和1300—600cm-1两个区域。波数4000-1300cm-1属于基团频率区或特征区,常用于鉴定和反映黄腐酸官能团的差异。波数在1300-600cm-1属于指纹区,当分子结构稍有不同时,该区域的吸收会有细微的差异,用于显示分子特征的差异。依据红外光谱不同区域的光谱学特征,可以比较不同类型黄腐酸的结构组成和重要官能团的差异。3000-3500cm-1之间的宽峰是由数个峰重叠导致的,其中包括酚、醇、羰基所连接的O-H伸缩振动峰,以及酰胺、胺所连接的N-H伸缩振动峰,3种类型黄腐酸均含有这一区域的宽峰,不同的是矿源MFA1、MFA2、MFA3和秸秆源BFA1样品具有更为显著的峰高,表明它们含有较高比例的酚基、醇基、羰基和酰胺、胺所连接的N-H结构;脂肪族-C-H的伸缩振动出现在2920-2850cm-1,其中2920cm-1是脂肪族-C-H的反对称伸缩振动,2850cm-1是脂肪族-C-H的对称伸缩振动,如图1所示,图中可以看出矿源MFA1、MFA2和MFA3含有一定比例的脂肪族-C-H结构;1600-1700cm-1之间的强峰由芳香环中的C=C伸缩振动峰和酰胺、羧基中的C=O(酰胺I带)伸缩共同作用导致,由于苯环的共轭作用导致峰向低波数方向移动,由谱图知相较于秸秆源黄腐酸和糖蜜(~1634cm-1),矿物源黄腐酸该范围内出峰在较低波数的位置(~1631cm-1),可推测矿物源黄腐酸所含芳香性基团比例较前两者高。1591cm-1处的峰属于酰胺的N-H面内弯曲振动(酰胺II带),在秸秆源黄腐酸中更为明显,1500cm-1处的峰为芳香环C=C的伸缩振动吸收导致,3种类型的黄腐酸中均含有,但其峰高差异明显。1385cm-1附近的峰为酚羟基和羧基的O-H弯曲振动吸收吸收峰,也可能由脂肪族中-CH3或-CH2的对称变形振动导致;波数1191-1210cm-1的峰对应酚、羧酸、酯中的C-O伸缩振动,或者对应酰胺中的C-N吸收振动峰(酰胺III带);多糖的C-O出现在1160cm-1;纤维素的C-O键多出现在1080-1000cm-1;波数1030cm-1代表碳水化合物或多糖结构中的C-O伸缩振动;波数810cm-1表示芳香环上C-H面外弯曲振动;波数690cm-1表示顺势烯烃类物质弯曲振动。综上可知,矿源黄腐酸和秸秆源黄腐酸BFA1含有较高比例的酚基、醇基、羰基和酰胺、胺所连接的N-H结构,秸秆源黄腐酸含有属于酰胺的N-H面内弯曲振动,矿物源黄腐酸所含芳香性基团种类丰富,比例大约为秸秆源黄腐酸和糖蜜的2倍左右。
通过上述方法,对不同来源黄腐酸的固态核磁共振碳谱分析,得出以下结论:
利用固态13C-NMR分析方法可以揭示不同来源黄腐酸官能团组成的差异。基于羧基、芳香族、烷氧基、甲氧基和烷基的化学峰位移的差别,可以识别出黄腐酸中含有的有机官能团。根据得到的黄腐酸样品的核磁共振波谱图,可划分为四个主要功能区,即烷基C区(0-45ppm)、烷氧C区(45-110ppm)、芳香C区(110-160ppm)和羰基C区(160-220ppm)。每个样品谱图又细化为6个区段:烷基C区(Alkyl-C,0-45ppm),主要为脂肪族C;烷氧C区(O-Alkyl-C,45-90ppm),包括甲氧基碳、含氧烷基碳(45-60ppm)和炔基碳(60-90ppm);缩醛类C区(90-110ppm),主要为双氧烷基C;芳香C区(110-140ppm),主要包括芳香碳和苯环基碳;酚基C区(140-160ppm),主要为酚芳香基碳;羧基C区(160-220ppm),主要包括羧基碳、酰胺碳、羧基羰基碳(160-190ppm)和羰基碳(190-220ppm)。
如图2所示,根据核磁共振波谱图可知,矿源黄腐酸中烷基碳、芳香碳和羰基碳的百分含量相对较高,秸秆源黄腐酸则含有较高比例的烷氧碳和缩醛类碳,糖蜜中含有较高比例的烷氧碳。烷基碳主要来源于植物生物聚合物(如角质、木栓质、蜡质)、微生物代谢产物的长链脂肪族化合物和甲基碳、脂类和多肽的侧链结构,是难以降解的、较稳定有机碳组分。芳香碳主要来源于木质素、软木纸、多肽类或黑炭等带有苯环类的物质,也可能来源于微生物代谢产物或植物体经过高热产生的物质,它常和烷基碳一起,用来表征难被微生物利用的碳化合物,即难分解碳。烷氧碳主要来源于半纤维素、纤维素、聚合和非聚合的碳水化合物或类乙醇物质,代表易被微生物代谢利用的碳水化合物,即易分解碳。一般认为秸秆和木质素中的烷氧碳比例较高,可达70%-90%。通常烷基碳/烷氧碳比例可作为评价黄腐酸中含有的有机碳分解程度的敏感指标,用来反应腐殖物质烷基化程度的高低,其比值越小说明有机质的分解程度越小。前人的研究认为糖蜜中主要含碳水化合物类的官能团,芳香碳和酚基碳含量较低,本研究中得到了类似的结论。此外,秸秆源黄腐酸中烷基碳的含量较高,这与原料主要是秸秆密切相关。除此之外,秸秆源黄腐酸还含有一定比例的缩醛类碳和酚基碳,说明其具有黄腐酸的典型特征。矿源黄腐酸中的烷基碳、芳香碳和羰基碳比例较高显著高于秸秆源和糖蜜,同样表明其具有黄腐酸的典型特征。与紫外和红外光谱的结果类似,可以发现即使是同一类型的黄腐酸,由于生产厂家的不同,其有机官能团含量的差异也是非常显著的,再一次验证了不能仅依据黄腐酸的制备工艺来衡量黄腐酸的结构和功能,说明我们需要更多地关注黄腐酸的有效成分含量和重要官能团来确定其对作物生长的影响。
表3不同来源黄腐酸含碳官能团的分配比例
通过上述方法,对不同来源黄腐酸的元素组成分析,得出以下结论:
根据紫外、红外和核磁共振光谱图特征,分选在3种类型的黄腐酸中各选择了1种黄腐酸品种,利用元素分析仪对其含有的C、N、O、S、P等元素含量进行比较(表4)。结果表明,矿源黄腐酸和糖蜜的碳素含量相当,分别为29.22%和28.93%,高于秸秆源黄腐酸。秸秆源黄腐酸BFA1的氮素含量显著高于其它两种,为8.87%。3种黄腐酸中的O和P差异不大,但在秸秆源黄腐酸中含有较高比例的S素,可能是由其生产工艺中引入。有研究表明H/C比越低,含有的芳香结构越多,研究中矿源黄腐酸的H/C比为0.09,显著小于秸秆源黄腐酸(0.19)和糖蜜(0.12),这一结果可以推测出矿源黄腐酸含有较多的芳香基官能团,与前面的核磁共振结果相一致。MFA1、BFA1和M1中的C/O差异不大,但C/N比差异显著,分别为47.59、2.96和8.23。
表4不同类型黄腐酸样品的元素组成含量和原子比分析
通过上述方法,对种子发芽实验比较分析,得出以下结论:
选取5种不同的冬小麦品种,设定7种黄腐酸的添加浓度,进行小麦种子发芽实验。研究结果表明,不同小麦品种对黄腐酸添加浓度的响应不同。总体来说,小麦的发芽率、根长和芽长随黄腐酸添加浓度的增加均呈现出先增加后降低的趋势,但不同小麦品种的最佳发芽率、根长和芽长所需的黄腐酸添加浓度有差异。当黄腐酸的添加浓度为20mg·L-1时,矿源和秸秆源黄腐酸对小麦种子发芽、根长和芽长的促进作用类似。继续增加黄腐酸的添加浓度,矿源黄腐酸对小麦种子发芽仍有一定的促进作用,而秸秆源和糖蜜则表现出一定程度的抑制作用。对于大部分小麦品种来说,当黄腐酸的添加浓度为20或40mg·L-1时,小麦种子发芽、根长和苗长可达到最大,但由于小麦品种差异,有些小麦种子偏好更高浓度的黄腐酸。例如,小麦GY18204在矿源黄腐酸的添加浓度为120mg·L-1和160mg·L-1时,种子发芽和根长、芽长长势更好。综合来看,小麦种子对矿源黄腐酸的适应性要高于秸秆源黄腐酸和糖蜜。当矿源黄腐酸MFA1、MFA3和MFA5的添加浓度为40mg·L-1时,5种小麦品种中的种子发芽率、根长和芽长的平均值为最高,如表5所示。而对秸秆源黄腐酸和糖蜜来说,黄腐酸的最适宜添加浓度为20mg·L-1,浓度过高,则会抑制种子的发芽和生长,甚至还会长菌,推测可能与这两种黄腐酸的元素含量和生产过程中引入其它元素和杂质等有一定的关系。
表5小麦种子萌发试验最优黄腐酸浓度和各指标平均值
将小麦种子的发芽率、根长和芽长与黄腐酸含量和关键官能团的含量进行相关分析时发现,小麦发芽率与烷基碳和烷基碳/烷氧碳含量显著正相关,而与黄腐酸的浓度相关性不显著。小麦的根长和芽长与黄腐酸中缩醛类碳、芳香碳、酚基碳含量呈极显著正相关,与羧基碳含量显著相关。
通过上述方法,对小麦苗期调控结果分析,得出以下结论:
根据小麦种子发芽实验可知,矿源和秸秆源黄腐酸比糖蜜更有利小麦的生长,因此苗期调控实验主要选用了矿源MFA1和秸秆源BFA1两种黄腐酸。这两种黄腐酸中有效黄腐酸含量都比较高,且重要的官能团组成结构也具有一定的差异性。同时小麦发芽实验表明,矿源和秸秆源黄腐酸对小麦生长影响的最适添加浓度不同,因此在设计盆栽实验时考虑到矿源和秸秆源黄腐酸可能对小麦生长的差异,选用了150kg ha-2和300kg ha-2两种浓度梯度进行添加,常规氮磷钾的添加量为按照N 250kg·ha-2,P2O5 125kg·ha-2,K2O 125kg·ha-2添加,以尿素作为氮肥,过磷酸钙和氯化钾为磷肥和钾肥。
实验设计了9种处理,对小麦7天的发芽率、收获后幼苗期小麦的根长、苗长和干重进行比较分析。结果显示对两种小麦种子来说,与CK相比,高浓度黄腐酸替代部分氮肥处理对小麦种子7天的发芽率有一定的促进作用,但差异不显著。无论是减氮还是减磷,化肥配施高、低浓度的黄腐酸对小麦7天发芽率的影响与CK处理差异不显著。与CK和NPK相比,300kg ha-2黄腐酸替代部分氮肥可在一定程度上提高幼苗期小麦的根长、苗长和干重,其中以矿源黄腐酸的效果更佳,与NPK相比分别对小麦根长、苗长和干重提高了21.4%、23.1%和33.3%。减氮15%配施150kg ha-2秸秆源黄腐酸和减氮15%配施300kg ha-2矿源黄腐酸均可显著提高苗期小麦的根长、苗长和干重,且以减氮15%配施300kg ha-2矿源黄腐酸处理更好;减氮30%配施150kg ha-2矿源黄腐酸和减氮30%配施300kg ha-2矿源黄腐酸均可显著提高苗期小麦的根长、苗长和干重,且以减氮30%配施300kg ha-2矿源黄腐酸更好;减磷15%配施150kg ha-2秸秆源黄腐酸和减磷15%配施300kg ha-2矿源黄腐酸均可显著提高苗期小麦的根长、苗长和干重,且以减磷15%配施150kg ha-2秸秆源黄腐酸更好。比较几种处理认为,减氮30%配施300kg ha-2矿源黄腐酸对小麦苗期根长、苗长和干重的促进作用最显著。即按照N 175kg·ha-2,P2O5 125kg·ha-2,K2O 125kg·ha-2配施300kg ha-2矿源黄腐酸时对小麦苗期生长具有显著的促进作用,与常规NPK相比小麦的根长、苗长和干重分别提高了21.4%、23.5%和66.6%。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,具体方法步骤如下:
步骤1、不同类型黄腐酸含量测定,采用重铬酸钾将黄腐酸中的碳氧化成二氧化碳,以邻菲罗啉作为指示剂,用硫酸亚铁铵标准溶液进行滴定,同时做空白试验,根据重铬酸钾消耗量和黄腐酸的碳系统计算黄腐酸的含量;
步骤2、不同类型黄腐酸光谱学性质的测定,具体包括:
步骤21、紫外分光光度计测定黄腐酸的紫外吸收特征;
步骤22、红外光谱分析不同类型黄腐酸的官能团;
步骤23、核磁共振仪测定不同类型黄腐酸官能团;
步骤3、元素分析仪测定黄腐酸的元素组成含量;
步骤4、种子发芽试验;
步骤5、小麦苗期调控配方研制。
2.根据权利要求1所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述步骤1不同类型黄腐酸含量测定具体步骤包括:
步骤11、称取0.5g黄腐酸样品放入300mL锥形瓶中,加入70mL浓度10g·L-1的氢氧化钠溶液;
步骤12、摇动锥形瓶使样品与溶液混合均匀,并在锥形瓶口加小漏斗,放于98-100℃的沸水中加热30min,加热期间摇动3-4次;
步骤13、加热结束后,取下锥形瓶,冷却至室温,用中速滤纸过滤,并用去离子水洗涤锥形瓶,直至沉淀洗涤滤液变为无色,将洗涤滤液一并过滤,合并滤液到另一个锥形瓶中;
步骤14、向滤液中加入硫酸溶液调节pH到1,搅拌均匀,沉淀腐殖酸;
步骤15、静置30min后用中速滤纸过滤,用约100ml水不少于5次洗涤沉淀,合并滤液,定容至250mL容量瓶;
步骤16、用磷酸三钠溶液去除重金属离子的干扰。准确吸取5mL过滤液,加入5mL浓度为0.4mol·L-1的重铬酸钾标准溶液,再缓慢加入15mL浓硫酸,置于98-100℃的沸水中加热30min,冷却至室温后,加入70mL水摇匀;
步骤17、向溶液中加入3滴邻菲罗啉—硫酸亚铁铵溶液作为指示剂,用浓度0.4mol·L-1的硫酸亚铁铵标准溶液滴定,直到溶液由橙色经绿色变成砖红色即为终点,记录硫酸亚铁铵的用量,测定过程中同时设定空白试验。
3.根据权利要求1所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述步骤21、紫外分光光度计测定黄腐酸的紫外吸收特征具体步骤包括:
用紫外-可见分光光度计进行扫描,选取波长范围为200-900nm进行吸光值An的连续测定(n为波长)。根据公式SUVAn=An/DOC计算选定波长下的特征值(DOC为可溶性有机质),并计算短波长275-295nm范围与长波长350-400nm范围的斜率比,用于表征黄腐酸分子量的大小。
4.根据权利要求1所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述步骤22、红外光谱分析不同类型黄腐酸的官能团采用溴化钾压片傅里叶红外光谱仪测定,具体步骤包括:称取2mg黄腐酸样品和100mg溴化钾,将其一起放入玛瑙研钵中研磨均匀,加压到20MPa压片,然后在采用傅里叶红外光谱仪进行测试,波数范围是400-4000cm-1,光谱仪分辨率4cm-1,信躁比是50000:1,扫描64次。
5.根据权利要求1所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述步骤23、核磁共振仪测定不同类型黄腐酸官能团具体步骤包括:选用4mm双共振魔角旋转探头,13C的频率为125.8Hz,应用13C CP实验转速为5kHz,循环延迟1s,交叉极化接触时间为1ms,将不同官能团划分为6个化学位移:0-45ppm,烷基碳AlkylC;45-90ppm,烷氧基碳O-AlkylC;90-110ppm,缩醛类碳(O-C-O)Acetal-C;110-140ppm,芳基碳(C-H/C-C)Aromatic-C;140-165ppm,酚基碳(C-O)Phenilic-C;165-220ppm,羧基碳CarbonylC。
6.根据权利要求1所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述步骤3、元素分析仪测定黄腐酸的元素组成含量,准确称取1-3mg黄腐酸样品,精确至0.001mg,按照样品测定程序连续测定两个以上的样品,直到结果达到分析误差的要求,具体步骤包括:
步骤31、样品中的碳、氢、氮及硫或氧元素,经催化氧化或裂解还原后分别转变成二氧化碳、水蒸气、氮气及二氧化硫或一氧化碳;
步骤32、然后随载气一起进入检测器,利用吸附分离—热导差检法依次测定各个组分,或采用色谱法将混合气体分离,用热导检测器或红外吸收检测器分别测定各组分的响应信号;
步骤33、根据组分的信号值或色谱峰值和对应元素的灵敏度或校正因子K值,分别计算样品中各元素的含量。
7.根据权利要求1所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述种子发芽试验具体步骤包括:
步骤41、根据黄腐酸光谱学特性的差异,选取了3种矿源黄腐酸(MFA1、MFA3和MFA5)、1种秸秆源黄腐酸(BFA1)和1种糖蜜(M1),共5种黄腐酸;
步骤42、为了避免由于小麦品种的差异而导致黄腐酸测定效果的偏差,筛选了GY18204、中麦895、CA16098、农大212、济麦23和中麦895这6种冬小麦品种进行种子发芽比较实验;
步骤43、种子发芽试验在培养皿中进行,共设置了7个处理:(1)0mg·L-1黄腐酸(去离子水),作为对照;(2)20mg·L-1黄腐酸;(3)40mg·L-1黄腐酸;(4)80mg·L-1黄腐酸;(5)120mg·L-1黄腐酸;(6)160mg·L-1黄腐酸;(7)200mg·L-1黄腐酸,每个处理设置3个重复;
步骤44、将小麦种子在0.5%的次氯酸钠溶液中浸泡30min,清水冲洗,放入底部垫有滤纸的培养皿中;
步骤45、每个培养皿放入20粒大小均匀的小麦种子,先加入20ml不同浓度、不同类型的黄腐酸,置于25℃培养箱中黑暗培养,第三天再补充10ml同一处理浓度的黄腐酸,在培养第4天时对小麦种子的发芽率、根长和芽长进行测定。
8.根据权利要求1所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述步骤5、小麦苗期调控配方研制具体步骤如下:
步骤51、根据种子发芽实验的结果,进一步选择1种矿源黄腐酸(MFA1)和1种秸秆源黄腐酸(BFA1),2种小麦种子(GY18204、中麦895)进行小麦苗期调控实验;
步骤52、选用家用无孔塑料花盆作为栽培器具,每盆装土质量1kg,播种前,将黄腐酸、肥料与土壤混匀后装入盆中,加水至适宜田间持水率;
步骤53、试验期间,保持土壤含水率在最大田间持水率的60±5%,作物生长期间的管理均按照常规进行,常规化肥氮磷钾的施用量按照N 250kg·ha-2,P2O5 125kg·ha-2,K2O125kg·ha-2添加,以尿素作为氮肥,过磷酸钙和氯化钾为磷肥和钾肥。黄腐酸的添加量选用高低两个浓度,分别为300kg·ha-2和150kg·ha-2;
步骤54、设计了9种处理方式,分别是:(1)对照CK;(2)常规施肥NPK;(3)黄腐酸(300kg·ha-2)替代部分氮肥,NPK总量不变,NPK+HFA;(4)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N减少15%,P、K不变,NPK+HFA-15N;(5)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N减少15%,P、K不变,NPK+LFA-15N;(6)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N减少30%,P、K不变,NPK+HFA-30N;(7)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N减少30%,P、K不变,NPK+LFA-30N;(8)黄腐酸高添加量(300kg·ha-2),总N、P、K均减15%,NPK+HFA-15NPK;(9)黄腐酸低添加量(150kg·ha-2),总N、P、K均减15%,NPK+LFA-15NPK,每个处理设置3次重复;
步骤55、实验开始每盆土壤中加入已经用次氯酸钠消毒处理过的10粒种子,出苗后留3株健壮植株。
9.根据权利要求7所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述种子发芽试验得出按照矿源黄腐酸MFA1、MFA3和MFA5的添加浓度为40mg·L-1或秸秆源黄腐酸BF1、糖蜜M1添加浓度为20mg·L-1时,5种小麦品种中的种子发芽率、根长和芽长的平均值均较高。
10.根据权利要求8所述的一种基于黄腐酸光谱学特性的小麦种子发芽和苗期调控方法,其特征在于,所述步骤5、小麦苗期调控配方是:按照N 175kg·ha-2,P2O5 125kg·ha-2,K2O 125kg·ha-2配施300kg ha-2矿源黄腐酸,促进小麦苗期生长。
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